ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Здесь мы представляем протокол трансплантации опухоли для характеристики присущих опухоли и периферийных инфильтрированных опухолью лимфоцитов в модели опухоли мыши. Специфическое отслеживание притока иммунных клеток реципиентного происхождения с помощью проточной цитометрии выявляет динамику фенотипических и функциональных изменений этих клеток при противоопухолевых иммунных реакциях.
Abstract
Т-клеточный иммунитет играет решающую роль в иммунных реакциях против опухолей, причем цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) играют ведущую роль в искоренении раковых клеток. Однако происхождение и пополнение опухолевых антиген-специфических CD8+ Т-клеток в микроокружении опухоли (TME) остаются неясными. В этом протоколе используется клеточная линия меланомы B16F10-OVA, которая стабильно экспрессирует суррогатный неоантиген, овальбумин (OVA) и трансгенные TCR OT-I мыши, у которых более 90% CD8+ Т-клеток специфически распознают OVA-производный пептид OVA257-264 (SIINFEKL), связанный с молекулой основного комплекса гистосовместимости класса I (MHC) H2-Kb. Эти особенности позволяют изучать антиген-специфические ответы Т-клеток во время опухолевого генеза.
Комбинируя эту модель с хирургией трансплантации опухоли, опухолевые ткани от доноров были пересажены опухолевым сингенным мышам-реципиентам, чтобы точно проследить приток иммунных клеток реципиентного происхождения в трансплантированные донорские ткани, что позволяет анализировать иммунные реакции опухолевых и периферийно-специфических антиген-специфических CD8 + Т-клетки. Было обнаружено, что между этими двумя популяциями происходит динамический переход. В совокупности этот экспериментальный проект обеспечил еще один подход к точному исследованию иммунных реакций CD8 + Т-клеток в TME, что прольет новый свет на иммунологию опухолей.
Introduction
CD8 + Т-клеточный иммунный ответ играет ключевую роль в контроле роста опухоли. Во время опухолевого генеза наивные CD8+ Т-клетки активируются при распознавании антигена ограниченным способом MHC класса I и впоследствии дифференцируются в эффекторные клетки и проникают в опухолевую массу 1,2. Однако в микроокружении опухоли (TME) длительное воздействие антигена, а также иммуносупрессивные факторы приводят инфильтрированные опухолеспецифические CD8 + Т-клетки в гипочувствительное состояние, известное как «истощение»3. Истощенные Т-клетки (Tex) отличаются от эффекторных Т-клеток или Т-клеток памяти, генерируемых при острой вирусной инфекции, как транскрипционно, так и эпигенетически. Эти текс-клетки в основном характеризуются устойчивой и повышенной экспрессией ряда тормозных рецепторов, а также иерархической потерей эффекторных функций. Кроме того, нарушение пролиферативной способности истощенных CD8+ Т-клеток приводит к уменьшению количества опухолеспецифических Т-клеток, так что остаточные CD8+ Т-клетки в TME едва ли могут обеспечить достаточный защитный иммунитет против прогрессирования опухоли3. Таким образом, поддержание или подкрепление внутриопухолевых антиген-специфических CD8+ Т-клеток незаменимо для подавления опухоли.
Кроме того, считается, что терапия блокады иммунных контрольных точек (ICB) оживляет Tex в опухолях, увеличивая инфильтрацию Т-клеток и, следовательно, количество Т-клеток и омолаживая функции Т-клеток для усиления подавления опухоли. Широкое применение лечения ICB изменило ландшафт терапии рака, при этом значительная часть пациентов испытывает длительные ответы 4,5,6. Тем не менее, большинство пациентов и типов рака не реагируют или только временно реагируют на ICB. Неадекватная инфильтрация Т-клеток в TME была постулирована как один из основных механизмов, объясняющих устойчивость ICB 7,8.
Несколько исследований продемонстрировали гетерогенность инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток (ТИЛ) как у пациентов, так и у мышеймоделей 9,10,11,12. Было подтверждено, что подмножество CD8+ Т-клеток, экспрессирующих Т-клеточный фактор-1 (TCF1) в опухолевой массе, проявляет свойства, подобные стволовым клеткам, которые могут в дальнейшем привести к терминально истощенным Т-клеткам и ответственны за всплеск пролиферации после терапии ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Однако было доказано, что лишь небольшая доля антиген-специфических TCF1+CD8+ Т-клеток существует в TME и генерирует расширенный пул дифференцированного потомства в ответ на ICB 23,24,25,26. Достаточно ли ограниченного размера этой популяции для обеспечения персистенции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) для контроля прогрессирования опухоли, остается неизвестным, и есть ли пополнение из периферийных тканей, требует дальнейшего изучения. Кроме того, недавние исследования свидетельствуют о недостаточной способности к оживлению ранее существовавших опухолеспецифических Т-клеток и появлении новых, ранее не существовавших клонотипов после антизапрограммированного лечения белком гибели клеток 1. Это указывает на то, что реакция Т-клеток на блокаду контрольных точек может быть обусловлена новым притоком отдельного репертуара клонов Т-клеток27. Вместе с присутствием неопухолевой цитотоксической фракции Т-клеток в ТМЭ эти результаты побудили к созданию модели аллотрансплантата опухоли для изучения роли периферийных CD8+ Т-клеток11.
До сих пор несколько видов имплантации опухолей, а также приемный перенос иммунных клеток широко использовались в области иммунологии опухолей28. ТИЛ, мононуклеарные клетки периферической крови и опухолеспособные иммунные клетки, происходящие из других тканей, могут быть хорошо охарактеризованы с помощью этих методов. Однако при изучении взаимодействий между системным и местным противоопухолевым иммунитетом эти модели оказываются недостаточными для изучения взаимодействий между иммунными клетками, полученными с периферии и ТМЭ. Здесь опухолевые ткани были пересажены от доноров мышам-реципиентам, чтобы точно проследить приток иммунных клеток реципиентного происхождения и одновременно наблюдать за клетками донорского происхождения в TME.
В этом исследовании была установлена мышиная сингенная модель меланомы с клеточной линией меланомы B16F10-OVA, которая стабильно экспрессирует суррогатный неоантиген овальбумин. Трансгенные мыши TCR OT-I, у которых более 90% CD8+ Т-клеток специфически распознают OVA-производный пептид OVA257-264 (SIINFEKL), связанный с молекулой MHC класса I H2-Kb, позволяют изучать антиген-специфические ответы Т-клеток, разработанные в модели опухоли B16F10-OVA. Сочетая эту модель с трансплантацией опухоли, иммунные реакции присущих опухоли и происходящих на периферии антиген-специфических CD8 + Т-клеток сравнивались, чтобы выявить динамический переход между этими двумя популяциями. В совокупности этот экспериментальный проект обеспечил еще один подход к точному исследованию иммунных реакций CD8 + Т-клеток в TME, что проливает новый свет на динамику опухолеспецифических иммунных реакций Т-клеток в TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с руководящими принципами Институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию Третьего военно-медицинского университета. Используйте 6-8-недельных мышей C57BL/6 и наивных трансгенных мышей OT-I весом 18-22 г. Используйте как мужчин, так и женщин без рандомизации или «ослепления».
1. Приготовление среды и реагентов
- Готовят клеточную культуральную среду D10, какописано ранее 29 , добавляя 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина в модифицированную орлиную среду Dulbecco.
- Готовят культуральную среду R10, добавляя RPMI-1640 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Питательные среды, D10 и R10, могут оставаться стерильными и стабильными в течение не менее 2 недель при хранении при 2-4 °C. - Приготовьте буфер флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), дополнив 1x фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) 2% FBS и 0,01% азида натрия.
ПРИМЕЧАНИЕ: С добавлением азида натрия FACS Buffer можно хранить при 2-4 °C в течение нескольких месяцев. - Подготовьте буфер лизиса эритроцитов (RBL), добавив 155 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3 и 0,1 мМ этилендиаминовой тетрауксусной кислоты (ЭДТА) в дважды дистиллированную воду и отрегулируйте ее рН до 7,3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер RBL стабилен до 3 месяцев при комнатной температуре (RT). - Подготовьте магнитно-активированный буфер сортировки клеток (MACS), добавив PBS 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ ЭДТА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор следует пропустить через фильтр 0,22 мкм после растворения реагента и сохранения в асептике. - Готовят рабочий раствор 2,2,2-трибромэтанола.
- Растворить 2,5 г 2,2,2-трибромэтанола в 5 мл трет-амилового спирта (2-метил-2-бутанол). Перемешивайте в паровозном вибраторе с постоянной температурой при 180 об/мин, 40 °C в течение ночи.
- Процедите раствор через фильтр 0,22 мкм в стерильный контейнер. Добавьте двойную дистиллированную воду до конечного объема 200 мл и тщательно и непрерывно перемешайте, пока раствор не станет прозрачным и прозрачным.
- Определите и отрегулируйте значение рН раствора до 7,3. Полностью оберните контейнер алюминиевой фольгой, чтобы исключить свет и хранить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация рабочего раствора 2,2,2-трибромэтанола составляет 12,5 мг/мл. Более концентрированный раствор не рекомендуется, потому что материал раздражает при более высоких концентрациях. Проверяйте значение рН рабочего раствора перед каждым использованием и отбрасывайте его, если рН меньше 5.
2. Приготовление клеточной суспензии B16F10-OVA
ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование клеток следует проводить в вытяжке биобезопасности в строгих асептических условиях.
- Разморозить и культивировать флакон с клетками B16F10-OVA с D10 в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C и 5% CO2.
- Когда клетки достигают слияния около 80-90%, клетки субкультурируются.
- Удалите питательную среду с помощью пипетки и дважды промойте клетки с помощью PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте PBS принудительно против адгезивных клеток в колбе или чашке для культивирования клеток. Вместо этого пипеткой PBS в сторону боковины или добавьте ее по каплям в колбу или блюдо. - Удалите PBS и добавьте 1-2 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в колбу или блюдо. Раскачивайте его взад и вперед, чтобы покрыть всю поверхность клетки. Поместите колбу или чашку в инкубатор при 37 °C в течение ~1 мин или при RT до тех пор, пока клетки не отсоединятся.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перевернутый микроскоп может быть использован для проверки того, отсоединились ли клетки. - Добавьте свежий D10, чтобы остановить трипсинизацию. Пипеткой суспензию вверх и вниз, чтобы все клетки были диссоциированы от колбы или поверхности тарелки.
- Перенесите суспензию ячейки B16F10-OVA в коническую трубку объемом 15 мл. Центрифугируют клетки при 125 × г в течение 5-7 мин при РТ.
- Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки D10. Дозируйте клеточную суспензию B16F10-OVA в новую колбу или чашку для клеточных культур, содержащую D10, и инкубируйте в инкубаторе клеточных культур при 37 °C и 5% CO2.
- Удалите питательную среду с помощью пипетки и дважды промойте клетки с помощью PBS.
- В день имплантации опухоли собирают клетки B16F10-OVA, которые на ~90% сливаются, как описано в шагах 2.2.1-2.2.4. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл PBS.
- Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра, используя 0,4% трипан синего цвета. Отрегулируйте плотность клеток до 1 × 106 ячеек на 100 мкл путем добавления PBS. Держите клетки на льду.
3. Внематочная опухолевая имплантация клеток B16F10-OVA в паховую область мышей
- Используйте 6-8-недельных мышей C57BL/6 весом 18-22 г. Используйте как мужчин, так и женщин без рандомизации или «ослепления».
- Выведите 100 мкл подготовленной клеточной суспензии B16F10-OVA в шприц туберкулина объемом 1 мл. Постучите по бочке, чтобы переместить пузырьки наверх, и осторожно нажмите на поршень, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Сдерживайте мышь и обнажайте ее брюшко. Прижмите мизинцем левую заднюю ногу, чтобы подтянуть кожу левой паховой области.
- Удалите волосы мыши с левой нижней части живота с помощью электробритвы. Используйте хлопок, пропитанный 75% этанолом, для очистки заднего квадранта левого живота.
- Удерживая шприц под очень небольшим углом (0-15°) со скосом иглы обращенным вверх, вставьте его в место левой верхней части бедра, и продвиньте 0,5-1 см через подкожную клетчатку в паховую область.
- Оттяните плунжер перед впрыском. Если есть отрицательное давление, полностью нажмите на плунжер и наблюдайте, как в подкожной клетчатке появляется небольшой болюс (образование кармана жидкости).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь втягивается обратно в игольчатый концентратор, выйдите и повторите попытку в другом месте. - Извлеките иглу после того, как инъекция будет проведена, и утилизируйте ее соответствующим образом. Отпустите и поместите мышь обратно в клетку.
- Измерьте размер опухоли на 6-8 день, используя шкалу Вернье после имплантации B16F10-OVA. Выберите мышей с опухолью диаметром ~ 3 мм (размером с боб мунг) и разделите их поровну и случайным образом на две группы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши с опухолями аналогичного размера случайным образом распределяются как донорские и реципиентные мыши; соответствующая опухолевая ткань, иссеченная у мышей-доноров, будет пересажена мышам-реципиентам. Кроме того, для оценки влияния операции на перенос клеток и общего состояния здоровья мышей следует включить неоперируемый контроль и фиктивный контроль. Таким образом, одна группа опухоленосных мышей служит в качестве неоперированных контрольных групп, получая либо CD45.1 + CD45.2+ , либо CD45.1 + OT-I клетки, но без хирургического вмешательства. Другая группа мышей служит в качестве фиктивного контроля, получая либо CD45.1 + CD45.2+ , либо CD45.1 + OT-I клетки и последующую операцию, аналогичную экспериментальной группе, но без трансплантации аллотрансплантата.
4. Перенос конгенно-маркированных Т-клеток OT-I мышам, несущим опухоль
- За день до переноса вводят 4 мг циклофосфамида, растворенного в 200 мкл PBS, путем внутрибрюшинной инъекции каждой опухоленосной мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение циклофосфамидом направлено на то, чтобы вызвать лимфопению у хозяина, который создает «пространство» для перенесенных клеток, способствуя их выживанию и нацеливаясь на лимфоидные органы для эффективного функционирования. - Используйте наивных трансгенных мышей OT-I с отчетливыми конгенными маркерами (6-8-недельные, 18-22 г, того же пола, что и опухоленосные мыши). Используйте мышей CD45.1+ OT-I и CD45.1 +CD45.2+ OT-I для принятия переноса антиген-специфических Т-клеток OVA257-264 опухолевым донорам и мышам-реципиентам соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Происхождение адаптированно перенесенных клеток OT-I может быть легко идентифицировано, если они имеют различные конгенные или флуоресцентные маркеры. Например, вводите CD45.1+ OT-I Т-клетки В16F10-OVA-несущим мышам-донорам, в то время как вводят CD45.1 + CD45.2 + OT-I Т-клетки в B16F10-OVA-несущих мышей-реципиентов. CD45.1 и CD45.2 являются изоформами пан-лимфоцитарного маркера CD45 (Ly5). Другие широко используемые конгенные маркеры включают различные изоформы CD90 (Thy1). Этот протокол может быть использован для мышей, несущих различные конгенные маркеры. Мыши OT-I должны быть того же пола, что и мыши, получающие перенос клеток OT-I, чтобы избежать проблем с отторжением. - Изолируйте лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов мыши OT-I.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры на этом этапе должны быть выполнены в шкафу биобезопасности для поддержания строгой асептики.- Приготовьте две чашки Петри × 60 мм × 10 мм. Добавьте 3 мл среды R10 в одну посуду, добавив 3 мл буфера RBL в другую посуду. Поместите 70 мкм нейлонового клеточного ситечка в чашку, содержащую буфер RBL.
- Усыплите мышь OT-I в изофлурановой камере с последующим вывихом шейки матки.
- Соберите селезенку, паховые (подвздошные) и подмышечные лимфатические узлы мыши и перенесите их на 60 мм × 10 мм блюдо с 3 мл R10 на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество принесенных в жертву мышей OT-I может быть скорректировано в зависимости от количества переносимых опухолей мышей. Типичный выход OT-I CD8+ Т-клеток из селезенки и двусторонних паховых и подмышечных лимфатических узлов OT-I CD8+ Т-клеток составляет ~ 30-100 × 106 клеток на мышь. - Используя концевой ствол шприца объемом 1 мл, мацерировать селезенку в 3 мл буфера RBL через ситечко. Инкубировать в течение 3 мин при РТ и прекратить реакцию добавлением 3 мл холодной среды R10.
- Размять лимфатические узлы до тех пор, пока не останутся только соединительные ткани. Промойте фильтр с помощью R10. Перенесите клеточную суспензию в новую коническую трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 500 × г, 4 °C в течение 6 мин.
- Декантировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 3 мл буфера MACS. Пропустите клеточную суспензию через новый 70-мкм клеточный ситечко, чтобы удалить все хлопья.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин при 4 °С. Декант супернатанта.
- Используйте комплект изоляции CD8+ Т-клеток мыши (см. Таблицу материалов) для очистки CD8+ Т-клеток отрицательным отбором в соответствии с протоколом производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании комплектов других компаний следуйте инструкциям производителя. - Держите очищенную клеточную суспензию на льду. Возьмите небольшой образец клеток и смешайте с трипаном синим для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
- Определение процента клеток OT-I (живых/мертвых-CD8+Va2+) методом проточной цитометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременное окрашивание конгенных маркеров и трансгенного TCR должно быть выполнено для проверки правильного фенотипа клеток перед переносом.- Добавьте 5 × 104-1 × 105 ячеек в 1 мл буфера FACS в центрифужной трубке объемом 1,5 мл и центрифугируйте клеточную суспензию при 350 × г, 4 °C в течение 3 мин.
- Выбросьте супернатант и рассейте клетки, щелкнув дном трубки. Поместите трубку на лед.
- Готовят следующие конъюгированные смеси антител (разведенные в буфере FACS 100 мкл): анти-CD8, 1:200; анти-TCR Vα2, 1:100; анти-CD45.1, 1:200; анти-CD45.2, 1:200; и живые/мертвые, 1:200 (см. Таблицу материалов).
- Вихрь коктейля антител и центрифуги при 15 000 × г в течение 3 мин до гранулированных антител. Храните коктейль на льду и защищайте его от света.
- Повторно суспендируйте клетки 100 мкл коктейля антител и тщательно перемешайте, щелкнув трубкой. Насиживать в темноте в течение 30 мин на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте нарушения агрегатов антител в нижней части трубки. - Дважды промыть гранулы 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 350 × г, 4 °C в течение 3 мин. Повторно суспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS и перенесите клеточную суспензию в трубку FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания жизнеспособности клеток OT-I, подлежащих переносу, протестируйте образец как можно скорее. Если окрашенные клетки OT-I не могут быть проверены немедленно, держите клетки в темноте на льду или храните в холодильнике при 4 ° C до анализа. Альтернативно, образцы могут быть повторно суспендированы в 1-4% параформальдегиде для длительного хранения (16 ч) для предотвращения порчи. - Запустите образец на проточном цитометре. Рассчитайте процент живых/мертвых клеток CD8+Va2+ , разделив количество живых/мертвых клеток CD8+Vα2+ на количество живых/мертвых клеток.
- Определите абсолютное количество клеток OT-I (живых/мертвых-CD8+Va2+) путем умножения процента живых/мертвых клеток CD8+Va2+ на число жизнеспособных клеток, полученное на шаге 4.3.9.
- Отрегулируйте концентрацию OT-I клеток (живых/мертвых CD8+Va2+) до 1,5 × 106/мл с PBS.
- Ввести 3 × 105 различных конгенно отмеченных клеток OT-I (живых/мертвых CD8+Va2+) в 200 мкл PBS внутривенно в две группы мышей, несущих B16F10-OVA (опухоленосные мыши, разделенные на доноров и мышей-реципиентов с этапа 3.8).
- Выведите 200 мкл суспензии ot-I клетки (живой/мертвой-CD8+Va2+) в шприц инсулина 100 Ед (29 г) и удалите пузырьки, как на этапе 3.2.
- Поместите мышь отдельно в клетку с инфракрасной лампой над клеткой на 5-10 минут, чтобы расширить хвостовую вену. Обездвижите мышь с помощью удерживающего устройства соответствующего размера. Потяните хвост, чтобы выпрямить его, и распылите 75% этанола, чтобы сделать вену видимой.
- Держите шприц параллельно вене и вставьте его в вену под углом 0-15°. Отодвиньте плунжер немного, и если кровь попадет в ствол, медленно и неуклонно впрыскивайте суспензию со скоростью не более 1 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление или отек в месте инъекции указывает на то, что игла не находится внутри вены; место инъекции должно быть перемещено проксимально. - После того, как инъекция будет завершена, снимите шприц и осторожно надавите на область введения в течение 3-5 с, чтобы остановить кровотечение. Верните мышь в клетку и внимательно наблюдайте за ней в течение нескольких минут на предмет побочных реакций. Если он имеет нормальную подвижность и выделения из носа, поместите его обратно в компанию других мышей.
5. Рассечение опухолевой массы у опухоленосных донорских мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживать стерильные состояния во время операции в разделах 5 и 6. Стерилизуйте все хирургические инструменты путем автоклавирования до и после каждого использования. Дезинфицируйте рабочую зону в шкафу биобезопасности 75% этанолом с последующим ультрафиолетовым облучением. Наденьте чистый халат, шапочку, маску для лица и стерильные перчатки.
- Через восемь-десять дней после переноса отбирают донорских мышей с сопоставимой массой опухоли диаметром ~ 5 мм (размером с сою) для трансплантационной хирургии.
- Приготовьте 100 мм × 20 мм посуду в шкафу для биобезопасности и добавьте 10 мл стерильного ледяного PBS.
- Усыплите опухоленосную донорскую мышь в изофлурановой камере с последующим вывихом шейки матки. Погрузите мышь в 75% этанол на 3-5 мин и переложите в шкаф биобезопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры на этом этапе должны быть выполнены в шкафу биобезопасности для поддержания строгой асептики. - Поместите мышь на рассеченную доску, покрытую чистой абсорбирующей бумагой, в лежачем положении. Удерживайте конечности мыши с помощью рассеченных игл.
- Срежьте ножницами кожу вдоль средней линии сверху уретрального отверстия до мечевидного. Растяните кожу по направлению к левой стороне тела мыши пинцетом и удерживайте кожу иглами для рассечения.
- Иссечь опухоль, сохранив ее капсулу как можно более неповрежденной. Аккуратно и аккуратно удалите соединительную ткань вблизи опухоли хирургическими ножницами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания целостности опухоли не отслаивайте опухолевую капсулу и не разрезайте опухолевую ткань на куски. - Поместите опухолевую ткань в 100 мм × 20 мм посуду, содержащую 10 мл стерильного ледяного PBS для последующей трансплантации.
6. Подкожная трансплантация опухоли донорского происхождения мышам-реципиентам, соответствующим опухоли
ПРИМЕЧАНИЕ: Аллотрансплантат должен быть имплантирован в нижний бок мыши с той же стороны, что и ранее существовавшая опухоль, чтобы две опухоли стекали в идентичный лимфатический узел. В протоколе, представленном здесь, поскольку опухоль B16F10-OVA имплантировалась подкожно в левую паховую область мыши (раздел 3), опухолевая ткань донорского происхождения была пересажена на левый фланг реципиента на этом этапе. Место трансплантации может быть адаптировано к первому имплантированному участку опухоли.
- Обезболить мышь-реципиент, соответствующую опухоли, 250 мг/кг 2,2,2-трибромэтанола с помощью внутрибрюшинной инъекции. Ущипните палец разгибательной конечности мыши, чтобы оценить уровень анестезии и дождаться отсутствия болевого рефлекса, что указывает на надлежащую глубину анестезии для выполнения операции. Если наблюдается вокализация или отмена задних конечностей, дополнительно вводят 0,01−0,03 мл 2,2,2-трибромэтанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь-реципиент с опухолью должна быть того же пола, что и мышь-донор, которая предоставляет аллотрансплантат, чтобы избежать проблем с отторжением. - Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость. Побрейте левый фланг мыши электробритвой. Нанесите крем для депиляции, чтобы удалить оставшиеся волосы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте истирания кожи, что может увеличить риск заражения и инфекции. - Поместите мышь в шкаф для обеспечения биобезопасности. Поместите его в положение лежа на рассеченной доске, покрытой чистой абсорбирующей бумагой, с вертикальной осью мыши, параллельной и ее головой с правой стороны экспериментатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры на этом этапе должны быть выполнены в шкафу биобезопасности для поддержания строгой асептики. - Протрите кожу бритого участка хлопком, пропитанным повидоном-йодом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте повидон-йод вместо 75% этанола для стерилизации, чтобы предотвратить потерю тепла тела. - Поднимите кожу в центральной точке между тазобедренными суставами мыши хирургическим пинцетом. С помощью ножниц сделайте вертикальное иссечение длиной 5 мм. Вытяните разрез рострально вдоль спинной средней линии до ~10-15 мм.
- Выполните резкое рассечение, вставив закрытые кончики ножниц в разрез, а затем открыв, чтобы отделить брюшину левого фланга от кожи и мягких тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повреждения подкожной клетчатки и брюшины, поднимите кожу в центре разреза, а затем вставьте закрытые ножницы как можно ближе к коже. - Сделайте кожный карман на левом фланге, выполнив резкое рассечение несколько раз. Поместите инкапсулированную, неповрежденную опухолевую массу донорского происхождения в капсулу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в контрольной группе с фиктивной операцией получают ту же хирургическую операцию без трансплантации опухоли донорского происхождения. - Закройте разрез прерванным швом (см. Список материалов). Наложите 2-3 шва на каждый разрез. Продезинфицируйте кожу вокруг разреза хлопком, смоченным в повидоне-йоде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Между двумя последовательными стежками должно быть 5 мм и расстояние от разреза 3 мм. - Поместите мышь в боковое положение в чистую и теплую клетку. Наблюдайте за ним непрерывно, пока он не придет в достаточное сознание, чтобы поддерживать стернальное равновесие.
- Вводят бупренорфин подкожно в дозе 0,1 мг/кг массы тела каждые 8 ч три раза после операции для облегчения боли. Следите за тем, как мышь ест, пьет, двигается, а также за областью, на которой она работает. Возвращать реципиента трансплантата компании других животных только после того, как он полностью выздоровеет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь обычно восстанавливается после травмы операции в течение 3 дней. Если мышь не вернулась к нормальному питанию и подвижности и проявляет какие-либо проявления инфекции, обратитесь к ветеринару для вмешательств или усыпните ее. - Приносить в жертву (усыплять животных, как на этапе 4.3.2) мышей в указанные моменты времени, и восстанавливать клетки, представляющие интерес для проточного цитометрического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема этого протокола показана на рисунке 1. Через восемь дней после посева опухоли cd45.1+ и CD45.1+CD45.2+ OT-I клетки были введены мышам B16F10-OVA, несущим опухоль C57BL/6. Опухоль была хирургически рассечена у мышей с имплантированными клетками CD45.1 + OT-I (донора) на 8-й день после переноса и пересажена в сопоставленный с опухолью CD45.1 + CD45.2 + OT-I клеточный имплантированный мыши (реципиент) в спинной бок на той же стороне, что и имплантированная опухоль. С помощью анализа проточной цитометрии (стратегия гатинга, показанная на рисунке 2) две популяции CD44 + CD8 + опухолевых антиген-специфических Т-клеток могут быть легко идентифицированы в TME, включая CD45.1 + донорские и CD45.1 + CD45.2 + реципиент-производные. Впоследствии пропорции этих двух популяций внутри аллотрансплантатов были проанализированы в указанные моменты времени для изучения динамики антиген-специфических CD8+ Т-клеток. На 2-й день после трансплантации в трансплантированной опухоли было ~ 83% донорских антиген-специфических CD8 + Т-клеток, более преобладающих, чем их аналоги, полученные реципиентом. Тем не менее, доля клеток OT-I, полученных от реципиента, была повышена на поздней стадии опухолевого генеза, превышая присущие опухоли клетки OT-I, полученные от донора. (Рисунок 3).
Рисунок 1: Схема экспериментального проекта. C57BL/6mice оспариваются опухолью B16F10-OVA на паховой области. Восемь дней спустя различные конгенно маркированные (CD45.1+ или CD45.1 + CD45.2 +) клетки OT-I переносятся мышам, несущим опухоль. На 8-й день после переноса опухоль на мышах, имплантированных клетками CD45.1+ OT-I, хирургически рассекается и подкожно пересаживается в реципиенты, имплантированные клетками CD45.1 + CD45.2 + OT-I в бок на той же стороне, что и существующая опухоль. Затем мышей приносят в жертву, и антиген-специфические Т-клетки (OT-I клетки) в аллотрансплантатах анализируют в указанные моменты времени. Сокращения: CD = кластер дифференциации; i.v. = внутривенно; Мешок = жертвоприношение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия измерения проточной цитометрии. Стратегия гейтинга, используемая для идентификации донорских (CD45.1+) и реципиентных (CD45.1+CD45.2+) антиген-специфических CD44+CD8+ Т-клеток в аллотрансплантатах. Сокращения: SSC-A = площадь бокового рассеяния; FSC-A = прямая площадь рассеяния; FSC-W = прямая ширина рассеяния; FSC-H = прямая высота рассеяния; SSC-W = ширина бокового рассеяния; SSC-H = высота бокового рассеяния; L/D = живой/мертвый; CD = кластер дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Соотношение донорских и реципиентных антиген-специфических CD8+ Т-клеток в опухолевых аллотрансплантатах. Репрезентативные графики проточной цитометрии, показывающие экспрессию конгенных маркеров CD45.1 и CD45.2, используемых для идентификации донорских и реципиентных клеток OT-I в опухолевых аллотрансплантатах на 2, 8 и 15 днях после трансплантации. Цифры представляют собой проценты двух подмножеств в популяции CD44 + CD8 + Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Т-клеточный иммунитет играет решающую роль в иммунных реакциях против опухолей, причем CTL играют ведущую роль в искоренении раковых клеток. Однако происхождение опухолевых антиген-специфических CTL в TME не было выяснено30. Использование этого протокола трансплантации опухоли дало важную подсказку о том, что внутриопухолевые антиген-специфические CD8 + Т-клетки могут не сохраняться в течение длительного времени, несмотря на существование стволовых предшественников TCF1 + CD8 + Т-клеток. Примечательно, что наблюдается непрерывный приток периферийных опухолеспецифических CD8+ Т-клеток в опухолевую массу.
Насколько нам известно, это относительно удобный и убедительный метод, подтверждающий, что поддержание антиген-специфических CD8+ Т-клеток в пределах TME преимущественно зависит от пополнения периферийных опухолеспецифических CD8+ Т-клеток вместо самообновления опухоле-резидентных ТИЛ. Хотя протокол, представленный здесь, фокусируется только на пропорциях ТИЛ, полученных от доноров и реципиентов, фенотипические, функциональные и транскрипционные свойства этих двух популяций могут быть легко исследованы с помощью проточной цитометрии. Кроме того, возможно комбинировать антитела ICB для исследования реакций конкретного подмножества клеток на терапию ICB.
В этом протоколе опухолевая ткань донорского происхождения пересаживается мыши-реципиенту с существующей исходной опухолью. Две опухоли у мыши-реципиента приведут к распределению Т-клеток, генерируемых периферией, в две опухолевые массы. Более того, опухолевая нагрузка будет почти вдвое увеличена по сравнению с животными без трансплантатов. В пилотных экспериментах мы попытались иссечь исходную опухоль у мышей-реципиентов перед трансплантацией; тем не менее, было технически сложно полностью устранить все опухолевые клетки хирургическим путем. Остаточные опухолевые клетки быстро образуют новую опухолевую ткань в ближайшее время. Таким образом, существует ограничение для этой системы при сравнении иммунных реакций Т-клеток с таковыми у нетрансплантированных мышей. Тем не менее, эта система по-прежнему полезна для сравнения недавно мигрировавших и существующих Т-клеток в пределах того же TME, который пересаживается от донорских опухоленосных мышей. Кроме того, нельзя отрицать, что трансплантация опухолевой ткани может привести к воспалению, которое может повлиять на динамику иммунных клеток внутри опухоли. Хотя влияние операции на инфильтрацию клеток OT-I может быть исключено с помощью неоперированного и фиктивного контроля, мы не оценивали влияние местных воспалительных реакций на динамику клеток OT-I.
Следует принять во внимание некоторые соображения, одним из которых является использование циклофосфамида. Циклофосфамид31 является алкилирующим агентом, широко используемым для лечения злокачественных новообразований твердых органов и лимфопролиферативных и аутоиммунных расстройств. Через шесть-восемь дней после инокуляции B16F10-OVA циклофосфамид вводят перед приемным переносом, чтобы индуцировать лимфодеплецию мышей-хозяев и усиливать активность перенесенных клеток OT-I29. Хотя меланома не чувствительна к этому реагенту, некоторые клеточные линии опухоли, такие как EG732, клеточная линия лимфомы тимуса, реагируют на циклофосфамид. Лечение EG7-несущих мышей циклофосфамидом приводит к эрадикации опухолей, что говорит о том, что циклофосфамид должен быть тщательно использован или титрован для чувствительных опухолевых моделей. Рекомендуемым альтернативным методом является однократная сублетальная доза облучения (4,5-5,5 Гр) за сутки до переноса, и оптимальный выбор зависит от характеристики опухолевых клеточных линий.
Другие шаги должны быть предприняты с осторожностью, включая тщательный отбор опухоленосных донорских мышей и деликатную хирургическую операцию во время трансплантации опухоли. Имплантированные опухоли будут удалены хирургическим путем и пересажены мышам-реципиентам, соответствующим опухоли, через 8-10 дней после переноса. Перед трансплантацией в качестве аллотрансплантата должен быть выбран сопоставимый размер опухолевой массы диаметром ~ 5 мм, чтобы уменьшить расхождения между отдельными мышами и сделать полученные данные более надежными. Более того, во время операции разрез должен находиться вблизи средней линии спины мыши, чтобы держать аллотрансплантат на расстоянии от опухоли, уже существующей у мыши-реципиента. Мягкое рассечение также рекомендуется для предотвращения травм пахового лимфатического узла и окружающих тканей.
Эффективное уничтожение раковых клеток требует координации различных компонентов в TME33. Протокол, представленный здесь, может быть расширен до исследования адаптивных и врожденных иммунных клеток, таких как естественные клетки-киллеры, опухолеассоциированные макрофаги и дендритные клетки. Кроме того, в дополнение к B16F10-OVA, используемой здесь, этот протокол может быть применен к другим моделям подкожных опухолей. В заключение, вышеупомянутый анализ трансплантации опухоли предлагает новый подход к изучению интерактивных переходов определенных типов иммунных клеток во время противоопухолевых реакций и полезен для исследователей в области иммунологии опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук для выдающихся молодых ученых (No 31825011 для LY) и Национального фонда естественных наук Китая (No 31900643 для QH, No 31900656 для ZW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Blank, C. U., et al.
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P.
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G.
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al.
Tags
Исследование рака выпуск 172Erratum
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 04/29/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
