ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Her presenterer vi en tumortransplantasjonsprotokoll for karakterisering av tumor-iboende og periferi-avledede tumorinfiltrerte lymfocytter i en musesvulstmodell. Spesifikk sporing av tilstrømningen av mottakeravledede immunceller med strømningscytometri avslører dynamikken i fenotypiske og funksjonelle endringer i disse cellene under antitumor immunresponser.
Abstract
T cellemediert immunitet spiller en avgjørende rolle i immunresponser mot svulster, med cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) som spiller hovedrollen i å utrydde kreftceller. Opprinnelsen og etterfyllingen av tumorantigenspesifikke CD8+ T-celler i tumormikromiljøet (TME) forblir imidlertid uklare. Denne protokollen bruker cellelinjen B16F10-OVA melanom, som stabilt uttrykker surrogat neoantigen, ovalbumin (OVA) og TCR transgene OT-I mus, der over 90% av CD8 + T-cellene spesifikt gjenkjenner det OVA-avledede peptidet OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klassen I store histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyl H2-Kb. Disse funksjonene muliggjør studiet av antigenspesifikke T-celleresponser under tumorigenese.
Ved å kombinere denne modellen med tumortransplantasjonskirurgi ble tumorvev fra donorer transplantert til tumortilpassede syngeneiske mottakermus for å spore tilstrømningen av mottakeravledede immunceller til transplantert donorvev, slik at analysen av immunresponsene til tumor-iboende og periferi-stammer antigenspesifikk CD8+ T celler. Det ble funnet en dynamisk overgang mellom disse to populasjonene. Samlet har denne eksperimentelle designen gitt en annen tilnærming for å nøyaktig undersøke immunresponsene til CD8 + T-celler i TME, som vil kaste nytt lys over tumorimmunologi.
Introduction
CD8+ T cellemediert immunrespons spiller en sentral rolle i å kontrollere tumorvekst. Under tumorigenese aktiveres naive CD8+ T-celler ved antigengjenkjenning på en MHC-klasse I-begrenset måte og skiller seg deretter ut i effektorceller og infiltrerer i tumormasse 1,2. Men innenfor tumormikromiljøet (TME), langvarig antigeneksponering, samt immundempende faktorer, driver infiltrerte tumorspesifikke CD8+ T-celler inn i en hyporesponsiv tilstand kjent som "utmattelse"3. Utmattede T-celler (Tex) skiller seg fra effektor- eller minne T-celler generert i akutt virusinfeksjon, både transkripsjonelt og epigenetisk. Disse Tex-cellene er hovedsakelig preget av det vedvarende og forhøyede uttrykket av en rekke hemmende reseptorer, samt det hierarkiske tapet av effektorfunksjoner. Videre resulterer den svekkede proliferative kapasiteten til utmattede CD8 + T-celler i synkende antall tumorspesifikke T-celler, slik at de resterende CD8 + T-cellene i TME knapt kan gi tilstrekkelig beskyttende immunitet mot tumorprogresjon3. Dermed er vedlikehold eller forsterkning av intratumorale antigenspesifikke CD8 + T-celler uunnværlig for tumorundertrykkelse.
Videre antas immunkontrollpunktblokade (ICB) terapi å gjenopplive Tex i svulster ved å øke T-celleinfiltrasjonen og dermed T-celletall og forynge T-cellefunksjoner for å øke tumorundertrykkelsen. Den utbredte anvendelsen av ICB-behandling har endret kreftterapilandskapet, med en betydelig undergruppe av pasienter som opplever holdbare responser 4,5,6. Likevel reagerer de fleste pasienter og krefttyper ikke eller bare midlertidig på ICB. Utilstrekkelig T-celleinfiltrasjon i TME er postulert til å være en av de underliggende mekanismene som står for ICB-resistens 7,8.
Flere studier har vist heterogeniteten til tumorinfiltrerende CD8+ T-celler (TILer) hos både pasienter og musemodeller 9,10,11,12. Det har blitt bekreftet at en undergruppe av CD8+ T-celler som uttrykker T-cellefaktor-1 (TCF1) i en tumormasse viser stamcellelignende egenskaper, noe som ytterligere kan gi opphav til terminalt utmattede T-celler og er ansvarlig for spredningsutbruddet etter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Imidlertid har det vist seg at bare en liten andel av antigenspesifikke TCF1 + CD8 + T-celler eksisterer i TME og genererer et utvidet utvalg av differensiert avkom som svar på ICB 23,24,25,26. Hvorvidt den begrensede størrelsen på denne befolkningen er nok til å sikre utholdenheten til cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) for å kontrollere tumorprogresjon, forblir ukjent, og om det er etterfylling fra periferivev krever videre undersøkelse. Videre antyder nyere forskning den utilstrekkelige gjenoppfriskningskapasiteten til eksisterende tumorspesifikke T-celler og utseendet på nye, tidligere ikke-eksisterende clonotyper etter antiprogrammert celledødsprotein 1-behandling. Dette indikerer at T-cellerespons på kontrollpunktblokade kan skyldes den nye tilstrømningen av et tydelig repertoar av T-cellekloner27. Sammen med tilstedeværelsen av tilskuer ikke-tumor-reaktiv cytotoksisk T-cellefraksjon i TME, førte disse funnene til etableringen av en tumor allograft modell for å studere rollen som periferi-avledede CD8 + T-celler11.
Inntil nå har flere typer tumorimplantasjon, samt immuncelle adoptivoverføring, blitt mye brukt innen tumorimmunologi28. TILer, perifere mononukleære celler i blodet og tumorreaktive immunceller som stammer fra andre vev, kan karakteriseres godt ved hjelp av disse metodene. Men når man studerer interaksjonene mellom systemisk og lokal antitumorimmunitet, virker disse modellene utilstrekkelige til å undersøke samspillet mellom immunceller avledet fra periferien og TME. Her ble tumorvev transplantert fra donorer til tumortilpassede mottakermus for å spore tilstrømningen av mottakeravledede immunceller og observere donoravledede celler i TME samtidig.
I denne studien ble det etablert en murine syngeneisk modell av melanom med cellelinjen B16F10-OVA melanom, som stabilt uttrykker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR transgene OT-I-mus, der over 90% av CD8 + T-cellene spesifikt gjenkjenner det OVA-avledede peptidet OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klassen I MHC-molekyl H2-Kb, muliggjør studiet av antigenspesifikke T-celleresponser utviklet i B16F10-OVA tumormodellen. Ved å kombinere denne modellen med tumortransplantasjon ble immunresponsene til tumor-iboende og periferi-stammer antigenspesifikke CD8+ T-celler sammenlignet med å avsløre en dynamisk overgang mellom disse to populasjonene. Samlet har denne eksperimentelle designen gitt en annen tilnærming for å nøyaktig undersøke immunresponsene til CD8 + T-celler i TME, som kaster nytt lys over dynamikken i tumorspesifikke T-celleimmuneresponser i TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museeksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene fra institusjonell dyrepleie og brukskomiteer ved Det tredje militære medisinske universitet. Bruk 6-8 uker gamle C57BL/6 mus og naive OT-I transgene mus som veier 18-22 g. Bruk både mann og kvinne uten randomisering eller "blinding".
1. Tilberedning av medium og reagenser
- Forbered cellekultur medium D10 som tidligere beskrevet29 ved å legge til 10% foster bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin og 2 mM L-glutamin i Dulbeccos Modified Eagle Medium.
- Forbered cellekultur medium R10 ved å supplere RPMI-1640 med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin.
MERK: Kulturmediene D10 og R10 kan være sterile og stabile i minst 2 uker når de oppbevares ved 2-4 °C. - Forbered fluorescensaktivert cellesorteringsbuffer (FACS) ved å supplere 1x fosfatbufret saltvann (PBS) med 2% FBS og 0,01% natriumazid.
MERK: Ved tilsetning av natriumazid kan FACS Buffer oppbevares ved 2-4 °C i månedsvis. - Forbered rød blodcellelysbuffer (RBL) ved å tilsette 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 og 0,1 mM etylendiamintetraedsyre (EDTA) i dobbeltdestillert vann, og juster pH til 7,3.
MERK: RBL-bufferen er stabil i opptil 3 måneder ved romtemperatur (RT). - Klargjør magnetisk aktivert cellesorteringsbuffer (MACS) ved å supplere PBS med 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA.
MERK: Oppløsningen skal føres gjennom et 0,22 μm filter etter at reagenset er oppløst og bevart i asepsis. - Forbered en arbeidsløsning på 2,2,2-tribromoetanol.
- Løs opp 2,5 g 2,2,2-tribromoetanol i 5 ml tert-amylalkohol (2-metyl-2-butanol). Rør inn en dampbadende vibrator med konstant temperatur ved 180 o/min, 40 °C over natten.
- Filtrer oppløsningen gjennom et 0,22 μm filter i en steril beholder. Tilsett dobbeltdestillert vann opp til et endelig volum på 200 ml, og bland grundig og kontinuerlig til løsningen blir klar og gjennomsiktig.
- Bestem og juster pH-verdien for løsningen til 7,3. Pakk beholderen helt inn med aluminiumsfolie for å utelukke lys og oppbevar den ved 4 °C.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av arbeidsløsningen på 2,2,2-tribromoetanol er 12,5 mg /ml. En mer konsentrert løsning anbefales ikke fordi materialet er irriterende ved høyere konsentrasjoner. Test pH-verdien til arbeidsløsningen før hver bruk, og kast den hvis pH-verdien er mindre enn 5.
2. Fremstilling av B16F10-OVA celle suspensjon
MERK: Cellekulturen bør utføres i en biosikkerhetshette under strenge aseptiske forhold.
- Tine og kultur et hetteglass med B16F10-OVA celler med D10 i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Når cellene når sammenløpet på ca 80-90%, subkultur cellene.
- Fjern kulturmediet med en pipettor, og skyll cellene to ganger ved hjelp av PBS.
MERK: Ikke tilsett PBS kraftig mot de tilhengerne i kolben eller cellekulturretten. I stedet pipetterer du PBS mot en sidevegg eller legger den dråpevis inn i kolben eller parabolen. - Fjern PBS, og tilsett 1-2 ml 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning i kolben eller parabolen. Rock den frem og tilbake for å dekke hele celleoverflaten. Plasser kolben eller retten i en inkubator ved 37 °C i ~1 min eller ved RT til cellene løsner.
MERK: Et invertert mikroskop kan brukes til å kontrollere om cellene er løsnet. - Tilsett fersk D10 for å stoppe trypsiniseringen. Pipette suspensjonen opp og ned for å sikre at alle cellene er dissosiert fra kolben eller parabolens overflate.
- Overfør B16F10-OVA cellefjæringen til et 15 ml konisk rør. Sentrifuger cellene ved 125 × g i 5-7 min ved RT.
- Kast supernatanten, og bruk cellepelleten på nytt med D10. Dispenser B16F10-OVA cellefjæringen i en ny kolbe eller cellekulturrett som inneholder D10 og inkuber i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern kulturmediet med en pipettor, og skyll cellene to ganger ved hjelp av PBS.
- På dagen for tumorimplantasjonen høster du B16F10-OVA-celler som er ~ 90% sammenfallende som beskrevet i trinn 2.2.1 til 2.2.4. Kast supernatanten, og bruk cellepelleten på nytt med 1 ml PBS.
- Tell levedyktige celler med et hemocytometer ved hjelp av 0,4% trypan blå. Juster celletettheten til 1 × 106 celler per 100 μL ved å legge til PBS. Hold cellene på is.
3. Ektopisk tumorimplantasjon av B16F10-OVA-celler i den inguinale regionen av mus
- Bruk 6-8 uker gamle C57BL/6 mus som veier 18-22 g. Bruk både mann og kvinne uten randomisering eller "blinding".
- Trekk 100 μL av den tilberedte B16F10-OVA cellefjæringen inn i en 1 ml tuberkulinsprøyte. Trykk på fatet for å flytte bobler til toppen, og skyv stempelet forsiktig for å fjerne luftbobler.
- Hold musen og eksponer magen. Trykk på venstre bakben med lillefingeren for å stramme huden på venstre inngangsregion.
- Fjern musens hår fra venstre underliv med en elektrisk barbermaskin. Bruk bomull gjennomvåt i 75% etanol for å rengjøre den bakre kvadranten i venstre mage.
- Hold sprøyten i en svært grunne vinkel (0-15°) med nålens skråkant vendt oppover, sett den inn på stedet til venstre øvre lår, og før 0,5-1 cm gjennom det subkutane vevet inn i inngangsområdet.
- Trekk stempelet tilbake før injeksjon. Hvis det er negativt trykk, trykk stempelet helt ned og observer en liten bolus (dannelse av væskelomme) i subcutis dukker opp.
MERK: Hvis blodet trekkes tilbake i nålenavet, trekker du det ut og prøver på nytt på et annet sted. - Fjern kanylen etter at injeksjonen er utført, og kast den på riktig måte. Slipp og legg musen tilbake i buret.
- Mål tumorstørrelse på dag 6-8 ved hjelp av en vernier skala etter B16F10-OVA implantasjon. Velg mus med en ~ 3 mm diameter (mung bønnestørrelse) svulst og del dem likt og tilfeldig i to grupper.
MERK: Mus med svulster av lignende størrelse tildeles tilfeldig som donor- og mottakermus; det matchede tumorvevet utskilt fra donormus vil bli transplantert i mottakermusene. Videre bør ikke-opererte kontroller og sham-opererte kontroller inkluderes for å evaluere effekten av kirurgi på adoptivcelleoverføring og på musens generelle helse. Dermed fungerer en gruppe tumorbærende mus som ikke-opererte kontroller, og mottar enten CD45.1 + CD45.2 + eller CD45.1 + OT-I-celler, men ingen kirurgi. Den andre gruppen mus fungerer som sham-opererte kontroller, mottar enten CD45.1 + CD45.2 + eller CD45.1 + OT-I celler og påfølgende kirurgi som ligner på eksperimentell gruppe, men ingen allograft transplantasjon.
4. Adoptivoverføring av kongentisk merkede OT-I T-celler til tumorbærende mus
- Dagen før overføringen, administrer 4 mg cyklofosfamid oppløst i 200 μL PBS via intraperitoneal injeksjon til hver tumorbærende mus.
MERK: Behandling med cyklofosfamid har som mål å indusere lymfopeni hos verten som produserer "plass" for overførte celler, fremme deres overlevelse og homing til lymfoide organer for å fungere effektivt. - Bruk naive OT-I transgene mus med distinkte kongene markører (6-8 uker gamle, 18-22 g, samme kjønn som tumorbærende mus). Bruk CD45.1+ OT-I-mus og CD45.1+CD45.2+ OT-I-mus til å overføre henholdsvis OVA257-264 antigenspesifikke T-celler til tumorbærende donor- og mottakermus.
MERK: Opprinnelsen til adoptivt overførte OT-I-celler kan enkelt identifiseres hvis de viser distinkte congenic eller fluorescerende markører. Injiser for eksempel CD45.1+ OT-I T-celler i B16F10-OVA-bærende donormus mens du injiserer CD45.1+CD45.2+ OT-I T-celler i B16F10-OVA-bærende mottakermus. CD45.1 og CD45.2 er begge isoformer av pan-lymfocyttmarkøren CD45 (Ly5). Andre ofte brukte congenic markører inkluderer forskjellige isoformer av CD90 (Thy1). Denne protokollen kan brukes til mus som bærer forskjellige kongene markører. OT-I mus bør være av samme kjønn som musene som mottar OT-I celleoverføring for å unngå avvisningsproblemer. - Isoler lymfocyttene fra milten og lymfeknuter av OT-I-musen.
MERK: Følgende prosedyrer i dette trinnet må utføres i et biosikkerhetsskap for å opprettholde streng asepsis.- Forbered to 60 mm × 10 mm Petri-retter. Tilsett 3 ml R10 medium i en tallerken mens du tilsetter 3 ml RBL-buffer i en annen tallerken. Plasser en 70 μm nyloncellesil i retten som inneholder RBL-buffer.
- Euthanize en OT-I mus i en isofluran kammer etterfulgt av Cervical dislokasjon.
- Høst milten, inguinal (subiliac) og aksillære lymfeknuter av musen og overfør dem til en 60 mm × 10 mm tallerken med 3 ml R10 på is.
MERK: Antallet OT-I-mus som ofres kan justeres avhengig av antall tumorbærende mus som skal overføres. Et typisk utbytte av OT-I CD8 + T-celler fra en milt og bilaterale inguinale og aksillære lymfeknuter av OT-I CD8 + T-celler er ~ 30-100 × 106 celler per mus. - Bruk endefatet på en 1 ml sprøyte til å macerere milten i 3 ml RBL-buffer gjennom silen. Inkuber i 3 min ved RT, og avslutt reaksjonen ved å legge til 3 ml kaldt R10-medium.
- Mos lymfeknuter til bare bindevev forblir. Skyll filteret med R10. Overfør cellefjæringen til et nytt konisk rør på 15 ml. Sentrifuge ved 500 × g, 4 °C i 6 minutter.
- Dekanter supernatanten, og resuspend cellene i 3 ml MACS-buffer. Før cellesuspensjonen gjennom en ny 70 μm cellesil for å fjerne eventuelle flocs.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 × g i 5 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten.
- Bruk en mus CD8+ T celleisolasjonssett (se materialtabellen) for å rense CD8+ T-celler ved negativt valg, i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Når du bruker sett fra andre selskaper, følg produsentens anvisninger. - Hold den rensede cellefjæringen på is. Ta en liten prøve av celler og bland med trypan blå for å telle celler ved hjelp av et hemocytometer.
- Bestem prosentandelen av OT-I-celler (live/dead-CD8+Va2+) ved strømningscytometri.
MERK: Samtidig farging av kongene markører og den transgene TCR bør utføres for å verifisere riktig fenotype av cellene før overføring.- Tilsett 5 × 104-1 × 105 celler i 1 ml FACS-buffer i et 1,5 ml sentrifugerør, og sentrifuger cellefjæringen ved 350 × g, 4 °C i 3 minutter.
- Kast supernatanten, og spre cellene ved å flikke bunnen av røret. Plasser røret på isen.
- Forbered følgende konjugede antistoffblandinger (fortynnet i 100 μL FACS buffer): anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; anti-CD45.2, 1:200; og levende/døde, 1:200 (se materialtabellen).
- Vortex antistoffcocktail og sentrifuge ved 15.000 × g i 3 min til pellet antistoff aggregater. Oppbevar cocktailen på isen og beskytt den mot lys.
- Resuspend cellene med 100 μL antistoff cocktail og bland grundig ved å flikke røret. Inkuber i mørket i 30 min på is.
MERK: Unngå å forstyrre antistoffaggregatene nederst på røret. - Vask pelletsene to ganger med 1 ml FACS-buffer. Sentrifuge ved 350 × g, 4 °C i 3 minutter. Resuspend cellene i 200 μL av FACS buffer, og overføre cellen suspensjon til en FACS tube.
MERK: For å opprettholde levedyktigheten til OT-I-cellene som skal overføres, test prøven så snart som mulig. Hvis de fargede OT-I-cellene ikke kan testes umiddelbart, må cellene holdes i mørket på is eller kjøles ned ved 4 °C til analyse. Alternativt kan prøvene brukes på nytt i 1-4% paraformaldehyd for utvidet lagring (16 timer) for å forhindre forverring. - Kjør prøven på et strømningscytometer. Beregn prosentandelen av live/dead-CD8+Va2+-celler ved å dele antall levende/døde CD8+Vα2+-celler på antall levende/døde celler.
- Bestem det absolutte antallet OT-I-celler (live/dead-CD8+Va2+) ved å multiplisere prosentandelen av live/dead-CD8+Va2+-celler med det levedyktige cellenummeret som ble oppnådd i trinn 4.3.9.
- Juster konsentrasjonen av OT-I-celler (live/dead-CD8+Va2+) til 1,5 × 106 /ml med PBS.
- Injiser 3 × 105 distinkte medfødt merkede OT-I-celler (levende/ død-CD8 + Va2 +) i 200 μL PBS intravenøst i to grupper av B16F10-OVA-bærende mus (tumorbærende mus delt inn i donor- og mottakermus fra trinn 3.8).
- Trekk 200 μL OT-I celle (live/dead-CD8+Va2+) suspensjon i en 100 U insulin sprøyte (29 G), og fjern bobler som i trinn 3.2.
- Plasser musen separat i et bur med en infrarød lampe over buret i 5-10 min for å utvide halevenen. Immobiliser musen med en begrensende enhet av passende størrelse. Trekk halen for å rette den og spray med 75% etanol for å gjøre venen synlig.
- Hold sprøyten parallelt med venen og sett den inn i venen i en vinkel på 0-15°. Trekk stempelet litt tilbake, og hvis blodet kommer inn i fatet, injiser suspensjonen sakte og jevnt med en hastighet på ikke mer enn 1 ml / min.
MERK: Motstand eller hevelse på injeksjonsstedet indikerer at nålen ikke er inne i venen; injeksjonsstedet skal flyttes proksimalt. - Når injeksjonen er fullført, fjerner du sprøyten og trykker forsiktig på innsettingsområdet i 3-5 s for å stoppe blødningen. Returner musen til buret og følg den nøye i noen minutter for bivirkninger. Hvis den har normal mobilitet og neseutslipp, plasser den tilbake i selskap med de andre musene.
5. Disseker tumormasse fra tumorbærende donormus
MERK: Oppretthold sterile forhold under operasjonen i avsnitt 5 og 6. Steriliser alle kirurgiske instrumenter ved autoklavering før og etter hver bruk. Desinfiser driftsområdet i biosikkerhetsskapet med 75% etanol etterfulgt av ultrafiolett bestråling. Bruk en ren kjole, hette, ansiktsmaske og sterile hansker.
- Åtte til ti dager etter adoptivoverføringen velger du donormus med sammenlignbar tumormasse på ~ 5 mm diameter (soyabønnestørrelse) for transplantasjonskirurgi.
- Forbered en 100 mm × 20 mm tallerken i et biosikkerhetsskap, og tilsett 10 ml steril iskald PBS.
- Avlivet en tumorbærende donormus i et isoflurankammer etterfulgt av cervical dislokasjon. Senk musen i 75% etanol i 3-5 min og overfør til biosikkerhetsskapet.
MERK: Følgende prosedyrer i dette trinnet må utføres i et biosikkerhetsskap for å opprettholde streng asepsis. - Plasser musen på et disseksjonskort dekket med rent absorberende papir i en liggende stilling. Hold muselemmene tilbake med disseksjonsnåler.
- Klipp huden langs midtlinjen ovenfra urinrørsåpningen til xiphoid med saks. Strekk huden mot venstre side av musekroppen med pinsett og hold huden tilbake med disseksjonsnåler.
- Slukn svulsten, og hold kapselen så intakt som mulig. Fjern forsiktig og forsiktig bindevevet nær svulsten med kirurgisk saks.
MERK: For å opprettholde svulstens integritet må du ikke skrelle av tumorkapselen eller kutte tumorvevet i stykker. - Legg tumorvevet i en 100 mm × 20 mm tallerken som inneholder 10 ml steril iskald PBS for etterfølgende transplantasjon.
6. Subkutan transplantasjon av donor-avledet svulst på tumor-matchede mottakermus
MERK: Allograften skal implanteres i musens nedre flanke på samme side som den tidligere eksisterende svulsten for å få to svulster til å renne ut til den identiske lymfeknuten. I protokollen som presenteres her, da B16F10-OVA-svulsten ble implantert subkutant på venstre inguinal region av musen (avsnitt 3), ble det donor-avledede tumorvevet transplantert på mottakerens venstre flanke i dette trinnet. Transplantasjonsstedet kan tilpasses det første implanterte tumorstedet.
- Bedøv en tumortilpasset mottakermus med 250 mg/kg 2,2,2-tribromoetanol via intraperitoneal injeksjon. Klem tåen til en ekstensorlem av musen for å vurdere nivået av anestesi og vent på mangel på smerterefleks, noe som indikerer riktig dybde av anestesi for å utføre operasjonen. Hvis vokalisering eller bakre lemuttak observeres, injiser ytterligere 0,01-0,03 ml 2,2,2-tribromoetanol.
MERK: Den tumortilpassede mottakermusen skal være av samme kjønn som donormusen som gir allograften for å unngå avvisningsproblemer. - Bruk veterinær salve på øynene for å forhindre tørrhet. Barber venstre flanke av musen med en elektrisk barbermaskin. Påfør en depilatorisk krem for å fjerne det gjenværende håret.
MERK: Unngå sliping av huden, noe som kan øke risikoen for forurensning og infeksjon. - Plasser musen i biosikkerhetsskapet. Plasser den i utsatt posisjon på et disseksjonskort dekket med rent absorberende papir, med musens vertikale akse parallelt med og hodet til høyre side av eksperimentet.
MERK: Følgende prosedyrer i dette trinnet må utføres i et biosikkerhetsskap for å opprettholde streng asepsis. - Gni huden på det barberte området med bomull gjennomvåt i povidon-jod.
MERK: Bruk povidon-jod i stedet for 75% etanol for sterilisering for å forhindre tap av kroppsvarme. - Løft huden i midten mellom musens hofteledd med kirurgiske pinsett. Bruk saksen til å lage et 5 mm langt vertikalt eksisjon. Utvid kuttet rostrally langs dorsal midtlinjen til ~ 10-15 mm.
- Utfør en skarp disseksjon ved å sette de lukkede spissene på saksen inn i snittet og deretter åpne for å skille bukhinnen på venstre flanke fra huden og bløtvevet.
MERK: For å unngå å forårsake skade på det subkutane vevet og bukhinnen, løft huden i midten av snittet, og sett deretter inn den lukkede saksen så nær huden som mulig. - Lag en hudlomme på venstre flanke ved å utføre skarp disseksjon flere ganger. Deponer den innkapslede, intakte donoravledede tumormassen i kapselen.
MERK: Mus i den sham-opererte kontrollgruppen får samme operasjon uten donor-avledet tumortransplantasjon. - Lukk snittet ved å avbryte suturen (se Materialliste). Plasser 2-3 suturer for hvert snitt. Desinfiser huden rundt kuttet med bomull gjennomvåt i povidon-jod.
MERK: Det skal være 5 mm mellom to påfølgende masker og en 3 mm avstand fra snittet. - Plasser musen i sidestilling i et rent og varmt bur. Overvåk den kontinuerlig til den har fått tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal heftelse.
- Administrer buprenorfin subkutant i en dose på 0,1 mg/kg kroppsvekt hver 8 h tre ganger etter operasjonen for å lindre smerten. Overvåk musens spising, drikking, flytting og området som drives på. Returner transplantasjonsmottakeren til selskap med andre dyr først etter at den er fullstendig gjenopprettet.
MERK: Musen gjenoppretter vanligvis fra traumer av operasjonen innen 3 dager. Hvis musen ikke er tilbake til normal fôring og mobilitet og viser noen manifestasjoner av infeksjon, kontakt en veterinær for intervensjoner eller euthanize den. - Offer (euthanize dyrene som i trinn 4.3.2) musene på de angitte tidspunktene, og gjenopprette cellene av interesse for strømning cytometrisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjemaet for denne protokollen vises i figur 1. Åtte dager etter tumorinokulering ble CD45.1+ og CD45.1+CD45.2+ OT-I celler injisert i B16F10-OVA tumorbærende C57BL/6 mus. Svulsten ble kirurgisk dissekert fra CD45.1+ OT-I celle-implanterte mus (donor) på dag 8 etter overføring og transplantert til tumor-matchet CD45.1 + CD45.2 + OT-I celle-implanterte mus (mottaker) i dorsal flanken på samme side som den implanterte svulsten. Gjennom flow cytometri (gating strategi vist i figur 2) analyse, to populasjoner av CD44 + CD8 + tumor antigen-spesifikke T-celler kan enkelt identifiseres i TME, inkludert CD45.1 + donor-avledet og CD45.1 + CD45.2 + mottaker-avledede TILer. Deretter ble proporsjonene av disse to populasjonene i allograftene analysert på angitte tidspunkter for å studere dynamikken i de antigenspesifikke CD8 + T-cellene. På dag 2 etter transplantasjon var det ~ 83% av donor-avledede antigenspesifikke CD8 + T-celler i den transplanterte svulsten, mer dominerende enn deres mottakeravledede kolleger. Imidlertid ble andelen mottakeravledede OT-I-celler forhøyet i sen fase av tumorigenesis, overgår tumor-iboende OT-I-celler avledet fra donoren. (Figur 3).
Figur 1: Skjematisk for eksperimentell utforming. C57BL/6mice utfordres med B16F10-OVA svulst på inngangsområdet. Åtte dager senere overføres forskjellige kongentisk merkede (CD45.1+ eller CD45.1 + CD45.2 +) OT-I-celler til tumorbærende mus. På dag 8 etter overføring blir svulsten på CD45.1+ OT-I celleimplanterte mus kirurgisk dissekert og subkutant transplantert i tumortilpassede CD45.1 + CD45.2 + OT-I celleimplanterte mottakere i flanken på samme side som den eksisterende svulsten. Deretter ofres musene, og antigenspesifikke T-celler (OT-I-celler) i allograftene analyseres på de angitte tidspunktene. Forkortelser: CD = klynge av differensiering; i.v. = intravenøs; Sac = offer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gating strategi for strømning cytometri analyse. Gating strategi som brukes til å identifisere donor-avledet (CD45.1+) og mottaker-avledet (CD45.1+CD45.2+) antigen-spesifikke CD44 + CD8 + T celler i allografts. Forkortelser: SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremoverspredningsområde; FSC-W = fremover spredningsbredde; FSC-H = fremover spredningshøyde; SSC-W = sidespredningsbredde; SSC-H = sidespredningshøyde; L/D = levende/død; CD = differensieringsklynge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forholdet mellom donor- og mottakeravledede antigenspesifikke CD8+ T-celler i tumor allografts. Representative flowcytometriplott som viser uttrykk for de congenic markørene CD45.1 og CD45.2 brukes til å identifisere donor-avledede og mottaker-avledede OT-I celler innen tumor allografts på dag 2, 8 og 15 etter transplantasjon. Tallene representerer prosentandelen av de to delsettene i CD44+CD8+ T-cellepopulasjonen . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T cellemediert immunitet spiller en avgjørende rolle i immunresponser mot svulster, med CTLer som spiller hovedrollen i å utrydde kreftceller. Opprinnelsen til tumorantigenspesifikke CTLer i TME har imidlertid ikke blitt belyst30. Bruken av denne tumortransplantasjonsprotokollen har gitt en viktig anelse om at intratumorale antigenspesifikke CD8+ T-celler kanskje ikke vedvarer i lang tid, til tross for eksistensen av stamceller som TCF1 + stamfar CD8 + T-celler. Spesielt er det en kontinuerlig tilstrømning av periferi-avledede tumorspesifikke CD8 + T-celler i tumormassen.
Så vidt vi vet, er dette en relativt praktisk og overbevisende metode som bekrefter at vedlikehold av antigenspesifikke CD8+ T-celler i TME hovedsakelig avhenger av etterfylling av periferi-avledede tumorspesifikke CD8 + T-celler i stedet for selvfornyelse av tumor-bosatte TILer. Selv om protokollen som presenteres her bare fokuserer på andelen donor-avledede og mottakeravledede TILer, kan fenotypiske, funksjonelle og transkripsjonelle egenskapene til disse to populasjonene lett undersøkes med strømningscytometri. Videre er det mulig å kombinere ICB-antistoffer for å undersøke svarene fra et bestemt celledelsett til ICB-terapi.
I denne protokollen transplanteres donor-avledet tumorvev på mottakermusen med en eksisterende original svulst. To svulster i en mottakermus vil føre til distribusjon av periferigenererte T-celler i to tumormasser. Videre vil tumorbyrden bli nesten doblet sammenlignet med dyr uten transplantasjoner. I pilotforsøk forsøkte vi å utskille den opprinnelige svulsten på mottakermus før transplantasjon; Det var imidlertid teknisk utfordrende å eliminere alle tumorceller ved kirurgi grundig. De gjenværende tumorcellene ville raskt og danne et nytt tumorvev snart. Dermed er det en begrensning for dette systemet når man sammenligner T-celle immunresponser med de i ikke-transplanterte mus. Imidlertid er dette systemet fortsatt nyttig for sammenligning av nylig migrerte og eksisterende T-celler i samme TME som transplanteres fra donor tumorbærende mus. Dessuten er det ingen som benekter at transplantasjon av tumorvev kan føre til betennelse, noe som kan påvirke immuncelledynamikken i svulsten. Selv om effekten av kirurgi på OT-I celleinfiltrasjon kunne utelukkes gjennom ikke-opererte og sham-opererte kontroller, vurderte vi ikke effekten av lokale inflammatoriske responser på OT-I celledynamikk.
Noen hensyn bør tas i betraktning, hvorav den ene er bruken av cyklofosfamid. Cyklofosfamid31 er et alkyleringsmiddel som er mye brukt til å behandle faste organ maligniteter og lymfoproliferative og autoimmune lidelser. Seks til åtte dager etter B16F10-OVA-inokulering administreres cyklofosfamid før adoptivoverføring for å indusere lymfodepletion av vertsmus og forbedre aktiviteten til de overførte OT-I-cellene29. Selv om melanom ikke er følsomt for dette reagenset, reagerer noen tumorcellelinjer, som EG732, en murin tymisk lymfomcellelinje, på cyklofosfamid. Behandling av EG7-bærende mus med cyklofosfamid resulterer i utryddelse av svulster, noe som antyder at cyklofosfamid må brukes nøye eller titreres for sensitive tumormodeller. Den anbefalte alternative metoden er en enkelt subletal dose stråling (4,5-5,5 Gy) en dag før overføringen, og det optimale valget avhenger av karakteristikken til tumorcellelinjer.
Andre trinn må tas forsiktig, inkludert nøye utvalg av tumorbærende donormus og den delikate kirurgiske operasjonen under tumortransplantasjon. Implanterte svulster ville bli kirurgisk fjernet og transplantert til tumortilpassede mottakermus 8-10 dager etter overføring. Før transplantasjon skal en sammenlignbar størrelse på tumormasse på ~ 5 mm diameter velges som en allograft for å redusere uoverensstemmelser mellom individuelle mus og gjøre oppkjøpte data mer pålitelige. Videre, under operasjonen, bør snittet være nær midtlinjen av musen tilbake for å holde allograften på avstand fra svulsten som allerede eksisterer i mottakermusen. Forsiktig disseksjon foreslås også for å forhindre skader på inguinal lymfeknute og omkringliggende vev.
Det effektive drapet på kreftceller krever koordinering av ulike komponenter i TME33. Protokollen som presenteres her kan utvides til undersøkelse av adaptive og medfødte immunceller som naturlige morderceller, tumorrelaterte makrofager og dendrittiske celler. Videre, i tillegg til B16F10-OVA som brukes her, kan denne protokollen brukes på andre subkutane tumormodeller. For å konkludere, tilbyr den nevnte tumortransplantasjonsanalysen en ny tilnærming for studiet av interaktive overganger av visse typer immunceller under antitumorresponser og er nyttig for forskere i tumorimmunologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 31825011 to LY) og National Natural Science Foundation of China (Nr. 31900643 til QH, Nr. 31900656 til ZW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Blank, C. U., et al.
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P.
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G.
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al.
Tags
Kreftforskning utgave 172Erratum
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 04/29/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
