ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Här presenterar vi ett tumörtransplantationsprotokoll för karakterisering av tumör-inneboende och periferi-härledda tumörinfiltrerade lymfocyter i en mustumörmodell. Specifik spårning av tillströmningen av mottagarhärledda immunceller med flödescytometri avslöjar dynamiken i de fenotypiska och funktionella förändringarna hos dessa celler under antitumörimmunsvar.
Abstract
T-cellmedierad immunitet spelar en avgörande roll i immunsvar mot tumörer, med cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) som spelar den ledande rollen för att utrota cancerceller. Ursprunget och påfyllningen av tumörantigenspecifika CD8 + T-celler inom tumörmikromiljön (TME) förblir emellertid oklara. Detta protokoll använder B16F10-OVA melanomcellinjen, som stabilt uttrycker surrogatneoantigen, ovalbumin (OVA) och TCR-transgena OT-I-möss, där över 90% av CD8 + T-cellerna specifikt känner igen den OVA-härledda peptiden OVA257-264 (SIINFEKL) bunden till klass I-molekylen H2-Kb. Dessa funktioner möjliggör studier av antigenspecifika T-cellsvar under tumorigenes.
Genom att kombinera denna modell med tumörtransplantationskirurgi transplanterades tumörvävnader från givare till tumörmatchade syngena mottagarmöss för att exakt spåra tillströmningen av mottagarhärledda immunceller till transplanterade donatorvävnader, vilket möjliggjorde analys av immunsvaren hos tumör-inneboende och periferi-ursprung antigenspecifik CD8+ T-celler. En dynamisk övergång visade sig inträffa mellan dessa två populationer. Sammantaget har denna experimentella design gett ett annat tillvägagångssätt för att exakt undersöka immunsvaren hos CD8 + T-celler i TME, vilket kommer att kasta nytt ljus på tumörimmunologi.
Introduction
CD8+ T-cellmedierat immunsvar spelar en avgörande roll för att kontrollera tumörtillväxt. Under tumorigenes aktiveras naiva CD8 + T-celler vid antigenigenkänning på ett MHC klass I-begränsat sätt och differentieras därefter till effektorceller och infiltrerar i tumörmassa 1,2. Inom tumörmikromiljön (TME) driver emellertid långvarig antigenexponering, liksom immunsuppressiva faktorer, infiltrerade tumörspecifika CD8 + T-celler till ett hyporesponsivt tillstånd som kallas "utmattning"3. Utmattade T-celler (Tex) skiljer sig från effektor- eller minnes-T-celler som genereras vid akut virusinfektion, både transkriptionellt och epigenetiskt. Dessa Tex-celler kännetecknas huvudsakligen av det ihållande och förhöjda uttrycket av en serie hämmande receptorer samt den hierarkiska förlusten av effektorfunktioner. Vidare resulterar den försämrade proliferativa kapaciteten hos utmattade CD8 + T-celler i minskande antal tumörspecifika T-celler, så att de återstående CD8 + T-cellerna i TME knappt kan ge tillräcklig skyddande immunitet mot tumörprogression3. Således är underhåll eller förstärkning av intratumorala antigenspecifika CD8 + T-celler oumbärliga för tumörförtryck.
Dessutom antas immunkontrollpunktsblockad (ICB) -terapi återuppliva Tex i tumörer genom att öka T-cellinfiltrationen och därmed T-cellnummer och föryngra T-cellfunktioner för att öka tumörrepressionen. Den utbredda tillämpningen av ICB-behandling har förändrat cancerterapilandskapet, med en betydande delmängd av patienterna som upplever varaktiga svar 4,5,6. Ändå svarar majoriteten av patienter och cancertyper inte eller bara tillfälligt på ICB. Otillräcklig T-cellinfiltration i TME har postulerats vara en av de underliggande mekanismerna som står för ICB-resistens 7,8.
Flera studier har visat heterogeniteten hos tumörinfiltrerande CD8 + T-celler (TILs) hos både patienter och musmodeller 9,10,11,12. Det har bekräftats att en delmängd av CD8 + T-celler som uttrycker T-cellfaktor-1 (TCF1) i en tumörmassa uppvisar stamcellsliknande egenskaper, vilket ytterligare kan ge upphov till terminalt utmattade T-celler och är ansvarig för spridningsutbrottet efter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Det har emellertid visat sig att endast en liten andel antigenspecifika TCF1 + CD8 + T-celler finns i TME och genererar en utökad pool av differentierad avkomma som svar på ICB 23,24,25,26. Huruvida den begränsade storleken på denna population är tillräcklig för att säkerställa persistensen av cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) för att kontrollera tumörprogression är fortfarande okänd, och om det finns påfyllning från periferivävnader kräver ytterligare undersökning. Vidare tyder ny forskning på otillräcklig återupplivningskapacitet hos redan existerande tumörspecifika T-celler och utseendet på nya, tidigare icke-existerande klonotyper efter antiprogrammerad celldödsprotein 1-behandling. Detta indikerar att T-cellsvaret på kontrollpunktsblockad kan bero på den nya tillströmningen av en distinkt repertoar av T-cellkloner27. Tillsammans med närvaron av åskådare icke-tumörreaktiv cytotoxisk T-cellfraktion i TME, föranledde dessa fynd inrättandet av en tumör allograftmodell för att studera rollen av periferi-härledda CD8 + T-celler11.
Hittills har flera typer av tumörimplantation, liksom immuncellsad adoptivöverföring, använts i stor utsträckning inom tumörimmunologi28. TILs, perifera blodmononukleära celler och tumörreaktiva immunceller som härrör från andra vävnader kan karakteriseras väl med hjälp av dessa metoder. Men när man studerar interaktionerna mellan systemisk och lokal antitumörimmunitet verkar dessa modeller otillräckliga för att undersöka interaktionerna mellan immunceller som härrör från periferin och TME. Här transplanterades tumörvävnader från donatorer till tumörmatchade mottagarmöss för att exakt spåra tillströmningen av mottagarhärledda immunceller och observera de givar-härledda cellerna i TME samtidigt.
I denna studie etablerades en murin syngen modell av melanom med B16F10-OVA melanomcellinjen, som stabilt uttrycker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR-transgena OT-I-möss, där över 90% av CD8 + T-cellerna specifikt känner igen den OVA-härledda peptiden OVA257-264 (SIINFEKL) bunden till klass I MHC-molekylen H2-Kb, möjliggör studier av antigenspecifika T-cellsvar som utvecklats i B16F10-OVA-tumörmodellen. Genom att kombinera denna modell med tumörtransplantation jämfördes immunsvaren hos tumör-inneboende och periferi-originerade antigenspecifika CD8 + T-celler för att avslöja en dynamisk övergång mellan dessa två populationer. Sammantaget har denna experimentella design gett ett annat tillvägagångssätt för att exakt undersöka immunsvaren hos CD8 + T-celler i TME, vilket ger nytt ljus på dynamiken i tumörspecifika T-cellsimmunsvar i TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musexperiment utfördes i enlighet med riktlinjerna från institutionala djurvårds- och användningskommittéer vid det tredje militära medicinska universitetet. Använd 6-8 veckor gamla C57BL/6-möss och naiva OT-I-transgena möss som väger 18-22 g. Använd både man och kvinna utan randomisering eller "blindning".
1. Beredning av medium och reagenser
- Förbered cellodlingsmediet D10 enligt tidigare beskrivit29 genom att tillsätta 10 % fetalt bovint serum (FBS), 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin och 2 mM L-glutamin i Dulbeccos Modified Eagle Medium.
- Förbered cellodlingsmediet R10 genom att komplettera RPMI-1640 med 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin.
OBS: Odlingsmediet, D10 och R10, kan förbli sterilt och stabilt i minst 2 veckor när det förvaras vid 2–4 °C. - Förbered fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (FACS) genom att komplettera 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 2% FBS och 0,01% natriumazid.
OBS: Med tillsats av natriumazid kan FACS Buffer lagras vid 2-4 ° C i månader. - Förbered buffert för rödblodkroppslys (RBL) genom att tillsätta 155 mMNH4Cl, 10 mMKHCO3 och 0,1 mM etylenediamintetraättiksyra (EDTA) i dubbeldestillerat vatten och justera dess pH till 7,3.
OBS: RBL-bufferten är stabil i upp till 3 månader vid rumstemperatur (RT). - Förbered magnetisk aktiverad cellsorteringsbuffert (MACS) genom att komplettera PBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA.
OBS: Lösningen ska passera genom ett 0,22 μm filter efter att reagenset har lösts upp och bevarats i asepsis. - Förbered en arbetslösning av 2,2,2-tribromoetanol.
- Lös upp 2,5 g 2,2,2-tribromoetanol i 5 ml tert-amylalkohol (2-metyl-2-butanol). Rör ner en ångbadande vibrator med konstant temperatur vid 180 rpm, 40 °C över natten.
- Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter i en steril behållare. Tillsätt dubbeldestillerat vatten upp till en slutlig volym på 200 ml och blanda noggrant och kontinuerligt tills lösningen blir klar och transparent.
- Bestäm och justera lösningens pH-värde till 7,3. Vik behållaren helt med aluminiumfolie för att utesluta ljus och förvara vid 4 ° C.
OBS: Den slutliga koncentrationen av arbetslösningen av 2,2,2-tribromoetanol är 12,5 mg/ml. En mer koncentrerad lösning rekommenderas inte eftersom materialet är irriterande vid högre koncentrationer. Testa arbetslösningens pH-värde före varje användning och kassera det om pH-värdet är mindre än 5.
2. Beredning av B16F10-OVA-cellsuspension
OBS: Cellodling bör utföras i en biosäkerhetskåpa under strikta aseptiska förhållanden.
- Tina och odla en injektionsflaska med B16F10-OVA-celler med D10 i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- När cellerna når sammanflödet av ca 80-90%, subkultur cellerna.
- Ta bort odlingsmediet med en pipettor och skölj cellerna två gånger med PBS.
OBS: Tillsätt inte PBS kraftfullt mot de vidhäftande cellerna i kolven eller cellodlingsskålen. Pipettera istället PBS mot en sidovägg eller lägg den droppvis i kolven eller skålen. - Ta bort PBS och tillsätt 1-2 ml 0,25% trypsin-EDTA-lösning i kolven eller skålen. Rocka den fram och tillbaka för att täcka hela cellytan. Placera kolven eller skålen i en inkubator vid 37 ° C i ~ 1 min eller vid RT tills cellerna lossnar.
OBS: Ett inverterat mikroskop kan användas för att kontrollera om cellerna har lossnat. - Lägg till färsk D10 för att stoppa trypsiniseringen. Pipettera suspensionen upp och ner för att säkerställa att alla celler är dissocierade från kolven eller skålens yta.
- Överför B16F10-OVA-cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera cellerna vid 125 × g i 5-7 min vid RT.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med D10. Fördela B16F10-OVA-cellsuspensionen i en ny kolv eller cellodlingsskål innehållande D10 och inkubera i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Ta bort odlingsmediet med en pipettor och skölj cellerna två gånger med PBS.
- På dagen för tumörimplantationen, skörda B16F10-OVA-celler som är ~ 90% sammanflytande enligt beskrivningen i steg 2.2.1 till 2.2.4. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 1 ml PBS.
- Räkna de livskraftiga cellerna med en hemocytometer med 0,4% trypanblå. Justera celldensiteten till 1 × 106 celler per 100 μL genom att tillsätta PBS. Håll cellerna på is.
3. Ektopisk tumörimplantation av B16F10-OVA-celler i inguinalregionen hos möss
- Använd 6-8 veckor gamla C57BL/6 möss som väger 18-22 g. Använd både man och kvinna utan randomisering eller "blindning".
- Dra ut 100 μL av den beredda B16F10-OVA-cellsuspensionen i en 1 ml tuberkulinspruta. Tryck på pipan för att flytta bubblor till toppen och tryck försiktigt på kolven för att ta bort luftbubblor.
- Håll musen och exponera buken. Tryck på vänster bakben med lillfingret för att dra åt huden i vänster inguinalregion.
- Ta bort musens hår från vänster underliv med en elektrisk rakapparat. Använd bomull som blötläggs i 75% etanol för att rengöra den bakre kvadranten i vänster buk.
- Håll sprutan i en mycket grund vinkel (0-15 °) med nålens fasning uppåt, sätt in den på platsen för vänster övre lår och avancera 0,5-1 cm genom den subkutana vävnaden in i inguinalområdet.
- Dra tillbaka kolven före injektionen. Om det finns negativt tryck, tryck ner kolven helt och observera en liten bolus (bildning av vätskeficka) i subcutis dyka upp.
OBS: Om blod dras tillbaka in i nålhavet, dra tillbaka och försök igen på en annan plats. - Ta bort nålen efter injektionen har utförts och kassera den på lämpligt sätt. Släpp och placera musen tillbaka i buret.
- Mät tumörstorlek på dag 6-8 med hjälp av en vernierskala efter B16F10-OVA-implantation. Välj möss med en ~ 3 mm diameter (mungbönstorlek) tumör och dela dem lika och slumpmässigt i två grupper.
OBS: Möss med tumörer av liknande storlek tilldelas slumpmässigt som donator- och mottagarmöss; den matchade tumörvävnaden som skärs ut från donatormöss kommer att transplanteras till mottagarmössen. Dessutom bör icke-opererade kontroller och skenstyrda kontroller inkluderas för att utvärdera effekterna av kirurgi på adoptiv cellöverföring och på mössens allmänna hälsa. Således fungerar en grupp tumörbärande möss som icke-opererade kontroller och får antingen CD45.1 + CD45.2 + eller CD45.1 + OT-I-celler men ingen operation. Den andra gruppen av möss fungerar som sham-opererade kontroller, som får antingen CD45.1 + CD45.2+ eller CD45.1 + OT-I-celler och efterföljande kirurgi som liknar experimentgruppen men ingen allografttransplantation.
4. Adoptiv överföring av kongeniskt märkta OT-I T-celler till tumörbärande möss
- Dagen före överföringen, administrera 4 mg cyklofosfamid upplöst i 200 μL PBS via intraperitoneal injektion till varje tumörbärande mus.
OBS: Behandling med cyklofosfamid syftar till att inducera lymfopeni i värden som producerar "utrymme" för överförda celler, främjar deras överlevnad och homing till lymfoida organ för att fungera effektivt. - Använd naiva OT-I-transgena möss med distinkta kongena markörer (6-8 veckor gamla, 18-22 g, samma kön som de tumörbärande mössen). Använd CD45.1+ OT-I-möss och CD45.1+CD45.2+ OT-I-möss för att adoptivt överföra OVA257-264 antigenspecifika T-celler till tumörbärande donator- respektive mottagarmöss.
OBS: Ursprunget till adoptivt överförda OT-I-celler kan lätt identifieras om de visar distinkta kongena eller fluorescerande markörer. Injicera till exempel CD45.1+ OT-I T-celler i B16F10-OVA-bärande donatormöss medan du injicerar CD45.1 + CD45.2+ OT-I T-celler i B16F10-OVA-bärande mottagarmöss. CD45.1 och CD45.2 är båda isoformer av panlymfocytmarkören CD45 (Ly5). Andra vanliga kongena markörer inkluderar olika isoformer av CD90 (Thy1). Detta protokoll kan användas för möss som bär olika kongena markörer. OT-I-möss bör vara av samma kön som mössen som får OT-I-cellöverföring för att undvika avstötningsproblem. - Isolera lymfocyterna från MJÄLTEN OCH LYMFKÖRTLARNA I OT-I-MUSEN.
OBS: Följande procedurer i detta steg måste utföras i ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla strikt asepsis.- Förbered två 60 mm × 10 mm petriskålar. Tillsätt 3 ml R10-medium i en skål medan du lägger till 3 ml RBL-buffert i en annan maträtt. Placera en 70 μm nyloncellsil i skålen som innehåller RBL-buffert.
- Avliva en OT-I-mus i en isoflurankammare följt av cervikal dislokation.
- Skörda musens mjälte, inguinal (subiliac) och axillära lymfkörtlar och överför dem till en 60 mm × 10 mm skål med 3 ml R10 på is.
OBS: Antalet OT-I-möss som offras kan justeras beroende på antalet tumörbärande möss som ska överföras. Ett typiskt utbyte av OT-I CD8 + T-celler från en mjälte och bilaterala inguinala och axillära lymfkörtlar av OT-I CD8 + T-celler är ~ 30-100 × 106 celler per mus. - Använd ändpipan på en 1 ml spruta och macerera mjälten i 3 ml RBL-buffert genom silen. Inkubera i 3 minuter vid RT och avsluta reaktionen genom att tillsätta 3 ml kallt R10-medium.
- Mosa lymfkörtlarna tills endast bindväv återstår. Skölj filtret med R10. Överför cellsuspensionen till ett nytt 15 ml koniskt rör. Centrifug vid 500 × g, 4 °C i 6 min.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna i 3 ml MACS-buffert. För cellsuspensionen genom en ny 70 μm cellsil för att ta bort eventuella flockar.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 × g i 5 min vid 4 °C. Dekantera supernatanten.
- Använd en mus CD8 + T-cellisoleringssats (se materialförteckningen) för att rena CD8 + T-celler genom negativt urval, enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Följ tillverkarens instruktioner när du använder kit från andra företag. - Håll den renade cellsuspensionen på is. Ta ett litet urval av celler och blanda med trypanblått för att räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Bestäm procentandelen OT-I(levande / död-CD8 + Va2 +) celler med flödescytometri.
OBS: Samtidig färgning av kongena markörer och den transgena TCR bör utföras för att verifiera den korrekta fenotypen hos cellerna före överföring.- Tillsätt 5 × 104-1 × 105 celler till 1 ml FACS-buffert i ett centrifugrör på 1,5 ml och centrifugera cellsuspensionen vid 350 × g, 4 °C i 3 min.
- Kassera supernatanten och sprid cellerna genom att snärta i botten av röret. Placera röret på is.
- Bereda följande konjugerade antikroppsblandningar (utspädda i 100 μL FACS-buffert): anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; anti-CD45.2, 1:200; och levande/döda, 1:200 (se Materialförteckningen).
- Vortex antikroppscocktailen och centrifugen vid 15 000 × g i 3 min till pelletsantikroppsaggregat. Förvara cocktailen på is och skydda den från ljus.
- Resuspendera cellerna med 100 μL antikroppscocktail och blanda noggrant genom att slå på röret. Inkubera i mörkret i 30 min på is.
OBS: Undvik att störa antikroppsaggregaten längst ner på röret. - Tvätta pelletsen två gånger med 1 ml FACS-buffert. Centrifug vid 350 × g, 4 °C i 3 min. Resuspendera cellerna i 200 μL FACS-buffert och överför cellsuspensionen till ett FACS-rör.
OBS: För att bibehålla livskraften hos de OT-I-celler som ska överföras, testa provet så snart som möjligt. Om de färgade OT-I-cellerna inte kan testas omedelbart, håll cellerna i mörkret på is eller kyl i kylen vid 4 ° C tills analysen. Alternativt kan proverna återanvändas i 1-4% paraformaldehyd för förlängd lagring (16 timmar) för att förhindra försämring. - Kör provet på en flödescytometer. Beräkna procentandelen levande /döda CD8 + Va2 + celler genom att dividera antalet levande / döda CD8 + Vα2 + celler med antalet levande / döda celler .
- Bestäm det absoluta antalet OT-I-celler (live/dead-CD8+Va2+) genom att multiplicera procentandelen levande/döda CD8+Va2+-celler med det viabla cellnummer som erhölls i steg 4.3.9.
- Justera koncentrationen av OT-I-celler (levande/död-CD8+Va2+) till 1,5 × 106/ml med PBS.
- Injicera 3 × 105 distinkta kongeniskt märkta OT-I-celler (levande / död-CD8 + Va2 +) i 200 μL PBS intravenöst i två grupper av B16F10-OVA-bärande möss (tumörbärande möss uppdelade i givar- och mottagarmöss från steg 3.8).
- Dra ut 200 μL OT-I-cellsuspension (live/dead-CD8+Va2+) i en 100 U insulinspruta (29 G) och ta bort bubblor som i steg 3.2.
- Placera musen separat i en bur med en infraröd lampa över buret i 5-10 minuter för att utvidga svansvenen. Immobilisera musen med en fasthållningsanordning av lämplig storlek. Dra i svansen för att räta ut den och spraya med 75% etanol för att göra venen synlig.
- Håll sprutan parallellt med venen och sätt in den i venen i en vinkel på 0-15°. Dra tillbaka kolven något, och om blod kommer in i pipan, injicera suspensionen långsamt och stadigt med en hastighet av högst 1 ml / min.
OBS: Motstånd eller svullnad på injektionsstället indikerar att nålen inte är inne i venen; injektionsstället ska flyttas proximalt. - När injektionen är klar, ta bort sprutan och tryck försiktigt på insättningsområdet i 3-5 s för att stoppa blödningen. Sätt tillbaka musen till buret och observera det noga i några minuter för biverkningar. Om den har normal rörlighet och näsanladdning, placera den tillbaka i sällskap med de andra mössen.
5. Dissekera tumörmassa från tumörbärande donatormöss
OBS: Upprätthålla sterila tillstånd under operationen i avsnitt 5 och 6. Sterilisera alla kirurgiska instrument genom autoklavering före och efter varje användning. Desinficera operationsområdet i biosäkerhetsskåpet med 75% etanol följt av ultraviolett bestrålning. Använd en ren klänning, keps, ansiktsmask och sterila handskar.
- Åtta till tio dagar efter den adoptiva överföringen, välj donatormöss med jämförbar tumörmassa på ~ 5 mm diameter (sojabönstorlek) för transplantationskirurgi.
- Förbered en 100 mm × 20 mm skål i ett biosäkerhetsskåp och tillsätt 10 ml steril iskall PBS.
- Avliva en tumörbärande donatormus i en isoflurankammare följt av cervikal dislokation. Sänk ner musen i 75% etanol i 3-5 minuter och överför till biosäkerhetsskåpet.
OBS: Följande procedurer i detta steg måste utföras i ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla strikt asepsis. - Placera musen på en dissektionsbräda täckt med rent absorberande papper i ryggläge. Håll musbenen med dissektionsnålar.
- Skär huden längs mittlinjen ovanför urinrörets öppning till xiphoiden med sax. Sträck huden mot vänster sida av muskroppen med pincett och håll tillbaka huden med dissektionsnålar.
- Punktskatta tumören och håll kapseln så intakt som möjligt. Ta försiktigt och försiktigt bort bindväven nära tumören med kirurgisk sax.
OBS: För att upprätthålla tumörens integritet, skala inte av tumörkapseln eller skär tumörvävnaden i bitar. - Placera tumörvävnaden i en 100 mm × 20 mm skål innehållande 10 ml steril iskall PBS för efterföljande transplantation.
6. Subkutan transplantation av donator-härledd tumör på de tumörmatchade mottagarmössen
OBS: Allograften ska implanteras i musens nedre flank på samma sida som den tidigare existerande tumören för att få två tumörer att rinna ut till samma lymfkörtel. I protokollet som presenteras här, när B16F10-OVA-tumören implanterades subkutant på musens vänstra inguinalregion (avsnitt 3), transplanterades den givarhärledda tumörvävnaden på mottagarens vänstra flank i detta steg. Transplantationsstället kan anpassas till det första implanterade tumörstället.
- Bedöva en tumörmatchad mottagarmus med 250 mg/kg 2,2,2-tribromoetanol via intraperitoneal injektion. Nyp tå på en extensor lem i musen för att bedöma anestesinivån och vänta på brist på smärtreflex, vilket indikerar det korrekta djupet av anestesi för att utföra operationen. Om vokalisering eller tillbakadragande av bakben observeras, injicera ytterligare 0,01-0,03 ml av 2,2,2-tribromoetanol.
OBS: Den tumörmatchade mottagarmusen ska vara av samma kön som givarmusen som tillhandahåller allograften för att undvika avstötningsproblem. - Använd veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet. Raka musens vänstra flank med en elektrisk rakapparat. Applicera en hårborttagningskräm för att ta bort det återstående håret.
OBS: Undvik att dra på huden, vilket kan öka risken för kontaminering och infektion. - Placera musen i biosäkerhetsskåpet. Placera den i utsatt läge på ett dissektionskort täckt med rent absorberande papper, med musens vertikala axel parallell med och huvudet på experimentens högra sida.
OBS: Följande procedurer i detta steg måste utföras i ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla strikt asepsis. - Gnid huden på det rakade området med bomull blöt i povidon-jod.
OBS: Använd povidon-jod istället för 75% etanol för sterilisering för att förhindra förlust av kroppsvärme. - Lyft huden i mittpunkten mellan musens höftleder med kirurgisk pincett. Använd saxen för att göra en 5 mm lång vertikal excision. Förläng snittet rostralt längs dorsala mittlinjen till ~ 10-15 mm.
- Utför en skarp dissektion genom att sätta in saxens slutna spetsar i snittet och sedan öppna för att separera bukhinnan på vänster flank från huden och mjukvävnaden.
OBS: För att undvika att orsaka skador på subkutan vävnad och bukhinnan, lyft huden i mitten av snittet och sätt sedan in den slutna saxen så nära huden som möjligt. - Gör en hudficka på vänster flank genom att utföra skarp dissektion flera gånger. Deponera den inkapslade, intakta donator-härledda tumörmassan i kapseln.
OBS: Möss i den skamstyrda kontrollgruppen får samma kirurgiska operation utan den donator-härledda tumörtransplantationen. - Stäng snittet med avbruten sutur (se Materiallista). Placera 2-3 suturer för varje snitt. Desinficera huden runt snittet med bomull som blötläggs i povidon-jod.
OBS: Det ska vara 5 mm mellan två på varandra följande stygn och ett avstånd på 3 mm från snittet. - Placera musen i sidoläge i en ren och varm bur. Övervaka den kontinuerligt tills den har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal liggande.
- Administrera buprenorfin subkutant i en dos av 0,1 mg/kg kroppsvikt var 8:e timme tre gånger efter operationen för att lindra smärtan. Övervaka musens ätande, drickande, rörelse och det område som opereras. Returnera transplantationsmottagaren till andra djurs företag först efter att den har återhämtat sig helt.
OBS: Musen återhämtar sig vanligtvis från traumat från operationen inom 3 dagar. Om musen inte är tillbaka till normal utfodring och rörlighet och visar några manifestationer av infektion, kontakta en veterinär för ingrepp eller avliva den. - Offra (avliva djuren som i steg 4.3.2) mössen vid de angivna tidpunkterna och återhämta cellerna av intresse för flödescytometrisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schemat för detta protokoll visas i figur 1. Åtta dagar efter tumörinokulering injicerades CD45.1+ och CD45.1+CD45.2+ OT-I-celler i B16F10-OVA tumörbärande C57BL/6-möss. Tumören dissekerades kirurgiskt från CD45.1+ OT-I-cellimplanterade möss (donator) på dag 8 efter överföring och transplanterades till tumörmatchade CD45.1 + CD45.2+ OT-I-cellimplanterade möss (mottagare) i dorsalflanken på samma sida som den implanterade tumören. Genom flödescytometri (gating strategi som visas i figur 2) analys kan två populationer av CD44 + CD8 + tumörantigenspecifika T-celler lätt identifieras i TME, inklusive CD45.1 + givarhärledda och CD45.1 + CD45.2 + mottagarhärledda TILs. Därefter analyserades proportionerna av dessa två populationer inom allografterna vid angivna tidpunkter för att studera dynamiken hos de antigenspecifika CD8 + T-cellerna. Vid dag 2 efter transplantationen fanns det ~ 83% av donator-härledda antigenspecifika CD8 + T-celler i den transplanterade tumören, mer dominerande än deras mottagarhärledda motsvarigheter. Andelen mottagarhärledda OT-I-celler var emellertid förhöjd i det sena stadiet av tumorigenes, vilket översteg tumör-inneboende OT-I-celler som härrör från givaren. (Figur 3).
Figur 1: Schematisk över den experimentella designen. C57BL/6mice utmanas med B16F10-OVA tumör på inguinalområdet. Åtta dagar senare överförs olika kongeniskt märkta (CD45.1+ eller CD45.1+CD45.2+) OT-I-celler till tumörbärande möss. På dag 8 efter överföringen dissekeras tumören på CD45.1+ OT-I-cellimplanterade möss kirurgiskt och transplanteras subkutant till tumörmatchade CD45.1 + CD45.2+ OT-I-cellimplanterade mottagare i flanken på samma sida som den befintliga tumören. Därefter offras mössen och antigenspecifika T-celler (OT-I-celler) inom allografterna analyseras vid de angivna tidpunkterna. Förkortningar: CD = kluster av differentiering; i.v. = intravenös; Sac = offer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Gating strategi för flödescytometrianalys. Gating-strategi som används för att identifiera givarhärledda (CD45.1+) och mottagarhärledda (CD45.1+CD45.2+) antigenspecifika CD44+CD8+ T-celler inom allografter. Förkortningar: SSC-A = sidospridningsområde; FSC-A = främre spridningsområde; FSC-W = framåtspridningsbredd; FSC-H = framåtriktad spridningshöjd; SSC-W = sidospridningsbredd; SSC-H = sidospridningshöjd; L/D = levande/död; CD = kluster av differentiering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förhållandet mellan donator- och mottagarhärledda antigenspecifika CD8 + T-celler inom tumöralografter. Representativa flödescytometridiagram som visar uttryck av de kongena markörerna CD45.1 och CD45.2 som används för att identifiera donator-härledda och mottagarhärledda OT-I-celler inom tumörallografter vid dag 2, 8 och 15 efter transplantation. Siffrorna representerar procentandelarna av de två delmängderna i CD44 + CD8 + T-cellpopulationen . Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T-cellmedierad immunitet spelar en avgörande roll i immunsvar mot tumörer, med CTL som spelar den ledande rollen för att utrota cancerceller. Ursprunget till tumörantigenspecifika CTL inom TME har dock inte belysts30. Användningen av detta tumörtransplantationsprotokoll har gett en viktig ledtråd om att intratumorala antigenspecifika CD8 + T-celler kanske inte kvarstår under lång tid, trots förekomsten av stamliknande TCF1 + stamfader CD8 + T-celler. I synnerhet finns det en kontinuerlig tillströmning av periferi-härledda tumörspecifika CD8 + T-celler i tumörmassan.
Såvitt vi vet är detta en relativt bekväm och övertygande metod som bekräftar att upprätthållandet av antigenspecifika CD8 + T-celler inom TME huvudsakligen beror på påfyllning av periferi-härledda tumörspecifika CD8 + T-celler istället för självförnyelse av tumör-bosatta TILs. Även om protokollet som presenteras här endast fokuserar på proportionerna av givar-härledda och mottagar-härledda TILs, kan de fenotypiska, funktionella och transkriptionella egenskaperna hos dessa två populationer lätt undersökas med flödescytometri. Dessutom är det möjligt att kombinera ICB-antikroppar för att undersöka svaren från en specifik celldelmängd på ICB-terapi.
I detta protokoll transplanteras donator-härledd tumörvävnad på mottagarmusen med en befintlig original tumör. Två tumörer i en mottagarmus kommer att leda till fördelningen av periferigenererade T-celler i två tumörmassor. Dessutom kommer tumörbördan att nästan fördubblas jämfört med djur utan transplantationer. I pilotexperiment försökte vi punktskatta den ursprungliga tumören på mottagarmöss före transplantation; Det var dock tekniskt utmanande att eliminera alla tumörceller genom operation noggrant. De kvarvarande tumörcellerna skulle snabbt och bilda en ny tumörvävnad snart. Således finns det en begränsning för detta system när man jämför T-cellsimmunsvar med dem hos icke-transplanterade möss. Detta system är emellertid fortfarande användbart för jämförelse av nyligen migrerade och befintliga T-celler inom samma TME som transplanteras från donatortumörbärande möss. Dessutom kan det inte förnekas att transplantation av tumörvävnad kan leda till inflammation, vilket kan påverka immuncelldynamiken i tumören. Även om effekten av kirurgi på OT-I-cellinfiltration kunde uteslutas genom icke-opererade och sham-opererade kontroller, bedömde vi inte effekterna av lokala inflammatoriska svar på OT-I-celldynamiken.
Vissa överväganden bör beaktas, varav en är användningen av cyklofosfamid. Cyklofosfamid31 är ett alkyleringsmedel som ofta används för att behandla maligniteter i fasta organ och lymfoproliferativa och autoimmuna störningar. Sex till åtta dagar efter B16F10-OVA-inokulering administreras cyklofosfamid före adoptiv överföring för att inducera lymfodepletion av värdmöss och förbättra aktiviteten hos de överförda OT-I-cellerna29. Även om melanom inte är känsligt för detta reagens, svarar vissa tumörcellinjer, såsom EG732, en murin tymisk lymfomcellinje, på cyklofosfamid. Behandling av EG7-bärande möss med cyklofosfamid resulterar i utrotning av tumörer, vilket tyder på att cyklofosfamid måste användas noggrant eller titreras för känsliga tumörmodeller. Den rekommenderade alternativa metoden är en enda subletal dos av strålning (4,5-5,5 Gy) en dag före överföringen, och det optimala valet beror på karaktäristiken hos tumörcellinjer.
Andra åtgärder måste vidtas försiktigt, inklusive noggrant urval av tumörbärande donatormöss och den känsliga kirurgiska operationen under tumörtransplantation. Implanterade tumörer skulle avlägsnas kirurgiskt och transplanteras till tumörmatchade mottagarmöss 8-10 dagar efter överföringen. Före transplantation ska en jämförbar storlek på tumörmassan med ~ 5 mm diameter väljas som en allograft för att minska skillnaderna mellan enskilda möss och göra förvärvade data mer tillförlitliga. Under operationen bör snittet dessutom vara nära musens mittlinje för att hålla allograften på avstånd från tumören som redan finns i mottagarmusen. Mild dissektion föreslås också för att förhindra skador på inguinal lymfkörtel och omgivande vävnader.
Effektiv avlivning av cancerceller kräver samordning av olika komponenter inom TME33. Protokollet som presenteras här kan utvidgas till undersökningen av adaptiva och medfödda immunceller som naturliga mördarceller, tumörassocierade makrofager och dendritiska celler. Dessutom, förutom B16F10-OVA som används här, kan detta protokoll tillämpas på andra subkutana tumörmodeller. Sammanfattningsvis erbjuder den ovannämnda tumörtransplantationsanalysen ett nytt tillvägagångssätt för studier av interaktiva övergångar av vissa typer av immunceller under antitumörsvar och är användbar för forskare inom tumörimmunologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr 31825011 till LY) och National Natural Science Foundation of China (nr 31900643 till QH, nr 31900656 till ZW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Blank, C. U., et al.
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P.
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G.
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al.
Tags
Cancerforskning utgåva 172Erratum
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 04/29/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
