Summary
Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.
Abstract
Os vasos sanguíneos são distribuídos de forma onipresente em todos os tecidos do corpo e desempenham diversas funções. Assim, a derivação de células endoteliais vasculares maduras, que revestem lúmens de vasos sanguíneos, a partir de células-tronco pluripotentes humanas é crucial para uma infinidade de aplicações de engenharia e regeneração de tecidos. In vivo, as células endoteliais primordiais são derivadas da linhagem mesodérmica e são especificadas para subtipos específicos, incluindo arteriais, venosas, capilares, hemogênicas e linfáticas. As células endoteliais hemogênicas são de particular interesse porque, durante o desenvolvimento, dão origem a células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, que geram todas as linhagens sanguíneas ao longo da vida. Assim, a criação de um sistema para gerar células endoteliais hemogênicas in vitro proporcionaria uma oportunidade para estudar a transição endotelial para hematopoiética e poderia levar à produção ex vivo de produtos sanguíneos humanos e à redução da dependência de doadores humanos. Embora existam vários protocolos para a derivação de células endoteliais progenitoras e primordiais, a geração de células endoteliais hemogênicas bem caracterizadas a partir de células-tronco humanas não foi descrita. Aqui, um método para a derivação de células endoteliais hemogênicas de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente 1 semana é apresentado: um protocolo de diferenciação com células estriadas primitivas formadas em resposta ao inibidor de GSK3β (CHIR99021), depois indução de linhagem mesodérmica mediada por bFGF, seguida de desenvolvimento de células endoteliais primordiais promovidas por BMP4 e VEGF-A e, finalmente, especificação de células endoteliais hemogênicas induzida por ácido retinóico. Este protocolo produz uma população bem definida de células endoteliais hemogênicas que podem ser usadas para entender melhor sua regulação molecular e transição endotelial-hematopoiética, que tem o potencial de ser aplicada a aplicações terapêuticas a jusante.
Introduction
As células endoteliais (CEs) são uma população heterogênea de células que desempenham múltiplas funções em todo o corpo humano e em tecidos modificados. Além de apoiar e regular outros tipos de células (ou seja, cardiomiócitos1, células osteoblásticas2), essas funções incluem a formação de uma barreira seletiva entre sangue e tecidos e auxiliam na formação de tecidos3. A diferenciação de CEs maduras durante o desenvolvimento normal requer diversas vias de sinalização. As CEs primordiais são derivadas de progenitores mesodérmicos e, em seguida, são especificadas para fenótipos arteriais, venosos, capilares e linfáticos maduros4. Além disso, um pequeno subconjunto de CEs no saco vitelino extraembrionário e na região embrionária da Aorta-Gônada-Mesonférfos (AGM) também é especificado para se tornar CEs hemogênicas, que dão origem a células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) que migram para o fígado fetal e a medula óssea fetal, onde permanecem no pós-natal e geram todos os tipos de células sanguíneas ao longo da vida4. A gama diversificada de fenótipos de CE é essencial para todo o desenvolvimento e manutenção dos tecidos.
Assim, as CEs e seus derivados são componentes críticos de estudos voltados para modelar e elucidar mecanismos de desenvolvimento humano e/ou doenças, bem como aplicações de medicina regenerativa e engenharia de tecidos 5,6,7,8. No entanto, a principal limitação para esses tipos de estudos é a falta de disponibilidade de CEs humanas primárias na quantidade necessária. Estima-se que um mínimo de 3 x 108 CEs seria necessário para a maioria das aplicações terapêuticas6. Para resolver esse problema, o uso de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) tem sido proposto devido ao seu potencial de linhagem diversificada e sua capacidade de gerar um grande número de progênies 6,9.
De fato, a utilidade de células derivadas de hESCs ou hiPSCs tem sido demonstrada em múltiplos estudos focados em modelagem de doenças e rastreamento de drogas10,11,12. A tecnologia Organ-on-a-Chip (OOC) tem sido usada para recapitular mais fielmente a fisiologia do corpo humano, integrando células e tecidos em andaimes tridimensionais. Além disso, a conexão de múltiplos OOCs individuais (o chamado corpo-ou-humano-em-um-chip, BOC/HOC) pode ser realizada via microfluídica para permitir o crosstalk entre os órgãos de interesse13,14,15. Tecidos de suporte, como a vasculatura, são componentes críticos de OOCs e BOC/HOCs; a incorporação de vasculatura permite o transporte de nutrientes, oxigênio e fatores parácrinos por todos os tecidos, promovendo assim o microambiente tecidual específico necessário 3,12. Assim, métodos para derivar CEs humanas maduras, como CEs arteriais, venosas, linfáticas e hemogênicas, são cruciais para o avanço dessas abordagens de engenharia de tecidos.
Vários protocolos foram publicados detalhando etapas para a derivação de ECs primordiais ou progenitoras humanas de hESCs ou hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Muitos desses protocolos dependem da formação de corpos embrionários (EB) ou co-cultura de ESCs/iPSCs com uma camada alimentadora murina de células estromais. Essas estratégias tendem a ser difíceis e demoradas, com baixos rendimentos de CE e/ou contaminação de CEs humanas com células murinas. Protocolos que dependem estritamente da cultura 2D sem o uso de células estromais geralmente requerem induções longas, utilizam combinações complexas de fatores de crescimento e / ou inibidores para indução, têm longos períodos de expansão após a separação celular ou uma combinação desses fatores. O avanço do conhecimento das vias de sinalização e dos fatores envolvidos na derivação de tipos maduros de CE in vivo fornece as bases para um protocolo de diferenciação in vitro simples e robusto.
Anteriormente, foram identificados papéis-chave para as vias de sinalização de Notch e Ácido Retinóico (AR) na especificação de CEs murinas e hemogênicas, respectivamente, durante o desenvolvimento. A via de sinalização Notch desempenha múltiplos papéis na especificação e manutenção do fenótipo arterial da CE. O trabalho utilizando o modelo de vascularização murina da retina identificou uma via na qual o estresse por cisalhamento de líquidos induz um eixo de sinalização Notch-Cx37-p27, promovendo a parada do ciclo celular G1, o que possibilita a especificação da CE arterial27. A hipótese de que os estados do ciclo celular desempenham um papel nas decisões de destino celular, fornecendo janelas de oportunidade distintas nas quais as células são receptivas a certos sinais que podem induzir a expressão gênica e mudanças fenotípicas28. Essa parada G1 mediada por Notch permitiu a expressão de genes enriquecidos em ECs arteriais, incluindo efrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 e Notch 4 (revisado em29,30). Também foi demonstrado que a especificação hemogênica da CE é promovida in vivo via sinalização daAR 31,32. Estudos adicionais identificaram que, a jusante da sinalização da AR, a expressão de c-Kit e Notch regulam a p27, o que possibilita a especificação hemogênica no saco vitelino murino e AGM33. As CEs hemogênicas murinas podem ser minimamente identificadas pela expressão de marcadores endoteliais (ou seja, CD31, KDR) e hematopoiéticos (ou seja, c-Kit, CD34)4. Por fim, as CEs hemogênicas passam por uma transição endotelial-hematopoiética (EHT) para a formação de HSPCs, o que pode dar origem a todos os tipos de células sanguíneas 4,34,35.
Trabalhos recentes testaram se essa mesma hierarquia de sinalização pode promover a especificação hemogênica humana da CE. Para tanto, foi desenvolvido um protocolo de cultura 2D sem soro e alimentador para derivar CEs hemogênicas de hESCs, e essas CEs hemogênicas foram caracterizadas em um único nível celular como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-. Este estudo também aproveitou o relator Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), que identifica diferentes estados do ciclo celular, utilizando H9-hESCs que expressam o construto repórter FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Em estudos com essas células, demonstrou-se que a AR promove a parada precoce do ciclo celular G1 nas CEs, e o estado G1 precoce permite a especificação hemogênica in vitro37. Neste documento, um protocolo detalhado para a diferenciação dessas células endoteliais hemogênicas humanas e ensaios confirmando sua identidade são fornecidos. Este método simples fornece um meio útil de gerar este subconjunto especializado de CEs para estudos futuros de mecanismos de desenvolvimento de células sanguíneas humanas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagentes e preparação de reagentes
NOTA: Uma lista de reagentes é fornecida na Tabela de Materiais.
- Obter as linhagens de células-tronco pluripotentes humanas: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
NOTA: A geração de CEs hemogênicas pode ser mais eficiente na linhagem celular H1. - Preparar estoques de proteína da matriz: Aliquotar a proteína da matriz em tubos pré-resfriados de 1,5 mL (no gelo) para que cada tubo contenha 1 mg de proteína da matriz. 1 mg de proteína da matriz é suficiente para revestir todos os poços de duas placas de 6 poços (12 poços no total). Conservar as alíquotas a -20 °C até à sua utilização.
NOTA: Execute todas as etapas que envolvem a proteína da matriz no gelo ou a 4 °C. Descongele o frasco para injetáveis congelado de proteína da matriz no gelo a 4 °C durante a noite. Uma vez descongelado, agite o frasco para injetáveis para garantir que o conteúdo está misturado. Pré-arrefecer tubos de microcentrífuga de 1,5 ml durante, pelo menos, 1 h a -20 °C e transferir para o gelo imediatamente antes da alíquota. - Preparar placas revestidas de proteína da matriz: Descongelar as alíquotas da proteína da matriz no gelo a 4 °C. Adicione 12,5 mL de DMEM:F12 gelado a um tubo cônico pré-resfriado sobre gelo. Utilizando pontas de pipeta pré-resfriadas, transfira uma alíquota (1 mg) de proteína da matriz para o tubo cônico e misture bem pipetando para cima e para baixo. Aliquot 1 mL da proteína da matriz diluída para cada poço de placas de 6 poços pré-resfriadas (em gelo) usando uma pipeta sorológica pré-resfriada. Gire e agite as placas para que todo o poço seja revestido uniformemente. Incubar as placas por um período mínimo de 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que a proteína da matriz se solidifique. Envolver as placas com parafilme e conservar a 4 °C até à utilização. Use placas revestidas de proteína da matriz dentro de 2 semanas após a preparação.
NOTA: Utilizar as placas de 6 poços revestidas de proteína da matriz para a passagem rotineira das células e diferenciação para células endoteliais primordiais e hemogênicas. Execute todas as etapas no gelo. Pré-refrigerar placas de 6 poços, pontas de pipeta, pipetas sorológicas e tubos cônicos antes do uso por pelo menos 1 h a -20 °C. Transfira esses itens para o gelo quando estiver pronto para uso. - Preparar o meio de diferenciação de base adicionando 5 mL de PFHM a 100 mL de meio pluripotente de diferenciação de células-tronco. Conservar a 4 °C.
- Preparar 0,1% de BSA-PBS dissolvendo 0,1 g de BSA em 100 mL de PBS. Filtrar esterilizar BSA-PBS passando por um filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.
- Preparar HCl 5 mM diluindo o estoque HCl (12 M) 1:2.400 com água. Ajuste o pH para 3,0 utilizando NaOH. Esterilizar a solução passando por um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C.
- Prepare os estoques de bFGF, BMP4, VEGF-A, ácido retinóico (RA) e DLL4.
- bFGF: Reconstituir o pó liofilizado a 100 μg/mL em BSA-PBS a 0,1%. Alíquota e conservar a -20 °C. Use estoques de bFGF dentro de 3 meses após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
- BMP4: Reconstituir o pó liofilizado para 1 mg/mL em HCl 5mM, pH 3,0. Diluir ainda mais para 50 μg/mL em BSA-PBS a 0,1%. Alíquota e conservar a -20 °C. Utilize as existências BMP4 no prazo de 3 meses após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
- VEGF-A: Reconstituir o pó liofilizado para 1 mg/mL em dH2O. Diluir ainda mais para 100 μg/mL em BSA-PBS a 0,1%. Alíquota e conservar a -20 °C. Use os estoques de VEGF-A dentro de 3 meses após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
- AR: Reconstituir o pó liofilizado a 100 mM em DMSO. Alíquota e conservar a -80 °C. Use os estoques de RA dentro de 1 mês após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
NOTA: Proteja os estoques de RA da luz. - DLL4: Reconstituir o pó liofilizado para 1 mg/mL em PBS. Alíquota e conservar a -20 °C. Use os estoques de DLL4 dentro de 12 meses após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
- Preparar o meio de diferenciação de células endoteliais imediatamente antes da utilização, diluindo VEGF-A e BMP4 em meio de diferenciação de base (passo 1.4) de modo a que as concentrações finais sejam de 25 ng/ml e 50 ng/ml, respetivamente.
- Preparar o RA de trabalho imediatamente antes da utilização, diluindo 100 mM de 1:1.000 em DMSO a 100 μM.
NOTA: Proteja o RA de trabalho da luz. - Preparar o meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas imediatamente antes do uso, diluindo VEGF-A, BMP4 e AR de trabalho em meio de diferenciação de base (etapa 1.4) de modo que as concentrações finais sejam de 25 ng/mL, 50 ng/mL e 0,5 μM, respectivamente.
- Prepare o tampão de coloração de anticorpos fazendo HBSS contendo 10% de FBS e complemente com 1:500 reagente antimicrobiano diluído. Filtro estéril do buffer e use imediatamente.
- Prepare o tampão de classificação celular fazendo HBSS contendo 1% de FBS e complemente com 1:500 reagente antimicrobiano diluído. Filtro estéril do buffer e use imediatamente.
- Prepare 1 mg/mL de estoques de fibronectina adicionando 5 mL de água estéril a 5 mg de fibronectina liofilizada. Alíquota e conservar a -20 °C. Use os estoques de fibronectina antes do prazo de validade no rótulo do produto liofilizado. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
- Prepare os pratos de 35 mm revestidos de fibronectina. Diluir os estoques de fibronectina (1 mg/mL) a 4 μg/mL em água estéril. Adicionar 1 ml desta solução de revestimento de fibronectina a cada prato e incubar a 37 °C durante 30 min a 1 h. Use os pratos imediatamente após o revestimento.
- Prepare alíquotas de 3 ou 4 mL de meio à base de metilcelulose seguindo as instruções do fabricante. Conservar as alíquotas a -20 °C até à sua utilização. Utilizar as alíquotas do meio à base de metilcelulose antes do prazo de validade indicado no rótulo do produto de reserva. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
- Preparar a solução de revestimento DLL4 diluindo o stock de DLL4 humano recombinante até uma concentração final de 10 μg/ml em PBS.
- Preparar e armazenar o meio de crescimento de células endoteliais de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare o tampão de análise de citometria de fluxo fazendo PBS contendo 0,1% de BSA. Filtrar o tampão estéril e conservar a 4 °C até à sua utilização.
2. Cultura celular e passagem de hESCs
- Permita que as placas revestidas de proteína da matriz, o meio de crescimento de células-tronco e o DMEM:F12 aqueçam até a temperatura ambiente.
- Cultivar as linhagens celulares hESC em meio de crescimento de células-tronco (2 mL/poço) em placas de 6 poços revestidas de proteína da matriz em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5%.
- Verifique as células diariamente e remova as células diferenciadas conforme necessário, raspando-as suavemente da placa usando uma ponta de pipeta p200.
NOTA: Células diferenciadas aparecerão na periferia das colônias. Consulte o manual do produto do meio de crescimento de células-tronco para obter exemplos de células diferenciadas em cultura. - Passe as células uma vez que atinjam 70% -80% de confluência. Para passar células, execute as etapas a seguir.
NOTA: As células devem ser divididas antes de atingir 70%-80% de confluência se ocorrer aumento da diferenciação.- Retire o meio acima das células e lave suavemente com 1 mL de DMEM:F12 por poço.
- Adicione 1 mL de DMEM:F12 por poço.
- Adicionar 160 μL/mL de Dispase por poço e incubar as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% por 45 min.
- Após a incubação Dispase, adicione mais 1 mL de DMEM:F12 por poço e pipete suavemente para levantar as células.
NOTA: Evite dissociar as células em uma suspensão de célula única. Passe as células como pequenos aglomerados. - Transfira as células para um tubo cônico contendo 12 mL de DMEM:F12 e permita que as células se depositem por gravidade (~5-10 min).
- Remova o sobrenadante e ressuscite suavemente o pellet em 0,5 mL de meio de crescimento de células-tronco por poço de células levantadas para obter pequenos aglomerados de células.
NOTA: Evite dissociar as células em uma suspensão de célula única. Passe as células como pequenos aglomerados. - Aspirar a solução de revestimento de proteína da matriz dos poços da placa revestida de proteína da matriz preparada e adicionar 1,5 mL do meio de crescimento de células-tronco por poço.
- Adicionar o volume desejado de células ressuspensas (etapa 2.4.6) a cada alvéolo da placa revestida de proteínas da matriz preparada.
- Incubar a placa numa incubadora de 37 °C, 5% de CO2 . Mude o meio a cada 24 h para o meio de crescimento de células-tronco frescas.
3. Diferenciação de hESCs em células endoteliais primordiais
- Dia -1: Cultura e passagem das células conforme descrito acima na seção 2. Semeia as células (passo 2.4.6) em pequenos aglomerados (~50 μm) a uma densidade de aproximadamente 2 aglomerados por centímetro quadrado38.
NOTA: Avalie a densidade da semente e refine empiricamente, se necessário. - Dia 0: 24 h após a semeadura das células, aspirar o meio de cada poço e lavar suavemente as células com 1 mL de DMEM:F12 por poço. Adicionar 1 mL do meio de diferenciação de base contendo 5 μM GSK3i (CHIR99021, adicionado fresco) a cada poço e incubar por 24 h (37 °C, 5% CO2).
NOTA: Para todas as etapas de lavagem, adicione lentamente o meio de lavagem indicado à placa pipetando contra a parede do poço da placa. Gire suavemente a placa de modo que toda a superfície do poço seja coberta por meios de lavagem. Incline ligeiramente a placa de modo a que o meio de lavagem se acumule na posição das seis horas e aspirar cuidadosamente o meio de lavagem. - Dia 1: Aspirar o meio de cada poço e lavar suavemente as células com 1 mL de DMEM:F12 por poço. Adicionar 1 mL do meio de diferenciação de base contendo 50 ng/mL de bFGF (adicionado fresco, 1:2.000 de estoque congelado) a cada poço e incubar 24 h (37 °C, 5% de CO2).
- Dia 2: Aspirar o meio de cada poço e lavar suavemente as células com 1 mL de DMEM:F12 por poço. Adicionar 1 mL do meio de diferenciação de células endoteliais a cada poço e incubar 24 h (37 °C, 5% de CO2).
- Dia 3: Substitua o meio acima das células por 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais recém-preparado por poço e incube 24 h (37 °C, 5% CO2).
- Dia 4: Substitua o meio acima das células por 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais recém-preparado por poço e incube 24 h (37 °C, 5% CO2).
- Dia 5: FACS purificar as células para avaliar o fenótipo CE (secções 4-5) ou manter em cultura e diferenciar para células endoteliais hemogénicas (secção 6).
4. Purificação FACS de células endoteliais primordiais
- Aspirar o meio acima das células e lavar suavemente uma vez com 1 mL de DMEM:F12 por poço.
- Adicionar 1 ml de solução de descolamento celular por alvéolo e incubar as células durante 12 min numa incubadora de CO2 a 37 °C, a 5%, ou até que as células se dissociassem.
- Transferir as células dissociadas para um tubo cônico contendo 12 mL de DMEM:F12 e pellet por centrifugação por 5 min, 1.000 x g.
- Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 12 mL de DMEM:F12 para lavar.
- Pellet as células por centrifugação por 5 min, 1.000 x g.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em tampão de coloração de anticorpos gelados e conte as células. Ajustar a concentração utilizando tampão de coloração de anticorpos gelados para 1 x 105 células/ml.
- Divida as células uniformemente em tubos de microcentrífuga sobre gelo, cada um contendo um mínimo de 600 μL de células a 1 x 105 células/mL, para coloração de anticorpos.
NOTA: Quatro tubos de células são necessários para a coloração de CEs primordiais: controle não corado, controle de anticorpos únicos CD31, controle de anticorpos únicos CD45 e amostra contendo anticorpos CD31 e CD45. Informações sobre anticorpos são fornecidas na Tabela de Materiais. - Adicione anticorpos aos tubos que contêm células, conforme apropriado, e incube no gelo e protegido da luz por 30 min.
- Controle não corado: Não adicione nenhum anticorpo.
- Controle de anticorpos CD31 únicos: Adicione apenas o anticorpo CD31.
- Controle de anticorpos CD45 únicos: Adicione apenas o anticorpo CD45.
- Amostra: Adicione anticorpos CD31 e CD45.
NOTA: A concentração final de anticorpos na amostra, bem como os conjugados fluorescentes, devem ser otimizados com base nos anticorpos específicos e no classificador celular usado.
- Pellet as células por centrifugação numa microcentrífuga de mesa de 4 °C durante 5 min a 1.000 x g.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets de células em 600 μL de tampão de classificação gelado.
- Coe as amostras através das tampas de filtro de malha de tubos FACS de 5 mL e armazene as células no gelo, protegidas da luz, para FACS imediato.
- Obtenha células endoteliais primordiais (CD31+ CD45-), executando as seguintes etapas.
- Identifique a população e a porta de células CD45-negativas (CD45-).
- Dentro de (CD45-), identifique a população de células CD31-positivas (CD31+) e classifique as células em 6 mL de tampão de classificação de células geladas. Utilize estas células para aplicações a jusante (ver secção 5).
5. Ensaio para confirmar o fenótipo de células endoteliais primordiais
- Revestir três poços de uma placa de 6 poços com solução de revestimento DLL4 de 1 mL/poço por 30 min em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5%. Como controle, simular os outros três poços da placa com 1 mL/poço PBS.
- Aspirar a solução de revestimento DLL4 e PBS e chapear 25.000 células endoteliais primordiais classificadas (ver etapa 4.12) em 2 mL de meio de crescimento de células endoteliais por poço.
- Incubar as células por 24 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 .
- Aspirar o meio acima das células e lavar uma vez com 2 mL/poço PBS. Analise as células por qPCR ou citometria de fluxo (para células que expressam o construto FUCCI).
- Para analisar as células por qPCR, execute as etapas a seguir.
- Aspirar o líquido acima das células e isolar o RNA nas células usando um kit de extração de RNA de acordo com o protocolo do fabricante.
- Realize reações de transcrição reversa com uma mistura mestre de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante.
- Realize reações de qPCR com uma master mix SYBR Green de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: Os primers utilizados (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) estão listados na Tabela 1.
- Para analisar as células que expressam o construto FUCCI por citometria de fluxo, execute as etapas a seguir.
- Aspirar o líquido acima das células e adicionar 500 μL/poço 0,25% de tripsina-EDTA.
- Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% até serem levantadas, ~5 min.
- Transfira as células para um tubo de microcentrífuga e coloque as células em uma microcentrífuga de 4 °C por 5 min a 1.000 x g.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de tampão de análise de citometria de fluxo gelado.
- Coe as amostras através da tampa do filtro de malha de um tubo FACS de 5 mL e armazene as células no gelo, protegidas da luz, para análise imediata da citometria de fluxo.
- Analise a porcentagem de células banhadas no DLL4 vs. controle PBS no início do G1 (sem cor), G1 tardio (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) e S/G2/M (mCherry-/mVenus+).
- Para analisar as células por qPCR, execute as etapas a seguir.
6. Diferenciação de hESCs em células endoteliais hemogênicas
NOTA: Diferenciar as células das CEs primordiais do dia 4, conforme descrito acima nas seções 3.1-3.6.
- Dia 5: Aspirar o meio acima das células e lavar suavemente as células com 1 mL de DMEM:F12 por poço. Adicionar 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incubar 24 h (37 °C, 5% de CO2).
- Dia 6: Substitua o meio acima das células por 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incube 24 h (37 °C, 5% de CO2).
- Dia 7: Substitua o meio acima das células por 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incube 24 h (37 °C, 5% CO2).
- Dia 8: FACS isola células endoteliais hemogénicas (ver secção 7).
7. FACS-isolamento de células endoteliais hemogênicas
- Levantar e lavar as células conforme descrito acima nas secções 4.1-4.6.
- Divida as células uniformemente em tubos de microcentrífuga sobre gelo, cada um contendo um mínimo de 600 μL de células a 1 x 105 células/mL, para coloração de anticorpos.
NOTA: Oito tubos de células são necessários para a coloração de anticorpos de CEs hemogênicas: controle não corado, controle de anticorpos únicos CD31, controle de anticorpos únicos CD45, controle de anticorpos únicos KDR, controle de anticorpos únicos c-Kit, controle de anticorpos únicos CD34, controle de anticorpos únicos VE-caderina e amostra contendo todos os seis anticorpos.
NOTA: As informações sobre anticorpos são fornecidas na Tabela de Materiais. - Adicione anticorpos aos tubos que contêm células, conforme apropriado, e incube no gelo e protegido da luz por 30 min.
- Controle não corado: Não adicione anticorpos.
- Controle de anticorpos CD31 únicos: Adicione apenas o anticorpo CD31.
- Controle de anticorpos CD45 únicos: Adicione apenas o anticorpo CD45.
- Controle de anticorpos únicos KDR: Adicione apenas anticorpos KDR.
- Controle de anticorpos únicos c-Kit: Adicione apenas o anticorpo c-Kit.
- Controle de anticorpos CD34 únicos: Adicione apenas anticorpos CD34.
- Controle de anticorpos únicos de VE-caderina: Adicione apenas o anticorpo VE-caderina.
- Amostra: Adicione anticorpos CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 e VE-caderina.
NOTA: A concentração final de anticorpos na amostra, bem como os conjugados fluorescentes, devem ser otimizados com base nos anticorpos específicos e no classificador celular usado.
- Pellet as células por centrifugação numa microcentrífuga a 4 °C durante 5 min a 1.000 x g.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 600 μL de tampão de triagem gelado.
- Coe as amostras através da tampa do filtro de malha de tubos FACS de 5 mL e armazene as células no gelo, protegidas da luz, para FACS imediato.
- Para obter células endoteliais hemogênicas (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Caderina-CD45-), execute as seguintes etapas.
- Identifique a população e a porta de células CD45- (CD45-).
- Dentro (CD45-), identifique a população de células CD31+ e a porta (CD31+).
- Dentro (CD31+), identifique a população de células VE-Caderrina e o portão (CDH5-).
- Dentro de (CDH5-), identifique a população de células c-Kit+ e o gate (KIT+).
- Dentro (KIT+), identifique a população de células CD34+ e a porta (CD34+).
- Dentro (CD34+), identifique e classifique as células KDR+ em 6 mL de tampão de classificação de células geladas. Utilize estas células em aplicações a jusante (ver secção 8).
8. Ensaio da unidade formadora de colônias
- Descongele as alíquotas do meio à base de metilcelulose seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: Uma alíquota de 3 mL é suficiente para duas amostras e uma alíquota de 4 mL é suficiente para três amostras. - Contar as células endoteliais hemogênicas classificadas obtidas na etapa 7.7.
- Seguindo as instruções do fabricante, calcule o volume de células classificadas para adicionar a cada alíquota de meio à base de metilcelulose, de modo que cada amostra contenha um mínimo de 1.000 células endoteliais hemogênicas.
Observação : O número de células pode ser ajustado conforme necessário. - Adicione o volume calculado de células à alíquota do meio à base de metilcelulose e ao vórtice completamente. Permita que as culturas de meio à base de metilcelulose permaneçam à temperatura ambiente por 10 minutos ou até que as bolhas se dissipem.
- Aspirar a solução de revestimento de fibronectina das placas preparadas de 35 mm. Seguindo as instruções do fabricante, dispense 1 mL de cultura de meio à base de metilcelulose por prato de 35 mm. Gire suavemente o prato para distribuir uniformemente a cultura.
- Coloque estes pratos de 35 mm, bem como dois pratos adicionais de 35 mm cheios de água estéril, dentro de um prato de cultura de tecidos de 15 cm.
- Incubar as culturas em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e observar as culturas nos dias 8 e 14.
- No dia 8, conte as colônias CFU-E e BFU-E.
- No dia 14, conte as colônias CFU-GM e CFU-GEMM.
NOTA: Consulte o manual de meios à base de metilcelulose para identificação morfológica de tipos de colônias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um esquema delineando a especificação de CEs primordiais e CEs hemogênicas de hESCs e uma imagem representativa das células 24 h após o revestimento são mostradas na Figura 1. Seguindo a especificação, CEs primordiais e CEs hemogênicas são FACS purificadas nos dias 5 e 8, respectivamente. As CEs primordiais são definidas como CD31+ CD45- e as CEs hemogênicas são definidas como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-. Uma estratégia de bloqueio citométrico de fluxo representativa para CEs primordiais e purificação hemogênica da CE é mostrada na Figura 2. As células são inicialmente fechadas com base na expressão negativa de CD45 e expressão positiva de CD31 para obtenção de CEs primordiais purificadas (Figura 2A). Para obter CEs hemogênicas purificadas, as células são inicialmente fechadas como na Figura 2A e, em seguida, são purificadas com base na expressão positiva ou negativa de (em ordem) VE-Caderina (CDH5), c-Kit (KIT), CD34 e KDR (Figura 2B).
Para avaliar o potencial das células endoteliais CD31+ CD45- primordiais derivadas de H9-Fucci-hES, isoladas via FACS no dia 5 de diferenciação (seção 4 do protocolo), para dar origem a subtipos endoteliais, as células purificadas são semeadas em placas revestidas com o ligante Notch DLL4 para induzir a especificação arterial, ou PBS (controle), e incubadas por 24 h a 37 °C, Incubadora de CO2 a 5%. As células são então lisadas com tampão de lise de RNA, o RNA extraído e transcrito reversamente para cDNA, e a qPCR é realizada para comparar os níveis de expressão gênica nas células tratadas com DLL4 versus as células de controle. Como esperado, as células endoteliais cultivadas em DLL4 aumentaram a expressão do gene responsivo a Notch HEY2, bem como dos genes associados à artéria EFNB2, GJA5 e GJA4. Além disso, essas células também apresentam expressão diminuída do fator de transcrição venosa NR2F2 (Figura 3A). Alternativamente, para determinar o efeito do tratamento com DLL4 no estado do ciclo celular, as células CD31+ CD45- purificadas pelo FACS são incubadas em placas revestidas com DLL4 ou PBS por 24 h, levantadas e analisadas com base na expressão de hCdt1(30/120)-mCherry (G1 tardio) e hGem(1/110)-mVenus (S/G2/M). Consistente com os achados de que a sinalização de Notch promove a parada tardia do ciclo celular G127, uma porcentagem maior de CEs primordiais é presa no G1 tardio após o crescimento na presença de DLL4, em comparação com as células de controle (Figura 3B,C).
Para verificar o potencial hematopoiético das células endoteliais hemogénicas, as células endoteliais CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Caderina-CD45- isoladas através de FACS (métodos na secção 7) são semeadas num meio à base de metilcelulose formulado para o crescimento de células progenitoras hematopoiéticas em ensaios de unidade formadora de colónias (UFC) e podem crescer durante 14 dias. As colônias eritróides da UFC-E e da unidade formadora de blastos (BFU)-E são contadas no dia 8 (Figura 4A,B), e as colônias multipotentes de granulócitos/macrófagos e GFU-GEMM (granulócitos, eritróides, macrófagos e megacariócitos) são contadas no dia 14 (Figura 4C e D). Por cada 1.000 CEs hemogênicas plaqueadas, aproximadamente 20 UFC são geradas (Figura 4F). Células com morfologia de células endoteliais também podem ser observadas nas culturas (Figura 4E); estas são as células endoteliais hemogênicas que dão origem a progenitores hematopoiéticos de várias linhagens em um único nível celular37.
Figura 1: Protocolo para a especificação de CEs primordiais e hemogênicas . (A) Diagrama esquemático do protocolo de diferenciação. As células-tronco embrionárias são banhadas no Dia -1 em placas revestidas de proteína da matriz e podem se fixar durante a noite. As células são então tratadas nos Dias 0 e 1 com inibidor de GSK3i (CHIR99021) e bFGF, respectivamente, para induzir a estria primitiva e a especificação mesodérmica, respectivamente. A partir do Dia 2, as células são tratadas com uma combinação de BMP4 e VEGF-A para promover o desenvolvimento primordial da CE. Os ECs primordiais (círculo vermelho) são FACS purificados no Dia 5. Alternativamente, para gerar CEs hemogênicas, o meio acima das CEs primordiais é trocado no Dia 5 por meio de diferenciação hemogênica fresco contendo BMP4, VEGF-A e AR. Este meio é substituído diariamente até o dia 8, quando as CEs hemogênicas (estrela vermelha) são purificadas pela FACS. (B) Colônias no Dia 0 de diferenciação, barra de escala= 100 μm. O painel A foi modificado de Qiu et al.37 com permissão da Elsevier. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise FACS de CEs hemogênicas derivadas de hESCs. Estratégia de gating citométrico de fluxo representativo para a purificação de CEs primordiais (A) e (B) CEs hemogênicas. Note-se que, uma vez que as CEs hemogênicas são derivadas de CEs primordiais, a estratégia de bloqueio por citometria de fluxo para CD45 e CD31 é idêntica para ambas as populações celulares. Na linha superior de cada painel (amostra) são mostradas células que foram diferenciadas para CEs hemogênicas, conforme descrito na seção 6 do protocolo, e coradas com anticorpos, conforme descrito na seção 7.3.8 do protocolo. Mostradas na linha inferior de cada painel (controle) estão as células não coradas que foram diferenciadas por 8 dias sem tratamento da AR. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A indução de DLL4 de células endoteliais primordiais H9-Fucci CD31+ CD45- resulta em parada G1 tardia e aumento da expressão gênica arterial. (A) O tratamento com DLL4 de células endoteliais primordiais derivadas de CD31+ CD45- H9-hESC expressando o construto Fucci purificado no dia 5 de diferenciação resulta em aumento da expressão de genes arteriais (i-iii) e do gene responsivo a Notch Hey2 (v), que é acompanhada por uma diminuição concomitante na expressão do gene venoso NR2F2 (iv). (B) Gráficos FACS representativos mostrando a distribuição do estado do ciclo celular de 5.000 CD31+ CD45- derivados de H9-Fucci cultivados em PBS (controle) ou DLL4 por 24 h. (C) A indução de DLL4 resulta em um aumento de 15% nas células na fase G1 tardia em comparação com o controle. Os dados são a média de amostras triplicadas do mesmo experimento mostrado no painel (B). As barras de erro indicam desvio padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise do potencial hematopoiético de CEs hemogênicas derivadas de hESCs. Imagens representativas mostrando a morfologia da colônia eritróide derivada de H1-hESC (A) UFC-E (barra de escala = 35 μm), (B) colônia eritróide BFU-E (barra de escala = 75 μm), (C) colônia de granulócitos/macrófagos CFU-GM, (D) colônia progenitora hematopoiética multipotente CFU-GEMM e (E) colônia de granulócitos/macrófagos CFU-GM com células endoteliais subjacentes (CEs) (setas vermelhas). (F) número e distribuição das UFCs formadas por 1.000 células endoteliais hemogênicas chapeadas. Barra de escala = 100 μm em (C-E). Imagens adicionais de UFCs diferenciadas por meio desse protocolo podem ser encontradas em Qiu et al.37. O painel F foi modificado de Qiu et al.37 com permissão da Elsevier. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Encaminhar | Inverter |
| EFNB2 | TATGCAGAACTGCGATTTCCAA | TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC |
| EPHB4 | CGCACCTACGAAGTGTGTGA | GTCCGCATCGCTCATAGTA |
| GJA5 | CCGTGGTAGGCAAGGTCTG | ATCACACCGGAAATCAGCCTG |
| GJA4 | ACACCCACCCTGGTCTAC | CACTGGCGACATAGGTGCC |
| HEY2 | GCCCGCCCTTGTCAGTATC | CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG |
| NR2F2 | GGACCACATACGGATCTTCCAA | ACATCAGACAGACCACAGGCAT |
Tabela 1: Informações do primer qPCR
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste documento, descrevem-se os passos para a produção de células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente 1 semana usando um sistema de cultura 2D livre de murino e soro (Figura 1). Esse protocolo expande um método descrito por Sriram et al. (2015) para obter CEs primordiais38. A natureza primordial e o potencial de especificação dos CD31+ CD45- ECs são demonstrados pela cultura dessas células em placas revestidas com DLL4 e pela observação de alterações na expressão gênica consistentes com a especificação arterial (Figura 3). Além disso, o ganho de identidade arterial está associado à parada tardia do ciclo celular G1 (Figura 3), o que é consistente com estudos anteriores27. Após a cultura de CEs primordiais por mais 3 dias na presença de 0,5 μM de AR, 25 ng/mL de BMP4 e 50 ng/mL VEGF-A, foi possível gerar e isolar CEs hemogênicas (Figura 2) capazes de dar origem a colônias de UFC-eritróide, BFU-eritróide, UFC-granulócito/macrófago e UFC-granulócito, eritrócito, macrófago e megacariócito (Figura 4 ). Usando esse método em um estudo publicado recentemente, foram observadas alterações na expressão gênica ao longo de um período de tempo de 8 dias, consistente com perda de pluripotência, estria primitiva e indução mesodérmica, aquisição de identidade de células endoteliais e, finalmente, identidade hematopoiética37. Além disso, o tratamento da AR induziu a parada precoce do ciclo celular G1 para permitir a especificação hemogênica da CE37.
Recentemente, Ohta et al. (2019) descreveram um protocolo para a diferenciação de CEs hemogênicas de hPSCs39. No entanto, o protocolo descrito acima oferece vantagens significativas: 1) este método não requer a formação de esferoides; 2) este protocolo utiliza uma incubadora padrão de 37 °C, 5% de CO2 em vez de uma incubadora hipóxica, eliminando a necessidade de equipamentos especiais dedicados; e 3) este protocolo utiliza apenas um meio (meio pluripotente de diferenciação de células-tronco suplementado com PFHM), uma vantagem de economia de custos, enquanto o protocolo Ohta requer dois meios para indução. Outro estudo recentemente publicado por Galat et al. (2017) descreveu um protocolo no qual a indução CHIR99021 foi utilizada para gerar uma população de células endoteliais hemogênicas CD34+ 40. Essas células também expressaram CD31 e foram capazes de dar origem a células endoteliais quando cultivadas em condições de monocamada ou células que expressam marcadores mieloides e linfoides após co-cultura com células OP9 ou OP9-DLL4, respectivamente, na presença de citocinas adicionais. A exigência de co-cultura adicional pode levar à contaminação potencial das populações celulares desejadas com células murinas. Além disso, embora Ohta et al. e Galat et al. tenham utilizado um período de indução hemogênica mais curto do que o descrito aqui (4 dias e 5 dias, respectivamente vs. 8 dias), ambos definiram CEs hemogênicas como CD34+, enquanto este protocolo utilizou uma definição mais rigorosa: CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Caderina- CD45- . Embora o CD34 seja reconhecido como um marcador de células hematopoiéticas, ele também é expresso por outros tipos de células não hematopoiéticas, como células estromais mesenquimais e células endoteliais41. A definição de CEs hemogênicas neste protocolo (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-) é, portanto, mais rigorosa e representa uma população mais definida.
Uma limitação ao uso de hESCs ou hiPSCs em aplicações terapêuticas é o grande número de células necessárias, e os métodos padrão de derivação 2D são restritos principalmente a diferenciações de pequena escala. Utilizando linhas de hiPSC, Olmer et al. (2018) demonstraram a viabilidade de aumentar a produção de CEs CD31+ funcionais que expressavam marcadores celulares arteriais (DLL4) e venosos (EPHB4) utilizando cultura de suspensão ou um biorreator de tanque agitado6. É importante ressaltar que eles mostraram que foram capazes de obter 1,18 x 107 CEs CD31+ que co-expressam CD34 e KDR a partir de um único frasco contendo 20 mL de cultura de suspensão. Para obter os 3 x 108 CEs necessários para a maioria das aplicações terapêuticas, seriam necessários pouco mais de dois frascos de 500 mL6. Experimentos futuros devem explorar a aplicação de técnicas de dimensionamento ao protocolo aqui apresentado para produção em larga escala de CEs hemogênicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
O autor não tem nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos subsídios do NIH HL128064 e U2EB017103. Mais apoio foi fornecido pela concessão CT Innovations 15-RMB-YALE-04.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
| 35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
| 6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
| Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
| FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 μg/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
| Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
| Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
| Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
| Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
| RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
| α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
| α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
| α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
| α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
| * Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |
References
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
- Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
- Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
- Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
- Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
- Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
- Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
- Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
- Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
- Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
- Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
- Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
- Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
- Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
- Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
- Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
- Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
- Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
- Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
- Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
- Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
- Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).
