Summary
酚酸是存在于全谷物中的重要植物化学物质。它们具有生物活性特性，如抗氧化保护功能。这项工作旨在报告HPLC鉴定的广义方法，总酚含量估计以及谷物和豆类中酚酸抗氧化能力的测定。
Abstract
酚酸是一类同时具有酚基和羧基的有机化合物。它们存在于谷物中，并集中在谷物的麸皮或豆类的种皮中。它们具有抗氧化特性，近年来引起了人们对其潜在的抗氧化保护健康功能的研究兴趣。这项工作提出了一种从全谷物中提取游离可溶性酚酸的广义方法，并分析了它们的抗氧化能力。使用五个全谷物样本，包括两种谷物（小麦和黄玉米）和三种豆类（豇豆，芸豆和大豆）。将谷物碾磨成面粉，并使用甲醇水溶液提取其游离可溶性酚酸。然后使用高压液相色谱仪（HPLC）鉴定化合物。Folin-Ciocalteu方法测定其总酚含量，同时使用DPPH自由基清除能力，Trolox等效抗氧化能力（TEAC）和氧自由基吸收能力（ORAC）测定测定其抗氧化能力。鉴定出的酚酸包括香草酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸。香草酸仅在豇豆中鉴定，而咖啡酸仅在芸豆中鉴定。在黄玉米、豇豆和大豆中鉴定出对香豆酸，而在所有样品中鉴定出阿魏酸。阿魏酸是确定的主要酚酸。样品中酚酸的总浓度按以下顺序下降：大豆>豇豆>黄玉米=芸豆>小麦。总抗氧化能力（DPPH，TEAC和ORAC测定值的总和）下降如下：大豆>芸豆>黄玉米=豇豆>小麦。这项研究得出结论，HPLC分析以及DPPH，TEAC和ORAC测定提供了有关全谷物酚酸组成和抗氧化特性的有用信息。
Introduction
酚酸是植物中研究的最重要植物化学物质之一，因为它们在植物防御食草动物和真菌感染以及维持植物组织中的结构支撑和完整性方面发挥着至关重要的作用1，2。它们在谷物的麸皮和豆类的种皮中含量丰富3.在结构上，它们分为两组：羟基苯甲酸（图1）和羟基肉桂酸（图2）。谷物和豆类中常见的羟基苯甲酸包括没食子酸、 对羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草酸和丁香酸，而常见的羟基肉桂酸包括咖啡酸、 对香豆酸、阿魏酸和芥子酸3。酚酸还具有抗氧化特性，因为它们能够清除导致脂肪氧化酸败的自由基，并在生理系统中启动和传播自由基诱导的氧化应激4，5。由于作为抗氧化剂的这种重要的生理作用，它们是最近研究的主题。这是因为当作为植物性食物的成分食用时，它们可以发挥抗氧化保护作用。
谷物和谷物制品是全世界人类和动物的主要碳水化合物食物来源6.谷物包括小麦，大米，玉米（玉米），大麦，小黑麦，小米和高粱。其中，玉米是利用量最大的，2019/2020年全球利用率估计为11.357亿吨，其次是小麦，同期全球估计利用率为7.575亿吨。谷物食品是消费者的重要能量来源，因为它们是碳水化合物的丰富来源。它们还提供一些蛋白质，脂肪，纤维，维生素和矿物质6。除了它们的营养价值外，谷物还是植物化学抗氧化剂的良好来源，特别是酚酸，它们具有保护生理系统免受自由基诱导的氧化损伤的潜力3。豆类也是营养物质的良好来源，蛋白质含量通常高于谷物。它们还含有维生素和矿物质，用于制备各种食物8。此外，豆类是各种植物化学抗氧化剂的良好来源，包括酚酸，类黄酮，花青素和原花青素9，10。不同品种的谷物和豆类可能具有不同的酚酸组成。因此，有必要研究谷物和豆类的酚酸组成及其品种，以了解它们在酚类抗氧化剂方面的潜在健康益处。
已经报道了许多用于测量谷物和豆类谷物中酚酸含量并确定其抗氧化活性的测定方法。全谷物酚酸最常用的分析方法是分光光度法和液相色谱法11。这项工作的目的是展示一种用于测定游离可溶性酚酸组成的广义高压液相色谱方法，以及用于测定某些全谷物谷物和豆类的总酚含量和抗氧化能力的分光光度法。
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Protocol
1. 样品类型
- 本研究使用五个全谷物样品，包括两种谷物（例如硬粒小麦和黄玉米）和三种豆类（例如黑眼豇豆，大豆和红芸豆）。
- 使用咖啡研磨机将50克每种谷物一式三份研磨成面粉，并通过500μm筛子。
- 将它们储存在-20°C。
2. 样品制备
-
以干物质含量的测定和干重表达为基础
注：根据AOAC （2000）12的方法测定每个粉状样品的干物质含量。- 打开强制对流烤箱，将温度设置为130°C。
- 干燥干燥剂（硅胶）在烘箱中干燥30分钟至1小时，并将干燥的硅胶转移到干燥器中。
- 将每个样品的2g准确称重到干净，预干燥并称重的铝罐中。
- 将称重的样品在130°C下在强制对流炉中干燥1小时。
- 将干燥的样品转移到干燥器中，并使其冷却至环境温度。
- 称取干燥、冷却的样品并记录其重量。
- 计算每个样品的干物质含量如下：
- 使用以下公式以干重为基础表示测量的每个参数：
-
酚酸萃取
注意：使用Y. Qiu等人5 的方法的修改提取谷物样品中的可溶性游离酚类化合物，该方法能够从毫克量的全谷物中提取酚类化合物。- 将 100 mg 全谷物面粉样品直接放入琥珀色的 2 mL 容量微量离心管中准确称量。管子的深色有助于防止混合物暴露在光线下。
- 向含有样品的每个试管中加入1 mL 80%HPLC级甲醇水溶液。
- 短暂涡旋以混合甲醇溶液和样品。
- 将样品超声处理60分钟以提取游离可溶性酚类化合物。在超声处理期间在样品上盖上盖子，以增加对光的保护。
- 超声处理后，将混合物以20，000× g 离心5分钟，以沉淀固体残留物，使上清液在上面。游离酚类化合物在离心后将存在于上清液中。
- 将上清液转移到干净的微量离心管中。
注意：上清液在注入HPLC仪器之前需要过滤。要过滤上清液，请取出3 mL注射器的柱塞并连接注射器过滤器。过滤器的孔径应不大于0.22μm。 - 将约0.4mL上清液移入注射器顶部。重新插入柱塞并将液体通过过滤器推入含有小瓶插入物的HPLC小瓶中。
- 一旦仪器被设置为运行手稿中概述的HPLC分析方法，将小瓶装入转盘中以与样品列表相对应。
- 在320nm和280nm处获得HPLC色谱图，显示代表不同酚类化合物的不同峰。
- 使用适当的标准曲线，在320nm处量化羟基肉桂酸，因为它们在该波长处具有最大的吸光度。通过相同的原理，在280nm处定量羟基苯甲酸。
- 将剩余的提取物储存在-20°C用于其他分析。
3. 酚类组合物
- 使用高压液相色谱仪（材料表）根据J. Xiang，F. .B. Apea-Bah，V. U. Ndolo，M.C. Katundu和T. Beta 4的方法鉴定和定量样品中提取的酚类化合物。
- 制备酚酸标准品（香草酸，咖啡酸，对香豆酸，阿魏酸和西那酸）以鉴定和定量提取物中的组成酚类化合物。
- 为此，称取每种标准品1mg，并溶解在1mL的50%甲醇水溶液中，以产生1，000μg/ mL的每种标准品。
- 在2 mL琥珀色离心管中混合等体积的所有五种标准品，以产生标准品混合物，每种标准品的浓度为200μg/ mL。
- 通过将一定体积放入新管中并用等体积的甲醇水溶液溶剂稀释来制备标准鸡尾酒的连续稀释液。
- 重复连续稀释至浓度为3.125μg/ mL。
- 另外，用溶剂单独稀释每个标准品40次，以获得每个标准品的25μg/ mL浓度。
- 将色谱柱温度设置为 35 °C，将样品烘箱温度设置为 15 °C。
- 为了制备流动相A（0.1%甲酸水溶液），将1mL甲酸转移到1L容量的容量瓶中，并将HPLC级水加入1L标记中。摇匀均匀。
- 为了制备流动相B（甲醇中0.1%甲酸），将1mL甲酸转移到1L容量容量的烧瓶中，并在1L标记处加入HPLC级甲醇。摇匀均匀。
- 如有必要，将音量调整到1 L标记。
- 通过0.45μm亲水滤纸过滤两个流动相。
- 对于分析，将10μL每种提取物或标准品（25μg/ mL标准品和标准混合物）注入反相柱上。
- 根据线性梯度程序用流动相洗脱25分钟，如下所示：0-3.81分钟，9%-14%B;3.81-4.85分钟， 14%-15% B;4.85-5.89分钟， 15%-15% B， 5.89-8.32分钟， 15%-17% B;8.32-9.71分钟， 17%-19% B;9.71-10.40分钟， 19%-19% B;10.40-12.48分钟， 19%-26% B;12.48-13.17分钟， 16%-28% B;13.17-14.21分钟， 28%-35% B;14.21-15.95分钟， 35%-40% B;15.95-16.64分钟， 40%-48% B;16.64-18.37分钟， 48%-53% B;18.37-22.53分钟， 53%-70% B;22.53-22.88分钟， 70%-90% B;22.88-25.00 分钟， 90% B.
- 将浓度为25μg/ mL的真实标准品在280nm和320nm处获得的色谱峰的保留时间与提取物的层析峰的保留时间进行比较，以确定样品中的组成酚类化合物。
- 绘制酚酸标准鸡尾酒的校准曲线，标准品的浓度在水平轴上，峰面积在垂直轴上
- 使用校准曲线将图上的峰面积与前面部分提到的280 nm和320 nm处的已鉴定化合物的峰面积进行比较，来估计已鉴定的酚类化合物的浓度。
4. 总酚含量
注意：使用F.B. Apea-Bah等人描述的Folin-Ciocalteu方法测定提取物的总酚含量。
- 在0.025~0.150mg/mL浓度范围内制备阿魏酸和没食子酸标准品，绘制校准曲线进行比较，用于估计总酚含量。
- 为此，将阿魏酸和没食子酸标准品分别精确称取1mg到2 mL容量离心管中。
- 向每个标准品中加入1 mL 50%甲醇水溶液并涡旋溶解，产生每个标准品的1 mg / mL储备。
- 从每个储备溶液中制备一系列稀释液，总共500μL。
- 将18.2μL每种提取物或标准品移液到96孔微孔板上的单独孔中。
- 向每种提取物或标准品中加入36.4μL10%（v / v）水性Folin-Ciocalteu试剂。
- 然后，向每个反应混合物中加入145.4μL700mM碳酸钠。
- 将反应混合物在室温（20-25°C）下在黑暗中孵育2小时。
- 在750nm处的酶标仪上读取吸光度。
- 绘制吸光度变化与酚酸标准品浓度的校准曲线，并使用它们来估计总酚含量。
- 以干重为基础，将结果表示为每克研磨样品的毫克阿魏酸当量（mg FAE / g）和每克研磨样品的毫克没食子酸当量（mg GAE / g）。
5. 抗氧化检测
注意：使用以下三种测定法测定谷物提取物的抗氧化能力：2，2-二苯基-1-丙烯酸肼（DPPH）自由基清除能力;2，2'-叠氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力，也称为Trolox当量抗氧化能力（TEAC）;和氧自由基吸收能力（ORAC）。
- 标准曲线的Trolox标准品的制备
- 使用维生素E的水溶性类似物Trolox作为标准来估计全谷物提取物的 体外 抗氧化能力。
- 在 15 mL 试管中准确称量 1 mg Trolox。溶于4 mL 50%甲醇水溶液中。涡旋溶解以制备1mM（1000μM）的储备溶液。
- 制备6种浓度的Trolox，即50，100，200，400，600和800μM，以绘制标准曲线，以估计DPPH自由基清除能力和Trolox当量抗氧化能力（TEAC）。同样，制备6.25，12.5，25和50μM浓度的Trolox用于估计氧自由基吸收能力（ORAC）。将每种浓度的总体积组成为500μL，如 表1所示。
- 样品提取物的稀释
- 分析前用甲醇稀释样品提取物。这里，黄玉米和豇豆提取物被稀释两次，小麦和芸豆被稀释了五次，大豆提取物用甲醇稀释了10倍。
- 特罗洛克斯等效抗氧化能力 （TEAC） 测定
- 使用F.B. Apea-Bah等人描述的方法测量样品的Trolox当量抗氧化能力（TEAC）。
- 称取 8.23 mg ABTS 到干净的 2 mL 容量琥珀色离心管中。
- 接下来，称取1.62mg过硫酸钾到另一个干净的2 mL容量的琥珀离心管中。
- 向每个蒸馏水中加入1 mL蒸馏水并涡旋溶解它们。
注意：这导致16 mM ABTS储备溶液与6 mM过硫酸钾水溶液。 - 通过将ABTS和过硫酸钾溶液等体积混合来制备ABTS储备溶液。溶液将立即变为深色。
- 将试剂混合物在黑暗中孵育12-16小时。
- 用200mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释ABTS储备溶液30倍，形成ABTS工作溶液。为此，将 58 mL 的 200 mM PBS 加入 2 mL ABTS 储备溶液中。工作溶液将含有0.27 mM ABTS和0.1 mM过硫酸钾。
- 对于分析，将10μL每个稀释的提取物或Trolox放入96孔微孔板中。
- 向每个孔中加入190μLABTS工作溶液，并将反应混合物孵育60分钟。
- 在酶标仪中测量反应混合物在750nm处的吸光度。
- 使用浓度范围为100至800μmol/L的Trolox标准品绘制校准曲线。
- 根据校准曲线估计 ABTS 自由基清除能力。
- 以干重为基础，以每克（μmol TE/g）样品的微摩尔特罗氏当量表示结果。
- 断续器
注意：使用F.B. Apea-Bah等人13先前描述的方法测定样品的DPPH自由基清除能力。DPPH抗氧化测定需要产生自由基的化合物DPPH（2，2-二苯基-1-苦味酰肼）。- 将 1.2 mg DPPH 准确称量到 50 mL 空容量离心管中。将DPPH溶解在30mL甲醇中以制备60μmol / L甲醇溶液。
注意：DPPH测定测试样品提取物清除DPPH产生的自由基的能力。 - 对于分析，将5μL样品提取物或Trolox溶液加入微孔板孔中。
- 接下来，加入195μL的60μmol / L DPPH甲醇溶液并孵育60分钟。
- 测量反应混合物在515nm处的吸光度。
- 使用Trolox标准品（50-800μmol/ L）绘制校准曲线，其中垂直轴上的吸光度变化和水平轴上的Trolox浓度的变化。
- 根据校准曲线估计DPPH清除能力。
- 以干重为基础，以每克（μmol TE/g）样品的微摩尔特罗氏当量表示结果。
- 将 1.2 mg DPPH 准确称量到 50 mL 空容量离心管中。将DPPH溶解在30mL甲醇中以制备60μmol / L甲醇溶液。
- 氧自由基吸收能力
- 根据F.B. Apea-Bah等人的方法确定样品的氧自由基吸收能力（ORAC）。
- 首先，从1，000μM Trolox标准储备溶液中制备浓度为6.25，12.5，25和50μM的Trolox标准品，在75mM磷酸钾（K2HPO4 / KH2PO4）缓冲液中。
- 为此，称取1mg Trolox粉末，并在超声处理下溶解在4mL缓冲溶液中，以制备1，000μM储备溶液。
- 然后，将50μL储备溶液放入2mL容量离心管中，并用950μL缓冲溶液稀释，得到1，000μL50μM Trolox溶液。
- 将500μL的50μM溶液移液到新管中，并用等体积的缓冲液稀释，以获得25μM Trolox溶液。
- 重复25μM的连续稀释得到12.5μM，然后同样重复12.5μM的稀释，得到6.25μM。
- 准备样品提取物的适当稀释度。
- 用缓冲溶液稀释黄玉米和豇豆提取物20倍，小麦和芸豆提取物稀释50倍，大豆提取物稀释100倍。
- 将每个样品或Trolox标准品的200μL转移到黑色96孔微孔板的孔中以进行自动移液。
- 然后，向装有ORAC设备的三个试剂罐中填充，用以下物质：（1）缓冲液;（2）缓冲液中荧光素0.816nM;和（3）153 mM的2，2'-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸盐（AAPH）在缓冲液中。
- 将它们放在容器中以进行自动移液。
- 根据标准操作程序设置ORAC机器和自动移液系统进行分析。
- 对于分析，设置自动移液系统，将25μL每个稀释的提取物或标准品转移到透明底部黑色96孔微孔板的孔中。
- 然后，在缓冲液中自动加入150μL0.816nM荧光素。
- 将反应混合物在37°C下在ORAC机器中孵育15分钟。
- 然后，自动向每个反应混合物中加入25μLAAPH。
- 将它们在37°C下在ORAC机器中孵育50分钟。
- 设置ORAC机器以测量孵育期内分别在485nm和520nm的激发和发射波长下的荧光衰变。
- 测量后，绘制Trolox标准曲线，水平轴上为Trolox（6.25-50μM），垂直轴上为荧光衰减。
- 从Trorox标准曲线估计提取物的氧自由基吸收能力。
- 以干重为基础，以μmol TE/g样品表示结果。
- 统计分析
- 将所有结果显示为至少一式三份的标准差±平均值。
- 执行方差分析 （ANOVA） 以确定晶粒类型对响应变量的影响。
- 如果 p < 0.05 处存在显著差异，则使用最小显著性差 （LSD） 来比较均值。
- 进行Pearson相关性分析以估计酚类含量与抗氧化能力之间的关系。
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Representative Results
表2 显示了在谷物和豆类谷物中鉴定的酚酸。根据现有的正品标准，在样品中鉴定出四种酚酸，它们是：香草酸，咖啡酸， 对香豆酸和阿魏酸。香草酸是一种羟基苯甲酸，而其他三种是羟基肉桂酸。香草酸仅在黑眼豇豆中鉴定，而咖啡酸仅在芸豆中鉴定。 在黄玉米，豇豆豆和大豆中鉴定出对香豆酸。按干重计算，其浓度范围在7.57至12.48微克/克面粉之间，黄玉米的最低值而大豆的数值最高。阿魏酸是所有样品中唯一鉴定出的酚酸。其浓度在5.69至41.76微克/克面粉之间，按干重计算。样本中，大豆阿魏酸浓度最高，其次是豇豆，而小麦、黄玉米及芸豆的含量则相当（表2）。当对各样品的所有酚酸浓度进行汇总后，其值按以下顺序下降：大豆>豇豆>黄玉米=芸豆>小麦。
表3 显示了谷物和豆类谷物的总酚含量（TPC）和抗氧化能力。抗氧化能力包括DPPH自由基清除能力，TEAC和ORAC。因此，这三个值的总和给出了样品的总抗氧化能力。为了进行比较，在阿魏酸当量和没食子酸当量中均测定TPC。按干重计算，TPC在1.16至2.78毫克FAE /克面粉和0.63至1.48毫克GAE /克面粉之间。无论当量单位如何，样品的TPC按以下顺序下降：大豆>小麦=黄玉米=芸豆>豇豆。
样品的DPPH自由基清除能力在干重基础上在4.48至14.87μmol TE / g面粉之间。大豆的DPPH清除能力最高，其次是芸豆，而黄玉米和豇豆具有相当的价值。小麦清除DPPH自由基的能力最低。样本的Trolox当量抗氧化能力（TEAC）按干重计算介乎12.82至57.24 μmol TE/g面粉。同样，大豆的TEAC值最高，其次是芸豆，然后是小麦，而黄玉米和豇豆的TEAC值相对较低。以干重计，样品的氧自由基吸光度在0.35~1.67 μmol TE/g面粉之间，其中谷物的吸氧量最低，大豆的吸氧量最高。当所有抗氧化能力相加时，样品中的抗氧化能力值按以下顺序下降：大豆>芸豆>黄玉米=豇豆>小麦。
两个TPC值与TEAC、ORAC和总抗氧化能力（TAC）的值之间存在很强的正相关关系（表4）。然而，TPC值与DPPH之间的相关性较弱。
图 1：在谷物和豆类中鉴定的羟基苯甲酸。请点击此处查看此图的大图。
图 2：在谷物和豆类中发现的羟基肉桂酸。请点击此处查看此图的放大版本。
表1：DPPH和ABTS标准曲线的Trolox浓度的制备。请按此下载此表格。
表2：一些全麦谷物和豆类的酚酸含量。请按此下载此表格。
表3：一些全麦谷物和豆类的总酚含量（TPC）和抗氧化能力。请按此下载此表格。
表4：一些谷物和豆类谷物的总酚含量和抗氧化能力的Pearson相关基质。请按此下载此表格。
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Discussion
全谷物被选为具有代表性的谷物和豆类，在世界范围内具有广泛的食品应用。虽然每种谷物的品种之间可能存在差异，但本研究的重点是展示一种用于全谷物的游离酚酸提取和分析的广义方法。通过大幅减少样品和溶剂的量来修改提取方法，以减少进行此类实验时释放到环境中的化学物质的量。这种改性还可以从毫克量的全谷物中提取酚醛。
HPLC分析产生样品中组成酚酸的色谱图。每个代表酚酸的色谱峰都可以通过比较其在预定波长下的保留时间与正宗酚酸标准品的保留时间来识别。紫外（UV）检测器通常用于识别紫外波长范围内的酚酸。羟基苯甲酸通常在254-280nm之间鉴定，而羟基肉桂酸通常在300-330nm15之间鉴定。光电二极管阵列探测器可用于扫描整个紫外-可见光波长范围，在确定从未研究过的样品中存在的化合物的紫外-可见光谱方面特别有用。R. J. Robbins和S. R. Bean15 报告了以下波长，分别用于最大吸收，分别用于香草酸，咖啡酸， 对香豆酸和阿魏酸：260nm;325 海里;310 海里;325海里。HPLC鉴定方法通常适用于已知酚酸组成的样品，其保留时间和紫外光谱数据已预先建立。这很重要，因为当柱上没有实现良好的分离时，一些化合物可以共洗脱。对于未知酚酸成分的样品，除了用于鉴定的真实标准外，还使用质谱仪。已发表的文献提供了关于先前在所研究样品或类似样品中鉴定的酚类化合物的有用信息3，9，14。值得注意的是，在HPLC分析过程中，只有当真品标准品可用于比较时，色谱图中的酚酸峰才可识别。因此，如果没有相应的标准，可能还有其他峰值将无法识别。这是HPLC分析的一个限制，当HPLC耦合到质谱仪时可以克服。因此，定量酚酸的总浓度将取决于所鉴定的酚酸的数量。
Folin-Ciocalteu方法首先由V. L. Singleton和J. A. Rossi（1965）16 发表，是一种基于电子转移的测定，用于估计分析物17的TPC。它基于分析物在碱性介质中还原磷钼酸盐 - 磷钨酸盐的能力，从而将其从黄色转化为深蓝色溶液18。然后可以在765nm19处测量所得溶液的吸光度。该试剂不单独对酚类化合物具有特异性，但可与具有还原性质的其他几种化合物（如硫醇、还原糖和某些氨基酸（如酪氨酸））发生反应。因此，建议TPC可用于估计样品或分析物17的还原性质。在酚类萃取过程中，大多数干扰化合物被排除在外，并且由于酚类化合物是最普遍的植物化学物质，因此Folin-Ciocalteu测定仍然是估计样品TPC的有用方法。在大多数酚类成分未知的样品中，没食子酸被用作标准，以绘制用于估计TPC的校准曲线。然而，并非所有样本都含有没食子酸。在目前的研究中，我们使用阿魏酸将其结果与没食子酸的结果进行比较。双样本T检验表明，被确定为阿魏酸当量的TPC具有明显高于以没食子酸当量表示的TPC。由于我们根据HPLC分析和其他报告结果确认阿魏酸存在于所有样品中，因此我们更倾向于将TPC结果表示为阿魏酸当量。相对于样品中的主要成分酚类化合物来表示TPC是有用的。
使用三种不同的抗氧化测定法，观察到不同的谷物在清除自由基的能力方面有不同的反应。DPPH自由基清除能力和TEAC测定基于电子转移（ET）机制，而ORAC测定基于氢原子转移（HAT）机制20。因此，结合这三种检测方法可以更好地指示样品的抗氧化能力。值得注意的是，ORAC测定测量样品清除生理相关过氧自由基的能力，这在生理系统中可引起与泡沫细胞形成和动脉粥样硬化发生相关的脂质过氧化21，22。另一方面，DPPH和TEAC测定使用不具有生理相关性的自由基。然而，它们的易用性使它们成为估计样品自由基清除能力的快速方法。ORAC测定也与其他使用细胞和DNA作为生物标志物的 体外 或 离体 抗氧化测定具有良好的比较23.
上述用于提取和鉴定游离酚酸，估计总酚含量和测定抗氧化性能的所有方法均未标准化。不同制造商的液相色谱柱建议使用不同的溶剂梯度洗脱系统来分离酚酸以进行鉴定。虽然Folin-Ciocalteu法是估计样品总酚含量的最常见方法，但不同的实验室进行这种测定的方式不同。抗氧化方法也是如此。因此，需要统一这些方法，以促进实验室间结果的比较。还需要开发强大的预测模型，将酚酸组成与通过这些重要的分析方法测量的抗氧化特性联系起来。
从本研究中得出结论，所采用的溶剂萃取法可有效从全麦谷物和豆类的面粉中提取游离可溶性酚酸，从而便于其鉴定和定量。HPLC方法能够鉴定和定量全谷物提取物中的游离可溶性酚酸，前提是有真实的比较标准。使用DPPH，TEAC和ORAC三种不同的抗氧化方法，可以根据氢原子转移和电子转移机制有效地确定来自全谷物的游离可溶性酚类提取物的抗氧化能力。这项研究进一步证实了全谷物在酚酸组成和抗氧化能力方面的差异。相关分析表明，测得的抗氧化能力与全谷物游离可溶性提取物中的组成酚酸有关。虽然TEAC和DPPH都通过电子转移机制清除自由基，但它们与TPC的相关性不同。由于不同抗氧化检测行为的差异，需要使用各种检测来确定样品的抗氧化能力。在研究的五种全谷物中，大豆具有最高的酚酸浓度和相应的最高抗氧化能力。该研究还表明，可以在低至1 mL的甲醇水溶液中提取全谷物游离可溶性酚酸并研究其抗氧化能力，从而减少释放到环境中的实验室化学物质的量。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢Alison Ser女士和Hannah Oduro-Obeng女士的技术支持，以及Janice Fajardo女士和Miguel del Rosario先生的视频编辑支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
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