Summary
Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.
Abstract
Bloedvaten zijn alomtegenwoordig verdeeld in alle weefsels van het lichaam en vervullen verschillende functies. Dus, afleiding van volwassen vasculaire endotheelcellen, die bloedvatlumen bekleden, van menselijke pluripotente stamcellen is cruciaal voor een veelheid aan weefselmanipulatie- en regeneratietoepassingen. In vivo zijn primordiale endotheelcellen afgeleid van de mesodermale afstamming en worden gespecificeerd voor specifieke subtypen, waaronder arteriële, veneuze, capillaire, hemogene en lymfatische. Hemogene endotheelcellen zijn van bijzonder belang omdat ze tijdens de ontwikkeling aanleiding geven tot hematopoëtische stam- en voorlopercellen, die vervolgens alle bloedlijnen gedurende het hele leven genereren. Het creëren van een systeem om hemogene endotheelcellen in vitro te genereren, zou dus een mogelijkheid bieden om de endotheel-naar-hematopoietische overgang te bestuderen, en kan leiden tot ex vivo productie van menselijke bloedproducten en verminderde afhankelijkheid van menselijke donoren. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de afleiding van voorloper- en primordiale endotheelcellen, is de generatie van goed gekarakteriseerde hemogene endotheelcellen uit menselijke stamcellen niet beschreven. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de afleiding van hemogene endotheelcellen uit menselijke embryonale stamcellen in ongeveer 1 week: een differentiatieprotocol met primitieve streakcellen gevormd als reactie op GSK3β-remmer (CHIR99021), vervolgens mesoderm-afstammingsinductie gemedieerd door bFGF, gevolgd door primordiale endotheelcelontwikkeling bevorderd door BMP4 en VEGF-A, en ten slotte hemogene endotheelcelspecificatie geïnduceerd door retinoïnezuur. Dit protocol levert een goed gedefinieerde populatie van hemogene endotheelcellen op die kunnen worden gebruikt om hun moleculaire regulatie en endotheel-naar-hematopoietische overgang verder te begrijpen, wat het potentieel heeft om te worden toegepast op downstream therapeutische toepassingen.
Introduction
Endotheelcellen (EC's) zijn een heterogene populatie van cellen die meerdere functies vervullen in het menselijk lichaam en in gemanipuleerde weefsels. Naast het ondersteunen en reguleren van andere celtypen (d.w.z. cardiomyocyten1, osteoblastische cellen2), omvatten deze functies het vormen van een selectieve barrière tussen bloed en weefsels en het helpen bij weefselvorming3. Differentiatie van volwassen EC's tijdens de normale ontwikkeling vereist diverse signaalroutes. Primordiale EC's zijn afgeleid van mesoderm-voorlopers en worden vervolgens gespecificeerd in de richting van volwassen arteriële, veneuze, capillaire en lymfatische fenotypen4. Bovendien wordt ook een kleine subset van EC's in het extra-embryonale dooierzak- en embryonale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) -gebied gespecificeerd om hemogene EC's te worden, die aanleiding geven tot hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) die migreren naar de foetale lever en het foetale beenmerg, waar ze postnataal blijven en alle bloedceltypen gedurende het hele leven genereren4. Het gevarieerde scala aan EC-fenotypen is essentieel voor alle weefselontwikkeling en -onderhoud.
ECs en hun derivaten zijn dus kritische componenten van studies gericht op het modelleren en ophelderen van mechanismen van menselijke ontwikkeling en / of ziekte, evenals regeneratieve geneeskunde en weefselmanipulatietoepassingen 5,6,7,8. De belangrijkste beperking voor dit soort studies is echter het gebrek aan beschikbaarheid van primaire menselijke EC's in de vereiste hoeveelheid. Geschat wordt dat voor de meeste therapeutische toepassingen minimaal 3 x 108 EC's nodig zouden zijn6. Om dit probleem op te lossen, is het gebruik van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) voorgesteld vanwege hun gevarieerde afstammingspotentieel en hun vermogen om grote aantallen nakomelingen te genereren 6,9.
Inderdaad, het nut van cellen afgeleid van hESCs of hiPSC's is aangetoond in meerdere studies gericht op ziektemodellering en medicijnscreening 10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) -technologie is gebruikt om de fysiologie van het menselijk lichaam getrouwer samen te vatten door cellen en weefsels te integreren in driedimensionale steigers. Bovendien kan verbinding van meerdere individuele OIC's (een zogenaamde body- of human-on-a-chip, BOC / HOC) worden bereikt via microfluïdica om kruisverwijzing tussen de organen van belang mogelijk te maken 13,14,15. Ondersteunende weefsels, zoals de vasculatuur, zijn kritieke componenten van OAG's en BOC / HOCs; het opnemen van vasculatuur maakt het transport van voedingsstoffen, zuurstof en paracriene factoren door de weefsels mogelijk, waardoor de vereiste weefselspecifieke micro-omgeving wordt bevorderd 3,12. Methoden voor het afleiden van volwassen menselijke EC's, zoals arteriële, veneuze, lymfatische en hemogene EC's, zijn dus cruciaal voor het bevorderen van deze weefselmanipulatiebenaderingen.
Er zijn meerdere protocollen gepubliceerd met gedetailleerde stappen voor de afleiding van menselijke primordiale of voorloper-EC's van hESCs of hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Veel van deze protocollen zijn afhankelijk van embryoïde lichaamsvorming (EB) of co-cultuur van SER's / iPSC's met een muizentoevoerlaag van stromale cellen. Deze strategieën zijn vaak moeilijk en tijdrovend, met lage EC-opbrengsten en/of besmetting van menselijke EC's met muizencellen. Protocollen die strikt afhankelijk zijn van 2D-cultuur zonder het gebruik van stromale cellen vereisen vaak lange inducties, gebruiken complexe combinaties van groeifactoren en / of remmers voor inductie, hebben langere expansieperioden na celscheiding of een combinatie van deze factoren. De voortschrijdende kennis van signaalroutes en factoren die betrokken zijn bij de afleiding van volwassen EC-typen in vivo biedt de basis voor een eenvoudig en robuust in vitro differentiatieprotocol.
Eerder werden belangrijke rollen voor notch- en retinoïnezuur (RA) signaleringsroutes geïdentificeerd in de specificatie van respectievelijk muriene arteriële en hemogene EC's tijdens de ontwikkeling. De Notch-signaleringsroute speelt meerdere rollen bij de specificatie en het onderhoud van het arteriële EC-fenotype. Werk met behulp van het murine retinale vascularisatiemodel identificeerde een route waarin vloeistofschuifspanning een Notch-Cx37-p27-signaleringsas induceert, waardoor G1-celcyclusstilstand wordt bevorderd, wat arteriële EC-specificatie27 mogelijk maakt. Celcyclustoestanden zijn verondersteld een rol te spelen bij beslissingen over het lot van cellen door verschillende kansen te bieden waarin cellen ontvankelijk zijn voor bepaalde signalen die genexpressie en fenotypische veranderingen kunnen induceren28. Deze notch-gemedieerde G1-arrestatie maakte de expressie mogelijk van genen verrijkt in arteriële EC's, waaronder ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 en Notch 4 (beoordeeld in29,30). Het is ook aangetoond dat hemogene EC-specificatie in vivo wordt bevorderd via RA-signalering 31,32. Aanvullende studies hebben aangetoond dat, stroomafwaarts van RA-signalering, expressie van c-Kit en Notch p27 upreguleren, wat hemogene specificatie in de murine dooierzak en AGM33 mogelijk maakt. Murine hemogene EC's kunnen minimaal worden geïdentificeerd door expressie van zowel endotheel (d.w.z. CD31, KDR) als hematopoëtische (d.w.z. c-Kit, CD34) markers4. Ten slotte ondergaan hemogene EC's een endotheel-naar-hematopoietische overgang (EHT) om HSPC's te vormen, die aanleiding kunnen geven tot alle bloedceltypen 4,34,35.
Recent werk testte of dezelfde signaleringshiërarchie de menselijke hemogene EC-specificatie kan bevorderen. Om dit te doen, werd een serum- en feedervrij 2D-kweekprotocol ontwikkeld om hemogene EC's af te leiden van hESCs, en deze hemogene EC's werden op eencellig niveau gekarakteriseerd als CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. Deze studie maakte ook gebruik van de Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) reporter, die verschillende celcyclustoestanden identificeert, met behulp van H9-hESCs die de FUCCI-reporterconstructie uitdrukken (H9-FUCCI-hESC)36. In studies met deze cellen werd aangetoond dat RA vroege G1-celcyclusstilstand in EC's bevordert, en vroege G1-toestand maakt hemogene specificatie in vitromogelijk 37. Hierin wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de differentiatie van deze menselijke hemogene endotheelcellen en testen die hun identiteit bevestigen. Deze eenvoudige methode biedt een nuttig middel om deze gespecialiseerde subset van EC's te genereren voor toekomstige studies van mechanismen van de ontwikkeling van menselijke bloedcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagentia en reagensbereiding
OPMERKING: Een lijst met reagentia is opgenomen in de tabel met materialen.
- Verkrijg de menselijke pluripotente stamcellijnen: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
OPMERKING: Het genereren van hemogene EC's kan efficiënter zijn in de H1-cellijn. - Bereid matrixeiwitvoorraden voor: Aliquot het matrixeiwit in voorgekoelde buisjes van 1,5 ml (op ijs) zodat elke buis 1 mg matrixeiwit bevat. 1 mg matrixeiwit is voldoende om alle putten van twee 6-wells platen (12 putten in totaal) te coaten. Bewaar de aliquots bij -20 °C tot gebruik.
OPMERKING: Voer alle stappen uit met matrixeiwit op ijs of bij 4 °C. Ontdooi de bevroren bouillonflacon met matrixeiwit op ijs bij 4 °C 's nachts. Eenmaal ontdooid, draai de injectieflacon om ervoor te zorgen dat de inhoud wordt gemengd. Prechill 1,5 ml microcentrifugebuizen gedurende ten minste 1 uur bij -20 °C en overslag in ijs onmiddellijk voorafgaand aan het almmen. - Bereid matrixeiwit-gecoate platen: Ontdooi matrixeiwit aliquots op ijs bij 4 °C. Voeg 12,5 ml ijskoude DMEM: F12 toe aan een vooraf gechilleerde conische buis op ijs. Breng met behulp van voorgekoelde pipetpunten één aliquot (1 mg) matrixeiwit over naar de conische buis en meng goed door op en neer te pipetteren. Aliquot 1 ml van het verdunde matrixeiwit naar elke put van voorgekoelde 6-wells platen (op ijs) met behulp van een voorgekoelde serologische pipet. Draai en schommel de platen zodat de hele put gelijkmatig wordt gecoat. Incubeer de platen gedurende minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur om het matrixeiwit te laten stollen. Wikkel de platen met parafilm en bewaar bij 4 °C tot gebruik. Gebruik matrix eiwit-gecoate platen binnen 2 weken na bereiding.
OPMERKING: Gebruik de matrix eiwit-gecoate 6-well platen voor routinematige passaging van cellen en differentiatie naar primordiale en hemogene endotheelcellen. Voer alle stappen op ijs uit. Voorkoelen van 6-well platen, pipetpunten, serologische pipetten en conische buizen voor gebruik gedurende ten minste 1 uur bij -20 °C. Breng deze items over op ijs wanneer ze klaar zijn voor gebruik. - Bereid het basisdifferentiatiemedium voor door 5 ml PFHM toe te voegen aan 100 ml pluripotent stamceldifferentiatiemedium. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 0,1% BSA-PBS door 0,1 g BSA op te lossen in 100 ml PBS. Filter steriliseer BSA-PBS door een filter van 0,22 μm te passeren en bewaar bij 4 °C.
- Bereid 5 mM HCl door bouillon HCl (12 M) 1:2.400 met water te verdunnen. Stel de pH in op 3,0 met naOH. Filter steriliseer de oplossing door een filter van 0,22 μm te passeren en bewaar bij 4 °C.
- Bereid bFGF, BMP4, VEGF-A, Retinoïnezuur (RA) en DLL4-aandelen.
- bFGF: Reconstitueer het gelyofiliseerde poeder tot 100 μg/ml in 0,1% BSA-PBS. Aliquot en bewaren bij -20 °C. Gebruik bFGF-voorraden binnen 3 maanden na bereiding. Ontdooi de aliquots onmiddellijk voor gebruik.
- BMP4: Reconstitueer het gelyofiliseerde poeder tot 1 mg / ml in 5mM HCl, pH 3,0. Verder verdunnen tot 50 μg/ml in 0,1% BSA-PBS. Aliquot en bewaren bij -20 °C. Gebruik de BMP4-voorraden binnen 3 maanden na bereiding. Ontdooi de aliquots onmiddellijk voor gebruik.
- VEGF-A: Reconstitueer het gelyofiliseerde poeder tot 1 mg / ml in dH2O. Verder verdunnen tot 100 μg/ml in 0,1% BSA-PBS. Aliquot en bewaren bij -20 °C. Gebruik de VEGF-A voorraden binnen 3 maanden na bereiding. Ontdooi de aliquots onmiddellijk voor gebruik.
- RA: Reconstitueer het gelyofiliseerde poeder tot 100 mM in DMSO. Aliquot en bewaren bij -80 °C. Gebruik de RA-voorraden binnen 1 maand na bereiding. Ontdooi de aliquots onmiddellijk voor gebruik.
OPMERKING: Bescherm RA-aandelen tegen licht. - DLL4: Reconstitueer het gelyofiliseerde poeder tot 1 mg / ml in PBS. Aliquot en bewaren bij -20 °C. Gebruik de DLL4-voorraden binnen 12 maanden na voorbereiding. Ontdooi de aliquots onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid het endotheelceldifferentiatiemedium onmiddellijk voor gebruik voor door VEGF-A en BMP4 in basedifferentiatiemedium te verdunnen (stap 1.4), zodat de uiteindelijke concentraties respectievelijk 25 ng/ml en 50 ng/ml zijn.
- Bereid de werkende RA direct voor gebruik voor door 100 mM voorraad 1:1.000 in DMSO te verdunnen tot 100 μM.
OPMERKING: Bescherm werkende RA tegen licht. - Bereid het hemogene endotheelceldifferentiatiemedium onmiddellijk voorafgaand aan gebruik voor door VEGF-A, BMP4 en werkende RA in basedifferentiatiemedium (stap 1.4) te verdunnen, zodat de uiteindelijke concentraties respectievelijk 25 ng / ml, 50 ng / ml en 0, 5 μM zijn.
- Bereid de antilichaamkleuringsbuffer voor door HBSS met 10% FBS te maken en aan te vullen met 1:500 verdund antimicrobieel reagens. Filter de buffer steriel en gebruik deze onmiddellijk.
- Bereid de celsorteerbuffer voor door HBSS te maken dat 1% FBS bevat en aan te vullen met 1:500 verdund antimicrobieel reagens. Filter de buffer steriel en gebruik deze onmiddellijk.
- Bereid 1 mg / ml fibronectinevoorraden door 5 ml steriel water toe te voegen aan 5 mg gelyofiliseerde fibronectine. Aliquot en bewaren bij -20 °C. Gebruik de fibronectinevoorraden vóór de vervaldatum op het etiket van het gelyofiliseerde product. Ontdooi de aliquots onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid de met fibronectine beklede schalen van 35 mm. Verdun de fibronectinevoorraden (1 mg/ml) tot 4 μg/ml in steriel water. Voeg 1 ml van deze fibronectine coatingoplossing toe aan elke schaal en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten tot 1 uur. Gebruik de gerechten direct na het coaten.
- Bereid 3 of 4 ml aliquots van het medium op basis van methylcellulose volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar de aliquots bij -20 °C tot gebruik. Gebruik de op methylcellulose gebaseerde medium aliquots vóór de vervaldatum die op het etiket van het voorraadproduct staat vermeld. Ontdooi de aliquots onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid de DLL4-coatingoplossing voor door recombinante menselijke DLL4-voorraad te verdunnen tot een eindconcentratie van 10 μg/ml in PBS.
- Bereid het groeimedium van de endotheelcel voor en bewaar het volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid de flowcytometrie-analysebuffer voor door PBS te maken die 0,1% BSA bevatten. Filtreer de buffer steriel en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
2. Celkweek en passaging van hESCs
- Laat de met matrixeiwit gecoate platen, het groeimedium van stamcellen en DMEM:F12 opwarmen tot kamertemperatuur.
- Kweek de hESC-cellijnen in stamcelgroeimedium (2 ml / put) op matrixeiwitgecoate 6-well platen in een 37 ° C, 5% CO2-incubator .
- Controleer de cellen dagelijks en verwijder de gedifferentieerde cellen indien nodig door ze voorzichtig van de plaat te schrapen met behulp van een p200 pipetpunt.
OPMERKING: Gedifferentieerde cellen verschijnen aan de rand van kolonies. Raadpleeg de producthandleiding voor stamcelgroeimedium voor voorbeelden van gedifferentieerde cellen in cultuur. - Passeer de cellen zodra ze 70% -80% samenvloeiing bereiken. Voer de volgende stappen uit om cellen te passeren.
OPMERKING: Cellen moeten worden gesplitst voordat ze 70% -80% confluency bereiken als verhoogde differentiatie optreedt.- Verwijder het medium boven de cellen en was voorzichtig met 1 ml DMEM: F12 per putje.
- Voeg 1 ml DMEM:F12 per putje toe.
- Voeg 160 μL/ml Dispase per put toe en incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende 45 minuten.
- Voeg na dispase-incubatie nog eens 1 ml DMEM: F12 per put toe en pipetteer voorzichtig om de cellen op te tillen.
OPMERKING: Vermijd het dissociëren van de cellen in een eencellige suspensie. Passeer de cellen als kleine klonten. - Breng de cellen over naar een conische buis met 12 ml DMEM: F12 en laat de cellen bezinken door de zwaartekracht (~ 5-10 min).
- Verwijder het supernatant en resuspenseer de pellet voorzichtig in 0,5 ml stamcelgroeimedium per putje opgetilde cellen om kleine klontjes cellen te verkrijgen.
OPMERKING: Vermijd het dissociëren van de cellen in een eencellige suspensie. Passeer de cellen als kleine klonten. - Aspirateer de matrix eiwit coating oplossing uit de putten van de bereide matrix eiwit-gecoate plaat en voeg 1,5 ml van het stamcel groeimedium per put toe.
- Voeg het gewenste volume geresuspendeerde cellen (stap 2.4.6) toe aan elk putje van de bereide matrix-eiwitgecoate plaat.
- Incubeer de plaat in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Vervang het medium elke 24 uur naar vers stamcelgroeimedium.
3. Differentiatie van hESCs naar primordiale endotheelcellen
- Dag -1: Kweek en passeer de cellen zoals hierboven beschreven in rubriek 2. Zaai de cellen (stap 2.4.6) in kleine klonten (~50 μm) met een dichtheid van ongeveer 2 klonten per vierkante centimeter38.
OPMERKING: Evalueer de zaaddichtheid en verfijn indien nodig empirisch. - Dag 0: 24 uur na het zaaien van de cellen, aspirateer het medium uit elke put en was de cellen voorzichtig met 1 ml DMEM: F12 per put. Voeg 1 ml van het basisdifferentiatiemedium met 5 μM GSK3i (CHIR99021, vers toegevoegd) toe aan elk putje en incubeer gedurende 24 uur (37 °C, 5% CO2).
OPMERKING: Voeg voor alle wasstappen langzaam de aangegeven wasmedia toe aan de plaat door tegen de wand van de plaat te pipetteren. Draai de plaat voorzichtig rond zodat het hele oppervlak van de put wordt bedekt met wasmedia. Kantel de plaat iets zodat de wasmedia zich op de zes uur-positie verzamelen en de wasmedia voorzichtig aspirateren. - Dag 1: Haal het medium uit elke put en was de cellen voorzichtig met 1 ml DMEM:F12 per putje. Voeg 1 ml van het basisdifferentiatiemedium met 50 ng/ml bFGF (vers toegevoegd, 1:2.000 uit bevroren bouillon) toe aan elk putje en incubeer 24 uur (37 °C, 5% CO2).
- Dag 2: Haal het medium uit elke put en was de cellen voorzichtig met 1 ml DMEM:F12 per putje. Voeg 1 ml van het endotheelceldifferentiatiemedium toe aan elke put en incubeer 24 uur (37 °C, 5% CO2).
- Dag 3: Vervang het medium boven de cellen door 1 ml vers bereid endotheelceldifferentiatiemedium per put en incubeer 24 uur (37 °C, 5% CO2).
- Dag 4: Vervang het medium boven de cellen door 1 ml vers bereid endotheelceldifferentiatiemedium per put en incubeer 24 uur (37 °C, 5% CO2).
- Dag 5: FACS zuivert de cellen om het EC-fenotype te beoordelen (secties 4-5) of in cultuur te houden en te differentiëren naar hemogene endotheelcellen (sectie 6).
4. FACS-zuivering van primordiale endotheelcellen
- Aspirateer het medium boven de cellen en was een keer voorzichtig met 1 ml DMEM:F12 per putje.
- Voeg 1 ml celloslatingsoplossing per put toe en incubeer de cellen gedurende 12 minuten in een 37 °C, 5% CO2-incubator of totdat de cellen zijn gedissocieerd.
- Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis met 12 ml DMEM:F12 en pellet door centrifugatie gedurende 5 minuten, 1.000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 12 ml DMEM:F12 om te wassen.
- Pelleteer de cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten, 1.000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in ijskoude antilichaamkleuringsbuffer en tel de cellen. Pas de concentratie aan met behulp van ijskoude antilichaamkleuringsbuffer tot 1 x 105 cellen / ml.
- Verdeel de cellen gelijkmatig in microcentrifugebuizen op ijs, elk met minimaal 600 μL cellen bij 1 x 105 cellen/ml, voor antilichaamkleuring.
OPMERKING: Vier buisjes cellen zijn nodig voor het kleuren van primordiale EC's: niet-gekleurde controle, CD31-controle met één antilichaam, CD45-controle met één antilichaam en monster dat zowel CD31- als CD45-antilichamen bevat. Informatie over antilichamen vindt u in de materiaaltabel. - Voeg antilichamen toe aan de buizen die cellen bevatten, indien van toepassing, en incubeer op ijs en beschermd tegen licht gedurende 30 minuten.
- Niet-gekleurde controle: Voeg geen antilichaam toe.
- CD31-controle met één antilichaam: voeg alleen CD31-antilichaam toe.
- CD45-controle met één antilichaam: voeg alleen CD45-antilichaam toe.
- Voorbeeld: Voeg zowel CD31- als CD45-antilichamen toe.
OPMERKING: De uiteindelijke antilichaamconcentratie in het monster, evenals de fluorescerende conjugaten, moet worden geoptimaliseerd op basis van de specifieke antilichamen en celsorteerder die worden gebruikt.
- Pelleteer de cellen door centrifugatie in een 4 °C tafelmicrocentrifuge gedurende 5 minuten bij 1.000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspenseer de celpellets in 600 μL ijskoude sorteerbuffer.
- Zeef de monsters door de mesh filterdoppen van 5 ml FACS-buizen en sla de cellen op ijs op, beschermd tegen licht, voor onmiddellijke FACS.
- Verkrijg primordiale endotheelcellen (CD31+ CD45-), door de volgende stappen uit te voeren.
- Identificeer de CD45-negatieve celpopulatie en poort (CD45-).
- Identificeer binnen (CD45-) de CD31-positieve (CD31+) celpopulatie en sorteer cellen in 6 ml ijskoude celsorteerbuffer. Gebruik deze cellen voor downstream-toepassingen (zie rubriek 5).
5. Bepaling ter bevestiging van het fenotype van de primordiale endotheelcel
- Bekleed drie putten van een 6-well plaat met 1 ml/put DLL4 coatingoplossing gedurende 30 minuten in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Als controlecoat je de andere drie putten van de plaat met 1 ml / put PBS.
- Aspirateer de DLL4-coatingoplossing en PBS en plaat 25.000 gesorteerde primordiale endotheelcellen (zie stap 4.12) in 2 ml endotheelcelgroeimedium per put.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- Aspirateer het medium boven de cellen en was eenmaal met 2 ml/put PBS. Analyseer de cellen met behulp van qPCR of flowcytometrie (voor cellen die het FUCCI-construct tot expressie brengen).
- Als u de cellen wilt analyseren op basis van qPCR, voert u de volgende stappen uit.
- Aspirateer de vloeistof boven de cellen en isoleer het RNA in de cellen met behulp van een RNA-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant.
- Voer reverse transcriptiereacties uit met een reverse transcriptie master mix volgens het protocol van de fabrikant.
- Voer qPCR-reacties uit met een SYBR Green-mastermix volgens het protocol van de fabrikant.
OPMERKING: Gebruikte primers (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) staan vermeld in tabel 1.
- Om cellen te analyseren die het FUCCI-construct tot expressie brengen door middel van flowcytometrie, voert u de volgende stappen uit.
- Aspirateer de vloeistof boven de cellen en voeg 500 μL/put 0,25% trypsine-EDTA toe.
- Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator totdat ze worden opgetild, ~ 5 min.
- Breng de cellen over naar een microcentrifugebuis en pelleteer de cellen in een 4 °C microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 1.000 x g.
- Aspirateer het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 μL ijskoude flowcytometrie-analysebuffer.
- Zeef de monsters door de mesh filterdop van een FACS-buis van 5 ml en sla de cellen op ijs op, beschermd tegen licht, voor onmiddellijke flowcytometrieanalyse.
- Analyseer het percentage cellen dat is verguld op DLL4 versus PBS-controle in vroege G1 (geen kleur), late G1 (mCherry +/ mVenus-), G1 / S (mCherry + / mVenus +) en S / G2 / M (mCherry - / mVenus +).
- Als u de cellen wilt analyseren op basis van qPCR, voert u de volgende stappen uit.
6. Differentiatie van hESCs naar hemogene endotheelcellen
OPMERKING: Differentieer de cellen tot dag 4 primordiale EC's, zoals hierboven beschreven in rubrieken 3.1-3.6.
- Dag 5: Aspirateer het medium boven de cellen en was de cellen voorzichtig met 1 ml DMEM:F12 per putje. Voeg 1 ml vers bereid hemogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put toe en incubeer 24 uur (37 °C, 5% CO2).
- Dag 6: Vervang het medium boven de cellen door 1 ml vers bereid hemogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put en incubeer 24 uur (37 °C, 5% CO2).
- Dag 7: Vervang het medium boven de cellen door 1 ml vers bereid hemogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put en incubeer 24 uur (37 °C, 5% CO2).
- Dag 8: FACS isolaat hemogene endotheelcellen (zie rubriek 7).
7. FACS-isolatie van hemogene endotheelcellen
- Til de cellen op en was ze zoals hierboven beschreven in rubrieken 4.1-4.6.
- Verdeel de cellen gelijkmatig in microcentrifugebuizen op ijs, elk met minimaal 600 μL cellen bij 1 x 105 cellen/ml, voor antilichaamkleuring.
OPMERKING: Acht buisjes cellen zijn nodig voor antilichaamkleuring van hemogene EC's: niet-gekleurde controle, CD31-controle van één antilichaam, CD45-controle van één antilichaam, KDR-controle van één antilichaam, c-Kit-controle van één antilichaam, CD34-controle van één antilichaam, VE-cadherine-controle van één antilichaam en monster dat alle zes antilichamen bevat.
OPMERKING: Informatie over antilichamen wordt verstrekt in de materiaaltabel. - Voeg antilichamen toe aan de buizen die cellen bevatten, indien van toepassing, en incubeer op ijs en beschermd tegen licht gedurende 30 minuten.
- Niet-gekleurde controle: Voeg geen antilichaam toe.
- CD31-controle met één antilichaam: voeg alleen CD31-antilichaam toe.
- CD45-controle met één antilichaam: voeg alleen CD45-antilichaam toe.
- KDR-controle met één antilichaam: voeg alleen KDR-antilichaam toe.
- c-Kit single antibody control: Voeg alleen c-Kit antilichaam toe.
- CD34-controle met één antilichaam: voeg alleen CD34-antilichaam toe.
- VE-cadherine single antibody control: Voeg alleen VE-cadherine antilichaam toe.
- Voorbeeld: Voeg CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 en VE-cadherine antilichamen toe.
OPMERKING: De uiteindelijke antilichaamconcentratie in het monster, evenals de fluorescerende conjugaten, moet worden geoptimaliseerd op basis van de specifieke antilichamen en celsorteerder die worden gebruikt.
- Pelleteer de cellen door centrifugeren in een 4 °C microcentrifuge gedurende 5 min bij 1.000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspenseer de pellets in 600 μL ijskoude sorteerbuffer.
- Zeef de monsters door de mesh filterdop van 5 ml FACS-buizen en bewaar cellen op ijs, beschermd tegen licht, voor onmiddellijke FACS.
- Voer de volgende stappen uit om hemogene endotheelcellen (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- te verkrijgen.
- Identificeer de CD45-celpopulatie en poort (CD45-).
- Identificeer binnen (CD45-) de CD31+ celpopulatie en poort (CD31+).
- Identificeer binnen (CD31+) de VE-Cadherine-celpopulatie en poort (CDH5-).
- Identificeer binnen (CDH5-) de c-Kit+ celpopulatie en poort (KIT+).
- Identificeer binnen (KIT+) de CD34+ celpopulatie en poort (CD34+).
- Identificeer en sorteer binnen (CD34+) de KDR+ -cellen in 6 ml ijskoude celsorteerbuffer. Gebruik deze cellen in downstream-toepassingen (zie rubriek 8).
8. Kolonievormende eenheidstest
- Ontdooi de aliquots van het medium op basis van methylcellulose volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Eén aliquot van 3 ml is voldoende voor twee monsters en één aliquot van 4 ml is voldoende voor drie monsters. - Tel de gesorteerde hemogene endotheelcellen verkregen in stap 7.7.
- Volg de instructies van de fabrikant en bereken het volume gesorteerde cellen dat aan elk medium aliquot op basis van methylcellulose moet worden toegevoegd, zodat elk monster minimaal 1.000 hemogene endotheelcellen bevat.
OPMERKING: Het aantal cellen kan indien nodig worden aangepast. - Voeg het berekende volume cellen toe aan het op methylcellulose gebaseerde medium aliquot en vortex grondig. Laat de op methylcellulose gebaseerde mediumculturen 10 minuten op kamertemperatuur zitten, of totdat de bubbels verdwijnen.
- Aspirateer de fibronectine coating oplossing uit de bereide 35 mm schotels. Volg de instructies van de fabrikant en doseer 1 ml mediumcultuur op basis van methylcellulose per schaal van 35 mm. Draai het gerecht voorzichtig om de cultuur gelijkmatig te verdelen.
- Plaats deze schotels van 35 mm, evenals twee extra schotels van 35 mm gevuld met steriel water, in een weefselkweekschaal van 15 cm.
- Incubeer de culturen in een 37 °C, 5% CO2 incubator en observeer de culturen op dag 8 en 14.
- Tel op dag 8 de CFU-E en BFU-E kolonies.
- Tel op dag 14 de CFU-GM en CFU-GEMM kolonies.
OPMERKING: Raadpleeg de handleiding voor het op methylcellulose gebaseerde medium voor morfologische identificatie van kolonietypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schema met de specificatie van primordiale EC's en hemogene EC's uit hESCs, en een representatief beeld van cellen 24 uur na plating zijn weergegeven in figuur 1. Volgens specificatie worden primordiale EC's en hemogene EC's FACS gezuiverd op respectievelijk dag 5 en 8. Primordiale EC's worden gedefinieerd als CD31+ CD45- en hemogene EC's worden gedefinieerd als CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. Een representatieve flowcytometrische gatingstrategie voor primordiale EC's en hemogene EC-zuivering is weergegeven in figuur 2. Cellen worden in eerste instantie gegated op basis van de negatieve expressie van CD45 en positieve expressie van CD31 om gezuiverde primordiale EC's te verkrijgen (figuur 2A). Om gezuiverde hemogene EC's te verkrijgen, worden cellen in eerste instantie afgesloten zoals in figuur 2A en vervolgens verder gezuiverd op basis van positieve of negatieve expressie van (in volgorde) VE-Cadherine (CDH5), c-Kit (KIT), CD34 en KDR (figuur 2B).
Om het potentieel te beoordelen van H9-Fucci-hES-afgeleide primordiale CD31+ CD45-endotheelcellen, geïsoleerd via FACS op dag 5 van differentiatie (protocolsectie 4), om aanleiding te geven tot endotheelsubtypen, worden de gezuiverde cellen gezaaid op platen bedekt met ofwel de Notch ligand DLL4 om arteriële specificatie te induceren, of PBS (controle), en geïncubeerd gedurende 24 uur in een 37 °C, 5% CO2-incubator. De cellen worden vervolgens gelyseerd met RNA-lysisbuffer, het RNA geëxtraheerd en omgekeerd getranscribeerd naar cDNA, en qPCR wordt uitgevoerd om genexpressieniveaus in de met DLL4 behandelde versus controlecellen te vergelijken. Zoals verwacht, hebben endotheelcellen gekweekt op DLL4 een verhoogde expressie van het Notch-responsieve gen HEY2, evenals de arteriële geassocieerde genen EFNB2, GJA5 en GJA4. Bovendien hebben deze cellen ook een verminderde expressie van de veneuze transcriptiefactor NR2F2 (figuur 3A). Als alternatief, om het effect van DLL4-behandeling op de celcyclustoestand te bepalen, worden de FACS-gezuiverde CD31 + CD45-cellen geïncubeerd op platen gecoat met DLL4 of PBS gedurende 24 uur, opgetild en geanalyseerd op basis van de expressie van hCdt1 (30/120) -mCherry (late G1) en hGem (1/110) -mVenus (S / G2 / M). In overeenstemming met de bevindingen dat Notch-signalering late G1-celcyclusstilstand27 bevordert, wordt een groter percentage primordiale EC's eind G1 gearresteerd na groei in aanwezigheid van DLL4, vergeleken met controlecellen (figuur 3B, C).
Om het hematopoietische potentieel van hemogene endotheelcellen te verifiëren, worden de CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherine- CD45- endotheelcellen geïsoleerd via FACS (methoden in sectie 7) gezaaid in een op methylcellulose gebaseerd medium dat is geformuleerd voor de groei van hematopoëtische voorlopercellen in kolonievormende eenheid (CFU) assays en mogen ze gedurende 14 dagen groeien. CFU-E erytroïde kolonies en blast-forming unit (BFU)-E erytroïde kolonies worden geteld op dag 8 (figuur 4A,B), en CFU-GM granulocyt/macrofaag en GFU-GEMM (granulocyt, erytroïde, macrofaag en megakaryocyt) multipotente hematopoietische voorloperkolonies worden geteld op dag 14 (figuur 4C en D). Per 1.000 geïnguleerde hemogene EC's worden ongeveer 20 CFU gegenereerd (figuur 4F). Cellen met endotheelcelmorfologie zijn ook te zien in de culturen (figuur 4E); dit zijn de hemogene endotheelcellen die aanleiding geven tot multi-lineage hematopoietische voorlopers op een enkelcellig niveau37.
Figuur 1: Protocol voor de specificatie van primordiale en hemogene EC's. (A) Schematisch diagram van het differentiatieprotocol. Embryonale stamcellen worden op dag -1 op matrixeiwit-gecoate platen geplaatst en mogen zich 's nachts hechten. De cellen worden vervolgens op dag 0 en 1 behandeld met respectievelijk GSK3i-remmer (CHIR99021) en bFGF om respectievelijk primitieve streak- en mesodermspecificatie te induceren. Vanaf dag 2 worden de cellen behandeld met een combinatie van BMP4 en VEGF-A om de primordiale EC-ontwikkeling te bevorderen. Primordiale EC's (rode cirkel) zijn FACS gezuiverd op dag 5. Als alternatief, om hemogene EC's te genereren, wordt het medium boven de primordiale EC's op dag 5 uitgewisseld met vers hemogeen differentiatiemedium dat BMP4, VEGF-A en RA bevat. Dit medium wordt dagelijks vervangen tot dag 8, wanneer hemogene EC's (rode ster) FACS worden gezuiverd. (B) Kolonies op dag 0 van differentiatie, schaalbalk = 100 μm. Paneel A is met toestemming van Elsevier aangepast van Qiu et al.37 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: FACS-analyse van hemogene EC's afgeleid van hESCs. Representatieve flowcytometrische gatingstrategie voor de zuivering van (A) primordiale EC's en (B) hemogene EC's. Merk op dat aangezien hemogene EC's zijn afgeleid van primordiale EC's, de flowcytometrie gating strategie voor CD45 en CD31 identiek is voor beide celpopulaties. In de bovenste rij van elk paneel (monster) worden cellen weergegeven die werden gedifferentieerd tot hemogene EC's zoals beschreven in protocolsectie 6 en gekleurd met antilichamen zoals beschreven in protocolparagraaf 7.3.8. In de onderste rij van elk paneel (controle) worden niet-gekleurde cellen getoond die gedurende 8 dagen zonder RA-behandeling werden gedifferentieerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: DLL4-inductie van H9-Fucci CD31+ CD45- primordiale endotheelcellen resulteert in late G1-arrestatie en verhoogde arteriële genexpressie. (A) DLL4-behandeling van CD31+ CD45- H9-hESC- afgeleide primordiotheelcellen die het Fucci-construct tot expressie brengen gezuiverd op dag 5 van differentiatie resulteert in verhoogde expressie van arteriële genen (i-iii) en het Notch-responsieve gen Hey2 (v), die gepaard gaat met een gelijktijdige afname van de expressie van het veneuze gen NR2F2 (iv). (B) Representatieve FACS-plots met de celcyclustoestandsverdeling van 5.000 H9-Fucci-afgeleide CD31 + CD45- gekweekt op PBS (controle) of DLL4 gedurende 24 h. (C) DLL4-inductie resulteert in een toename van 15% in cellen in de late G1-fase in vergelijking met controle. De gegevens zijn het gemiddelde van drievoudige monsters uit hetzelfde experiment dat in paneel (B) wordt weergegeven. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van het hematopoëtische potentieel van hemogene EC's afgeleid van hESCs. Representatieve beelden van morfologie van H1-hESC afgeleide (A) CFU-E erytroïde kolonie (schaal bar = 35 μm), (B) BFU-E erytroïde kolonie (schaal bar = 75 μm), (C) CFU-GM granulocyten/macrofaag kolonie, (D) CFU-GEMM multipotente hematopoietische voorloperkolonie, en (E) CFU-GM granulocyten/macrofaagkolonie met onderliggende endotheelcellen (EC's) (rode pijlen). (F) aantal en verdeling van CFU's gevormd per 1.000 geplateerde hemogene endotheelcellen. Schaalbalk = 100 μm in (C-E). Aanvullende afbeeldingen van CFU's die met behulp van dit protocol zijn gedifferentieerd, zijn te vinden in Qiu et al.37. Paneel F is met toestemming van Elsevier aangepast van Qiu et al.37. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam | Voorwaarts | Omkeren |
| Efnb2 | TATGCAGAACTGCGATTTCCAA | TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC |
| EPHB4 | CGCACCTACGAAGTGTGTGAGA | GTCCGCATCGCTCTCATAGTA |
| GJA5 | STEGGGTAGGCAAGGTCTG | ATCACACCGGAAATCAGCCTG |
| GJA4 | ACACCCACCCTGGTCTAC | CACTGGCGACATAGGTGCC |
| HÉ2 | GCCCGCCCTTGTCAGTATC | CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG |
| NR2F2 | GGACCACATACGGATCTTCCAA | ACATCAGACAGACCACAGGCAT |
Tabel 1: qPCR primer informatie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin worden de stappen beschreven voor het produceren van hemogene endotheelcellen uit menselijke embryonale stamcellen in ongeveer 1 week met behulp van een muizenvoeder- en serumvrij 2D-kweeksysteem (figuur 1). Dit protocol borduurt voort op een methode beschreven door Sriram et al. (2015) om primordiale EC's38 te verkrijgen. De primordiale aard en het specificatiepotentieel van de CD31+ CD45-EC's wordt aangetoond door deze cellen op DLL4-gecoate platen te kweken en veranderingen in genexpressie te observeren die consistent zijn met de arteriële specificatie (figuur 3). Bovendien is de winst van arteriële identiteit geassocieerd met late G1-celcyclusstilstand (figuur 3), wat consistent is met eerdere studies27. Na het kweken van primordiale EC's gedurende nog eens 3 dagen in aanwezigheid van 0,5 μM RA, 25 ng/ml BMP4 en 50 ng/ml VEGF-A, was het mogelijk om hemogene EC's (figuur 2) te genereren en te FACS-isoleren die aanleiding kunnen geven tot CFU-erytroïde, BFU-erytroïde, CFU-granulocyt/macrofaag en CFU-granulocyt, erytrocyt, macrofaag en megakaryocytenkolonies (figuur 4 ). Met behulp van deze methode in een onlangs gepubliceerde studie, genexpressie veranderingen over een periode van 8 dagen consistent met verlies van pluripotentie, primitieve streak en mesoderm inductie, verwerving van endotheelcelidentiteit en ten slotte hematopoietische identiteit werden waargenomen37. Bovendien veroorzaakte RA-behandeling vroege G1-celcyclusstilstand om hemogene EC-specificatie37 mogelijk te maken.
Onlangs beschreven Ohta et al. (2019) een protocol voor de differentiatie van hemogene EC's van hPSC's39. Het hierboven beschreven protocol biedt echter aanzienlijke voordelen: 1) deze methode vereist geen vorming van sferoïden; 2) dit protocol maakt gebruik van een standaard 37 ° C, 5% CO2-incubator in plaats van een hypoxische incubator, waardoor de noodzaak voor speciale speciale apparatuur wordt geëlimineerd; en 3) dit protocol gebruikt slechts één medium (pluripotent stamceldifferentiatiemedium aangevuld met PFHM), een kostenbesparend voordeel, terwijl het Ohta-protocol twee mediums vereist voor inductie. Een andere onlangs gepubliceerde studie van Galat et al. (2017) beschreef een protocol waarin CHIR99021-inductie werd gebruikt om een populatie van CD34 + hemogene endotheelcellen te genereren40. Deze cellen brachten ook CD31 tot expressie en waren in staat om aanleiding te geven tot endotheelcellen wanneer ze werden gekweekt onder monolaagomstandigheden of cellen die myeloïde en lymfoïde markers tot expressie brachten na co-kweek met RESPECTIEVELIJK OP9- of OP9-DLL4-cellen, in aanwezigheid van extra cytokines. De behoefte aan extra cocultuur kan leiden tot mogelijke besmetting van gewenste celpopulaties met muizencellen. Bovendien, hoewel Ohta et al. en Galat et al. een hemogene inductieperiode gebruikten die korter was dan de hier beschreven periode (respectievelijk 4 dagen en 5 dagen versus 8 dagen), definieerden beide hemogene EC's als CD34 +, terwijl dit protocol een strengere definitie gebruikte: CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45- . Hoewel CD34 wordt erkend als een marker van hematopoietische cellen, wordt het ook tot expressie gebracht door andere niet-hematopoëtische celtypen, zoals mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen41. De definitie van hemogene EC's in dit protocol (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-) is daarom strenger en vertegenwoordigt een meer gedefinieerde populatie.
Een beperking voor het gebruik van hESCs of hiPSC's in therapeutische toepassingen is het grote aantal cellen dat nodig is, en standaard 2D-afleidingsmethoden zijn voornamelijk beperkt tot kleinschalige differentiaties. Met behulp van hiPSC-lijnen toonden Olmer et al. (2018) de haalbaarheid aan van het opschalen van de productie van functionele CD31 + EC's die zowel arteriële (DLL4) als veneuze (EPHB4) celmarkers tot expressie brachten met behulp van suspensiecultuur of een geroerde tankbioreactor6. Belangrijk is dat ze lieten zien dat ze in staat waren om 1,18 x 107 CD31 + EC's te verkrijgen die CD34 en KDR co-expressen uit een enkele kolf met 20 ml suspensiecultuur. Om de vereiste 3 x 108 EC's te verkrijgen die nodig zijn voor de meeste therapeutische toepassingen, zouden iets meer dan twee kolven van 500 ml nodig zijn6. Toekomstige experimenten moeten de toepassing van schaaltechnieken op het hier gepresenteerde protocol voor grootschalige productie van hemogene EC's onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies HL128064 en U2EB017103. Verdere ondersteuning werd geboden door CT Innovations 15-RMB-YALE-04 subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
| 35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
| 6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
| Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
| FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 μg/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
| Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
| Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
| Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
| Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
| RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
| α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
| α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
| α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
| α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
| * Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |
References
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
- Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
- Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
- Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
- Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
- Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
- Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
- Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
- Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
- Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
- Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
- Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
- Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
- Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
- Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
- Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
- Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
- Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
- Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
- Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
- Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
- Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).
