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Summary
ここでは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍固有および末梢由来腫瘍浸潤リンパ球の特性評価のための腫瘍移植プロトコールを提示する。フローサイトメトリーによるレシピエント由来免疫細胞の流入の特異的追跡は、抗腫瘍免疫応答中のこれらの細胞の表現型および機能的変化のダイナミクスを明らかにする。
Abstract
T細胞媒介性免疫は腫瘍に対する免疫応答において重要な役割を果たしており、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は癌細胞の根絶において主導的な役割を果たしている。しかしながら、腫瘍微小環境(TME)内の腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞の起源および補充は不明瞭なままである。このプロトコールは、代理ネオ抗原、オボアルブミン(OVA)、およびTCRトランスジェニックOT-Iマウスを安定に発現するB16F10-OVAメラノーマ細胞株を採用し、CD8+ T細胞の90%以上がクラスI主要組織適合性複合体(MHC)分子H2-Kbに結合したOVA由来ペプチドOVA257-264(SIINFEKL)を特異的に認識する。これらの特徴は、腫瘍形成中の抗原特異的T細胞応答の研究を可能にする。
このモデルを腫瘍移植手術と組み合わせることで、ドナー由来の腫瘍組織を腫瘍マッチした同系レシピエントマウスに移植し、移植ドナー組織へのレシピエント由来免疫細胞の流入を正確に追跡し、腫瘍固有の抗原特異的CD8+および末梢起源抗原特異的CD8+ の免疫応答の解析を可能にした。 T セル。これら2つの集団間で動的な遷移が起こることが判明した。全体として、この実験計画は、TME中のCD8+ T細胞の免疫応答を正確に調査するための別のアプローチを提供し、腫瘍免疫学に新たな光を当てるであろう。
Introduction
CD8+ T細胞媒介性免疫応答は、腫瘍増殖の制御において極めて重要な役割を果たしている。腫瘍形成の間、ナイーブCD8+ T細胞はMHCクラスI制限様式で抗原認識時に活性化され、続いてエフェクター細胞に分化し、腫瘍塊に浸潤する1,2。しかし、腫瘍微小環境(TME)内では、長期にわたる抗原曝露および免疫抑制因子が、浸潤した腫瘍特異的CD8+ T細胞を「枯渇」3として知られる低応答状態に追いやる。疲弊したT細胞(Tex)は、急性ウイルス感染で生成されたエフェクターまたはメモリーT細胞とは、転写的およびエピジェネティックに区別される。これらのTex細胞は、主に、一連の阻害性受容体の持続性および上昇した発現、ならびにエフェクター機能の階層的喪失によって特徴付けられる。さらに、疲弊したCD8+ T細胞の増殖能の障害は、腫瘍特異的T細胞の数を減少させ、その結果、TME内の残留CD8+ T細胞は、腫瘍進行に対して十分な保護免疫をかろうじて提供することができる3。したがって、腫瘍内抗原特異的CD8+ T細胞の維持または強化は、腫瘍抑制に不可欠である。
さらに、免疫チェックポイント遮断(ICB)療法は、T細胞浸潤を増加させることによって腫瘍中のTexを再活性化し、したがって、T細胞数および若返りT細胞機能を若返らせて腫瘍抑制を促進すると考えられている。ICB治療の広範な適用は、がん治療のランドスケープを変え、患者のかなりのサブセットが持続的な応答を経験している4,5,6。それにもかかわらず、大多数の患者およびがんタイプはICBに反応しないか、または一時的にしか反応しない。TMEにおける不十分なT細胞浸潤は、ICB耐性を説明する根底にあるメカニズムの1つであると仮定されている7、8。
いくつかの研究は、患者およびマウスモデルの両方において、腫瘍浸潤性CD8+ T細胞(TIL)の不均一性を実証している9、10、11、12。腫瘍塊中でT細胞因子-1(TCF1)を発現するCD8+ T細胞のサブセットが幹細胞様特性を示すことが確認されており、これはさらに終末的に疲弊したT細胞を生じさせ、ICB療法後の増殖バーストの原因であることが確認されている12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,22。しかし、抗原特異的TCF1+CD8+ T細胞のごく一部しかTMEに存在せず、ICB23、24、25、26に応答して分化した子孫の拡張プールを生成することが証明されている。この集団の限られたサイズが、腫瘍の進行を制御するために細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の持続性を保証するのに十分であるかどうかは不明のままであり、末梢組織からの補充があるかどうかはさらなる調査を必要とする。さらに、最近の研究は、既存の腫瘍特異的T細胞の再活性化能力が不十分であり、抗プログラム細胞死タンパク質1治療後の新規で以前は存在しなかったクロノタイプの出現を示唆している。これは、チェックポイント遮断に対するT細胞応答が、T細胞クローン27の別個のレパートリーの新たな流入によるものかもしれないことを示す。TMEにおける傍観者の非腫瘍反応性細胞傷害性T細胞画分の存在とともに、これらの知見は、末梢由来CD8+ T細胞の役割を研究するための腫瘍同種移植片モデルの確立を促した11。
これまで、数種類の腫瘍移植、ならびに免疫細胞養子移入が、腫瘍免疫学28の分野において広く用いられてきた。他の組織に由来するTIL、末梢血単核球、および腫瘍反応性免疫細胞は、これらの方法を用いて十分に特徴付けることができる。しかし、全身抗腫瘍免疫と局所抗腫瘍免疫との相互作用を研究する場合、これらのモデルは、末梢に由来する免疫細胞とTMEとの間の相互作用を調べるには不十分であると思われる。ここでは、ドナーから腫瘍マッチレシピエントマウスに腫瘍組織を移植し、レシピエント由来免疫細胞の流入を正確にトレースし、TME中のドナー由来細胞を同時に観察した。
この研究では、代理ネオ抗原オボアルブミンを安定に発現するB16F10-OVAメラノーマ細胞株を用いて、メラノーマのマウス同系モデルを確立した。TCRトランスジェニックOT-Iマウスは、CD8+ T細胞の90%以上がクラスI MHC分子H2-Kbに結合したOVA由来ペプチドOVA257-264(SIINFEKL)を特異的に認識し、B16F10-OVA腫瘍モデルで開発された抗原特異的T細胞応答の研究を可能にする。このモデルを腫瘍移植と組み合わせると、腫瘍固有の抗原特異的CD8+ T細胞と末梢起源の抗原特異的CD8+ T細胞の免疫応答を比較し、これら2つの集団間の動的移行を明らかにした。全体として、この実験計画は、TME中のCD8+ T細胞の免疫応答を正確に調査するための別のアプローチを提供し、TMEにおける腫瘍特異的T細胞免疫応答のダイナミクスに新しい光を当てる。
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Protocol
すべてのマウス実験は、第三軍事医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに準拠して実施された。体重18~22gの6~8週齢のC57BL/6マウスおよび素朴なOT-Iトランスジェニックマウスを使用する。無作為化や「盲検化」を行わずに男性と女性の両方を使用してください。
培地および試薬の調製
- ダルベッコの改変イーグル培地に10%ウシ胎児血清(FBS)、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを添加して、前述の29 と同様に細胞培養培地D10を調製する。
- RPMI-1640に10%FBS、100U/mLペニシリン、および100mg/mLストレプトマイシンを添加して細胞培養培地R10を調製する。
注:培養培地D10およびR10は、2〜4°Cで保存した場合、少なくとも2週間は無菌で安定なままにすることができます。 - 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に2%FBSおよび0.01%のアジ化ナトリウムを補充することによって、蛍光活性化細胞選別(FACS)緩衝液を調製する。
注:アジ化ナトリウムを添加すると、FACSバッファーは2〜4°Cで数ヶ月間保存することができます。 - 二重蒸留水に155 mM NH 4 Cl、10 mMKHCO3、および0.1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えて赤血球溶解(RBL)バッファーを調製し、そのpHを7.3に調整する。
注:RBLバッファーは、室温(RT)で最大3ヶ月間安定です。 - PBSに0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および2mM EDTAを補充することにより、磁気活性化細胞選別(MACS)バッファーを調製する。
注:試薬を溶解し、無菌で保存した後、溶液を0.22μmフィルターに通す必要があります。 - 2,2,2-トリブロモエタノールの作用溶液を調製する。
- 2.5gの2,2,2-トリブロモエタノールを5mLの tert-アミルアルコール(2-メチル-2-ブタノール)に溶解する。蒸気浴、恒温バイブレーターで180rpm、40°Cで一晩撹拌する。
- 溶液を0.22 μmフィルターで滅菌容器にろ過します。200mLの最終容量まで二重蒸留水を加え、溶液が透明で透明になるまで徹底的に連続的に混合する。
- 溶液のpH値を決定し、7.3に調整する。容器をアルミホイルで完全に包み、光を避けて4°Cで保存してください。
注:2,2,2-トリブロモエタノールの作業溶液の最終濃度は12.5mg / mLである。より濃縮された溶液は、材料がより高い濃度で刺激性であるため、推奨されない。各使用前に作業溶液のpH値を試験し、pHが5未満の場合は廃棄する。
B16F10-OVA細胞懸濁液の調製
注:細胞培養は、厳格な無菌条件下でバイオセーフティフード内で行う必要があります。
- B16F10-OVA細胞のバイアルをD10とともに解凍し、37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーター内で培養する。
- 細胞が約80〜90%のコンフルエントに達すると、細胞を継代培養する。
- ピペッターで培養液を取り出し、PBSを用いて細胞を2回すすぎます。
注:フラスコまたは細胞培養皿内の付着細胞に対してPBSを無理に添加しないでください。代わりに、PBSを側壁に向かってピペットするか、フラスコまたは皿に滴下して加えます。 - PBSを取り出し、1〜2mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液をフラスコまたはディッシュに加える。細胞表面全体を覆うように前後に揺らします。フラスコまたはディッシュを、細胞が剥離するまで37°Cで約1分間またはRTでインキュベーターに入れる。
注:倒立顕微鏡を使用して、細胞が剥離したかどうかを確認できます。 - 新鮮なD10を加えてトリプシン処理を停止します。懸濁液を上下にピペットでピペットして、すべての細胞がフラスコまたはディッシュ表面から解離することを確認します。
- B16F10-OVA細胞懸濁液を15mL円錐管に移す。細胞を125 × g でRTで5〜7分間遠心分離する。
- 上清を捨て、細胞ペレットをD10で再懸濁した。B16F10-OVA細胞懸濁液をD10を含む新しいフラスコまたは細胞培養皿に分注し、37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーター内でインキュベートする。
- ピペッターで培養液を取り出し、PBSを用いて細胞を2回すすぎます。
- 腫瘍移植の日に、ステップ2.2.1〜2.2.4に記載されるように〜90%コンフルエントであるB16F10−OVA細胞を採取する。上清を捨て、細胞ペレットを1mLのPBSで再懸濁した。
- 0.4%トリパンブルーを用いた血球計数器で生細胞を計数する。PBSを加えて100 μLあたり1×106 細胞に細胞密度を調整します。細胞を氷の上に保ちます。
3. マウスの鼠径部へのB16F10-OVA細胞の異所性腫瘍移植
- 体重18〜22gの6〜8週齢のC57BL / 6マウスを使用してください。無作為化や「盲検化」を行わずに男性と女性の両方を使用してください。
- 調製したB16F10-OVA細胞懸濁液100 μLを1 mLツベルクリンシリンジに引き抜く。バレルをタップして気泡を上に移動し、プランジャーを静かに押して気泡を取り除きます。
- マウスを拘束し、腹部を露出させます。左後肢を小指で押して、左鼠径部の皮膚を引き締めます。
- マウスの毛を左下腹部から電気シェーバーで取り除きます。75%エタノールに浸した綿を使用して、左腹部の後象限をきれいにしてください。
- 針の斜めを上に向けて注射器を非常に浅い角度(0〜15°)で保持し、左大腿部上部の部位に挿入し、皮下組織を通って鼠径部に0.5〜1cm前進する。
- 注射する前にプランジャーを後ろに引いてください。負圧がある場合は、プランジャーを完全に押し下げ、下枝に小さなボーラス(流体ポケットの形成)が現れるのを観察します。
メモ:血液が針ハブに引き戻された場合は、引き抜いて別の場所でもう一度やり直してください。 - 注射を行った後に針を取り外し、適切に処分してください。マウスを放してケージに戻します。
- B16F10-OVA移植後のバーニアスケールを用いて6~8日目に腫瘍サイズを測定する。直径約3mm(緑豆サイズ)の腫瘍を有するマウスを選択し、それらを均等かつランダムに2つの群に分ける。
注:同様のサイズの腫瘍を有するマウスは、ドナーマウスおよびレシピエントマウスとしてランダムに割り当てられる。ドナーマウスから摘出したマッチした腫瘍組織をレシピエントマウスに移植する。さらに、養子細胞導入およびマウスの一般的な健康に対する手術の影響を評価するために、非手術対照および偽手術対照を含めるべきである。したがって、担癌マウスの1つの群は、CD45.1+CD45.2+またはCD45.1+ OT-I細胞のいずれかを投与するが、手術を受けない非手術対照として機能する。他の群のマウスは偽手術対照として機能し、CD45.1+CD45.2+またはCD45.1+ OT-I細胞のいずれかを受け、その後の実験群と同様の手術を受けたが、同種移植は行われなかった。
4. 生態的にマークされたOT-I T細胞の担癌マウスへの養子移入
- 移入の前日に、200μLのPBSに溶解したシクロホスファミド4mgを腹腔内注射で各担癌マウスに投与する。
注:シクロホスファミドによる治療は、移入細胞のための「空間」を産生する宿主にリンパ球減少症を誘導し、それらの生存を促進し、効率的に機能するようにリンパ器官にホーミングすることを目的としている。 - 明確な同遺伝子マーカー(6〜8週齢、18〜22g、担癌マウスと同じ性別)を有する素朴なOT-Iトランスジェニックマウスを使用する。CD45.1+ OT-IマウスおよびCD45.1+CD45.2+ OT-Iマウスを使用して、OVA257-264抗原特異的T細胞をそれぞれ担がんドナーマウスおよびレシピエントマウスに養子的に移入する。
注:養子移入されたOT-I細胞の起源は、明確な同遺伝子マーカーまたは蛍光マーカーを示す場合、容易に同定することができる。例えば、CD45.1+ OT-I T細胞をB16F10-OVA担持ドナーマウスに注射し、CD45.1+CD45.2+ OT-I T細胞をB16F10-OVA担持レシピエントマウスに注射する。CD45.1およびCD45.2は、いずれも汎リンパ球マーカーCD45(Ly5)のアイソフォームである。他の一般的に使用される同遺伝子マーカーには、CD90(Thy1)の異なるアイソフォームが含まれる。このプロトコルは、異なるコンジェニックマーカーを有するマウスに使用することができる。OT-Iマウスは、拒絶反応の問題を避けるために、OT-I細胞導入を受けたマウスと同じ性別であるべきである。 - OT-Iマウスの脾臓およびリンパ節からリンパ球を単離する。
注:このステップの次の手順は、厳格な無菌を維持するためにバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。- 60 mm × 10 mm のペトリ皿を 2 つ用意します。3 mL の R10 培地を 1 つのディッシュに加え、3 mL の RBL バッファーを別のディッシュに加えます。RBL緩衝液を含むディッシュに70μmナイロンセルストレーナーを置く。
- OT-Iマウスをイソフルランチャンバー内で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
- マウスの脾臓、鼠径部(下腸骨)、および腋窩リンパ節を収穫し、それらを氷上のR10の3mLを含む60mm×10mmの皿に移す。
注:屠殺するOT-Iマウスの数は、移治する担癌マウスの数に応じて調整され得る。OT-I CD8+ T細胞の脾臓および両側鼠径部および腋窩リンパ節からのOT−I CD8+ T細胞の典型的な収量は、マウス当たり〜30〜100×106個の細胞である。 - 1 mLシリンジのエンドバレルを使用して、ストレーナーを通して3 mLのRBL緩衝液で脾臓を浸軟させる。RTで3分間インキュベートし、3mLの低温R10培地を加えて反応を終了させた。
- 結合組織だけが残るまでリンパ節をマッシュアップする。フィルターをR10ですすいでください。細胞懸濁液を新しい15mL円錐管に移す。500 × g、4°Cで6分間遠心分離機。
- 上清をデカントし、細胞を3mLのMACS緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を新しい70μmのセルストレーナーに通し、フロックを除去します。
- 細胞懸濁液を500× g で4°Cで5分間遠心分離する。 上清をデカントする。
- マウスCD8+ T細胞単離キット(材料表を参照)を使用して、製造元のプロトコルに従って、ネガティブセレクションによってCD8+ T細胞を精製します。
メモ: 他社のキットを使用する場合は、製造元の指示に従ってください。 - 精製した細胞懸濁液を氷上に保管する。細胞の小さなサンプルを採取し、トリパンブルーと混合して血球計数器を使用して細胞を数えます。
- OT-I(生/死型CD8+Va2+)細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定します。
注:転写前に細胞の正しい表現型を検証するために、同遺伝子マーカーとトランスジェニックTCRの同時染色を行う必要があります。- 1.5 mL遠沈管内の1 mLのFACS緩衝液に5×104-1 × 105細胞を加え、細胞懸濁液を350 × g、4°Cで3分間遠心分離した。
- 上清を捨て、チューブの底をフリックして細胞を分散させた。チューブを氷の上に置きます。
- 以下のコンジュゲート抗体混合物(100μL FACS緩衝液で希釈)を調製する:抗CD8、1:200;抗TCR Vα2, 1:100;アンチCD45.1、1:200;アンチCD45.2、1:200;生/死、1:200( 資料表参照)。
- 抗体カクテルをボルテックスし、15,000× g で3分間遠心分離し、抗体凝集体をペレット化する。カクテルを氷の上に保管し、光から保護してください。
- 細胞を100 μLの抗体カクテルで再懸濁し、チューブをフリックして十分に混合する。氷上で暗闇の中で30分間インキュベートする。
注:チューブの底にある抗体凝集体を乱さないでください。 - ペレットを1mLのFACS緩衝液で2回洗浄する。350 × g、4°Cで3分間遠心分離機。細胞を200 μLのFACSバッファーに再懸濁し、細胞懸濁液をFACSチューブに移す。
注:移送するOT-I細胞の生存率を維持するために、できるだけ早く検体を試験してください。染色されたOT-I細胞をすぐに試験できない場合は、細胞を氷上で暗所に保管するか、分析まで4°Cで冷蔵してください。あるいは、サンプルを1〜4%パラホルムアルデヒドに再懸濁して、劣化を防ぐために長期保存(16時間)することもできます。 - 試料をフローサイトメーター上で実行します。生/死-CD8+Vα2+細胞の数を生/死細胞の数で割ることによって、生/死-CD8+Va2+細胞の割合を計算する。
- OT-I細胞(生/死-CD8+Va2+)の絶対数を決定するには、生/死-CD8+Va2+細胞の割合にステップ4.3.9で得られた生細胞数を乗じます。
- OT-I細胞(生/死血CD8+Va2+)の濃度をPBSで1.5×106/ mLに調整します。
- 200 μLのPBS中の3つ×105 個の異なる先天的にマークされたOT-I細胞(生/死-CD8+Va2+)を、B16F10-OVA担持マウス(ステップ3.8からドナーマウスとレシピエントマウスに分けた担癌マウス)の2つのグループに静脈内注射する。
- 200 μL の OT-I 細胞 (生/死型 CD8+Va2+) 懸濁液を 100 U インスリン注射器 (29 G) に抜き取り、ステップ 3.2 と同様に気泡を除去します。
- マウスをケージに別々に入れ、ケージの上に赤外線ランプをかけて5〜10分間置き、尾静脈を拡張します。マウスを適切なサイズの拘束装置で固定する。尾を引っ張ってまっすぐにし、静脈を見えるように75%エタノールでスプレーします。
- シリンジを静脈と平行に保持し、0〜15°の角度で静脈に挿入します。プランジャーを少し引き戻し、血液がバレルに入った場合は、1mL/min以下の速度で懸濁液をゆっくりと着実に注入します。
注:注射部位の抵抗または腫れは、針が静脈の内側にないことを示します。注射部位を近位で移動させるべきである。 - 注射が完了したら、シリンジを取り外し、挿入領域を3〜5秒間静かに押して出血を止めます。マウスをケージに戻し、副作用がないか数分間注意深く観察します。それが正常な可動性と鼻汁を持っているならば、それを他のマウスの会社に戻してください。
5. 担がんドナーマウスの腫瘍塊を解剖する
注:セクション5および6の手術中は無菌状態を維持してください。すべての手術器具は、使用前と使用後にオートクレーブ処理して滅菌します。バイオセーフティキャビネット内の操作領域を75%エタノールで消毒し、続いて紫外線を照射します。清潔なガウン、帽子、フェイスマスク、滅菌手袋を着用してください。
- 養子移入の8〜10日後に、直径〜5mm(大豆サイズ)の同等の腫瘍塊を有するドナーマウスを移植手術用に選択する。
- バイオセーフティキャビネットに100 mm×20 mmのディッシュを準備し、滅菌氷冷PBSを10 mL加える。
- 担癌ドナーマウスをイソフルランチャンバー内で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。マウスを75%エタノールに3〜5分間浸漬し、バイオセーフティキャビネットに移す。
注:このステップの次の手順は、厳格な無菌を維持するためにバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。 - 清潔な吸収紙で覆われた解剖ボードの上にマウスを仰臥位に置きます。解剖針でマウスの四肢を拘束する。
- はさみで尿道オリフィスの上から剣状体まで正中線に沿って皮膚を切断する。ピンセットで皮膚をマウスの体の左側に伸ばし、解剖針で皮膚を拘束します。
- 腫瘍を切除し、そのカプセルをできるだけ無傷に保つ。外科用はさみで腫瘍の近くの結合組織を注意深く静かに除去する。
注:腫瘍の完全性を維持するために、腫瘍カプセルを剥がしたり、腫瘍組織を細かく切断したりしないでください。 - 腫瘍組織を、その後の移植のために10mLの滅菌氷冷PBSを含む100mm×20mmのディッシュに入れた。
6. ドナー由来腫瘍を腫瘍一致レシピエントマウスに皮下移植
注:同種移植片は、以前に存在していた腫瘍と同じ側のマウスの下側腹部に移植され、2つの腫瘍が同一のリンパ節に排出されることになっている。ここで提示されたプロトコールでは、B16F10-OVA腫瘍をマウスの左鼠径部の皮下に移植したように(セクション3)、ドナー由来腫瘍組織を、このステップでレシピエントの左脇腹に移植した。移植部位は、最初に移植された腫瘍部位に適合させることができる。
- 腫瘍マッチしたレシピエントマウスに250mg/kgの2,2,2-トリブロモエタノールを腹腔内注射で麻酔する。麻酔のレベルを評価し、手術を行うための麻酔の適切な深さを示す痛み反射の欠如を待つために、マウスの伸筋肢のつま先をつまむ。発声または後肢離脱が観察される場合は、さらに0.01−0.03mLの2,2,2−トリブロモエタノールを注入する。
注:腫瘍一致レシピエントマウスは、拒絶反応の問題を回避するために、同種移植片を提供するドナーマウスと同じ性別であるべきである。 - 乾燥を防ぐために目に獣医用軟膏を使用してください。マウスの左脇腹を電気シェーバーで剃ります。脱毛クリームを塗布して残りの髪を取り除きます。
注:汚れや感染のリスクを高める可能性のある皮膚の擦り傷は避けてください。 - マウスをバイオセーフティキャビネットに入れます。マウスの縦軸が実験者の右側に平行で、きれいな吸収紙で覆われた解剖ボード上の傾向がある位置に置きます。
注:このステップの次の手順は、厳格な無菌を維持するためにバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。 - ポビドンヨードに浸した綿で剃った部分の皮膚をこすります。
注:体温の損失を防ぐために、滅菌のために75%エタノールの代わりにポビドンヨウ素を使用してください。 - マウスの股関節の間の中心点にある皮膚を外科用ピンセットで持ち上げます。はさみを使用して、長さ5mmの垂直切除を行います。切り欠きを背側正中線に沿って吻側に約10〜15mmまで伸ばす。
- はさみの閉じた先端を切開部に挿入し、左脇腹の腹膜を皮膚および軟部組織から分離するために開いて鋭い解剖を行う。
注:皮下組織および腹膜に損傷を与えないように、切開部の中心にある皮膚を持ち上げてから、閉じたはさみをできるだけ皮膚の近くに挿入してください。 - 鋭い解剖を数回行って左脇腹に皮膚ポケットを作ります。カプセル化された無傷のドナー由来腫瘍塊をカプセルに沈着させる。
注:偽手術対照群のマウスは、ドナー由来腫瘍移植なしで同じ手術を受ける。 - 中断された縫合糸で切開部を閉じます(材料リストを参照)。各切開部に2〜3本の縫合糸を置く。ポビドンヨードに浸した綿でカットの周りの皮膚を消毒します。
注:2つの連続したステッチの間に5 mm、切開部から3 mmの距離が必要です。 - マウスを清潔で暖かいケージの横の位置に置きます。胸骨の臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、継続的に監視してください。
- ブプレノルフィンを皮下投与し、手術後3回8時間ごとに0.1mg/kg体重で投与し、痛みを和らげます。マウスの食べたり、飲んだり、動いたり、手術をしている場所を監視します。移植レシピエントは、完全に回復した後にのみ他の動物の会社に返してください。
注:マウスは通常、3日以内に手術の外傷から回復します。マウスが正常な摂食と可動性に戻らず、感染の症状を示す場合は、獣医師に介入を依頼するか、安楽死させてください。 - 示された時点でマウスを屠殺(ステップ4.3.2のように動物を安楽死させる)し、フローサイトメトリー分析のために目的の細胞を回収した。
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Representative Results
このプロトコルの概略を図1に示します。腫瘍接種から8日後、CD45.1+およびCD45.1+CD45.2+ OT-I細胞をB16F10-OVA担がんC57BL/6マウスに注射した。腫瘍を、移植後8日目にCD45.1+ OT-I細胞移植マウス(ドナー)から外科的に切除し、移植腫瘍と同じ側の背側腹部の腫瘍マッチCD45.1+CD45.2+ OT-I細胞移植マウス(レシピエント)に移植した。フローサイトメトリー(図2に示すゲーティング戦略)分析により、CD45.1+ドナー由来およびCD45.1+CD45.2+レシピエント由来TILを含む、CD44+CD8+腫瘍抗原特異的T細胞の2つの集団をTMEにおいて容易に同定することができる。続いて、抗原特異的CD8+ T細胞の動態を研究するために、同種移植片内のこれら2つの集団の割合を、示された時点で分析した。移植後2日目には、移植腫瘍内にドナー由来抗原特異的CD8+ T細胞が約83%存在し、レシピエント由来のCD8+ T細胞よりも優勢であった。しかしながら、レシピエント由来OT-I細胞の割合は腫瘍形成の後期段階で上昇し、ドナー由来の腫瘍固有のOT-I細胞を上回った。(図3)。
図1:実験計画の概略図C57BL/6マウスは、鼠径部のB16F10-OVA腫瘍で挑戦される。8日後、異なる先天的にマークされたOT-I細胞(CD45.1+またはCD45.1+CD45.2+)が担癌マウスに移入される。移植後8日目に、CD45.1+ OT-I細胞移植マウスの腫瘍を外科的に解剖し、既存の腫瘍と同じ側の脇腹部の腫瘍マッチCD45.1+CD45.2+ OT-I細胞移植レシピエントに皮下移植した。次いで、マウスを屠殺し、同種移植片内の抗原特異的T細胞(OT−I細胞)を、指示された時点で分析する。略語: CD = 分化のクラスター;i.v. = 静脈内;サック=犠牲。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フローサイトメトリー分析のゲーティング戦略。同種移植片内のドナー由来(CD45.1+)およびレシピエント由来(CD45.1+CD45.2+)抗原特異的CD44+CD8+ T細胞を同定するために使用されるゲーティング戦略。略語: SSC-A = 側方散乱面積;FSC-A = 前方散乱面積;FSC-W = 前方散乱幅;FSC-H = 前方散乱高さ;SSC-W = 側面散乱幅;SSC-H = 側面散乱高さ;L / D = 生きている/死んだ;CD = 分化のクラスター。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:腫瘍同種移植片内のドナー由来およびレシピエント由来抗原特異的CD8+ T細胞の比率。 移植後2日目、8日目、および15日目における腫瘍同種移植片内のドナー由来およびレシピエント由来OT−I細胞を同定するために用いられる同遺伝子マーカーCD45.1およびCD45.2の発現を示す代表的なフローサイトメトリープロット。数字は、CD44+CD8+ T細胞集団における2つのサブセットの割合を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
T細胞媒介性免疫は腫瘍に対する免疫応答において重要な役割を果たしており、CTLはがん細胞の根絶において主導的な役割を果たしている。しかしながら、TME内の腫瘍抗原特異的CTLの起源は解明されていない30。この腫瘍移植プロトコールの使用は、幹細胞様TCF1+前駆CD8+ T細胞が存在するにもかかわらず、腫瘍内抗原特異的CD8+ T細胞が長期間持続しない可能性があるという重要な手がかりを提供してきた。注目すべきは、末梢由来腫瘍特異的CD8+ T細胞が腫瘍塊に連続的に流入していることです。
我々の知る限り、これは、TME内の抗原特異的CD8+ T細胞の維持が、腫瘍常在性TILの自己複製ではなく、末梢由来腫瘍特異的CD8+ T細胞の補充に主に依存することを確認する比較的便利で説得力のある方法である。ここで提示されたプロトコルは、ドナー由来およびレシピエント由来のTILの割合にのみ焦点を当てているが、これら2つの集団の表現的、機能的、および転写的特性は、フローサイトメトリーで容易に調べることができる。さらに、ICB抗体を組み合わせて、ICB治療に対する特定の細胞サブセットの応答を調べることが可能である。
このプロトコールでは、ドナー由来の腫瘍組織を、既存の元の腫瘍を有するレシピエントマウスに移植する。レシピエントマウスの2つの腫瘍は、末梢で生成されたT細胞を2つの腫瘍塊に分布させることになる。さらに、移植を受けていない動物と比較して腫瘍量はほぼ2倍になります。パイロット実験では、移植前にレシピエントマウスの元の腫瘍を切除することを試みた。しかし、手術によってすべての腫瘍細胞を徹底的に排除することは技術的に困難でした。残留腫瘍細胞は急速に新しい腫瘍組織を形成するであろう。したがって、T細胞免疫応答を非移植マウスにおけるものと比較する場合、この系には限界がある。しかしながら、このシステムは、ドナー担癌マウスから移植された同じTME内の最近遊走したT細胞と既存のT細胞との比較に依然として有用である。その上、腫瘍組織の移植が炎症を引き起こし、腫瘍内の免疫細胞動態に影響を与える可能性があることは否定できない。OT-I細胞浸潤に対する手術の影響は、非手術および偽手術対照によって除外することができたが、OT-I細胞ダイナミクスに対する局所炎症反応の影響は評価しなかった。
いくつかの考慮事項を考慮する必要があり、そのうちの1つはシクロホスファミドの使用である。シクロホスファミド31 は、固形臓器悪性腫瘍およびリンパ増殖性および自己免疫障害を治療するために広く使用されているアルキル化剤である。B16F10−OVA接種後6〜8日後に、養子移入前にシクロホスファミドを投与して、宿主マウスのリンパ枯渇を誘導し、移入されたOT−I細胞29の活性を増強する。黒色腫はこの試薬に感受性ではないが、マウス胸腺リンパ腫細胞株であるEG732などのいくつかの腫瘍細胞株は、シクロホスファミドに応答する。シクロホスファミドによるEG7含有マウスの治療は、腫瘍の根絶をもたらし、これは、シクロホスファミドを敏感な腫瘍モデルのために注意深く使用または滴定しなければならないことを示唆している。推奨される代替方法は、移送の1日前に1回の致死量以下の放射線(4.5〜5.5Gy)であり、最適な選択は腫瘍細胞株の特性に依存する。
他のステップは、担がんドナーマウスの慎重な選択や腫瘍移植中の繊細な外科手術など、慎重に行う必要があります。移植された腫瘍は外科的に除去され、移入後8〜10日目に腫瘍マッチレシピエントマウスに移植されるであろう。移植前に、直径約5mmの同等のサイズの腫瘍塊を同種移植片として選択して、個々のマウス間の不一致を低減し、取得したデータの信頼性を高める。さらに、手術中、切開部はマウスの正中線の近くにあるべきであり、同種移植片をレシピエントマウスに既に存在する腫瘍から遠ざけておくべきである。穏やかな解剖はまた、鼠径リンパ節および周囲の組織の傷害を防ぐために示唆される。
癌細胞を効果的に殺傷するには、TME33内の様々な成分の調整が必要である。ここで提示されたプロトコルは、ナチュラルキラー細胞、腫瘍関連マクロファージ、樹状細胞などの適応免疫細胞および自然免疫細胞の調査に拡張することができる。さらに、ここで利用されるB16F10−OVAに加えて、このプロトコルは、他の皮下腫瘍モデルに適用することができる。結論として、前述の腫瘍移植アッセイは、抗腫瘍応答中の特定のタイプの免疫細胞の相互作用的移行の研究のための新しいアプローチを提供し、腫瘍免疫学の研究者にとって有用である。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、国家自然科学基金(LYに31825011番)と中国国家自然科学財団(31900643番からQHへ、31900656番からZWへ)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
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- Thorsson, V., et al.
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がん研究 第172号Erratum
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 04/29/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
