Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Tumortransplantation til vurdering af dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler i mus

Published: June 12, 2021 doi: 10.3791/62442
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 1, 5, 1
1Institute of Immunology, Third Military Medical University, 2Guanghua School of Stomatology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Stomatological Hospital, Sun Yat-Sen University, 3Shigatse Branch, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, 4Department of Emergency Medicine, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 5Cancer Center, The General Hospital of Western Theater Command

ERRATUM NOTICE

Summary

Her præsenterer vi en tumortransplantationsprotokol til karakterisering af tumor-iboende og periferi-afledte tumorinfiltrerede lymfocytter i en musetumormodel. Specifik sporing af tilstrømningen af modtagerafledte immunceller med flowcytometri afslører dynamikken i de fænotypiske og funktionelle ændringer af disse celler under antitumorimmunresponser.

Abstract

T-cellemedieret immunitet spiller en afgørende rolle i immunresponser mod tumorer, hvor cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er) spiller hovedrollen i udryddelsen af kræftceller. Oprindelsen og genopfyldningen af tumorantigenspecifikke CD8 + T-celler i tumormikromiljøet (TME) forbliver imidlertid uklar. Denne protokol anvender B16F10-OVA melanomcellelinjen, som stabilt udtrykker surrogatneoantigenet, ovalbumin (OVA) og TCR transgene OT-I-mus, hvor over 90% af CD8 + T-cellerne specifikt genkender det OVA-afledte peptid OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klasse I større histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyle H2-Kb. Disse funktioner muliggør undersøgelse af antigenspecifikke T-celleresponser under tumorgenese.

Ved at kombinere denne model med tumortransplantationskirurgi blev tumorvæv fra donorer transplanteret i tumormatchede syngeneiske modtagermus for præcist at spore tilstrømningen af modtagerafledte immunceller til transplanterede donorvæv, hvilket ifølge analysen af immunresponserne fra tumor-iboende og periferi-stammer antigenspecifik CD8+ T-celler. En dynamisk overgang viste sig at forekomme mellem disse to populationer. Samlet set har dette eksperimentelle design givet en anden tilgang til præcist at undersøge immunresponserne fra CD8 + T-celler i TME, hvilket vil kaste nyt lys over tumorimmunologi.

Introduction

CD8 + T-cellemedieret immunrespons spiller en central rolle i at kontrollere tumorvækst. Under tumorgenese aktiveres naive CD8 + T-celler ved antigengenkendelse på en MHC klasse I-begrænset måde og differentieres derefter til effektorceller og infiltreres i tumormasse 1,2. Inden for tumormikromiljøet (TME) driver langvarig antigeneksponering såvel som immunsuppressive faktorer imidlertid infiltrerede tumorspecifikke CD8 + T-celler i en hyporesponsiv tilstand kendt som "udmattelse"3. Udmattede T-celler (Tex) adskiller sig fra effektor- eller hukommelses-T-celler, der genereres ved akut virusinfektion, både transkriptionelt og epigenetisk. Disse Tex-celler er hovedsageligt karakteriseret ved den vedvarende og forhøjede ekspression af en række hæmmende receptorer samt det hierarkiske tab af effektorfunktioner. Endvidere resulterer den nedsatte proliferative kapacitet af udmattede CD8 + T-celler i faldende antal tumorspecifikke T-celler, således at de resterende CD8 + T-celler i TME næppe kan tilvejebringe tilstrækkelig beskyttende immunitet mod tumorprogression3. Således er vedligeholdelse eller forstærkning af intratumorale antigenspecifikke CD8 + T-celler uundværlig for tumorundertrykkelse.

Desuden menes immun checkpoint blokade (ICB) terapi at genoplive Tex i tumorer ved at øge T-celleinfiltration og dermed T-cellenumre og foryngende T-cellefunktioner for at øge tumorundertrykkelsen. Den udbredte anvendelse af ICB-behandling har ændret kræftbehandlingslandskabet, hvor en betydelig delmængde af patienter oplever holdbare reaktioner 4,5,6. Ikke desto mindre reagerer størstedelen af patienterne og kræfttyperne ikke eller kun midlertidigt på ICB. Utilstrækkelig T-celleinfiltration i TME er blevet postuleret at være en af de underliggende mekanismer, der tegner sig for ICB-resistens 7,8.

Flere undersøgelser har vist heterogeniteten af tumorinfiltrerende CD8 + T-celler (TIL'er) hos både patienter og musemodeller 9,10,11,12. Det er blevet bekræftet, at en delmængde af CD8 + T-celler, der udtrykker T-cellefaktor-1 (TCF1) i en tumormasse, udviser stamcellelignende egenskaber, hvilket yderligere kan give anledning til terminalt udmattede T-celler og er ansvarlig for proliferationsudbruddet efter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Det er imidlertid blevet bevist, at kun en lille del af antigenspecifikke TCF1 + CD8 + T-celler findes i TME og genererer en udvidet pulje af differentierede afkom som reaktion på ICB 23,24,25,26. Hvorvidt den begrænsede størrelse af denne population er tilstrækkelig til at sikre persistensen af cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er) til at kontrollere tumorprogression forbliver ukendt, og om der er genopfyldning fra periferivæv, kræver yderligere undersøgelse. Desuden tyder nyere forskning på den utilstrækkelige genoplivningskapacitet af allerede eksisterende tumorspecifikke T-celler og udseendet af nye, tidligere ikke-eksisterende clonotyper efter anti-programmeret celledødsprotein 1-behandling. Dette indikerer, at T-cellerespons på checkpoint-blokade kan skyldes den nye tilstrømning af et særskilt repertoire af T-cellekloner27. Sammen med tilstedeværelsen af tilskuer ikke-tumor-reaktiv cytotoksisk T-cellefraktion i TME førte disse fund til etablering af en tumorallograftmodel til at studere rollen som periferiafledte CD8 + T-celler11.

Indtil nu har flere former for tumorimplantation samt immuncelleadopteloverførsel været meget udbredt inden for tumorimmunologi28. TIG'er, mononukleære celler i perifert blod og tumorreaktive immunceller, der stammer fra andre væv, kan karakteriseres godt ved hjælp af disse metoder. Når man studerer interaktionerne mellem systemisk og lokal antitumorimmunitet, synes disse modeller imidlertid utilstrækkelige til at undersøge interaktionerne mellem immunceller afledt af periferien og TME. Her blev tumorvæv transplanteret fra donorer til tumormatchede modtagermus for præcist at spore tilstrømningen af modtagerafledte immunceller og observere de donorafledte celler i TME samtidigt.

I denne undersøgelse blev der etableret en murine syngeneisk model af melanom med B16F10-OVA melanomcellelinjen, som stabilt udtrykker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR-transgene OT-I-mus, hvor over 90% af CD8 + T-cellerne specifikt genkender det OVA-afledte peptid OVA257-264 (SIINFEKL), der er bundet til klasse I MHC-molekylet H2-Kb, muliggør undersøgelse af antigenspecifikke T-celleresponser udviklet i B16F10-OVA-tumormodellen. Ved at kombinere denne model med tumortransplantation blev immunresponserne fra tumor-iboende og periferi-stammer antigenspecifikke CD8 + T-celler sammenlignet for at afsløre en dynamisk overgang mellem disse to populationer. Samlet set har dette eksperimentelle design givet en anden tilgang til præcist at undersøge immunresponserne fra CD8 + T-celler i TME, hvilket kaster nyt lys over dynamikken i tumorspecifikke T-celleimmunresponser i TME.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle museforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committees fra Third Military Medical University. Brug 6-8 uger gamle C57BL/6 mus og naive OT-I transgene mus, der vejer 18-22 g. Brug både mand og kvinde uden randomisering eller "blændende".

1. Fremstilling af medium og reagenser

  1. Forbered cellekulturmedium D10 som tidligere beskrevet29 ved at tilsætte 10% føtalt kvægserum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin og 2 mM L-glutamin i Dulbeccos modificerede ørnemedium.
  2. Forbered cellekulturmedium R10 ved at supplere RPMI-1640 med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin.
    BEMÆRK: Kulturmedierne, D10 og R10, kan forblive sterile og stabile i mindst 2 uger, når de opbevares ved 2-4 °C.
  3. Forbered FLUORESCENSAKTIVERET CELLESORTERING (FACS) buffer ved at supplere 1x fosfatbufret saltvand (PBS) med 2% FBS og 0,01% natriumazid.
    BEMÆRK: Med tilsætning af natriumazid kan FACS Buffer opbevares ved 2-4 °C i flere måneder.
  4. Forbered buffer for røde blodlegemer (RBL) ved at tilsætte 155 mMNH4Cl, 10 mM KHCO3 og 0,1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i dobbeltdestilleret vand, og juster pH til 7,3.
    BEMÆRK: RBL-bufferen er stabil i op til 3 måneder ved stuetemperatur (RT).
  5. Forbered magnetisk aktiveret cellesorteringsbuffer (MACS) ved at supplere PBS med 0,5% bovin serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA.
    BEMÆRK: Opløsningen skal føres gennem et 0,22 μm filter, efter at reagenset er opløst og konserveret i asepsis.
  6. Forbered en arbejdsløsning af 2,2,2-tribromoethanol.
    1. 2,5 g 2,2,2-tribromoethanol opløses i 5 ml tert-amylalkohol (2-methyl-2-butanol). Rør en dampbadende vibrator ved konstant temperatur ved 180 o / min, 40 ° C natten over.
    2. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 μm filter i en steril beholder. Tilsæt dobbeltdestilleret vand op til et endeligt volumen på 200 ml, og bland grundigt og kontinuerligt, indtil opløsningen bliver klar og gennemsigtig.
    3. Bestem og juster opløsningens pH-værdi til 7,3. Pak beholderen helt ind med aluminiumsfolie for at udelukke lys og opbevar den ved 4 °C.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af arbejdsløsningen på 2,2,2-tribromethanol er 12,5 mg/ml. En mere koncentreret opløsning anbefales ikke, fordi materialet er irriterende ved højere koncentrationer. Test pH-værdien af arbejdsløsningen før hver brug, og kassér den, hvis pH-værdien er mindre end 5.

2. Fremstilling af B16F10-OVA-cellesuspension

BEMÆRK: Cellekultur skal udføres i en biosikkerhedshætte under strenge aseptiske forhold.

  1. Optø og kultur et hætteglas med B16F10-OVA-celler med D10 i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  2. Når cellerne når sammenløbet på ca. 80-90%, subkultur cellerne.
    1. Fjern kulturmediet med en pipettor, og skyl cellerne to gange ved hjælp af PBS.
      BEMÆRK: Tilsæt ikke PBS kraftigt mod de klæbende celler i kolben eller cellekulturskålen. I stedet pipetter PBS mod en sidevæg eller tilsættes dråbevis i kolben eller fadet.
    2. Fjern PBS, og tilsæt 1-2 ml 0,25% trypsin-EDTA-opløsning i kolben eller fadet. Rock det frem og tilbage for at dække hele celleoverfladen. Kolben eller fadet anbringes i en inkubator ved 37 °C i ~1 min. eller ved RT, indtil cellerne løsnes.
      BEMÆRK: Et omvendt mikroskop kan bruges til at kontrollere, om cellerne har løsnet sig.
    3. Tilsæt frisk D10 for at stoppe trypsiniseringen. Ophænget pipetteres op og ned for at sikre, at alle cellerne adskilles fra kolbens eller fadets overflade.
    4. Overfør B16F10-OVA-cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør. Centrifugering af cellerne ved 125 × g i 5-7 minutter ved RT.
    5. Kassér supernatanten, og gensuspend cellepillen med D10. B16F10-OVA-cellesuspensionen udleveres i en ny kolbe- eller cellekulturskål indeholdende D10 og inkuberes i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  3. På dagen for tumorimplantationen høstes B16F10-OVA-celler, der er ~ 90% sammenflydende som beskrevet i trin 2.2.1 til 2.2.4. Kassér supernatanten, og genanvende cellepillen med 1 ml PBS.
  4. Tæl de levedygtige celler med et hæmocytometer ved hjælp af 0,4% trypanblå. Juster celletætheden til 1 × 106 celler pr. 100 μL ved at tilføje PBS. Hold cellerne på is.

3. Ektopisk tumorimplantation af B16F10-OVA-celler i musens lyskeregion

  1. Brug 6-8 uger gamle C57BL/6 mus, der vejer 18-22 g. Brug både mand og kvinde uden randomisering eller "blændende".
  2. 100 μL af den tilberedte B16F10-OVA-cellesuspension trækkes tilbage i en 1 ml tuberkulinsprøjte. Tryk på tønden for at flytte bobler til toppen, og skub forsigtigt stemplet for at fjerne luftbobler.
  3. Begræns musen og udsæt dens underliv. Tryk på venstre bagben med lillefingeren for at stramme huden i venstre inguinalområde.
  4. Fjern musens hår fra venstre underliv med en elektrisk barbermaskine. Brug bomuld gennemblødt i 75% ethanol til at rengøre den bageste kvadrant i venstre mave.
  5. Hold sprøjten i en meget lav vinkel (0-15 °) med nålens skråning opad, indsæt den på stedet for venstre øvre lår og fremryk 0,5-1 cm gennem det subkutane væv ind i lyskeområdet.
  6. Træk stemplet tilbage inden injektion. Hvis der er undertryk, skal du trykke stemplet helt ned og observere en lille bolus (dannelse af væskelomme) i subcutis dukke op.
    BEMÆRK: Hvis blod trækkes tilbage i nålenavet, skal du trække det tilbage og prøve igen på et andet sted.
  7. Fjern nålen, når injektionen er udført, og bortskaf den korrekt. Slip og læg musen tilbage i buret.
  8. Mål tumorstørrelse på dag 6-8 ved hjælp af en vernier skala efter B16F10-OVA implantation. Vælg mus med en ~ 3 mm diameter (mung bønnestørrelse) tumor og del dem lige og tilfældigt i to grupper.
    BEMÆRK: Mus med tumorer af samme størrelse tildeles tilfældigt som donor- og modtagermus; det matchede tumorvæv, der udskæres fra donormus, transplanteres til modtagermusene. Desuden bør ikke-opererede kontroller og sham-opererede kontroller medtages for at evaluere virkningerne af kirurgi på adoptivcelleoverførsel og på musens generelle sundhed. Således tjener en gruppe tumorbærende mus som ikke-opererede kontroller, der modtager enten CD45.1 + CD45.2+ eller CD45.1 + OT-I-celler, men ingen kirurgi. Den anden gruppe mus fungerer som sham-opererede kontroller, der modtager enten CD45.1 + CD45.2 + eller CD45.1 + OT-I-celler og efterfølgende kirurgi svarende til den eksperimentelle gruppe, men ingen allografttransplantation.

4. Adoptiv overførsel af medfødt markerede OT-I T-celler til tumorbærende mus

  1. Dagen før overførslen administreres 4 mg cyclophosphamid opløst i 200 μL PBS via intraperitoneal injektion til hver tumorbærende mus.
    BEMÆRK: Behandling med cyclophosphamid sigter mod at inducere lymfopeni i værten, der producerer "plads" til overførte celler, fremme deres overlevelse og homing til lymfoide organer for at fungere effektivt.
  2. Brug naive OT-I transgene mus med tydelige kongeniske markører (6-8 uger gamle, 18-22 g, samme køn som de tumorbærende mus). Brug CD45.1+ OT-I-mus og CD45.1+CD45.2+ OT-I-mus til adoptivt at overføre OVA257-264 antigenspecifikke T-celler til henholdsvis tumorbærende donor- og modtagermus.
    BEMÆRK: Oprindelsen af adoptivt overførte OT-I-celler kan let identificeres, hvis de viser forskellige medfødte eller fluorescerende markører. For eksempel injicere CD45.1+ OT-I T-celler i B16F10-OVA-bærende donormus, mens du injicerer CD45.1 + CD45.2 + OT-I T-celler i B16F10-OVA-bærende modtagermus. CD45.1 og CD45.2 er begge isoformer af pan-lymfocytmarkøren CD45 (Ly5). Andre almindeligt anvendte kongeneniske markører omfatter forskellige isoformer af CD90 (Thy1). Denne protokol kan bruges til mus, der bærer forskellige kongeniske markører. OT-I-mus skal være af samme køn som de mus, der modtager OT-I-celleoverførsel for at undgå afvisningsproblemer.
  3. Isoler lymfocytterne fra milten og lymfeknuderne i OT-I-musen.
    BEMÆRK: Følgende procedurer i dette trin skal udføres i et biosikkerhedsskab for at opretholde streng asepsis.
    1. Forbered to 60 mm × 10 mm petriskåle. Tilsæt 3 ml R10-medium i en skål, mens du tilføjer 3 ml RBL-buffer i en anden skål. Anbring en 70 μm nyloncellesil i fadet, der indeholder RBL-buffer.
    2. Afliv en OT-I-mus i et isoflurankammer efterfulgt af cervikal dislokation.
    3. Høst milten, inguinal (subiliac) og aksillære lymfeknuder af musen og overfør dem til en 60 mm × 10 mm skål med 3 ml R10 på is.
      BEMÆRK: Antallet af OFREDE OT-I-mus kan justeres afhængigt af antallet af tumorbærende mus, der skal overføres. Et typisk udbytte af OT-I CD8 + T-celler fra en milt og bilaterale inguinale og aksillære lymfeknuder af OT-I CD8 + T-celler er ~ 30-100 × 106 celler pr. Mus.
    4. Brug endetønden af en 1 ml sprøjte til at macerere milten i 3 ml RBL-buffer gennem silen. Inkuber i 3 minutter ved RT, og afslut reaktionen ved at tilsætte 3 ml koldt R10-medium.
    5. Mos lymfeknuderne, indtil kun bindevæv er tilbage. Skyl filteret med R10. Overfør cellesuspensionen til et nyt 15 ml konisk rør. Centrifuge ved 500 × g, 4 °C i 6 min.
    6. Dekanter supernatanten, og resuspend cellerne i 3 ml MACS-buffer. Før cellesuspensionen gennem en ny 70 μm cellesil for at fjerne eventuelle flokkuler.
    7. Centrifugering af cellesuspensionen ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C. Dekanter supernatanten.
    8. Brug et muse-CD8+ T-celleisoleringssæt (se materialetabellen) til at rense CD8+ T-celler ved negativ markering i henhold til producentens protokol.
      BEMÆRK: Når du bruger sæt fra andre virksomheder, skal du følge producentens anvisninger.
    9. Hold den rensede cellesuspension på is. Tag en lille prøve af celler og bland med trypan blå for at tælle celler ved hjælp af et hæmocytometer.
  4. Bestem procentdelen af OT-I (levende / død-CD8 + Va2+) celler ved flowcytometri.
    BEMÆRK: Samtidig farvning af kongeniske markører og den transgene TCR skal udføres for at verificere den korrekte fænotype af cellerne inden overførsel.
    1. Der tilsættes 5 × 104-1 × 105 celler i 1 ml FACS-buffer i et 1,5 ml centrifugerør, og cellesuspensionen centrifugeres ved 350 × g, 4 °C i 3 minutter.
    2. Kassér supernatanten, og spred cellerne ved at svirpe bunden af røret. Placer røret på is.
    3. Følgende konjugerede antistofblandinger fremstilles (fortyndet i 100 μL FACS-buffer): anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; anti-CD45.2, 1:200; og levende/døde, 1:200 (se materialetabellen).
    4. Vortex antistofcocktailen og centrifugen ved 15.000 × g i 3 minutter til pelletsantistofaggregater. Opbevar cocktailen på is og beskyt den mod lys.
    5. Resuspend cellerne med 100 μL antistofcocktail og bland grundigt ved at svirpe røret. Inkuber i mørke i 30 minutter på is.
      BEMÆRK: Undgå at forstyrre antistofaggregaterne i bunden af røret.
    6. Vask pellets to gange med 1 ml FACS-buffer. Centrifuge ved 350 × g, 4 °C i 3 min. Resuspend cellerne i 200 μL FACS-buffer, og overfør cellesuspensionen til et FACS-rør.
      BEMÆRK: For at opretholde levedygtigheden af de OT-I-celler, der skal overføres, skal prøven testes så hurtigt som muligt. Hvis de farvede OT-I-celler ikke kan testes med det samme, skal cellerne opbevares i mørke på is eller afkøles ved 4 °C indtil analysen. Alternativt kan prøverne resuspenderet i 1-4% paraformaldehyd til udvidet opbevaring (16 timer) for at forhindre forringelse.
    7. Kør prøven på et flowcytometer. Beregn procentdelen af levende/døde-CD8+Va2+-celler ved at dividere antallet af levende/døde-CD8+Vα2+-celler med antallet af levende/døde celler.
  5. Bestem det absolutte antal OT-I-celler (live/dead-CD8+Va2+) ved at gange procentdelen af levende/døde CD8+Va2+-celler med det levedygtige cellenummer opnået i trin 4.3.9.
  6. Juster koncentrationen af OT-I-celler (levende/død-CD8+Va2+) til 1,5 × 106 /ml med PBS.
  7. 3 × 105 forskellige kongenisk mærkede OT-I-celler (levende/døde-CD8+Va2+) i 200 μL PBS intravenøst i to grupper af B16F10-OVA-bærende mus (tumorbærende mus opdelt i donor- og modtagermus fra trin 3.8).
    1. Træk 200 μL OT-I-celle (levende/død-CD8+Va2+) suspension tilbage i en 100 U insulinsprøjte (29 G), og fjern bobler som i trin 3.2.
    2. Placer musen separat i et bur med en infrarød lampe over buret i 5-10 minutter for at udvide halevenen. Immobiliser musen med en fastholdelsesanordning af passende størrelse. Træk i halen for at rette den ud og spray med 75% ethanol for at gøre venen synlig.
    3. Hold sprøjten parallelt med venen og indsæt den i venen i en vinkel på 0-15 °. Træk stemplet lidt tilbage, og hvis blodet kommer ind i tønden, skal du langsomt og støt injicere suspensionen med en hastighed på højst 1 ml / min.
      BEMÆRK: Modstand eller hævelse på injektionsstedet indikerer, at nålen ikke er inde i venen; injektionsstedet skal flyttes i nærheden.
    4. Når injektionen er afsluttet, skal du fjerne sprøjten og trykke forsigtigt på indsættelsesområdet i 3-5 s for at stoppe blødningen. Returner musen til buret og observer det nøje i et par minutter for bivirkninger. Hvis den har normal mobilitet og nasal udledning, skal du placere den tilbage i selskab med de andre mus.

5. Dissekere tumormasse fra tumorbærende donormus

BEMÆRK: Oprethold sterile tilstande under operationen i afsnit 5 og 6. Steriliser alle kirurgiske instrumenter ved autoklavering før og efter hver brug. Desinficer operationsområdet i biosikkerhedsskabet med 75% ethanol efterfulgt af ultraviolet bestråling. Brug en ren kjole, kasket, ansigtsmaske og sterile handsker.

  1. Otte til ti dage efter adoptivoverførslen udvælges donormus med sammenlignelig tumormasse på ~5 mm i diameter (sojabønnestørrelse) til transplantationskirurgi.
  2. Forbered en 100 mm × 20 mm skål i et biosikkerhedsskab, og tilsæt 10 ml steril iskold PBS.
  3. Afliv en tumorbærende donormus i et isoflurankammer efterfulgt af cervikal dislokation. Sænk musen i 75% ethanol i 3-5 min og overfør til biosikkerhedsskabet.
    BEMÆRK: Følgende procedurer i dette trin skal udføres i et biosikkerhedsskab for at opretholde streng asepsis.
  4. Placer musen på et dissektionsbræt dækket med rent absorberende papir i liggende stilling. Begræns muselemmerne med dissektionsnåle.
  5. Skær huden langs midterlinjen ovenfra urinrørsåbningen til xiphoiden med en saks. Stræk huden mod venstre side af musekroppen med en pincet og begræns huden med dissektionsnåle.
  6. Punktafgift tumoren, holde sin kapsel så intakt som muligt. Fjern forsigtigt bindevævet nær tumoren med kirurgisk saks.
    BEMÆRK: For at opretholde tumorens integritet må du ikke skrælle tumorkapslen af eller skære tumorvævet i stykker.
  7. Anbring tumorvævet i en 100 mm × 20 mm skål indeholdende 10 ml steril iskold PBS til efterfølgende transplantation.

6. Subkutan transplantation af donorafledt tumor på de tumormatchede modtagermus

BEMÆRK: Allograften skal implanteres i musens nedre flanke på samme side som den tidligere eksisterende tumor for at få to tumorer til at dræne til den identiske lymfeknude. I den protokol, der præsenteres her, da B16F10-OVA-tumoren blev implanteret subkutant på musens venstre lyskeregion (afsnit 3), blev det donorafledte tumorvæv transplanteret på modtagerens venstre flanke i dette trin. Transplantationsstedet kan tilpasses det første implanterede tumorsted.

  1. Anæstesi en tumormatchet modtagermus med 250 mg/kg 2,2,2-tribromethanol via intraperitoneal injektion. Klem tåen på en ekstensorlem af musen for at vurdere niveauet af anæstesi og vent på mangel på smerterefleks, hvilket indikerer den rette dybde af anæstesi til udførelse af operationen. Hvis der observeres vokalisering eller tilbagetrækning af bagbenet, injiceres yderligere 0,01-0,03 ml 2,2,2-tribromethanol.
    BEMÆRK: Den tumormatchede modtagermus skal være af samme køn som donormusen, der giver allograften for at undgå afvisningsproblemer.
  2. Brug veterinær salve på øjnene for at forhindre tørhed. Barber musens venstre flanke med en elektrisk barbermaskine. Påfør en hårfjerningscreme for at fjerne det resterende hår.
    BEMÆRK: Undgå at slibe huden, hvilket kan øge risikoen for forurening og infektion.
  3. Placer musen i biosikkerhedsskabet. Placer den i den udsatte position på et dissektionskort dækket af rent absorberende papir, med musens lodrette akse parallelt med og hovedet til højre for eksperimentatoren.
    BEMÆRK: Følgende procedurer i dette trin skal udføres i et biosikkerhedsskab for at opretholde streng asepsis.
  4. Gnid huden på det barberede område med bomuld gennemblødt i povidon-jod.
    BEMÆRK: Brug povidon-jod i stedet for 75% ethanol til sterilisering for at forhindre tab af kropsvarme.
  5. Løft huden i midtpunktet mellem musens hofteled med kirurgisk pincet. Brug saksen til at lave en 5 mm lang lodret udskæring. Forlæng snittet rostralt langs den dorsale midterlinje til ~ 10-15 mm.
  6. Udfør en skarp dissektion ved at indsætte saksens lukkede spidser i snittet og derefter åbne for at adskille bughinden på venstre flanke fra huden og blødt væv.
    BEMÆRK: For at undgå at forårsage skade på det subkutane væv og bughinden skal du løfte huden i midten af snittet og derefter indsætte den lukkede saks så tæt på huden som muligt.
  7. Lav en hudlomme på venstre flanke ved at udføre skarp dissektion flere gange. Deponer den indkapslede, intakte donorafledte tumormasse i kapslen.
    BEMÆRK: Mus i den sham-opererede kontrolgruppe modtager den samme kirurgiske operation uden den donorafledte tumortransplantation.
  8. Luk snittet ved afbrudt sutur (se Materialeliste). Placer 2-3 suturer til hvert snit. Desinficere huden omkring snittet med bomuld gennemblødt i povidon-jod.
    BEMÆRK: Der skal være 5 mm mellem to på hinanden følgende sting og en afstand på 3 mm fra snittet.
  9. Placer musen i lateral position i et rent og varmt bur. Overvåg det kontinuerligt, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde streng liggende.
  10. Administrere buprenorphin subkutant i en dosis på 0,1 mg/kg legemsvægt hver 8. time tre gange efter operationen for at lindre smerten. Overvåg musens spisning, drikke, bevægelse og det område, der opereres på. Returner transplantationsmodtageren til selskabet med andre dyr først, når den er fuldt ud genoprettet.
    BEMÆRK: Musen kommer sig typisk efter traumet fra operationen inden for 3 dage. Hvis musen ikke er tilbage til normal fodring og mobilitet og viser nogen manifestationer af infektion, skal du konsultere en dyrlæge for interventioner eller aflive den.
  11. Ofre (aflive dyrene som i trin 4.3.2) musene på de angivne tidspunkter og genvinde cellerne af interesse for flowcytometrisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skemaet for denne protokol er vist i figur 1. Otte dage efter tumorpodning blev CD45,1+ og CD45,1+CD45,2+ OT-I-celler injiceret i B16F10-OVA tumorbærende C57BL/6-mus. Tumoren blev kirurgisk dissekeret fra CD45.1+ OT-I celleimplanterede mus (donor) på dag 8 efter overførslen og transplanteret til tumormatchede CD45.1+ CD45.2+ OT-I celleimplanterede mus (modtager) i dorsal flanken på samme side som den implanterede tumor. Gennem flowcytometri (gating-strategi vist i figur 2) analyse kan to populationer af CD44 + CD8 + tumorantigenspecifikke T-celler let identificeres i TME, herunder CD45.1+ donorafledte og CD45.1 + CD45.2 + modtagerafledte TIG'er. Derefter blev proportionerne af disse to populationer inden for allografterne analyseret på angivne tidspunkter for at studere dynamikken i de antigenspecifikke CD8 + T-celler. På dag 2 efter transplantationen var der ~ 83% af donorafledte antigenspecifikke CD8 + T-celler i den transplanterede tumor, mere fremherskende end deres modtagerafledte modstykker. Andelen af modtagerafledte OT-I-celler blev imidlertid forhøjet i det sene stadium af tumorgenese, hvilket oversteg tumor-iboende OT-I-celler afledt af donoren. (Figur 3).

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over det eksperimentelle design. C57BL/6mice er udfordret med B16F10-OVA tumor på lyskeområdet. Otte dage senere overføres forskellige medfødt markerede (CD45.1+ eller CD45.1 + CD45.2+) OT-I-celler til tumorbærende mus. På dag 8 efter overførslen dissekeres tumoren på cd45.1+ OT-I-celleimplanterede mus kirurgisk og subkutant transplanteres til tumormatchede CD45.1 + CD45.2+ OT-I-celleimplanterede modtagere i flanken på samme side som den eksisterende tumor. Derefter ofres musene, og antigenspecifikke T-celler (OT-I-celler) i allografterne analyseres på de angivne tidspunkter. Forkortelser: CD = klynge af differentiering; i.v. = intravenøs; Sac = offer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi for flowcytometri analyse. Gating-strategi, der bruges til at identificere donorafledte (CD45.1+) og modtagerafledte (CD45.1 + CD45.2+) antigenspecifikke CD44 + CD8 + T-celler inden for allografter. Forkortelser: SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremadrettet spredningsområde; FSC-W = fremadspredningsbredde; FSC-H = fremadspredningshøjde; SSC-W = sidespredningsbredde; SSC-H = sidespredningshøjde; L/D = levende/døde; CD = klynge af differentiering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Forholdet mellem donor- og recipientafledte antigenspecifikke CD8+ T-celler i tumorallografter. Repræsentative flowcytometridiagramm, der viser ekspression af de kongeniske markører CD45.1 og CD45.2, der anvendes til at identificere donorafledte og modtagerafledte OT-I-celler inden for tumorallografter på dag 2, 8 og 15 efter transplantation. Tallene repræsenterer procentdelene af de to delmængder i CD44 + CD8 + T-cellepopulationen . Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

T-cellemedieret immunitet spiller en afgørende rolle i immunresponser mod tumorer, hvor CTL'er spiller hovedrollen i udryddelsen af kræftceller. Oprindelsen af tumorantigenspecifikke CTL'er inden for TME er imidlertid ikke blevet belyst30. Anvendelsen af denne tumortransplantationsprotokol har givet et vigtigt fingerpeg om, at intratumorale antigenspecifikke CD8 + T-celler muligvis ikke vedvarer i lang tid på trods af eksistensen af stamlignende TCF1+ stamcelle CD8 + T-celler. Især er der en kontinuerlig tilstrømning af periferiafledte tumorspecifikke CD8 + T-celler i tumormassen.

Så vidt vi ved, er dette en relativt bekvem og overbevisende metode, der bekræfter, at vedligeholdelsen af antigenspecifikke CD8 + T-celler inden for TME overvejende afhænger af genopfyldningen af periferiafledte tumorspecifikke CD8 + T-celler i stedet for selvfornyelse af tumor-residente TIG'er. Selvom protokollen, der præsenteres her, kun fokuserer på proportionerne af donorafledte og modtagerafledte TIG'er, kan de fænotypiske, funktionelle og transkriptionelle egenskaber af disse to populationer let undersøges med flowcytometri. Desuden er det muligt at kombinere ICB-antistoffer for at undersøge reaktionerne fra en bestemt celledelmængde på ICB-terapi.

I denne protokol transplanteres donorafledt tumorvæv på modtagermusen med en eksisterende original tumor. To tumorer i en modtagermus vil føre til fordeling af periferigenererede T-celler i to tumormasser. Desuden vil tumorbyrden blive næsten fordoblet sammenlignet med dyr uden transplantationer. I pilotforsøg forsøgte vi at skære den oprindelige tumor på modtagermus før transplantation; Det var dog teknisk udfordrende at eliminere alle tumorceller ved operation grundigt. De resterende tumorceller ville hurtigt og danne et nyt tumorvæv snart. Der er således en begrænsning for dette system, når man sammenligner T-celleimmunresponser med dem i ikke-transplanterede mus. Dette system er dog stadig nyttigt til sammenligning af nyligt migrerede og eksisterende T-celler inden for samme TME, der transplanteres fra donortumorbærende mus. Desuden kan det ikke benægtes, at transplantationen af tumorvæv kan føre til betændelse, hvilket kan påvirke immuncelledynamikken i tumoren. Selvom virkningen af kirurgi på OT-I-celleinfiltration kunne udelukkes gennem ikke-opererede og sham-opererede kontroller, vurderede vi ikke virkningerne af lokale inflammatoriske reaktioner på OT-I-celledynamik.

Nogle overvejelser bør tages i betragtning, hvoraf den ene er brugen af cyclophosphamid. Cyclophosphamid31 er et alkyleringsmiddel, der i vid udstrækning anvendes til behandling af maligniteter i faste organer og lymfoproliferative og autoimmune lidelser. Seks til otte dage efter B16F10-OVA-podning administreres cyclophosphamid før adoptivoverførsel for at inducere lymfodring af værtsmus og forbedre aktiviteten af de overførte OT-I-celler29. Selvom melanom ikke er følsomt over for dette reagens, reagerer nogle tumorcellelinjer, såsom EG732, en murin thymisk lymfomcellelinje, på cyclophosphamid. Behandling af EG7-bærende mus med cyclophosphamid resulterer i udryddelse af tumorer, hvilket tyder på, at cyclophosphamid skal anvendes omhyggeligt eller titreres til følsomme tumormodeller. Den anbefalede alternative metode er en enkelt subletal dosis stråling (4,5-5,5 Gy) en dag før overførslen, og det optimale valg afhænger af karakteristikken for tumorcellelinjer.

Andre skridt skal tages forsigtigt, herunder omhyggelig udvælgelse af tumorbærende donormus og den delikate kirurgiske operation under tumortransplantation. Implanterede tumorer ville blive fjernet kirurgisk og transplanteret i tumormatchede modtagermus 8-10 dage efter overførslen. Før transplantation skal en sammenlignelig størrelse af tumormasse på ~ 5 mm diameter vælges som en allograft for at reducere uoverensstemmelser mellem individuelle mus og gøre erhvervede data mere pålidelige. Desuden skal snittet under operationen være nær musens midterlinje tilbage for at holde allograften i en afstand fra tumoren, der allerede findes i modtagermusen. Skånsom dissektion foreslås også for at forhindre skader på den indinale lymfeknude og omgivende væv.

Den effektive aflivning af kræftceller kræver koordinering af forskellige komponenter inden for TME33. Protokollen, der præsenteres her, kan udvides til undersøgelse af adaptive og medfødte immunceller såsom naturlige dræberceller, tumorassocierede makrofager og dendritiske celler. Ud over B16F10-OVA, der anvendes her, kan denne protokol desuden anvendes på andre subkutane tumormodeller. Afslutningsvis tilbyder det førnævnte tumortransplantationsassay en ny tilgang til undersøgelse af interaktive overgange af visse typer immunceller under antitumorresponser og er nyttig for forskere i tumorimmunologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr. 31825011 til LY) og National Natural Science Foundation of China (nr. 31900643 til QH, nr. 31900656 til ZW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore SLGPR33RB
1 mL tuberculin syringe KDL BB000925
1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences 320310
15 mL conical tube BEAVER 43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma T48402-25G
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
APC anti-mouse CD45.1 BioLegend 110714 Clone:A20
B16F10-OVA cell line bluefbio BFN607200447
BSA-V (bovine serum albumin) Bioss bs-0292P
BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 BD Horizon 562895 Clone:104
cell culture dish BEAVER 43701/43702/43703
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R
cyclophosphamide Sigma C0768-25G
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco C11995500BT
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19853
EDTA Sigma EDS-500g
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science R510-22-16
KHCO3 Sangon Biotech A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation Life Technologies L10199
needle carrier RWD Life Science F31034-14
NH4Cl Sangon Biotech A501569-0500
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002
surgical forceps RWD Life Science F12005-10
surgical scissors RWD Life Science S12003-09
suture thread RWD Life Science F34004-30
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
  2. Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
  3. McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
  4. Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
  7. Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
  8. Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
  9. Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
  10. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
  11. Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
  12. Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
  13. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
  14. Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
  15. Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
  16. Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
  17. Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
  18. Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
  19. Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
  20. Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
  21. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
  22. E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
  23. Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
  25. Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
  26. Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
  27. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
  28. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  29. Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
  30. Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
  31. Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
  32. Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
  33. Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).

Tags

Kræftforskning nummer 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 04/29/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.

Step 6.10 of the Protocol was updated from:

Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

to:

Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

Tumortransplantation til vurdering af dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 <sup>+</sup> T-celler i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Wang, Z., Guo, J., Lin,… More

Wang, L., Wang, Z., Guo, J., Lin, H., Wen, S., Liu, Q., Li, Y., Wu, Q., Gao, L., Chen, X., Xie, L., Tian, Q., Tang, J., Li, Z., Hu, L., Wang, J., Xu, L., Huang, Q., Ye, L. Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. J. Vis. Exp. (172), e62442, doi:10.3791/62442 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter