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Developmental Biology

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं का निर्देशित भेदभाव

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62391
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

यहां प्रस्तुत लगभग 1 सप्ताह में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के निर्देशित भेदभाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल है।

Abstract

रक्त वाहिकाओं को शरीर के सभी ऊतकों के भीतर सर्वव्यापी रूप से वितरित किया जाता है और विभिन्न कार्य करते हैं। इस प्रकार, परिपक्व संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं की व्युत्पत्ति, जो मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से रक्त वाहिका लुमेन को पंक्तिबद्ध करती है, ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्जनन अनुप्रयोगों की भीड़ के लिए महत्वपूर्ण है। विवो में, आदिम एंडोथेलियल कोशिकाएं मेसोडर्मल वंश से ली जाती हैं और धमनी, शिरापरक, केशिका, हेमोजेनिक और लसीका सहित विशिष्ट उपप्रकारों की ओर निर्दिष्ट होती हैं। हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाएं विशेष रुचि रखती हैं क्योंकि, विकास के दौरान, वे हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं को जन्म देती हैं, जो तब जीवन भर सभी रक्त वंश उत्पन्न करती हैं। इस प्रकार, विट्रो में हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक प्रणाली बनाने से एंडोथेलियल-टू-हेमटोपोइएटिक संक्रमण का अध्ययन करने का अवसर मिलेगा, और मानव रक्त उत्पादों के पूर्व विवो उत्पादन और मानव दाताओं पर निर्भरता कम हो सकती है। जबकि पूर्वज और आदिम एंडोथेलियल कोशिकाओं की व्युत्पत्ति के लिए कई प्रोटोकॉल मौजूद हैं, मानव स्टेम कोशिकाओं से अच्छी तरह से विशेषता वाले हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं की पीढ़ी का वर्णन नहीं किया गया है। यहां, लगभग 1 सप्ताह में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं की व्युत्पत्ति के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है: जीएसके 3ए अवरोधक (सीएचआईआर 99021) के जवाब में गठित आदिम लकीर कोशिकाओं के साथ एक भेदभाव प्रोटोकॉल, फिर बीएफजीएफ द्वारा मध्यस्थता मेसोडर्म वंश प्रेरण, इसके बाद बीएमपी 4 और वीईजीएफ-ए द्वारा प्रचारित आदिम एंडोथेलियल सेल विकास, और अंत में रेटिनोइक एसिड द्वारा प्रेरित हेमोजेनिक एंडोथेलियल सेल विनिर्देश। यह प्रोटोकॉल हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से परिभाषित आबादी पैदा करता है जिसका उपयोग उनके आणविक विनियमन और एंडोथेलियल-टू-हेमटोपोइएटिक संक्रमण को समझने के लिए किया जा सकता है, जिसमें डाउनस्ट्रीम चिकित्सीय अनुप्रयोगों पर लागू होने की क्षमता है।

Introduction

एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) कोशिकाओं की एक विषम आबादी है जो पूरे मानव शरीर में और इंजीनियर ऊतकों में कई कार्य करती हैं। अन्य सेल प्रकारों (यानी, कार्डियोमायोसाइट्स1, ओस्टियोब्लास्टिक कोशिकाओं 2) का समर्थन और विनियमन करने के अलावा, इन कार्यों में रक्त औरऊतकों के बीच एक चयनात्मक बाधा बनाना और ऊतक निर्माण में सहायता करना शामिलहै। सामान्य विकास के दौरान परिपक्व ईसी के भेदभाव के लिए विविध सिग्नलिंग मार्गों की आवश्यकता होती है। आदिम ईसी मेसोडर्म पूर्वजों से प्राप्त होते हैं, और फिर परिपक्व धमनी, शिरापरक, केशिका और लसीका फेनोटाइप्स की ओर निर्दिष्ट होते हैं। इसके अतिरिक्त, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक जर्दी थैली और भ्रूण महाधमनी-गोनाड-मेसोनेफ्रोस (एजीएम) क्षेत्र में ईसी का एक छोटा उप-समूह भी हेमोजेनिक ईसी बनने के लिए निर्दिष्ट किया जाता है, जो हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) को जन्म देता है जो भ्रूण के यकृत और भ्रूण अस्थि मज्जा में स्थानांतरित होते हैं, जहां वे प्रसवोत्तर रहते हैं और पूरेजीवन में सभी रक्त कोशिका प्रकार उत्पन्न करते हैं। ईसी फेनोटाइप की विविध श्रेणी सभी ऊतक विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक है।

इस प्रकार, ईसी और उनके डेरिवेटिव मानव विकास और / या बीमारी के साथ-साथ पुनर्योजी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 5,6,7,8 के मॉडलिंग और तंत्रको स्पष्ट करने के उद्देश्य से अध्ययन के महत्वपूर्ण घटक हैं। हालांकि, इस प्रकार के अध्ययनों के लिए मुख्य सीमा आवश्यक मात्रा में प्राथमिक मानव ईसी की उपलब्धता की कमी है। यह अनुमान लगाया गया है कि चिकित्सीय अनुप्रयोगों के बहुमत के लिए न्यूनतम 3 x 108 ईसी की आवश्यकताहोगी। इस समस्या को हल करने के लिए, मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) का उपयोग उनकी विविध वंश क्षमता और बड़ी संख्या में संतान उत्पन्न करने की उनकी क्षमता के कारण प्रस्तावितकिया गया है।

दरअसल, एचईएससी या एचआईपीएससी से प्राप्त कोशिकाओं की उपयोगिता रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग10,11,12 पर केंद्रित कई अध्ययनों में प्रदर्शित की गई है। ऑर्गन-ऑन-ए-चिप (ओओसी) तकनीक का उपयोग कोशिकाओं और ऊतकों को त्रि-आयामी मचानों में एकीकृत करके मानव शरीर के शरीर विज्ञान को अधिक ईमानदारी से पुन: व्यवस्थित करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, कई अलग-अलग ओओसी (एक तथाकथित शरीर- या मानव-ऑन-ए-चिप, बीओसी / एचओसी) का कनेक्शन माइक्रोफ्लुइडिक्स के माध्यम से पूरा किया जा सकता है ताकि रुचि केअंगों के बीच क्रॉसस्टॉक की अनुमति मिल सके। सहायक ऊतक, जैसे वाहिका, ओओसी और बीओसी / एचओसी के महत्वपूर्ण घटक हैं; वास्कुलचर को शामिल करने से ऊतकों में पोषक तत्वों, ऑक्सीजन और पैराक्रिन कारकों के परिवहन की अनुमति मिलती है, जिससे आवश्यक ऊतक-विशिष्ट माइक्रोएन्वायरमेंट 3,12 को बढ़ावा मिलता है। इस प्रकार, परिपक्व मानव ईसी, जैसे धमनी, शिरापरक, लसीका और हेमोजेनिक ईसी प्राप्त करने के तरीके, इन ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोणों को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

एचईएससी या एचआईपीएससी से मानव आदिम या पूर्वज ईसी की व्युत्पत्ति के लिए चरणों का विवरण देते हुए कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . इनमें से कई प्रोटोकॉल भ्रूण शरीर (ईबी) गठन या स्ट्रोमल कोशिकाओं की मुराइन फीडर परत के साथ ईएससी / आईपीएससी के सह-संस्कृति पर भरोसा करते हैं। ये रणनीतियाँ कठिन और समय लेने वाली होती हैं, कम ईसी पैदावार और / या म्यूरिन कोशिकाओं के साथ मानव ईसी के संदूषण के साथ। प्रोटोकॉल जो स्ट्रोमल कोशिकाओं के उपयोग के बिना 2 डी संस्कृति पर सख्ती से भरोसा करते हैं, अक्सर लंबे प्रेरण की आवश्यकता होती है, प्रेरण के लिए विकास कारकों और / या अवरोधकों के जटिल संयोजन का उपयोग करते हैं, सेल पृथक्करण के बाद विस्तारित विस्तार अवधि होती है, या इन कारकों का संयोजन होता है। विवो में परिपक्व ईसी प्रकारों की व्युत्पत्ति में शामिल सिग्नलिंग मार्गों और कारकों के ज्ञान को आगे बढ़ाना एक सरल और मजबूत इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए आधार प्रदान करता है।

इससे पहले, विकास के दौरान क्रमशः मुराइन धमनी और हेमोजेनिक ईसी के विनिर्देश में नॉच और रेटिनोइक एसिड (आरए) सिग्नलिंग मार्गों के लिए महत्वपूर्ण भूमिकाओं की पहचान की गई थी। नॉच सिग्नलिंग मार्ग धमनी ईसी फेनोटाइप के विनिर्देश और रखरखाव में कई भूमिका निभाता है। मुराइन रेटिना वैस्कुलराइजेशन मॉडल का उपयोग करके काम ने एक मार्ग की पहचान की जिसमें द्रव कतरनी तनाव नॉच-सीएक्स 37-पी 27 सिग्नलिंग अक्ष को प्रेरित करता है, जी 1 सेल चक्र गिरफ्तारी को बढ़ावा देता है, जो धमनी ईसी विनिर्देश27 को सक्षम बनाता है। सेल चक्र राज्यों को अवसर की अलग-अलग खिड़कियां प्रदान करके सेल भाग्य निर्णयों में एक भूमिका निभाने की परिकल्पना की गई है जिसमें कोशिकाएं कुछ संकेतों के लिए ग्रहणशील होती हैं जो जीन अभिव्यक्ति और फेनोटाइपिकपरिवर्तनों को प्रेरित कर सकती हैं। इस नॉच-मध्यस्थता जी 1 गिरफ्तारी ने धमनी ईसी में समृद्ध जीन की अभिव्यक्ति को सक्षम किया, जिसमें एफ्रिन बी 2, सीएक्स 40, डीएलएल 4, नॉच 1 और नॉच 4 (29,30 में समीक्षा की गई) शामिल हैं। यह भी दिखाया गया है कि आरए सिग्नलिंग31,32 के माध्यम से विवो में हेमोजेनिक ईसी विनिर्देश को बढ़ावा दिया जाता है। अतिरिक्त अध्ययनों ने पहचान की कि, आरए सिग्नलिंग के डाउनस्ट्रीम, सी-किट और नॉच अपरेगुलेट पी 27 की अभिव्यक्ति, जो मुराइन जर्दी थैली और एजीएम33 में हेमोजेनिक विनिर्देश को सक्षम बनाता है। म्यूरिन हेमोजेनिक ईसी को एंडोथेलियल (यानी, सीडी 31, केडीआर) और हेमटोपोइएटिक (यानी, सी-किट, सीडी 34) मार्कर4 दोनों की अभिव्यक्ति द्वारा न्यूनतम रूप से पहचाना जा सकता है। अंत में, हेमोजेनिक ईसी एचएसपीसी बनाने के लिए एंडोथेलियल-टू-हेमटोपोइएटिक संक्रमण (ईएचटी) से गुजरते हैं, जो सभी रक्त कोशिकाप्रकारों 4,34,35 को जन्म दे सकता है।

हाल के काम ने परीक्षण किया कि क्या यह एक ही सिग्नलिंग पदानुक्रम मानव हेमोजेनिक ईसी विनिर्देश को बढ़ावा दे सकता है। ऐसा करने के लिए, एचईएससी से हेमोजेनिक ईसी प्राप्त करने के लिए एक सीरम- और फीडर-मुक्त 2 डी कल्चर प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, और इन हेमोजेनिक ईसी को सीडी 31 + केडीआर + सी-किट + सीडी 34 + वीई-कैडरिन-सीडी 45 के रूप में एकल सेल स्तर पर विशेषता दी गई थी। इस अध्ययन ने फ्लोरोसेंट सर्वव्यापी सेल चक्र संकेतक (एफयूसीसीआई) रिपोर्टर का भी लाभ उठाया, जो एच 9-एचईएससी का उपयोग करके विभिन्न सेल चक्र राज्यों की पहचान करता है जो एफयूसीसीआई रिपोर्टर निर्माण (एच 9-एफयूसीसीआई-एचईएससी) 36 को व्यक्त करते हैं। इन कोशिकाओं के साथ अध्ययन में, यह प्रदर्शित किया गया था कि आरए ईसी में प्रारंभिक जी 1 सेल चक्र गिरफ्तारी को बढ़ावा देता है, और प्रारंभिक जी 1 राज्य विट्रो37 में हेमोजेनिक विनिर्देश को सक्षम बनाता है। इसमें, इन मानव हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और उनकी पहचान की पुष्टि करने वाले परख प्रदान किए गए हैं। यह सरल विधि मानव रक्त कोशिका विकास के तंत्र के भविष्य के अध्ययन के लिए ईसी के इस विशेष उप-समूह को उत्पन्न करने का एक उपयोगी साधन प्रदान करती है।

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Protocol

1. अभिकर्मक और अभिकर्मक तैयारी

नोट: अभिकर्मकों की एक सूची सामग्री की तालिका में प्रदान की गई है।

  1. मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनें प्राप्त करें: एच 1-एचईएससी, एच 9-फुकी-एचईएससी।
    नोट: हेमोजेनिक ईसी की पीढ़ी एच 1 सेल लाइन में अधिक कुशल हो सकती है।
  2. मैट्रिक्स प्रोटीन स्टॉक तैयार करें: मैट्रिक्स प्रोटीन को पूर्व-ठंडा 1.5 एमएल ट्यूबों (बर्फ पर) में मिलाएं ताकि प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीग्राम मैट्रिक्स प्रोटीन हो। 1 मिलीग्राम मैट्रिक्स प्रोटीन दो 6-वेल प्लेटों (कुल 12 कुओं) के सभी कुओं को कोट करने के लिए पर्याप्त है। उपयोग होने तक एलिकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर मैट्रिक्स प्रोटीन से जुड़े सभी चरणों का प्रदर्शन करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर मैट्रिक्स प्रोटीन की जमी हुई स्टॉक शीशी को पिघलाएं। एक बार पिघलने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए शीशी को घुमाएं कि सामग्री मिश्रित है। प्रीकिल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए और एलिकोटिंग से तुरंत पहले बर्फ में स्थानांतरित होते हैं।
  3. मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित प्लेटें तैयार करें: 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर पिघल मैट्रिक्स प्रोटीन एलिकोट। बर्फ पर एक पूर्व-शंक्वाकार ट्यूब में 12.5 एमएल बर्फ-ठंडा डीएमईएम: एफ 12 जोड़ें। प्री-चिल्ड पिपेट युक्तियों का उपयोग करके, एक एलिकोट (1 मिलीग्राम) मैट्रिक्स प्रोटीन को शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं। पूर्व-ठंडा सेरोलॉजिक पिपेट का उपयोग करके पूर्व-ठंडा 6-वेल प्लेटों (बर्फ पर) के प्रत्येक कुएं में पतला मैट्रिक्स प्रोटीन का 1 एमएल एलिकोट करें। प्लेटों को घुमाएं और हिलाएं ताकि पूरे कुएं को समान रूप से लेपित किया जा सके। मैट्रिक्स प्रोटीन को जमने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों को न्यूनतम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्लेटों को पैराफिल्म के साथ लपेटें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। तैयारी के 2 सप्ताह के भीतर मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित प्लेटों का उपयोग करें।
    नोट: कोशिकाओं के नियमित पासिंग और प्राइमर्डियल और हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं में भेदभाव के लिए मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित 6-वेल प्लेटों का उपयोग करें। बर्फ पर सभी चरणों का प्रदर्शन करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए उपयोग करने से पहले 6-वेल प्लेटों, पिपेट टिप्स, सेरोलॉजिक पिपेट और शंक्वाकार ट्यूबों को प्री-चिल करें। उपयोग करने के लिए तैयार होने पर इन वस्तुओं को बर्फ में स्थानांतरित करें।
  4. प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल विभेदन माध्यम के 100 एमएल में पीएफएचएम के 5 एमएल जोड़कर बेस भेदभाव माध्यम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 100 एमएल पीबीएस में 0.1 ग्राम बीएसए को भंग करके 0.1% बीएसए-पीबीएस तैयार करें। 0.22 μm फ़िल्टर से गुजरकर बीएसए-पीबीएस को फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. स्टॉक एचसीएल (12 एम) 1: 2,400 को पानी के साथ पतला करके 5 एमएम एचसीएल तैयार करें। NaOH का उपयोग करके pH को 3.0 पर समायोजित करें। 0.22 μm फ़िल्टर से गुजरकर घोल को फ़िल्टर करें और 4 °C पर स्टोर करें।
  7. बीएफजीएफ, बीएमपी 4, वीईजीएफ-ए, रेटिनोइक एसिड (आरए), और डीएलएल 4 स्टॉक तैयार करें।
    1. बीएफजीएफ: 0.1% बीएसए-पीबीएस में लियोफिलाइज्ड पाउडर को 100 μg / mL में पुनर्गठित करें। Aliquot और -20 °C पर स्टोर करें। तैयारी के 3 महीने के भीतर bFGF स्टॉक का उपयोग करें। उपयोग करने से तुरंत पहले एलिकोट को पिघलाएं।
    2. बीएमपी 4: 5 एमएम एचसीएल, पीएच 3.0 में लियोफिलाइज्ड पाउडर को 1 मिलीग्राम / एमएल में पुनर्गठित करें। इसके अलावा 0.1% बीएसए-पीबीएस में 50 μg / mL तक पतला करें। Aliquot और -20 °C पर स्टोर करें। तैयारी के 3 महीने के भीतर बीएमपी 4 स्टॉक का उपयोग करें। उपयोग करने से तुरंत पहले एलिकोट को पिघलाएं।
    3. वीईजीएफ-ए: लियोफिलाइज्ड पाउडर को डीएच2ओ में 1 मिलीग्राम / एमएल में पुनर्गठित करें। इसके अलावा 0.1% बीएसए-पीबीएस में 100 μg / mL तक पतला करें। Aliquot और -20 °C पर स्टोर करें। तैयारी के 3 महीने के भीतर वीईजीएफ-ए स्टॉक का उपयोग करें। उपयोग करने से तुरंत पहले एलिकोट को पिघलाएं।
    4. आरए: डीएमएसओ में लियोफिलाइज्ड पाउडर को 100 एमएम तक पुनर्गठित करें। एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। तैयारी के 1 महीने के भीतर आरए स्टॉक का उपयोग करें। उपयोग करने से तुरंत पहले एलिकोट को पिघलाएं।
      नोट: आरए स्टॉक को प्रकाश से बचाएं।
    5. डीएलएल 4: पीबीएस में लियोफिलाइज्ड पाउडर को 1 मिलीग्राम / एमएल में पुनर्गठित करें। Aliquot और -20 °C पर स्टोर करें। तैयारी के 12 महीनों के भीतर डीएलएल 4 स्टॉक का उपयोग करें। उपयोग करने से तुरंत पहले एलिकोट को पिघलाएं।
  8. आधार विभेदन माध्यम (चरण 1.4) में वीईजीएफ-ए और बीएमपी 4 को पतला करके उपयोग से तुरंत पहले एंडोथेलियल सेल भेदभाव माध्यम तैयार करें ताकि अंतिम सांद्रता क्रमशः 25 एनजी / एमएल और 50 एनजी / एमएल हो।
  9. डीएमएसओ में 100 एमएम स्टॉक 1: 1,000 को 100 μM तक पतला करके उपयोग से तुरंत पहले काम करने वाले आरए तैयार करें।
    नोट: काम करने वाले आरए को प्रकाश से बचाएं।
  10. आधार विभेदन माध्यम (चरण 1.4) में वीईजीएफ-ए, बीएमपी 4 और काम करने वाले आरए को पतला करके उपयोग से तुरंत पहले हेमोजेनिक एंडोथेलियल सेल भेदभाव माध्यम तैयार करें ताकि अंतिम सांद्रता क्रमशः 25 एनजी / एमएल, 50 एनजी / एमएल और 0.5 μM हो।
  11. 10% एफबीएस युक्त एचबीएसएस बनाकर एंटीबॉडी स्टेनिंग बफर तैयार करें और 1: 500 पतला रोगाणुरोधी अभिकर्मक के साथ पूरक करें। बाँझ बफर को फ़िल्टर करें और तुरंत उपयोग करें।
  12. 1% एफबीएस युक्त एचबीएसएस बनाकर सेल सॉर्टिंग बफर तैयार करें और 1: 500 पतला रोगाणुरोधी अभिकर्मक के साथ पूरक करें। बाँझ बफर को फ़िल्टर करें और तुरंत उपयोग करें।
  13. 5 मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड फाइब्रोनेक्टिन में 5 एमएल बाँझ पानी जोड़कर 1 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक तैयार करें। Aliquot और -20 °C पर स्टोर करें। लियोफिलाइज्ड उत्पाद लेबल पर समाप्ति तिथि से पहले फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक का उपयोग करें। उपयोग करने से तुरंत पहले एलिकोट को पिघलाएं।
  14. फाइब्रोनेक्टिन-लेपित 35 मिमी व्यंजन तैयार करें। बाँझ पानी में फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक (1 मिलीग्राम / एमएल) को 4 μg / mL तक पतला करें। प्रत्येक डिश में इस फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान का 1 एमएल जोड़ें और 30 मिनट से 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोटिंग के तुरंत बाद व्यंजनों का उपयोग करें।
  15. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित माध्यम के 3 या 4 एमएल एलिकोट तैयार करें। उपयोग होने तक एलिकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। स्टॉक उत्पाद लेबल पर इंगित समाप्ति तिथि से पहले मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित मध्यम एलिकोट का उपयोग करें। उपयोग करने से तुरंत पहले एलिकोट को पिघलाएं।
  16. पुनः संयोजक मानव डीएलएल 4 स्टॉक को पीबीएस में 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता तक पतला करके DLL4 कोटिंग समाधान तैयार करें।
  17. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम तैयार करें और संग्रहीत करें।
  18. 0.1% बीएसए युक्त पीबीएस बनाकर फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण बफर तैयार करें। बाँझ बफर को फ़िल्टर करें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. सेल कल्चर और एचईएससी की पासिंग

  1. मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित प्लेटों, स्टेम सेल विकास माध्यम, और डीएमईएम: एफ 12 को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित 6-वेल प्लेटों पर स्टेम सेल विकास माध्यम (2 एमएल / वेल) में एचईएससी सेल लाइनों को विकसित करें।
  3. कोशिकाओं को दैनिक रूप से जांचें और पी 200 पिपेट टिप का उपयोग करके प्लेट से धीरे-धीरे स्क्रैप करके विभेदित कोशिकाओं को हटा दें।
    नोट: कॉलोनियों की परिधि पर विभेदित कोशिकाएं दिखाई देंगी। संस्कृति में विभेदित कोशिकाओं के उदाहरणों के लिए स्टेम सेल विकास मध्यम उत्पाद मैनुअल देखें।
  4. कोशिकाओं को 70% -80% स्थिरता तक पहुंचने के बाद पारित करें। कक्षों को पारित करने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें।
    नोट: यदि भेदभाव में वृद्धि होती है तो कोशिकाओं को 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने से पहले विभाजित किया जाना चाहिए।
    1. कोशिकाओं के ऊपर माध्यम को हटा दें और धीरे से 1 एमएल डीएमईएम: एफ 12 प्रति अच्छी तरह से धो लें।
    2. डीएमईएम के 1 एमएल जोड़ें: एफ 12 प्रति अच्छी तरह से।
    3. प्रति कुएं में डिस्पेज़ का 160 μL/mL जोड़ें और 45 मिनट के लिए 5%CO2 इनक्यूबेटर में 37 °C पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. डिस्पेस इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को उठाने के लिए प्रति कुएं और धीरे से पिपेट का अतिरिक्त 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: कोशिकाओं को एकल-सेल निलंबन में अलग करने से बचें। कोशिकाओं को छोटे झुरमुट के रूप में पारित करें।
    5. कोशिकाओं को डीएमईएम: एफ 12 के 12 एमएल युक्त शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को गुरुत्वाकर्षण (~ 5-10 मिनट) द्वारा व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
    6. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और धीरे-धीरे कोशिकाओं के छोटे झुरमुट प्राप्त करने के लिए उठाए गए कोशिकाओं के प्रति कुएं में 0.5 एमएल स्टेम सेल विकास माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: कोशिकाओं को एकल-सेल निलंबन में अलग करने से बचें। कोशिकाओं को छोटे झुरमुट के रूप में पारित करें।
    7. तैयार मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित प्लेट के कुओं से मैट्रिक्स प्रोटीन कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से स्टेम सेल विकास माध्यम के 1.5 एमएल जोड़ें।
    8. तैयार मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं में पुन: निलंबित कोशिकाओं (चरण 2.4.6) की वांछित मात्रा जोड़ें।
    9. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। माध्यम को हर 24 घंटे में ताजा स्टेम सेल विकास माध्यम में बदलें।

3. एचईएससी का प्राइमर्डियल एंडोथेलियल कोशिकाओं में विभेदन

  1. दिन -1: धारा 2 में ऊपर वर्णित कोशिकाओं को संस्कृति और पारित करना। कोशिकाओं (चरण 2.4.6) को छोटे झुरमुट (~ 50 μm) में लगभग 2 झुरमुट प्रति वर्ग सेंटीमीटर38 के घनत्व पर बीज दें।
    नोट: बीज घनत्व का मूल्यांकन करें और यदि आवश्यक हो तो अनुभवजन्य रूप से परिष्कृत करें।
  2. दिन 0: कोशिकाओं को बीज देने के 24 घंटे बाद, प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे से कोशिकाओं को 1 एमएल डीएमईएम: एफ 12 प्रति अच्छी तरह से धोएं। प्रत्येक कुएं में 5 μM GSK3i (CHIR99021, ताजा जोड़ा गया) वाले बेस भेदभाव माध्यम का 1 एमएल जोड़ें और 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: सभी धोने के चरणों के लिए, धीरे-धीरे प्लेट की दीवार के खिलाफ अच्छी तरह से पाइप करके प्लेट में संकेतित वॉश मीडिया जोड़ें। धीरे से प्लेट को घुमाएं ताकि कुएं की पूरी सतह वॉश मीडिया द्वारा कवर की जा सके। प्लेट को थोड़ा झुकाएं ताकि छह बजे की स्थिति में वॉश मीडिया पूल और वॉश मीडिया को सावधानी से एस्पिरेट करें।
  3. दिन 1: प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे से कोशिकाओं को 1 एमएल डीएमईएम: एफ 12 प्रति अच्छी तरह से धोएं। प्रत्येक कुएं में 50 एनजी / एमएल बीएफजीएफ (जमे हुए स्टॉक से ताजा, 1: 2,000 जोड़ा गया) वाले बेस भेदभाव माध्यम का 1 एमएल जोड़ें और 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) को इनक्यूबेट करें।
  4. दिन 2: प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे से कोशिकाओं को 1 एमएल डीएमईएम: एफ 12 प्रति अच्छी तरह से धोएं। प्रत्येक कुएं में एंडोथेलियल सेल भेदभाव माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) को इनक्यूबेट करें।
  5. दिन 3: कोशिकाओं के ऊपर के माध्यम को 1 एमएल ताजा तैयार एंडोथेलियल सेल भेदभाव माध्यम प्रति अच्छी तरह से बदलें और 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) को इनक्यूबेट करें।
  6. दिन 4: कोशिकाओं के ऊपर के माध्यम को प्रति अच्छी तरह से ताजा तैयार एंडोथेलियल सेल भेदभाव माध्यम के 1 एमएल के साथ बदलें और 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) को इनक्यूबेट करें।
  7. दिन 5: एफएसीएस ईसी फेनोटाइप (खंड 4-5) का आकलन करने के लिए कोशिकाओं को शुद्ध करता है या संस्कृति में रखता है और हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं (खंड 6) की ओर अंतर करता है।

4. मौलिक एंडोथेलियल कोशिकाओं का एफएसीएस शुद्धिकरण

  1. कोशिकाओं के ऊपर माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे से डीएमईएम: एफ 12 प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल के साथ एक बार धो लें।
  2. प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल सेल डिटेचमेंट समाधान जोड़ें और कोशिकाओं को 12 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें, या जब तक कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
  3. विघटित कोशिकाओं को एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 12 एमएल डीएमईएम: एफ 12 और 5 मिनट, 1,000 एक्स जी के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली होती है।
  4. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और धोने के लिए डीएमईएम: एफ 12 के 12 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. 5 मिनट, 1,000 x g के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को छर्रों।
  6. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और बर्फ-ठंडे एंटीबॉडी धुंधला बफर में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं की गिनती करें। बर्फ-ठंडे एंटीबॉडी धुंधला बफर का उपयोग करके एकाग्रता को 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।
  7. कोशिकाओं को बर्फ पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में समान रूप से विभाजित करें, प्रत्येक में एंटीबॉडी धुंधला होने के लिए 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल पर न्यूनतम 600 μL कोशिकाएं होती हैं।
    नोट: आदिम ईसी के धुंधला होने के लिए कोशिकाओं की चार ट्यूबों की आवश्यकता होती है: बिना दाग वाले नियंत्रण, सीडी 31 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण, सीडी 45 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण, और सीडी 31 और सीडी 45 एंटीबॉडी दोनों वाले नमूने। एंटीबॉडी के बारे में जानकारी सामग्री की तालिका में प्रदान की गई है।
  8. कोशिकाओं वाले ट्यूबों में एंटीबॉडी जोड़ें, जैसा कि उपयुक्त है, और बर्फ पर इनक्यूबेट करें और 30 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित करें।
    1. बिना दाग वाला नियंत्रण: कोई एंटीबॉडी न जोड़ें।
    2. सीडी 31 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण: केवल सीडी 31 एंटीबॉडी जोड़ें।
    3. सीडी 45 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण: केवल सीडी 45 एंटीबॉडी जोड़ें।
    4. नमूना: सीडी 31 और सीडी 45 एंटीबॉडी दोनों जोड़ें।
      नोट: नमूने में अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता, साथ ही फ्लोरोसेंट संयुग्म, उपयोग किए गए विशिष्ट एंटीबॉडी और सेल सॉर्टर के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  9. 1,000 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस टेबलटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को पेलेट करें।
  10. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और सेल छर्रों को 600 μL बर्फ-ठंडा छंटाई बफर में फिर से निलंबित करें।
  11. 5 एमएल एफएसीएस ट्यूबों के जाल फिल्टर कैप के माध्यम से नमूनों को छान लें और कोशिकाओं को बर्फ पर स्टोर करें, जो प्रकाश से संरक्षित हैं, तत्काल एफएसीएस के लिए।
  12. निम्न चरणों का प्रदर्शन करके आदिम एंडोथेलियल कोशिकाओं (CD31+ CD45-) प्राप्त करें।
    1. CD45-नकारात्मक सेल आबादी और गेट (CD45-) की पहचान करें।
    2. (CD45-) के भीतर, CD31-पॉजिटिव (CD31+) सेल आबादी की पहचान करें और कोशिकाओं को 6 mL आइस-कोल्ड सेल सॉर्टिंग बफर में क्रमबद्ध करें। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए इन कक्षों का उपयोग करें (अनुभाग 5 देखें).

5. प्राइमर्डियल एंडोथेलियल सेल फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए परख

  1. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 1 एमएल / वेल डीएलएल 4 कोटिंग समाधान के साथ 6-वेल प्लेट के तीनकुओं को कोट करें। नियंत्रण के रूप में, प्लेट के अन्य तीन कुओं को 1 एमएल / वेल पीबीएस के साथ मॉक-कोट करें।
  2. डीएलएल 4 कोटिंग समाधान और पीबीएस, और प्लेट 25,000 क्रमबद्ध प्राइमर्डियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (चरण 4.12 देखें) को एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के 2 एमएल में अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. कोशिकाओं के ऊपर माध्यम को एस्पिरेट करें और 2 एमएल / अच्छी तरह से पीबीएस के साथ एक बार धो लें। क्यूपीसीआर या फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करें (एफयूसीसीसीआई निर्माण को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए)।
    1. QPCR द्वारा कक्षों का विश्लेषण करने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें।
      1. कोशिकाओं के ऊपर तरल को एस्पिरेट करें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कोशिकाओं में आरएनए को अलग करें।
      2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मास्टर मिक्स के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाएं करें।
      3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार SYBR ग्रीन मास्टर मिश्रण के साथ QPCR प्रतिक्रियाएं निष्पादित करें।
        नोट: उपयोग किए गए प्राइमर (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
    2. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एफयूसीसीआई निर्माण को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
      1. कोशिकाओं के ऊपर तरल को एस्पिरेट करें और 500 μL / अच्छी तरह से 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए जोड़ें।
      2. कोशिकाओं को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि उठा नहीं लिया जाता, ~ 5 मिनट।
      3. कोशिकाओं को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1,000 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में कोशिकाओं को पेलेट करें।
      4. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और बर्फ-ठंडे प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण बफर के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
      5. 5 एमएल एफएसीएस ट्यूब के जाल फिल्टर कैप के माध्यम से नमूनों को छान लें और तत्काल प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रकाश से संरक्षित कोशिकाओं को बर्फ पर स्टोर करें।
      6. प्रारंभिक G1 (कोई रंग नहीं), देर से G1 (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+), और S/G2/M (mCherry-/mVenus+) में DLL4 बनाम PBS नियंत्रण पर प्लेट की गई कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण करें।

6. हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एचईएससी का भेदभाव

नोट: कोशिकाओं को दिन 4 आदिम ईसी से अलग करें, जैसा कि ऊपर अनुभाग 3.1-3.6 में वर्णित है।

  1. दिन 5: कोशिकाओं के ऊपर माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे से कोशिकाओं को 1 एमएल डीएमईएम: एफ 12 प्रति अच्छी तरह से धोएं। प्रति अच्छी तरह से ताजा तैयार हेमोजेनिक एंडोथेलियल सेल भेदभाव माध्यम का 1 एमएल जोड़ें और 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) को इनक्यूबेट करें।
  2. दिन 6: कोशिकाओं के ऊपर के माध्यम को 1 एमएल ताजा तैयार हेमोजेनिक एंडोथेलियल सेल भेदभाव माध्यम प्रति अच्छी तरह से बदलें और 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) को इनक्यूबेट करें।
  3. दिन 7: कोशिकाओं के ऊपर के माध्यम को 1 एमएल ताजा तैयार हेमोजेनिक एंडोथेलियल सेल भेदभाव माध्यम प्रति अच्छी तरह से बदलें और 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) को इनक्यूबेट करें।
  4. दिन 8: एफएसीएस हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करता है (अनुभाग 7 देखें)।

7. हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं का एफएसीएस-अलगाव

  1. अनुभाग 4.1-4.6 में ऊपर वर्णित कोशिकाओं को उठाएं और धोएं।
  2. कोशिकाओं को बर्फ पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में समान रूप से विभाजित करें, प्रत्येक में एंटीबॉडी धुंधला होने के लिए 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल पर न्यूनतम 600 μL कोशिकाएं होती हैं।
    नोट: हेमोजेनिक ईसी के एंटीबॉडी धुंधला होने के लिए कोशिकाओं की आठ ट्यूबों की आवश्यकता होती है: बिना दाग वाले नियंत्रण, सीडी 31 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण, सीडी 45 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण, केडीआर एकल एंटीबॉडी नियंत्रण, सी-किट एकल एंटीबॉडी नियंत्रण, सीडी 34 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण, वीई-कैडरिन एकल एंटीबॉडी नियंत्रण, और सभी छह एंटीबॉडी वाले नमूने।
    नोट: एंटीबॉडी जानकारी सामग्री की तालिका में प्रदान की जाती है।
  3. कोशिकाओं वाले ट्यूबों में एंटीबॉडी जोड़ें, जैसा कि उपयुक्त है, और बर्फ पर इनक्यूबेट करें और 30 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित करें।
    1. बिना दाग वाला नियंत्रण: एंटीबॉडी न जोड़ें।
    2. सीडी 31 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण: केवल सीडी 31 एंटीबॉडी जोड़ें।
    3. सीडी 45 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण: केवल सीडी 45 एंटीबॉडी जोड़ें।
    4. केडीआर एकल एंटीबॉडी नियंत्रण: केवल केडीआर एंटीबॉडी जोड़ें।
    5. सी-किट एकल एंटीबॉडी नियंत्रण: केवल सी-किट एंटीबॉडी जोड़ें।
    6. सीडी 34 एकल एंटीबॉडी नियंत्रण: केवल सीडी 34 एंटीबॉडी जोड़ें।
    7. वीई-कैडरिन एकल एंटीबॉडी नियंत्रण: केवल वीई-कैडरिन एंटीबॉडी जोड़ें।
    8. नमूना: सीडी 31, सीडी 45, केडीआर, सी-किट, सीडी 34, और वीई-कैडरिन एंटीबॉडी जोड़ें।
      नोट: नमूने में अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता, साथ ही फ्लोरोसेंट संयुग्म, उपयोग किए गए विशिष्ट एंटीबॉडी और सेल सॉर्टर के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  4. 1,000 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को छर्रों।
  5. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और छर्रों को 600 μL बर्फ-ठंडा छंटाई बफर में फिर से निलंबित करें।
  6. 5 एमएल एफएसीएस ट्यूबों के जाल फिल्टर कैप के माध्यम से नमूनों को छान लें और तत्काल एफएसीएस के लिए प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर कोशिकाओं को स्टोर करें।
  7. हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं (CD31+ KDR + c-Kit + CD34 + VE-कैडरिन-CD45-) प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
    1. CD45- सेल जनसंख्या और गेट (CD45-) की पहचान करें।
    2. (CD45-) के भीतर, CD31+ सेल जनसंख्या और गेट (CD31+) की पहचान करें।
    3. (सीडी 31+) के भीतर, वीई-कैडरिन-सेल आबादी और गेट (सीडीएच 5-) की पहचान करें।
    4. (सीडीएच 5-) के भीतर, सी-किट + सेल आबादी और गेट (केआईटी +) की पहचान करें।
    5. (KIT+) के भीतर, CD34+ सेल आबादी और गेट (CD34+) की पहचान करें।
    6. (सीडी 34 +) के भीतर, केडीआर + कोशिकाओं को 6 एमएल बर्फ-कोल्ड सेल सॉर्टिंग बफर में पहचानें और क्रमबद्ध करें। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में इन कक्षों का उपयोग करें (अनुभाग 8 देखें).

8. कॉलोनी बनाने वाली इकाई परख

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित माध्यम के एलिकोट को पिघलाएं।
    नोट: एक 3 एमएल एलिकोट दो नमूनों के लिए पर्याप्त है और एक 4 एमएल एलिकोट तीन नमूनों के लिए पर्याप्त है।
  2. चरण 7.7 में प्राप्त क्रमबद्ध हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं की गणना करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के बाद, प्रत्येक मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित मध्यम एलिकोट में जोड़ने के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं की मात्रा की गणना करें ताकि प्रत्येक नमूने में न्यूनतम 1,000 हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाएं हों।
    नोट: कोशिकाओं की संख्या को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है।
  4. मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित मध्यम एलिकोट और भंवर में कोशिकाओं की गणना की मात्रा को अच्छी तरह से जोड़ें। मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित मध्यम संस्कृतियों को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें, या जब तक बुलबुले न फैल जाएं।
  5. तैयार 35 मिमी व्यंजनों से फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, प्रति 35 मिमी डिश में 1 एमएल मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित मध्यम संस्कृति वितरित करें। संस्कृति को समान रूप से वितरित करने के लिए धीरे से पकवान को घुमाएं।
  6. इन 35 मिमी व्यंजनों को रखें, साथ ही बाँझ पानी से भरे दो अतिरिक्त 35 मिमी व्यंजन, 15 सेमी ऊतक संवर्धन पकवान के भीतर रखें।
  7. संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें, और 8 और 14 दिनों में संस्कृतियों का निरीक्षण करें।
    1. दिन 8 पर, सीएफयू-ई और बीएफयू-ई कॉलोनियों की गिनती करें।
    2. 14 वें दिन, सीएफयू-जीएम और सीएफयू-जीईएमएम कॉलोनियों की गिनती करें।
      नोट: कॉलोनी प्रकारों की रूपात्मक पहचान के लिए मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित मध्यम मैनुअल देखें।

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Representative Results

एचईएससी से आदिम ईसी और हेमोजेनिक ईसी के विनिर्देश को रेखांकित करने वाला एक योजनाबद्ध, और चढ़ाना के 24 घंटे बाद कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि छवि चित्र 1 में दिखाई गई है। विनिर्देश के बाद, प्राइमर्डियल ईसी और हेमोजेनिक ईसी को क्रमशः 5 और 8 दिनों में एफएसीएस शुद्ध किया जाता है। आदिम ईसी को सीडी 31 + सीडी 45 के रूप में परिभाषित किया गया है- और हेमोजेनिक ईसी को सीडी 31 + केडीआर + सी-किट + सीडी 34 + वीई-कैडरिन- सीडी 45 के रूप में परिभाषित किया गया है। आदिम ईसी और हेमोजेनिक ईसी शुद्धिकरण के लिए एक प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक गेटिंग रणनीति चित्रा 2 में दिखाया गया है। कोशिकाओं को शुरू में सीडी 45 की नकारात्मक अभिव्यक्ति और सीडी 31 की सकारात्मक अभिव्यक्ति के आधार पर शुद्ध आदिम ईसी (चित्रा 2 ए) प्राप्त करने के लिए गेट किया जाता है। शुद्ध हेमोजेनिक ईसी प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को शुरू में चित्रा 2 ए के रूप में गेट किया जाता है और फिर वीई-कैडरिन (सीडीएच 5), सी-किट (केआईटी), सीडी 34 और केडीआर (चित्रा 2 बी) की सकारात्मक या नकारात्मक अभिव्यक्ति के आधार पर आगे शुद्ध किया जाता है।

एच9-फुची-एचईएस-व्युत्पन्न प्राइमर्डियल सीडी 31+ सीडी 45- एंडोथेलियल कोशिकाओं की क्षमता का आकलन करने के लिए, जो विभेदन के दिन 5 (प्रोटोकॉल सेक्शन 4) में एफएसीएस के माध्यम से पृथक होते हैं, एंडोथेलियल उपप्रकारों को जन्म देने के लिए, शुद्ध कोशिकाओं को धमनी विनिर्देश, या पीबीएस (नियंत्रण) को प्रेरित करने के लिए या तो नॉच लिगैंड डीएलएल 4 के साथ लेपित प्लेटों पर बीज दिया जाता है, और 37 डिग्री सेल्सियस में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। 5% सीओ2 इनक्यूबेटर। कोशिकाओं को फिर आरएनए लाइसिस बफर, आरएनए निकाले गए और सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट किया जाता है, और डीएलएल 4-उपचारित बनाम नियंत्रण कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना करने के लिए क्यूपीसीआर किया जाता है। जैसा कि अपेक्षित था, डीएलएल 4 पर विकसित एंडोथेलियल कोशिकाओं ने नॉच-उत्तरदायी जीन एचईवाई 2 की अभिव्यक्ति में वृद्धि की है, साथ ही धमनी से जुड़े जीन ईएफएनबी 2, जीजेए 5 और जीजेए 4 भी हैं। इसके अतिरिक्त, इन कोशिकाओं ने शिरापरक प्रतिलेखन कारक एनआर 2 एफ 2 (चित्रा 3 ए) की अभिव्यक्ति को भी कम कर दिया है। वैकल्पिक रूप से, सेल चक्र स्थिति पर डीएलएल 4 उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, एफएसीएस शुद्ध सीडी 31 + सीडी 45- कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए डीएलएल 4 या पीबीएस के साथ लेपित प्लेटों पर इनक्यूबेट किया जाता है, उठाया जाता है, और एचडीटीटी 1 (30/120)-एमचेरी (देर से जी 1) और एचजीईएम (1/110)-एमवेनस (एस / जी 2 / एम) की अभिव्यक्ति के आधार पर विश्लेषण किया जाता है। इस निष्कर्ष के अनुरूप कि नॉच सिग्नलिंग देर से जी 1 सेल चक्र गिरफ्तारी27 को बढ़ावा देता है, नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में डीएलएल 4 की उपस्थिति में वृद्धि के बाद जी 1 के अंत में आदिम ईसी का अधिक प्रतिशत गिरफ्तार किया जाता है (चित्रा 3 बी, सी)।

हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं की हेमटोपोइएटिक क्षमता को सत्यापित करने के लिए, सीडी 31 + केडीआर + सी-किट + सीडी 34 + वीई-कैडरिन- सीडी 45- एंडोथेलियल कोशिकाओं को एफएसीएस (खंड 7 में विधियां) के माध्यम से अलग किया जाता है, जिन्हें कॉलोनी बनाने वाली इकाई (सीएफयू) में हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं के विकास के लिए तैयार मिथाइलसेल्यूलोज-आधारित माध्यम में बीज दिया जाता है और 14 दिनों तक बढ़ने की अनुमति दी जाती है। सीएफयू-ई एरिथ्रोइड कॉलोनियों और ब्लास्ट-फॉर्मिंग यूनिट (बीएफयू)-ई एरिथ्रोइड कॉलोनियों को दिन 8 (चित्रा 4 ए, बी) पर गिना जाता है, और सीएफयू-जीएम ग्रैनुलोसाइट / मैक्रोफेज और जीएफयू-जीईएमएम (ग्रैनुलोसाइट, एरिथ्रोइड, मैक्रोफेज और मेगाकैरियोसाइट) मल्टीपोटेंट हेमटोपोइएटिक पूर्वज कॉलोनियों को 14 वें दिन गिना जाता है (चित्रा 4 सी और डी)। प्रति 1,000 हेमोजेनिक ईसी चढ़ाए गए, लगभग 20 सीएफयू उत्पन्न होते हैं (चित्रा 4 एफ)। एंडोथेलियल सेल आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं को संस्कृतियों में भी देखा जा सकता है (चित्रा 4 ई); ये हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाएं हैं जो एकल कोशिका स्तर37 पर बहु-वंश हेमटोपोइएटिक पूर्वजों को जन्म देती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: आदिम और हेमोजेनिक ईसी के विनिर्देश के लिए प्रोटोकॉल(ए) भेदभाव प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध आरेख। भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित प्लेटों पर दिन -1 पर चढ़ाया जाता है और रात भर संलग्न करने की अनुमति दी जाती है। कोशिकाओं को क्रमशः आदिम लकीर और मेसोडर्म विनिर्देश को प्रेरित करने के लिए क्रमशः जीएसके 3 आई अवरोधक (सीएचआईआर 99021) और बीएफजीएफ के साथ दिन 0 और 1 पर इलाज किया जाता है। दिन 2 से शुरू होकर, कोशिकाओं को आदिम ईसी विकास को बढ़ावा देने के लिए बीएमपी 4 और वीईजीएफ-ए के संयोजन के साथ इलाज किया जाता है। प्राइमर्डियल ईसी (लाल सर्कल) को एफएसीएस को 5 वें दिन शुद्ध किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, हेमोजेनिक ईसी उत्पन्न करने के लिए, प्राइमर्डियल ईसी के ऊपर के माध्यम को बीएमपी 4, वीईजीएफ-ए और आरए युक्त ताजा हेमोजेनिक भेदभाव माध्यम में दिन 5 पर आदान-प्रदान किया जाता है। इस माध्यम को 8 वें दिन तक दैनिक रूप से प्रतिस्थापित किया जाता है, जब हेमोजेनिक ईसी (लाल तारा) को एफएसीएस शुद्ध किया जाता है। (बी) विभेदन के दिन 0 पर कॉलोनियां, स्केल बार = 100 μm। पैनल ए को एल्सेवियर की अनुमति से किउ एट अल .37 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एचईएससी से प्राप्त हेमोजेनिक ईसी का एफएसीएस विश्लेषण। (ए) आदिम ईसी और (बी) हेमोजेनिक ईसी के शुद्धिकरण के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक गेटिंग रणनीति। ध्यान दें कि चूंकि हेमोजेनिक ईसी आदिम ईसी से प्राप्त होते हैं, इसलिए सीडी 45 और सीडी 31 के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति दोनों सेल आबादी के लिए समान है। प्रत्येक पैनल (नमूना) की शीर्ष पंक्ति में दिखाए गए कोशिकाएं ऐसी कोशिकाएं हैं जिन्हें प्रोटोकॉल अनुभाग 6 में वर्णित हेमोजेनिक ईसी से विभेदित किया गया था और प्रोटोकॉल अनुभाग 7.3.8 में वर्णित एंटीबॉडी से सना हुआ था। प्रत्येक पैनल (नियंत्रण) की निचली पंक्ति में दिखाए गए बिना दाग वाली कोशिकाएं हैं जिन्हें आरए उपचार के बिना 8 दिनों तक विभेदित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: DLL4-H9-Fucci CD31+ CD45- प्राइमर्डियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रेरण के परिणामस्वरूप देर से G1 गिरफ्तारी और धमनी जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है। (A) CD31+ CD45- H9-hESC- व्युत्पन्न आदिम एंडोथेलियल कोशिकाओं के DLL4 उपचार के परिणामस्वरूप विभेदन के दिन 5 में शुद्ध फुकी निर्माण को व्यक्त करने वाले धमनी जीन (i-iii) और नॉच उत्तरदायी जीन Hey2 (v) की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है। जो शिरापरक जीन NR2F2 (iv) की अभिव्यक्ति में सहवर्ती कमी के साथ होता है। (बी) प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट 5,000 एच 9-फुची-व्युत्पन्न सीडी 31 + सीडी 45 के सेल चक्र राज्य वितरण को दर्शाते हैं- 24 घंटे के लिए पीबीएस (नियंत्रण) या डीएलएल 4 पर उगाया जाता है। डेटा पैनल (बी) में दिखाए गए एक ही प्रयोग से तीन प्रतियों के नमूनों का औसत है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एचईएससी से प्राप्त हेमोजेनिक ईसी की हेमटोपोइएटिक क्षमता का विश्लेषण। एच1-एचईएससी व्युत्पन्न (ए) सीएफयू-ई एरिथ्रोइड कॉलोनी (स्केल बार = 35 μm), (B) BFU-E एरिथ्रोइड कॉलोनी (स्केल बार = 75 μm), (C) CFU-GM ग्रैनुलोसाइट्स/ मैक्रोफेज कॉलोनी, (D) CFU-GEMM मल्टीपोटेंट हेमटोपोइएटिक पूर्वज कॉलोनी, और (E) अंतर्निहित एंडोथेलियल कोशिकाओं (EC) (लाल तीर) के साथ CFU-GM ग्रैनुलोसाइट / मैक्रोफेज कॉलोनी की आकृति विज्ञान दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां। (एफ) प्रति 1,000 प्लेटेड हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं में गठित सीएफयू की संख्या और वितरण। स्केल बार = 100 μm in (C-E)। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके विभेदित सीएफयू की अतिरिक्त छवियां किउ एट अल .37 में पाई जा सकती हैं। पैनल एफ को एल्सेवियर की अनुमति से किउ एट अल.37 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नाम आगे उल्टा
EFNB2 TATGCAGAACTGCGATTTCCAA TGGGTATagTAGACCTCCTTGTC
EPHB4 CGCACCTACGAAGTGTGTGA GTCCGCATCGCTCATAGTA
GJA5 CCGTGGTAGGCAAGGTCTG ATCACACCGGAAATCAGCCTG
GJA4 ACACCCACCCTGGTCTAC CACTGGCGACATAGGTGCC
HEY2 GCCCCCTTGTCAGTATC CCAGGGGGTAAGGTTTTG
NR2F2 GGACCACACGGATCTTCCAA ACATCAGACACACAGGCAT

तालिका 1: QPCR प्राइमर जानकारी

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Discussion

इसमें, एक मुराइन फीडर- और सीरम-मुक्त 2 डी संस्कृति प्रणाली (चित्रा 1) का उपयोग करके लगभग 1 सप्ताह में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के उत्पादन के चरणों को रेखांकित किया गया है। यह प्रोटोकॉल श्रीराम एट अल (2015) द्वारा वर्णित एक विधि पर विस्तारित है ताकि आदिम ईसी38 प्राप्त किया जा सके। सीडी 31 + सीडी 45- ईसी की मौलिक प्रकृति और विनिर्देश क्षमता डीएलएल 4-लेपित प्लेटों पर इन कोशिकाओं की खेती करके और धमनी विनिर्देश के अनुरूप जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का अवलोकन करके प्रदर्शित की जाती है (चित्रा 3)। इसके अतिरिक्त, धमनी पहचान का लाभ देर से जी 1 सेल चक्र गिरफ्तारी (चित्रा 3) से जुड़ा हुआ है, जो पिछलेअध्ययनों 27 के अनुरूप है। 0.5 μM RA, 25 ng/mL BMP4, और 50 ng/mL VEGF-A की उपस्थिति में अतिरिक्त 3 दिनों के लिए आदिम ईसी की खेती करने के बाद, हेमोजेनिक ईसी (चित्रा 2) को उत्पन्न करना और FACS-पृथक करना संभव था जो CFU-एरिथ्रोइड, BFU-एरिथ्रोइड, CFU-ग्रैनुलोसाइट/मैक्रोफेज, और CFU-ग्रैनुलोसाइट, एरिथ्रोसाइट, मैक्रोफेज और मेगाकैरियोसाइट कॉलोनियों को जन्म देने में सक्षम हैं। ). हाल ही में प्रकाशित एक अध्ययन में इस पद्धति का उपयोग करते हुए, प्लुरिपोटेंसी, आदिम लकीर और मेसोडर्म प्रेरण, एंडोथेलियल सेल पहचान के अधिग्रहण और अंत में हेमटोपोइएटिक पहचान के नुकसान के अनुरूप 8-दिवसीय समय अवधि में जीन अभिव्यक्तिपरिवर्तन देखा गया। इसके अलावा, आरए उपचार ने हेमोजेनिक ईसी विनिर्देश37 को सक्षम करने के लिए प्रारंभिक जी 1 सेल चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित किया।

हाल ही में, ओहटा एट अल (2019) ने एचपीएससी39 से हेमोजेनिक ईसी के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। हालांकि, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण फायदे प्रदान करता है: 1) इस विधि को स्फेरॉइड के गठन की आवश्यकता नहीं है; 2) यह प्रोटोकॉल हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर के बजाय एक मानक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर का उपयोग करता है, जिससे समर्पित विशेषता उपकरणों की आवश्यकता समाप्त हो जाती है; और 3) यह प्रोटोकॉल केवल एक माध्यम (पीएफएचएम के साथ पूरक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल भेदभाव माध्यम) का उपयोग करता है, एक लागत-बचत लाभ, जबकि ओहटा प्रोटोकॉल को प्रेरण के लिए दो माध्यमों की आवश्यकता होती है। (2017) द्वारा हाल ही में प्रकाशित एक अन्य अध्ययन ने एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया जिसमें सीडी 34 + हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं 40 की आबादी उत्पन्न करने के लिए सीएचआईआर99021 प्रेरण का उपयोग किया गया था। इन कोशिकाओं ने सीडी 31 को भी व्यक्त किया और अतिरिक्त साइटोकिन्स की उपस्थिति में क्रमशः ओपी 9 या ओपी 9-डीएलएल 4 कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन के बाद माइलॉयड और लिम्फोइड मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को मोनोलेयर स्थितियों या कोशिकाओं के तहत संवर्धित होने पर एंडोथेलियल कोशिकाओं को जन्म देने में सक्षम थे। अतिरिक्त सह-संस्कृति की आवश्यकता से मुराइन कोशिकाओं के साथ वांछित सेल आबादी का संभावित संदूषण हो सकता है। इसके अतिरिक्त, हालांकि ओहटा एट अल और गलाट एट अल ने एक हेमोजेनिक प्रेरण अवधि का उपयोग किया जो यहां वर्णित एक से कम था (क्रमशः 4 दिन और 5 दिन, बनाम 8 दिन), दोनों ने हेमोजेनिक ईसी को सीडी 34 + के रूप में परिभाषित किया, जबकि इस प्रोटोकॉल ने अधिक कठोर परिभाषा का उपयोग किया: सीडी 31 + केडीआर + सी-किट + सीडी 34 + वीई-कैडरिन- सीडी 45- . जबकि सीडी 34 को हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के मार्कर के रूप में पहचाना जाता है, यह अन्य गैर-हेमटोपोइएटिक सेल प्रकारों द्वारा भी व्यक्त किया जाता है, जैसे कि मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं और एंडोथेलियल कोशिकाएं41। इस प्रोटोकॉल में हेमोजेनिक ईसी की परिभाषा (सीडी 31 + केडीआर + सी-किट + सीडी 34 + वीई-कैडरिन- सीडी 45-) इसलिए अधिक कठोर है और अधिक परिभाषित आबादी का प्रतिनिधित्व करती है।

चिकित्सीय अनुप्रयोगों में एचईएससी या एचआईपीएससी के उपयोग की एक सीमा बड़ी संख्या में आवश्यक कोशिकाएं हैं, और मानक 2 डी व्युत्पत्ति विधियां मुख्य रूप से छोटे पैमाने पर भेदभाव तक सीमित हैं। (2018) ने कार्यात्मक सीडी 31 + ईसी के उत्पादन को बढ़ाने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया, जो निलंबन संस्कृति या एक हलचल-टैंक बायोरिएक्टर6 का उपयोग करके धमनी (डीएलएल 4) और शिरापरक (ईपीएचबी 4) सेल मार्करदोनों को व्यक्त करता है। महत्वपूर्ण रूप से, उन्होंने दिखाया कि वे 1.18 x 107 सीडी 31 + ईसी प्राप्त करने में सक्षम थे जो 20 एमएल निलंबन संस्कृति वाले एकल फ्लास्क से सीडी 34 और केडीआर को सह-व्यक्त करते हैं। चिकित्सीय अनुप्रयोगों के बहुमत के लिए आवश्यक आवश्यक 3 x 108 ईसी प्राप्त करने के लिए, केवल दो 500 एमएल फ्लास्ककी आवश्यकता होगी। भविष्य के प्रयोगों को हेमोजेनिक ईसी के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए स्केलिंग तकनीकों के अनुप्रयोग का पता लगाना चाहिए।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान एचएल 128064 और यू 2ईबी017103 द्वारा आंशिक रूप से समर्थित था। सीटी इनोवेशन 15-आरएमबी-येल-04 अनुदान द्वारा आगे सहायता प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 cm dishes Corning 430599 tissue culture treated
35 mm dishes Corning 430165 tissue culture treated
6-well plates Corning 3516 tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		 Invitrogen ant-nr-1
bFGF R&D systems 233-FB-025 use at 50 ng/mL
BMP4 BioLegend 595202 use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		 Stemcell Technologies 7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-100mL
Dispase Stemcell Technologies 7913
DLL4 R&D systems 1506-D4/CF recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		 Lonza CC-3162
FACS tubes Corning 352235 polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fibronectin ThermoFisher Scientific 33016015 use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021 Stemgent 04-0004-02 10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14175-095
Hydrochloric Acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		 Corning 356230 Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		 Stemcell Technologies 4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		 Stemcell Technologies 5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI WiCell WA09 (H9), WA01 (H1) human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) Gibco 12040077
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625-50mg use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		 BioRad 1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		 Qiagen 74104
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		 Stemcell Technologies 85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		 BioRad 1725121
Trypsin-EDTA Gibco 25299956 0.25%
VEGF165 (VEGF-A) PeproTech 100-20 use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC BioLegend 303104 2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue BioLegend 343512 2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7 BioLegend 304014 2 μg/mL*
α-c-Kit-APC BioLegend 313206 2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7 BioLegend 359911 2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE BioLegend 348506 2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

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References

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मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं का निर्देशित भेदभाव
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Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N.… More

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (169), e62391, doi:10.3791/62391 (2021).

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