Summary
ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。
Abstract
血管は体のすべての組織に遍在し、多様な機能を果たしています。したがって、血管内腔を覆う成熟血管内皮細胞のヒト多能性幹細胞からの誘導は、多数の組織工学および再生アプリケーションにとって非常に重要です。in vivoでは、始原内皮細胞は中胚葉系譜に由来し、動脈、静脈、毛細血管、血発生、リンパなどの特定のサブタイプに対して特定されます。血原性内皮細胞は、発生中に造血幹細胞と前駆細胞を生じさせ、それが生涯を通じてすべての血液系統を生成するため、特に興味深いものです。したがって、in vitroで血原性内皮細胞を生成するシステムを作成することは、内皮から造血への移行を研究する機会を提供し、ヒト血液製剤のex vivo産生とヒトドナーへの依存の減少につながる可能性があります。前駆細胞および始原内皮細胞の誘導にはいくつかのプロトコルが存在するが、ヒト幹細胞からの十分に特徴付けられた血原性内皮細胞の生成は記載されていない。ここでは、GSK3β阻害剤(CHIR99021)に応答して形成された原始的な筋細胞による分化プロトコル、bFGFによる中胚葉誘導、BMP4およびVEGF-Aによる始原内皮細胞の発生促進、そして最後にレチノイン酸による血原性内皮細胞仕様の約1週間でヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を誘導する方法を紹介します。このプロトコルは、それらの分子調節と内皮から造血への移行をさらに理解するために使用できる血原性内皮細胞の明確に定義された集団を生み出し、下流の治療アプリケーションに適用できる可能性があります。
Introduction
内皮細胞(EC)は、人体全体および操作された組織で複数の機能を果たす細胞の不均一な集団です。これらの機能には、他の細胞型(心筋細胞1、骨芽細胞2)をサポートおよび調節することに加えて、血液と組織の間に選択的バリアを形成し、組織形成を支援することが含まれます3。正常な発達中の成熟ECの分化には、多様なシグナル伝達経路が必要です。原始ECは中胚葉前駆細胞に由来し、成熟した動脈、静脈、毛細血管、リンパの表現型4に向けて指定されます。さらに、胚性卵黄嚢および胚性大動脈-生殖腺-中腎(AGM)領域のECの小さなサブセットも、胎児の肝臓と胎児の骨髄に移動する造血幹および前駆細胞(HSPC)を生じさせ、そこで出生後に留まり、生涯を通じてすべての血球タイプを生成します4。多様なEC表現型は、すべての組織の発生と維持に不可欠です。
したがって、ECとその誘導体は、ヒトの発生および/または疾患のモデル化およびメカニズムの解明、ならびに再生医療および組織工学の応用を目的とした研究の重要な要素です5,6,7,8。ただし、これらのタイプの研究の主な制限は、必要な量で主要なヒトECが利用できないことです。治療用途の大部分には、最低3 x 108 ECが必要になると推定されています6。この問題を解決するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、それらの多様な系統の可能性および多数の子孫を生成する能力のために提案されている6,9。
実際、hESCまたはhiPS細胞に由来する細胞の有用性は、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングに焦点を当てた複数の研究で実証されている10、11、12。Organ-on-a-Chip(OOC)技術は、細胞や組織を3次元の足場に統合することにより、人体の生理機能をより忠実に再現するために使用されてきました。さらに、複数の個々のOOC(いわゆるボディオンチップまたはヒューマンオンチップ、BOC / HOC)の接続は、マイクロフルイディクスを介して達成でき、関心のある器官間のクロストークを可能にします13、14、15。血管系などの支持組織は、OOCおよびBOC / HOCの重要な要素です。血管系を組み込むことは、組織全体にわたる栄養素、酸素、およびパラクリン因子の輸送を可能にし、それによって必要な組織特異的微小環境を促進する3,12。したがって、動脈、静脈、リンパ、および血発生ECなどの成熟ヒトECを導出する方法は、これらの組織工学的アプローチを前進させるために不可欠です。
hESCまたはhiPS細胞からヒト始原性または前駆細胞ECを誘導するためのステップを詳述した複数のプロトコルが公開されている5、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26.これらのプロトコルの多くは、ESC/iPS細胞と間質細胞のマウスフィーダー層との胚様体(EB)形成または共培養に依存しています。これらの戦略は、EC収率が低く、および/またはマウス細胞によるヒトECの汚染により、困難で時間がかかる傾向があります。間質細胞を使用せずに2D培養に厳密に依存するプロトコルは、多くの場合、長い誘導を必要とし、誘導のために成長因子および/または阻害剤の複雑な組み合わせを利用し、細胞分離後の拡張期間が長くなる、またはこれらの因子の組み合わせを有する。in vivoでの成熟ECタイプの導出に関与するシグナル伝達経路および因子に関する知識の進歩は、簡単で堅牢なin vitro分化プロトコルの基礎を提供します。
以前は、発生中のマウス動脈および血原性ECの仕様におけるNotchおよびレチノイン酸(RA)シグナル伝達経路の重要な役割がそれぞれ特定されていました。Notchシグナル伝達経路は、動脈EC表現型の仕様と維持において複数の役割を果たします。マウス網膜血管新生モデルを用いた研究では、流体せん断応力がNotch-Cx37-p27シグナル伝達軸を誘導し、G1細胞周期停止を促進する経路が同定され、動脈EC仕様27が可能になりました。細胞周期の状態は、細胞が遺伝子発現および表現型の変化を誘発することができる特定のシグナルを受け入れる明確な機会の窓を提供することによって、細胞の運命決定において役割を果たすと仮定されている28。このNotchを介したG1停止により、エフリンB2、Cx40、DLL4、Notch1、およびNotch 4などの動脈ECに富む遺伝子の発現が可能になりました(29,30でレビュー)。また、血原性EC仕様は、RAシグナル伝達を介してインビボで促進されることも示されている31,32。追加の研究では、RAシグナル伝達の下流で、c-KitとNotchの発現がp27をアップレギュレートし、マウス卵黄嚢とAGM33の血原性仕様を可能にすることが確認されました。マウスの血原性ECは、内皮(すなわち、CD31、KDR)および造血(すなわち、c-Kit、CD34)マーカーの両方の発現によって最小限に同定することができる4。最後に、血原性ECは内皮から造血への移行(EHT)を受けてHSPCを形成し、すべての血球タイプを生じさせる可能性があります4,34,35。
最近の研究では、この同じシグナル伝達階層がヒト血原性EC仕様を促進できるかどうかをテストしました。そのために、hESCから血発生性ECを誘導するための血清およびフィーダーフリーの2D培養プロトコルが開発され、これらの血発生性ECはCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-カドヘリン- CD45-として単一細胞レベルで特徴付けられました。この研究では、FUCCIレポーターコンストラクト(H9-FUCCI-hESC)を発現するH9-hESCを使用して、さまざまな細胞周期状態を識別する蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)レポーターも利用しました36。これらの細胞を用いた研究では、RAがECにおける早期G1細胞周期停止を促進し、初期のG1状態がin vitroでの血原性仕様を可能にすることが実証された37。本明細書では、これらのヒト血原性内皮細胞の分化のための詳細なプロトコールおよびそれらの同一性を確認するアッセイが提供される。この簡単な方法は、ヒト血球発生のメカニズムの将来の研究のために、この特殊なECのサブセットを生成するための有用な手段を提供します。
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Protocol
1.試薬および試薬調製
注:試薬のリストは 、材料の表に記載されています。
- ヒト多能性幹細胞株を入手します:H1-hESC、H9-フッチ-hESC。
注:血発生性ECの生成は、H1細胞株でより効率的である可能性があります。 - マトリックスタンパク質ストックの準備:マトリックスタンパク質を事前に冷やした1.5 mLチューブ(氷上)に分注し、各チューブに1 mgのマトリックスタンパク質が含まれるようにします。1 mgのマトリックスタンパク質は、2つの6ウェルプレート(合計12ウェル)のすべてのウェルをコーティングするのに十分です。アリコートは使用するまで-20°Cで保管してください。
注:マトリックスタンパク質を含むすべてのステップを氷上または4°Cで実行します。 マトリックスタンパク質の凍結ストックバイアルを氷上で4°Cで一晩解凍します。解凍したら、バイアルを回転させて内容物が混合されていることを確認します。1.5 mLマイクロ遠心チューブを-20°Cで少なくとも1時間プレチルし、分注する直前に氷に移します。 - マトリックスタンパク質コーティングプレートの準備:マトリックスタンパク質アリコートを氷上で4°Cで解凍します。 氷冷したDMEM:F12 12 mLを氷上でプレチルした円錐形チューブに加えます。プレチルドピペットチップを使用して、1アリコート(1 mg)のマトリックスタンパク質をコニカルチューブに移し、上下にピペッティングしてよく混合します。予め冷却された血清学的ピペットを用いて、予め冷却された6ウェルプレート(氷上)の各ウェルに1mLの希釈マトリックスタンパク質を分注する。ウェル全体が均一にコーティングされるようにプレートを旋回させて揺り動かします。プレートを室温で最低30分間インキュベートして、マトリックスタンパク質を固化させます。プレートをパラフィルムで包み、使用するまで4°Cで保存してください。調製後2週間以内にマトリックスタンパク質コーティングプレートを使用してください。
注:マトリックスタンパク質コーティングされた6ウェルプレートは、細胞の日常的な継代、および始原性および血原性内皮細胞への分化に使用します。氷上ですべての手順を実行します。6ウェルプレート、ピペットチップ、血清ピペット、コニカルチューブをプレチルしてから、-20°Cで1時間以上使用してください。 使用する準備ができたら、これらのアイテムを氷に移します。 - 多能性幹細胞分化培地100mLにPFHM5mLを添加してベース分化培地を調製する。4°Cで保存してください。
- 0.1 g BSAを100 mL PBSに溶解して、0.1% BSA-PBSを調製します。フィルターは0.22μmのフィルターを通過させてBSA-PBSを滅菌し、4°Cで保存します。
- ストックHCl(12 M)を水で1:2,400に希釈して5 mM HClを調製します。NaOHを利用してpHを3.0に調整します。フィルターは0.22μmのフィルターを通過させて溶液を滅菌し、4°Cで保存します。
- bFGF、BMP4、VEGF-A、レチノイン酸(RA)、およびDLL4ストックを準備します。
- bFGF:凍結乾燥粉末を0.1%BSA-PBS中で100 μg/mLに再構成します。分注し、-20°Cで保存します。 準備から3ヶ月以内にbFGFストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
- BMP4:凍結乾燥粉末を5mM HCl、pH 3.0で1 mg/mLに再構成します。さらに0.1%BSA-PBSで50 μg/mLに希釈します。分注し、-20°Cで保存します。 準備から4か月以内にBMP3ストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
- VEGF-A:凍結乾燥粉末をdH2O中で1 mg/mLに再構成します。さらに0.1%BSA-PBSで100 μg/mLに希釈します。分注し、-20°Cで保存します。 準備から3ヶ月以内にVEGF-Aストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
- RA:凍結乾燥粉末をDMSO中で100mMに再構成する。分注し、-80°Cで保存します。 準備から1ヶ月以内にRA在庫を使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
注意: RAストックを光から保護してください。 - DLL4:凍結乾燥粉末をPBS中で1 mg / mLに再構成します。分注し、-20°Cで保存します。 準備から12か月以内にDLL4ストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
- 最終濃度がそれぞれ25 ng/mLおよび50 ng/mLになるように、VEGF-AおよびBMP4をベース分化培地で希釈して、使用直前に内皮細胞分化培地を調製します(ステップ1.4)。
- 使用直前に、100 mMストックをDMSOで1:1,000で100 μMに希釈して、作業RAを準備します。
注意: 動作中のRAを光から保護してください。 - VEGF-A、BMP4、ワーキングRAをベース分化培地で希釈し(ステップ1.4)、最終濃度がそれぞれ25 ng/mL、50 ng/mL、0.5 μMになるように、使用直前に血原性内皮細胞分化培地を調製します。
- 10%FBSを含むHBSSを作製して抗体染色バッファーを調製し、1:500希釈抗菌試薬を補充します。滅菌濾過剤は緩衝液を濾過し、直ちに使用する。
- 1%FBSを含むHBSSを作製してセルソーティングバッファーを調製し、1:500希釈抗菌試薬を補充します。滅菌濾過剤は緩衝液を濾過し、直ちに使用する。
- 5 mgの凍結乾燥フィブロネクチンに5 mLの滅菌水を加えて、1 mg/mLのフィブロネクチンストックを準備します。分注し、-20°Cで保存します。 凍結乾燥製品ラベルの有効期限より前にフィブロネクチンストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
- フィブロネクチンでコーティングされた35 mmの皿を準備します。フィブロネクチンストック(1 mg / mL)を滅菌水で4 μg / mLに希釈します。.このフィブロネクチンコーティング溶液1 mLを各ディッシュに加え、37°Cで30分から1時間インキュベートします。コーティング直後に皿を使用してください。
- 製造元の指示に従って、3または4 mLのメチルセルロースベースの培地を調製します。アリコートは使用するまで-20°Cで保管してください。在庫製品ラベルに記載されている有効期限の前にメチルセルロースベースの培地アリコートを使用してください。.使用直前にアリコートを解凍してください。
- 組換えヒトDLL4ストックをPBSで最終濃度10 μg/mLに希釈して、DLL4コーティング溶液を調製します。
- 内皮細胞増殖培地は、製造元の指示に従って調製し、保管します。
- 0.1% BSAを含むPBSを作製することにより、フローサイトメトリー解析バッファーを調製します。バッファーを滅菌ろ過し、使用するまで4°Cで保存します。
2. 細胞培養とhESCの継代
- マトリックスタンパク質でコーティングされたプレート、幹細胞増殖培地、およびDMEM:F12を室温まで温めます。
- hESC細胞株を幹細胞増殖培地(2 mL/ウェル)で、マトリックスタンパク質でコーティングされた6ウェルプレート上で、37°C、5%CO2 インキュベーターで増殖させます。
- 細胞を毎日チェックし、必要に応じてp200ピペットチップを使用してプレートからそっとこすり落とし、分化した細胞を取り除きます。
注:分化した細胞はコロニーの周辺に現れます。培養中の分化細胞の例については、幹細胞増殖培地の製品マニュアルを参照してください。 - 細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したら、細胞を継代します。細胞を継代するには、次の手順を実行します。
注:分化の増加が発生した場合は、70%〜80%のコンフルエントに達する前に細胞を分割する必要があります。- 細胞の上の培地を取り除き、ウェルあたり1 mL DMEM:F12で穏やかに洗浄します。
- ウェルあたり1 mLのDMEM:F12を追加します。
- ウェルあたり160 μL/mLのディスパーゼを加え、細胞を5%CO2 インキュベーター内で37°Cで45分間インキュベートします。
- ディスパーゼインキュベーション後、ウェルあたりDMEM:F12を1 mL追加し、穏やかにピペットで細胞を持ち上げます。
注:細胞を単一細胞懸濁液に解離することは避けてください。細胞を小さな塊として継代します。 - 細胞を12 mLのDMEM:F12を含むコニカルチューブに移し、細胞を重力(~5-10分)で沈降させます。
- 上清を除去し、持ち上げた細胞のウェルあたり0.5 mLの幹細胞増殖培地にペレットを静かに再懸濁して、細胞の小さな塊を得ます。
注:細胞を単一細胞懸濁液に解離することは避けてください。細胞を小さな塊として継代します。 - 調製したマトリックスタンパク質コーティングプレートのウェルからマトリックスタンパク質コーティング溶液を吸引し、ウェルあたり1.5 mLの幹細胞増殖培地を追加します。
- 所望の量の再懸濁細胞を調製したマトリックスタンパク質コーティングプレートの各ウェルに加える(ステップ2.4.6)。
- プレートを37°C、5%CO2 インキュベーター内でインキュベートします。24時間ごとに培地を新鮮な幹細胞増殖培地に交換します。
3. hESCの始原内皮細胞への分化
- 1日目:上記セクション2に記載のように細胞を培養および継代する。細胞を小さな塊(~50μm)に播種し、1平方センチメートルあたり約2塊の密度で播種します(ステップ2.4.6)38。
注: シード密度を評価し、必要に応じて経験的に調整します。 - 0日目:細胞を播種してから24時間後、各ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で細胞を穏やかに洗浄します。5 μM GSK3iを含むベース分化培地1 mL(CHIR99021、新鮮添加)を各ウェルに加え、24時間インキュベートします(37°C、5%CO2)。
注意: すべての洗浄ステップで、プレートウェルの壁にピペッティングして、指示された洗浄媒体をプレートにゆっくりと追加します。ウェルの表面全体が洗浄媒体で覆われるように、プレートを静かに回転させます。プレートを少し傾けて、洗浄メディアが6時位置に溜まるようにし、洗浄メディアを慎重に吸引します。 - 1日目:各ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で細胞を穏やかに洗浄します。50 ng/mL bFGF(新鮮、凍結ストックから1:2,000添加)を含むベース分化培地1 mLを各ウェルに加え、24時間インキュベートします(37°C、5%CO2)。
- 2日目:各ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で細胞を穏やかに洗浄します。内皮細胞分化培地1 mLを各ウェルに加え、24時間インキュベートします(37°C、5%CO2)。
- 3日目:細胞を1ウェルあたり1 mLの新たに調製した内皮細胞分化培地で細胞上の培地に交換し、24時間インキュベートする(37°C、5%CO2)。
- 4日目:細胞上の培地を1ウェルあたり1 mLの新たに調製した内皮細胞分化培地と交換し、24時間インキュベートする(37°C、5%CO2)。
- 5日目:FACSは細胞を精製してEC表現型を評価するか(セクション4〜5)、培養に保持して血原性内皮細胞に向かって分化させます(セクション6)。
4. 始原内皮細胞のFACS精製
- 細胞の上に培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で1回穏やかに洗浄します。
- ウェルあたり1 mLの細胞剥離溶液を加え、37°C、5%CO2インキュベーター内で、または細胞が解離するまで細胞を12 分間インキュベートします。
- 解離した細胞を12 mLのDMEM:F12とペレットを含むコニカルチューブに移し、5分間遠心分離してペレットを1,000 x gに移します。
- 上清を取り除き、ペレットを12 mLのDMEM:F12に再懸濁して洗浄します。
- 5分間の遠心分離により細胞をペレット化し、1,000 x g。
- 上清を除去し、細胞ペレットを氷冷抗体染色バッファーに再懸濁し、細胞をカウントします。氷冷抗体染色バッファーを使用して濃度を1 x 105 細胞/mLに調整します。
- 抗体染色のために、細胞を氷上のマイクロ遠心チューブに均等に分割し、それぞれに1 x 105 細胞/mLで最低600 μLの細胞を入れます。
注:始発ECの染色には、染色されていないコントロール、CD31単一抗体コントロール、CD45単一抗体コントロール、およびCD31抗体とCD45抗体の両方を含むサンプルの4本の細胞チューブが必要です。抗体に関する情報は、 材料表に記載されています。 - 必要に応じて、細胞を含むチューブに抗体を加え、氷上でインキュベートし、光から30分間保護します。
- 無染色コントロール:抗体を添加しないでください。
- CD31単一抗体コントロール:CD31抗体のみを追加します。
- CD45単一抗体コントロール:CD45抗体のみを追加します。
- サンプル:CD31抗体とCD45抗体の両方を追加します。
注:サンプル中の最終抗体濃度と蛍光コンジュゲートは、使用する特異的抗体とセルソーターに基づいて最適化する必要があります。
- 4°Cの卓上マイクロ遠心機で1,000 x gで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。
- 上清を除去し、細胞ペレットを600 μLの氷冷ソーティングバッファーに再懸濁します。
- 5 mL FACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、光から保護された氷上に細胞を保存して、すぐにFACSを実現します。
- 始原内皮細胞(CD31+ CD45-)を得るには、以下の手順を行う。
- CD45陰性細胞集団およびゲート(CD45−)を同定する。
- (CD45-)内で、CD31陽性(CD31+)細胞集団を特定し、細胞を6 mLの氷冷細胞ソーティングバッファーにソーティングします。これらのセルは、ダウンストリーム アプリケーションに使用します (セクション 5 を参照)。
5. 始原内皮細胞の表現型を確認するアッセイ
- 6ウェルプレートの3ウェルを1 mL/ウェルのDLL4コーティング溶液で37°C、5%CO2 インキュベーターで30分間コーティングします。対照として、プレートの他の3つのウェルを1 mL/ウェルPBSでモックコートします。
- DLL4コーティング溶液およびPBSを吸引し、1ウェルあたり2mLの内皮細胞増殖培地中で25,000個の選別された始原内皮細胞(ステップ4.12を参照)をプレート化する。
- 細胞を37°C、5%CO2 インキュベーター内で24時間インキュベートします。
- 細胞の上に培地を吸引し、2 mL/ウェルPBSで1回洗浄します。qPCRまたはフローサイトメトリー(FUCCIコンストラクトを発現する細胞の場合)で細胞を分析します。
- qPCRで細胞を分析するには、次の手順を実行します。
- 細胞の上の液体を吸引し、製造元のプロトコルに従ってRNA抽出キットを使用して細胞内のRNAを分離します。
- メーカーのプロトコルに従って、逆転写マスターミックスを使用して逆転写反応を実行します。
- メーカーのプロトコルに従って、SYBRグリーンマスターミックスを使用してqPCR反応を実行します。
注:使用したプライマー(EFNB2、GJA5、GJA4、NR2F2、EPHB4、HEY2)を 表1に示します。
- FUCCI構築物を発現する細胞をフローサイトメトリーで解析するには、以下のステップを実行します。
- 細胞の上に液体を吸引し、500 μL/ウェルの0.25%トリプシン-EDTAを加えます。
- 細胞を5%CO2インキュベーター内で37°Cで持ち上げるまで~5分間インキュベートします。
- 細胞をマイクロ遠心チューブに移し、4°Cの微量遠心機で1,000 x gで5分間ペレット化します。
- 上清を吸引し、ペレットを500 μLの氷冷フローサイトメトリー分析バッファーに再懸濁します。
- 5 mL FACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、細胞を光から保護された氷上に保存して、すぐにフローサイトメトリー分析を行うことができます。
- 初期G1(色なし)、後期G1(mCherry+/mVenus-)、G1/S(mCherry+/mVenus+)、およびS/G2/M(mCherry-/mVenus+)のDLL4で播種された細胞の割合をPBSコントロールと比較して分析します。
- qPCRで細胞を分析するには、次の手順を実行します。
6. hESCの血原性内皮細胞への分化
注:上記のセクション3.1〜3.6で説明されているように、細胞を4日目の始始ECに分化させます。
- 5日目:細胞の上に培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で細胞を穏やかに洗浄します。新たに調製した血液原性内皮細胞分化培地を1ウェルあたり1 mL加え、24時間インキュベートします(37°C、5%CO2)。
- 6日目:細胞上の培地をウェルあたり1 mLの新たに調製した血原性内皮細胞分化培地と交換し、24時間インキュベートする(37°C、5%CO2)。
- 7日目:細胞を1ウェルあたり1 mLの新たに調製した血原性内皮細胞分化培地で細胞上の培地を交換し、24時間インキュベートする(37°C、5%CO2)。
- 8日目:FACSは血原性内皮細胞を分離します(セクション7を参照)。
7.FACS-血原性内皮細胞の分離
- 上記のセクション4.1〜4.6で説明したように、セルを持ち上げて洗浄します。
- 抗体染色のために、細胞を氷上のマイクロ遠心チューブに均等に分割し、それぞれに1 x 105 細胞/mLで最低600 μLの細胞を入れます。
注:血原性ECの抗体染色には、無染色コントロール、CD31シングル抗体コントロール、CD45シングル抗体コントロール、KDRシングル抗体コントロール、c-Kitシングル抗体コントロール、CD34シングル抗体コントロール、VE-カドヘリンシングル抗体コントロール、および6つの抗体すべてを含むサンプルの8本の細胞チューブが必要です。
注:抗体情報は 材料表に記載されています。 - 必要に応じて、細胞を含むチューブに抗体を加え、氷上でインキュベートし、光から30分間保護します。
- 非染色コントロール:抗体を添加しないでください。
- CD31単一抗体コントロール:CD31抗体のみを追加します。
- CD45単一抗体コントロール:CD45抗体のみを追加します。
- KDR単一抗体コントロール:KDR抗体のみを追加します。
- c-Kit単一抗体コントロール:c-Kit抗体のみを追加します。
- CD34単一抗体コントロール:CD34抗体のみを追加します。
- VE-カドヘリン単一抗体コントロール:VE-カドヘリン抗体のみを追加します。
- サンプル:CD31、CD45、KDR、c-Kit、CD34、およびVE-カドヘリン抗体を追加します。
注:サンプル中の最終抗体濃度と蛍光コンジュゲートは、使用する特異的抗体とセルソーターに基づいて最適化する必要があります。
- 4°Cのマイクロ遠心機で1,000 x gで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。
- 上清を除去し、ペレットを600 μLの氷冷ソーティングバッファーに再懸濁します。
- 5 mL FACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、光から保護された氷上に細胞を保管して、すぐにFACSを実現します。
- 血原性内皮細胞(CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-カドヘリン-CD45-)を取得するには、以下の手順を実行します。
- CD45-細胞集団およびゲート(CD45-)を同定する。
- (CD45-)内で、CD31+細胞集団をゲート(CD31+)と同定する。
- (CD31+)内で、VE-カドヘリン-細胞集団およびゲート(CDH5-)を同定する。
- (CDH5-)内で、c-Kit+細胞集団およびゲート(KIT+)を同定する。
- (KIT+)内で、CD34+細胞集団とゲート(CD34+)を特定します。
- (CD34+)内で、KDR+細胞を同定し、6 mLの氷冷セルソーティングバッファーにソーティングします。これらのセルをダウンストリーム アプリケーションで使用します (セクション 8 を参照)。
8.コロニー形成ユニットアッセイ
- 製造元の指示に従って、メチルセルロースベースの培地のアリコートを解凍します。
注:2つのサンプルには1つの3 mLアリコートで十分であり、3つのサンプルには1つの4 mLアリコートで十分です。 - ステップ7.7で得られた選別された血原性内皮細胞をカウントする。
- 製造元の指示に従って、各サンプルに最低1,000個の血原性内皮細胞が含まれるように、各メチルセルロースベースの培地アリコートに追加する選別された細胞の量を計算します。
注:セルの数は必要に応じて調整できます。 - 計算された細胞量をメチルセルロースベースの培地アリコートとボルテックスに完全に加えます。メチルセルロースベースの培地培養物を室温で10分間、または気泡が消散するまで放置します。
- 準備した35 mmディッシュからフィブロネクチンコーティング溶液を吸引します。製造元の指示に従って、35 mmディッシュあたり1 mLのメチルセルロースベースの培地培養液を分注します。皿を静かに回転させて、文化を均等に分配します。
- これらの35 mmディッシュと、滅菌水で満たされた追加の35 mmディッシュ2つを、15 cmの組織培養ディッシュ内に置きます。
- 培養物を37°C、5%CO2 インキュベーター内でインキュベートし、8日目および14日目に培養物を観察する。
- 8日目に、CFU-EおよびBFU-Eコロニーを数えます。
- 14日目に、CFU-GMおよびCFU-GEMMコロニーを数えます。
注:コロニータイプの形態学的同定については、メチルセルロースベースの培地マニュアルを参照してください。
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Representative Results
hESC由来の始原ECおよび血原性ECの仕様を概説した模式図と、めっき後24時間後の細胞の代表的な画像を図1に示します。仕様に従い、始原ECおよび血原性ECは、それぞれ5日目および8日目にFACS精製される。原始ECはCD31+ CD45-と定義され、血原性ECはCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-カドヘリン-CD45-と定義される。始原ECおよび血原性EC精製のための代表的なフローサイトメトリーゲーティング戦略を図2に示します。細胞は、CD45の陰性発現およびCD31の陽性発現に基づいて最初にゲーティングされ、精製された始原ECを得る(図2A)。精製された血原性ECを得るために、細胞は図2Aのように最初にゲートされ、次にVE-カドヘリン(CDH5)、c-Kit(KIT)、CD34、およびKDRの(順番に)陽性または陰性の発現に基づいてさらに精製されます(図2B)。
分化の5日目(プロトコルセクション4)にFACSを介して単離されたH9-Fucci-hES由来の始原CD31+ CD45- 内皮細胞の可能性を評価するために、内皮サブタイプを生じさせるために、精製された細胞を、動脈仕様を誘導するためのNotchリガンドDLL4またはPBS(コントロール)のいずれかでコーティングされたプレートに播種し、37°Cで24時間インキュベートし、 5%CO2 インキュベーター。次に、細胞をRNA溶解バッファーで溶解し、RNAを抽出してcDNAに逆転写し、qPCRを実行して、DLL4処理細胞とコントロール細胞の遺伝子発現レベルを比較します。予想通り、DLL4上で増殖した内皮細胞は、Notch応答性遺伝子HEY2、ならびに動脈関連遺伝子EFNB2、GJA5、およびGJA4の発現を増加させた。さらに、これらの細胞は、静脈転写因子NR2F2の発現も低下しています(図3A)。あるいは、細胞周期状態に対するDLL4処理の効果を決定するために、FACS精製CD31+ CD45-細胞をDLL4またはPBSのいずれかでコーティングされたプレート上で24時間インキュベートし、持ち上げ、hCdt1(30/120)-mCherry(後期G1)およびhGem(1/110)- mVenus(S/G2/M)の発現に基づいて分析します。Notchシグナル伝達が後期G1細胞周期停止を促進するという知見と一致して27、コントロール細胞と比較して、DLL4の存在下で増殖後の後期G1で始原ECの停止の割合が高い(図3B、C)。
造血内皮細胞の造血能を検証するために、FACS(セクション7の方法)によって単離されたCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-内皮細胞を、コロニー形成単位(CFU)アッセイで造血前駆細胞の増殖用に処方されたメチルセルロースベースの培地に播種し、14日間増殖させます。CFU-E赤血球コロニーおよび芽球形成ユニット(BFU)-E赤血球コロニーは8日目にカウントされ(図4A、B)、CFU-GM顆粒球/マクロファージおよびGFU-GEMM(顆粒球、赤血球、マクロファージ、および巨核球)多能性造血前駆細胞コロニーは14日目にカウントされます(図4CおよびD)。めっきされた1,000個の血原性ECあたり、約20CFUが生成されます(図4F)。内皮細胞形態の細胞も培養物に見られます(図4E)。これらは、単一細胞レベルで多系統造血前駆細胞を生じさせる血原性内皮細胞です37。
図1:始原性および血原性ECの仕様に関するプロトコル 。 (A)分化プロトコルの概略図。胚性幹細胞は、マトリックスタンパク質コーティングプレート上に-1日目に播種され、一晩付着させます。次に、細胞を0日目と1日目にそれぞれGSK3i阻害剤(CHIR99021)とbFGFで処理し、それぞれ原始的な線条と中胚葉の仕様を誘導します。2日目から、細胞はBMP4とVEGF-Aの組み合わせで処理され、始発ECの発生を促進します。原始EC(赤丸)は5日目にFACS精製されます。あるいは、血原性ECを生成するために、始原ECsの上の培地を、BMP4、VEGF-A、およびRAを含む新鮮な血液分化培地に5日目に交換する。この培地は、血原性EC(赤い星)がFACS精製される8日目まで毎日交換されます。(B)分化0日目のコロニー、スケールバー= 100μm。パネルAは、エルゼビアの許可を得てQiu et al.37 から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:hESCに由来する血原性ECのFACS分析。 (A)始原性ECおよび(B)血原性ECの精製のための代表的なフローサイトメトリーゲーティング戦略。血原性ECは始原ECに由来するため、CD45およびCD31のフローサイトメトリーゲーティング戦略は両方の細胞集団で同じであることに注意してください。各パネル(サンプル)の一番上の行に示されているのは、プロトコルセクション6に記載されているように血原性ECに分化し、プロトコルセクション7.3.8に記載されているように抗体で染色された細胞です。各パネル(対照)の一番下の行に示すのは、RA処理なしで8日間分化させた未染色細胞である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:H9-フッチCD31+ CD45-始原内皮細胞のDLL4誘導は、後期G1停止および動脈遺伝子発現の増加をもたらす。 (a)分化5日目に精製されたFucci構築物を発現するCD31+ CD45-H9-hESC−由来始原内皮細胞のDLL4処理は、動脈遺伝子(i-iii)およびNotch応答性遺伝子Hey2(v)の発現増加をもたらし、 これは、静脈遺伝子NR2F2(iv)の発現の付随する減少を伴う。(B)PBS(コントロール)またはDLL4上で24時間増殖した5,000個のH9-Fucci由来CD31+ CD45-の細胞周期状態分布を示す代表的なFACSプロット。 (C)DLL4誘導は、コントロールと比較して後期G1期の細胞が15%増加する結果となる。データは、パネル(B)に示す同じ実験からの三重サンプルの平均である。エラーバーは標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:hESC由来の血原性ECの造血能の解析。(A)CFU-E赤血球コロニー(スケールバー=35μm)、(B)BFU-E赤血球コロニー(スケールバー=75μm)、(C)CFU-GM顆粒球/マクロファージコロニー、(D)CFU-GEMM多能性造血前駆コロニー、および(E)内皮細胞(EC)を基盤とするCFU-GM顆粒球/マクロファージコロニー(赤矢印)の形態を示す代表的な画像。(f)播種血原性内皮細胞1,000個あたりに形成されるCFUの数と分布。スケールバー = 100 μm インチ (C-E)。このプロトコルを使用して区別されたCFUの追加の画像は、Qiuら37に見出すことができる。パネルFは、エルゼビアの許可を得てQiu et al.37から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | フォワード | 逆 |
| EFNB2 | TATGCAGAACTGCGATTCCCAA | TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC |
| EPHB4 | CGCACCTACGAAGTGTGA | GTCCGCATCGCTCTCATAGTA |
| GJA5 | CCGTGGTAGGCAAGGTCTG | ATCACACCGGAATCAGCCTG |
| GJA4 | ACACCCACCCTGGTCTAC | CACTGGCGACATAGGTGCC |
| ねえ2 | GCCCGCCCTTGTCAGTATC | CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG |
| NR2F2 | GGACCACATAGGGATCTCCCAA | アカッカガカキャカ |
表1:qPCRプライマー情報
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Discussion
本明細書では、マウスフィーダーおよび無血清2D培養システム(図1)を用いて、約1週間でヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を作製するステップを概説する。このプロトコルは、Sriramら(2015)によって記述された方法を拡張して、原始EC38を取得します。CD31+ CD45-ECの原始的な性質と仕様の可能性は、これらの細胞をDLL4コーティングプレート上で培養し、動脈仕様と一致する遺伝子発現変化を観察することによって実証されます(図3)。さらに、動脈同一性の獲得は後期G1細胞周期停止と関連しており(図3)、これは以前の研究と一致しています27。0.5 μM RA、25 ng/mL BMP4、および50 ng/mL VEGF-Aの存在下でさらに3日間始始ECを培養した後、CFU赤血球、BFU赤血球、CFU顆粒球/マクロファージ、CFU顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球コロニーを生じさせることができる血発生ECをFACS分離することができました(図4).最近発表された研究でこの方法を使用すると、多能性の喪失、原始的な線条、および中胚葉誘導、内皮細胞同一性の獲得、そして最終的に造血同一性と一致する8日間にわたる遺伝子発現の変化が観察されました37。さらに、RA治療は早期G1細胞周期停止を誘導し、血原性EC仕様37を可能にした。
最近、Ohtaら(2019)は、血原性ECをhPSCから分化させるためのプロトコルを記載した39。しかしながら、上記のプロトコルは重要な利点を提供する:1)この方法はスフェロイドの形成を必要としない。2)このプロトコルは、低酸素インキュベーターではなく、標準の37°C、5%CO2インキュベーターを利用しているため、専用の特殊機器は必要ありません。3)このプロトコルは1つの培地(PFHMを添加した多能性幹細胞分化培地)のみを使用するため、コスト削減の利点がありますが、太田プロトコルは誘導に2つの培地を必要とします。Galatら(2017)による別の最近発表された研究は、CD34+血原性内皮細胞の集団を生成するためにCHIR99021誘導が利用されたプロトコルを説明しました40。これらの細胞はまた、CD31を発現し、単層条件下で培養した場合に内皮細胞を生じさせることができ、または追加のサイトカインの存在下でそれぞれOP9またはOP9-DLL4細胞と共培養した後に骨髄系およびリンパ系マーカーを発現する細胞を生じさせた。追加の共培養の必要性は、マウス細胞による所望の細胞集団の潜在的な汚染につながる可能性があります。さらに、OhtaらとGalatらは、ここに記載されているものよりも短い血原性導入期間(それぞれ4日と5日対8日)を利用しましたが、どちらも血原性ECをCD34+と定義しましたが、このプロトコルはより厳密な定義を利用しました:CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-カドヘリン- CD45-.CD34は造血細胞のマーカーとして認識されるが、間葉系間質細胞および内皮細胞などの他の非造血細胞型によっても発現される41。したがって、このプロトコル(CD31 + KDR + c-Kit+ CD34 + VE-カドヘリン-CD45-)における血原性ECの定義はより厳密であり、より定義された集団を表しています。
治療用途におけるhESCまたはhiPS細胞の使用に対する1つの制限は、必要な細胞の数が多いことであり、標準的な2D誘導法は主に小規模分化に限定されています。Olmerら(2018)は、hiPSC株を利用して、浮遊培養または攪拌槽バイオリアクターのいずれかを利用して、動脈(DLL4)および静脈(EPHB4)細胞マーカーの両方を発現する機能的CD31+ ECの産生を拡大する可能性を実証しました6。重要なことに、彼らは、20 mL浮遊培養を含む単一のフラスコからCD34とKDRを共発現する1.18 x 107 CD31+ ECを取得できることを示しました。大部分の治療用途に必要な3 x 108 ECを得るためには、2本強の500 mLフラスコが必要になります6。今後の実験では、ここで紹介したプロトコルへのスケーリング技術の適用を探る必要があり、血発生性ECの大規模生産のために。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、NIH助成金HL128064およびU2EB017103によって部分的にサポートされました。CT Innovations 15-RMB-YALE-04助成金によってさらなる支援が提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
| 35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
| 6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
| Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
| FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 μg/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
| Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
| Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
| Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
| Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
| RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
| α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
| α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
| α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
| α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
| * Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |
References
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