Summary
Fenolsyrer er vigtige fytokemikalier, der er til stede i fuldkorn. De besidder bioaktive egenskaber såsom antioxidantbeskyttende funktioner. Dette arbejde havde til formål at rapportere om en generaliseret metode til HPLC-identifikation, estimering af total phenolindhold og bestemmelse af antioxidantkapaciteten af phenolsyrer i korn og bælgfrugter.
Abstract
Phenolsyrer er en klasse af organiske forbindelser, der bærer både en phenolgruppe og en carboxylgruppe. De findes i korn og koncentreres i klid af korn eller frølag af bælgfrugter. De besidder antioxidantegenskaber, der har skabt stor forskningsinteresse i de senere år, om deres potentielle antioxidantbeskyttende sundhedsfunktioner. Dette arbejde præsenterer en generaliseret metode til ekstraktion af friopløselige phenolsyrer fra fuldkorn og analyse af deres antioxidantkapacitet. Fem fuldkornsprøver bestående af to korn (hvede og gul majs) og tre bælgfrugter (cowpea bønne, nyrebønne og sojabønne) blev anvendt. Kornene blev malet til mel og deres frit opløselige phenolsyrer ekstraheret ved hjælp af vandig methanol. Forbindelserne blev derefter identificeret ved anvendelse af en højtryksvæskekromatograf (HPLC). Folin-Ciocalteu-metoden blev brugt til at bestemme deres samlede phenolindhold, mens deres antioxidantkapacitet blev bestemt ved anvendelse af DPPH-radikalrensningskapaciteten, Trolox-ækvivalent antioxidantkapacitet (TEAC) og iltradikalusionskapacitet (ORAC) assays. De identificerede phenolsyrer omfattede vanillsyre, koffeinsyre, p-coumarsyre og ferulinsyre. Vanillsyre blev kun identificeret i cowpea, mens koffeinsyre kun blev identificeret i nyrebønne. p-Coumarsyre blev identificeret i gul majs, cowpea og sojabønne, mens ferulinsyre blev identificeret i alle prøverne. Ferulinsyre var den fremherskende phenolsyre, der blev identificeret. Den samlede koncentration af phenolsyrer i prøverne faldt i følgende rækkefølge: sojabønne > cowpea bønne > gul majs = nyrebønne > hvede. Den samlede antioxidantkapacitet (summen af værdier af DPPH-, TEAC- og ORAC-assays) faldt som følger: sojabønne > nyrebønne > gul majs = cowpea bønne > hvede. Denne undersøgelse konkluderede, at HPLC-analyse såvel som DPPH-, TEAC- og ORAC-assays giver nyttige oplysninger om phenolsyresammensætningen og antioxidantegenskaberne af fuldkorn.
Introduction
Phenolsyrer er blandt de vigtigste fytokemikalier, der er undersøgt i planter på grund af den afgørende rolle, de spiller i planteforsvaret mod planteædende og svampeinfektion, samt opretholdelse af strukturel støtte og integritet i plantevæv 1,2. De er rigelige i klid af korn og frøbeklædning af bælgfrugter3. Strukturelt er de opdelt i to grupper: hydroxybenzoesyrer (figur 1) og hydroxycinnaminsyrer (figur 2). De almindelige hydroxybenzoesyrer i korn og bælgfrugter omfatter gallinsyre, p-hydroxybenzoesyre, 2,4-dihydroxybenzoesyre, protocatechuic, vanillic og syringinsyrer, mens de almindelige hydroxycinnaminsyrer omfatter koffeinsyre, p-coumarsyre, ferulsyre og sinapicsyrer3. Phenolsyrer besidder også antioxidantegenskaber, da de er i stand til at opsage frie radikaler, som forårsager oxidativ harskning i fedtstoffer, og initiere og udbrede radikal-induceret oxidativ stress i fysiologiske systemer 4,5. På grund af denne vitale fysiologiske rolle som antioxidanter er de genstand for nyere forskning. Dette skyldes, at når de indtages som komponenter i vegetabilske fødevarer, kan de udøve antioxidantbeskyttelse.
Korn og kornprodukter er vigtige kulhydratfødekilder for mennesker og dyr over hele verden6. Korn omfatter hvede, ris, majs (majs), byg, triticale, hirse og sorghum. Blandt dem er majs den mest anvendte med en anslået global udnyttelse på 1,135,7 millioner tons i 2019/2020, efterfulgt af hvede med en anslået global udnyttelse på 757,5 millioner tons i samme periode7. Kornfødevarer er gode energikilder til forbrugerne, da de er rige kilder til kulhydrater. De giver også noget protein, fedt, fiber, vitaminer og mineraler6. Ud over deres næringsværdi er korn gode kilder til fytokemiske antioxidanter, især phenolsyrer, som har potentiale til at beskytte det fysiologiske system mod radikalt induceret oxidativ skade3. Bælgfrugter er også gode kilder til næringsstoffer og er generelt højere i protein end korn. De indeholder også vitaminer og mineraler og bruges til fremstilling af forskellige fødevarer8. Derudover er bælgfrugter gode kilder til en række fytokemiske antioxidanter, herunder phenolsyrer, flavonoider, anthocyaniner og proanthocyanidiner 9,10. Forskellige sorter af korn og bælgfrugter kan have en anden phenolsyresammensætning. Der er derfor behov for at undersøge phenolsyresammensætningen af korn og bælgfrugter og deres sorter for at kende deres potentielle sundhedsmæssige fordele med hensyn til phenolantioxidanter.
Der er rapporteret om en række assays til måling af mængden af phenolsyrer i korn- og bælgfrugtkorn og bestemmelse af deres antioxidantaktiviteter. De mest almindelige analysemetoder for fuldkornsphenolsyrer er spektrofotometri og væskekromatografi11. Formålet med dette arbejde var at demonstrere en generaliseret højtryksvæskekromatografisk metode til bestemmelse af friopløselig phenolsyresammensætning og spektrofotometriske metoder til bestemmelse af totalt phenolindhold og antioxidantkapacitet i nogle fuldkornsprodukter og bælgfrugter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Type prøver
- Brug fem fuldkornsprøver, der består af to korn (f.eks. Hård hvede og gul majs) og tre bælgfrugter (f.eks. Blackeye cowpea bønne, sojabønne og rød nyrebønne) til denne undersøgelse.
- 50 g af hvert korn i tre eksemplarer til mel ved hjælp af en kaffekværn og før dem gennem en 500 μm sigte.
- Opbevar dem ved -20 °C.
2. Prøveforberedelse
-
Bestemmelse af tørstofindhold og ekspression af tørstofbasis
BEMÆRK: Tørstofindholdet i hver pulveriseret prøve bestemmes efter metoden i AOAC (2000)12.- Tænd for en ovn med tvungen konvektion, og indstil temperaturen til 130 °C.
- Tør tørremiddel (silicagel) i ovnen i 30 minutter til 1 time og overfør den tørrede silicagel til en tørremaskine.
- Vej nøjagtigt 2 g af hver prøve i en ren, fortørret og vejet aluminiumsbeholder.
- De vejede prøver tørres ved 130 °C i 1 time i en tvungen konvektionsovn.
- Overfør den tørrede prøve til ekssikkatoren, og lad den køle af til omgivelsestemperatur.
- Den tørrede, afkølede prøve vejes, og dens vægt registreres.
- Tørstofindholdet i hver prøve beregnes på følgende:
- Hver parameter målt i tørvægt udtrykkes ved hjælp af følgende formel:
-
Ekstraktion af phenolsyre
BEMÆRK: Uddrag de opløselige frie phenolforbindelser i kornprøverne ved hjælp af en ændring af metoden Y. Qiu et al.5 , der muliggør phenolekstraktion fra milligrammængder fuldkorn.- Nøjagtigt veje 100 mg af fuldkornsmelprøven direkte i et ravfarvet mikrocentrifugerør med en kapacitet på 2 ml. Rørets mørke farve hjælper med at forhindre udsættelse af blandingen for lys.
- Der tilsættes 1 ml 80 % vandig methanol af HPLC-kvalitet til hvert af de rør, der indeholder prøverne.
- Vortex kort for at blande methanolopløsningen og prøverne.
- Sonikere prøverne i 60 minutter for at ekstrahere de frit opløselige phenolforbindelser. Sæt et dæksel over prøverne i løbet af sonikeringen for ekstra beskyttelse mod lys.
- Efter sonikering centrifugeres blandingen ved 20.000 × g i 5 minutter for at sedimentere de faste rester, der efterlader supernatanten ovenpå. Frie phenolforbindelser vil være til stede i supernatanten efter centrifugering.
- Overfør supernatanten til et rent mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Supernatanten skal filtreres, inden den sprøjtes ind i HPLC-instrumentet. For at filtrere supernatanten skal du fjerne stemplet på en 3 ml sprøjte og fastgøre et sprøjtefilter. Filteret skal have en porestørrelse på højst 0,22 μm. - Pipette ca. 0,4 ml af supernatanten ind i toppen af sprøjten. Indsæt stemplet igen, og skub væsken gennem filteret ind i et HPLC-hætteglas, der indeholder et hætteglasindsats.
- Når instrumentet er sat op til at køre den metode, der er beskrevet i manuskriptet til HPLC-analyse, skal du lægge hætteglassene i karrusellen for at svare til prøvelisten.
- Der opnås HPLC-kromatogrammer ved 320 nm og 280 nm, der viser forskellige toppe, der repræsenterer forskellige phenolforbindelser.
- Ved hjælp af passende standardkurver kvantificeres hydroxycinnaminsyrer ved 320 nm, da de har maksimal absorbans ved denne bølgelængde. Efter samme princip kvantificeres hydroxybenzoesyrer ved 280 nm.
- De resterende ekstrakter opbevares ved -20 °C til andre analyser.
3. Phenolsammensætning
- Brug en højtryksvæskekromatograf (Table of Materials) til at identificere og kvantificere de ekstraherede phenolforbindelser i prøverne baseret på metoden J. Xiang, F.B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.C. Katundu og T. Beta 4.
- Forbered phenolsyrestandarder (vanillsyre, koffeinsyre, p-coumarsyre, ferulinsyre og sinapinsyre) for at identificere og kvantificere bestanddele phenolforbindelser i ekstrakterne.
- For at gøre dette skal du veje 1 mg af hver standard og opløses i 1 ml 50% vandig methanol for at producere 1.000 μg / ml af hver standard.
- Bland lige store mængder af alle fem standarder i et 2 ml ravcentrifugerør for at producere en cocktail af standarder, der hver har en koncentration på 200 μg / ml.
- Forbered serielle fortyndinger af standardcocktailen ved at tage et volumen i et nyt rør og fortynding med samme volumen af det vandige methanolopløsningsmiddel.
- Gentag de serielle fortyndinger ned til en koncentration på 3,125 μg/ml.
- Fortynd også hver standard separat 40 gange med opløsningsmidlet for at opnå en koncentration på 25 μg/ml af hver standard.
- Kolonnetemperaturen indstilles til 35 °C og prøveovnens temperatur til 15 °C.
- For at forberede mobil fase A (0,1 % vandig myresyre) overføres 1 ml myresyre til en volumetrisk kolbe med en kapacitet på 1 liter og tilsættes vand af HPLC-kvalitet til 1 L-mærket. Ryst godt for at blande.
- For at forberede mobil fase B (0,1 % myresyre i methanol) overføres 1 ml myresyre til en volumetrisk kolbe med en kapacitet på 1 liter og tilsættes hpLC-grade methanol til 1 L-mærket. Ryst godt for at blande.
- Juster lydstyrken til 1 L-mærket, hvis det er nødvendigt.
- Filtrer begge mobile faser gennem et 0,45 μm hydrofilt filterpapir.
- Til analysen injiceres 10 μL af hvert ekstrakt eller hver standard (25 μg/ml-standarder og standardcocktails) på den omvendte fasekolonne.
- Elute med de mobile faser i henhold til det lineære gradientprogram i et 25 minutters løb som følger: 0-3,81 min, 9% -14% B; 3,81-4,85 min, 14%-15% B; 4,85-5,89 min, 15%-15% B, 5,89-8,32 min, 15%-17% B; 8,32-9,71 min, 17%-19% B; 9,71-10,40 min, 19%-19% B; 10,40-12,48 min, 19%-26% B; 12,48-13,17 min, 16%-28% B; 13,17-14,21 min, 28%-35% B; 14,21-15,95 min, 35%-40% B; 15,95-16,64 min, 40%-48% B; 16,64-18,37 min, 48%-53% B; 18,37-22,53 min, 53%-70% B; 22,53-22,88 min, 70%-90% B; 22,88-25,00 min, 90% B.
- Sammenlign retentionstiderne for kromatografiske toppe opnået for de autentiske standarder for koncentrationer 25 μg/ml ved 280 nm og 320 nm med ekstrakternes for at identificere de phenolforbindelser, der indgår i prøverne.
- Afbild kalibreringskurver for phenolsyrestandardcocktails med koncentration af standarderne på den vandrette akse og topområdet på den lodrette akse
- Brug kalibreringskurverne til at estimere koncentrationerne af de identificerede phenolforbindelser ved at sammenligne topområderne på plottet med koncentrationerne af de identificerede forbindelser ved 280 nm og 320 nm som nævnt i det tidligere afsnit.
4. Samlet phenolindhold
BEMÆRK: Bestem det samlede phenolindhold i ekstrakterne ved hjælp af Folin-Ciocalteu-metoden beskrevet af F.B. Apea-Bah et al.13.
- Ferulinsyre- og gallinsyrestandarder udarbejdes inden for koncentrationsintervallet 0,025 til 0,150 mg/ml for at afbilde kalibreringskurver til sammenligning med henblik på estimering af det samlede phenolindhold.
- For at gøre dette skal du nøjagtigt veje 1 mg hver af ferulinsyre- og gallinsyrestandarder i centrifugerør med en kapacitet på 2 ml.
- Tilsæt 1 ml 50% vandig methanol til hver standard og hvirvel for at opløse, hvilket giver 1 mg / ml lager af hver standard.
- Der fremstilles en række fortyndinger fra hver stamopløsning på i alt 500 μL.
- Pipette 18,2 μL af hvert ekstrakt eller standard i en separat brønd på en 96-brønds mikroplade.
- Der tilsættes 36,4 μL 10 % (v/v) vandigt Folin-Ciocalteu-reagens til hvert ekstrakt eller hver standard.
- Derefter tilsættes 145,4 μL 700 mM natriumcarbonat til hver reaktionsblanding.
- Inkuber reaktionsblandingerne i mørke ved stuetemperatur (20-25 °C) i 2 timer.
- Læs absorbansen på en mikropladelæser ved 750 nm.
- Afbildningskurver for ændring i absorbans i forhold til koncentration af phenolsyrestandarderne og brug dem til at estimere det samlede phenolindhold.
- Resultaterne udtrykkes som milligram ferulinsyreækvivalenter pr. gram formalet prøve (mg FAE/g) og milligram gallinsyreækvivalenter pr. gram formalet prøve (mg GAE/g) på tørvægtsbasis.
5. Antioxidant assays
BEMÆRK: Bestem kornekstrakternes antioxidantkapacitet ved hjælp af følgende tre assays: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikal oprensningskapacitet; 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) radikal oprensningskapacitet, som også kaldes Trolox-ækvivalent antioxidantkapacitet (TEAC); og oxygenradikalabsortanskapacitet (ORAC).
- Udarbejdelse af Trolox-standarder for standardkurver
- Brug Trolox, en vandopløselig analog af E-vitamin, som standard til at estimere fuldkornsekstrakternes in vitro-antioxidantkapacitet .
- Vej nøjagtigt 1 mg Trolox i et 15 ml rør. Opløs i 4 ml 50% vandig methanol. Vortex opløses for at fremstille en stamopløsning på 1 mM (1000 μM).
- Forbered seks koncentrationer af Trolox, det vil sige 50, 100, 200, 400, 600 og 800 μM for at plotte standardkurver til estimering af DPPH-radikaloprensningskapacitet og Trolox-ækvivalent antioxidantkapacitet (TEAC). Tilsvarende forberede 6,25, 12,5, 25 og 50 μM koncentrationer af Trolox til estimering af oxygenradikale absorbanskapacitet (ORAC). Det samlede volumen af hver koncentration udgør 500 μL som vist i tabel 1.
- Fortynding af prøveekstrakter
- Prøveekstrakterne fortyndes med methanol inden analysen. Her blev gule majs- og cowpea-ekstrakter fortyndet to gange, hvede- og nyrebønnen blev fortyndet fem gange, mens sojabønneekstraktet blev fortyndet 10 gange med methanol.
- Trolox ækvivalent antioxidant kapacitet (TEAC) assay
- Prøvernes Trolox-ækvivalente antioxidantkapacitet (TEAC) måles ved hjælp af den metode, der tidligere er beskrevet af F.B. Apea-Bah et al.14.
- 8,23 mg ABTS vejes i et rent ravcentrifugerør med en kapacitet på 2 ml.
- Dernæst vejes 1,62 mg kaliumpersulfat i et andet rent ravcentrifugerør med en kapacitet på 2 ml.
- Tilsæt 1 ml destilleret vand til hver af dem og hvirvel for at opløse dem.
BEMÆRK: Dette resulterer i 16 mM ABTS-stamopløsning med 6 mM vandig kaliumpersulfatopløsning. - Forbered ABTS-stamopløsningen ved at blande ABTS- og kaliumpersulfatopløsningerne i lige store mængder. Opløsningen skifter straks til en mørk farve.
- Inkuber reagensblandingen i mørke i 12-16 timer.
- Fortynd ABTS-stamopløsningen 30 gange med 200 mM fosfatbufret saltvand (PBS) for at danne ABTS-arbejdsløsningen. For at gøre dette skal du tilføje 58 ml 200 mM PBS til 2 ml af ABTS-lageropløsningen. Arbejdsløsningen vil indeholde 0,27 mM ABTS og 0,1 mM kaliumpersulfat.
- Til analysen anbringes 10 μL af hvert fortyndet ekstrakt eller Trolox i en mikroplade med 96 brønde.
- Tilsæt 190 μL ABTS-arbejdsløsning til hver brønd og inkuber reaktionsblandingerne i 60 minutter.
- Reaktionsblandingernes absorbans måles ved 750 nm i en mikropladelæser.
- Brug Trolox-standarderne i en koncentration fra 100 til 800 pmol / l til at afbilde en kalibreringskurve.
- Anslå ABTS-radikaloprensningskapaciteten fra kalibreringskurven.
- Resultaterne udtrykkes som mikromole Trolox-ækvivalenter pr. gram (pmol TE/g) prøve på tørvægtsbasis.
- DPPH-analyse
BEMÆRK: Bestem PRØVERNES DPPH-radikale oprensningskapacitet ved hjælp af den metode, der tidligere er beskrevet af F.B. Apea-Bah et al.13. DPPH-antioxidantassayet kræver en radikalgenererende forbindelse, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).- Vej nøjagtigt 1,2 mg DPPH i et tomt centrifugerør med en kapacitet på 50 ml. DPPH opløses i 30 ml methanol for at fremstille en 60 μmol/l metanolopløsning.
BEMÆRK: DPPH-assayet tester prøveekstrakternes evne til at opsage frie radikaler produceret af DPPH. - Til analysen tilsættes 5 μL af prøveekstrakterne eller Trolox-opløsningen i mikropladebrøndene.
- Derefter tilsættes 195 μL af 60 μmol / L DPPH-metanolopløsningen og inkuberes i 60 minutter.
- Reaktionsblandingens absorbans måles ved 515 nm.
- Brug Trolox-standarderne (50-800 μmol/L) til at afbilde en kalibreringskurve med ændringen i absorbans på den lodrette akse og Trolox-koncentrationerne på den vandrette akse.
- Anslå DPPH-oprensningskapaciteten fra kalibreringskurven.
- Resultaterne udtrykkes som mikromole Trolox-ækvivalenter pr. gram (pmol TE/g) prøve på tørvægtsbasis.
- Vej nøjagtigt 1,2 mg DPPH i et tomt centrifugerør med en kapacitet på 50 ml. DPPH opløses i 30 ml methanol for at fremstille en 60 μmol/l metanolopløsning.
- Oxygen radikal absorbans kapacitet
- Bestem prøvernes iltradikale absorbanskapacitet (ORAC) baseret på metoden F.B. Apea-Bah et al.13.
- Til at begynde med skal du forberede Trolox-standarder for koncentrationer 6,25, 12,5, 25 og 50 μM fra en 1.000 μM Trolox-standardopløsning i 75 mM kaliumphosphat (K2HPO4/KH2PO4) buffer.
- For at gøre dette skal du veje 1 mg Trolox-pulver og opløses i 4 ml af bufferopløsningen under sonikering for at fremstille en 1.000 μM stamopløsning.
- Derefter tages 50 μL af stamopløsningen i et centrifugerør med en kapacitet på 2 ml og fortyndes med 950 μL bufferopløsning for at opnå 1.000 μL 50 μM Trolox-opløsning.
- Pipette 500 μL af 50 μM-opløsningen i et nyt rør og fortyndes med samme volumen buffer for at opnå en 25 μM Trolox-opløsning.
- Gentag den serielle fortynding af 25 μM for at opnå 12,5 μM, og gentag derefter på samme måde fortyndingen af 12,5 μM for at opnå 6,25 μM.
- Der forberedes passende fortyndinger af prøveekstrakterne.
- Fortynd de gule majs- og cowpea-ekstrakter 20 gange, hvede- og nyrebønneekstrakterne 50 gange og sojabønneekstraktet 100 gange med bufferopløsningen.
- Overfør 200 μL af hver prøve eller Trolox-standard til brøndene på en sort 96-brønds mikroplade til automatisk pipettering.
- Derefter fyldes de tre reagenstanke, der er forsynet med ORAC-udstyret, med følgende: (1) bufferopløsningen; (2) 0,816 nM fluorescein i bufferen og (3) 153 mM 2,2′-azobis(2-amidinopropan)dihydrochlorid (AAPH) i buffer.
- Placer dem i deres beholdere til automatisk pipettering.
- Konfigurer ORAC-maskinen og det automatiske pipetteringssystem til analyse baseret på standarddriftsproceduren.
- Til analysen skal du oprette det automatiserede pipetteringssystem til at overføre 25 μL af hvert fortyndet ekstrakt eller standard til brøndene i en klar sort 96-brønds mikroplade.
- Derefter tilsættes automatisk 150 μL 0,816 nM fluorescein i buffer.
- Inkubere reaktionsblandingen ved 37 °C i 15 minutter i ORAC-maskinen.
- Derefter tilsættes automatisk 25 μL af AAPH til hver reaktionsblanding.
- Inkuber dem ved 37 °C i 50 minutter i ORAC-maskinen.
- Konfigurer ORAC-maskinen til at måle fluorescenshenfaldet over inkubationsperioden ved excitations- og emissionsbølgelængder på henholdsvis 485 nm og 520 nm.
- Efter målingerne skal du afbilde en Trolox-standardkurve med Trolox (6,25-50 μM) på den vandrette akse og fluorescenshenfald på den lodrette akse.
- Vurder oxygenradikalets absorbanskapacitet for ekstrakterne fra Trolox-standardkurven.
- Resultaterne udtrykkes som pmol TE/g-prøve på tørvægtsbasis.
- Statistisk analyse
- Præsenter alle resultaterne som midler ± standardafvigelse på mindst triplikater.
- Udfør analyse af varians (ANOVA) for at bestemme effekten af korntype på responsvariablerne.
- Hvis der findes signifikante forskelle ved p < 0,05, skal du bruge mindst signifikant forskel (LSD) til at sammenligne midlerne.
- Udfør Pearson korrelationsanalyse for at estimere forholdet mellem phenolindholdet og antioxidantkapaciteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 2 viser de phenolsyrer, der blev identificeret i korn- og bælgfrugtkornene. Baseret på tilgængelige autentiske standarder blev fire phenolsyrer identificeret i prøverne, og de er: vanillsyre, koffeinsyre, p-coumaric og ferulinsyrer. Vanillsyre er en hydroxybenzoesyre, mens de tre andre er hydroxycinnaminsyrer. Vanillinsyre blev kun identificeret i Blackeye cowpea bønne, mens koffeinsyre kun blev identificeret i nyrebønne. p-Coumarsyre blev identificeret i gul majs, cowpea bønne og sojabønne. Dens koncentration varierede mellem 7,57 og 12,48 μg / g mel på tørvægtsbasis, hvor gul majs havde den laveste værdi, mens sojabønne havde den højeste værdi. Ferulinsyre var den eneste phenolsyre, der blev identificeret i alle prøverne. Dens koncentration varierede mellem 5,69 og 41,76 μg/g mel på tørstofbasis. Blandt prøverne var ferulinsyrekoncentrationen højest i sojabønne efterfulgt af cowpeabønne, mens hvede, gul majs og nyrebønne havde sammenlignelige værdier (tabel 2). Når alle phenolsyrekoncentrationerne blev opsummeret for hver prøve, faldt deres værdier i følgende rækkefølge: sojabønne > cowpea bønne > gul majs = nyrebønne > hvede.
Tabel 3 viste det samlede phenolindhold (TPC) og antioxidantkapaciteten i korn- og bælgplantekornene. Antioxidantkapaciteten omfattede DPPH-radikal scavenging kapacitet, TEAC og ORAC. Summen af disse tre værdier gav derfor prøvernes samlede antioxidantkapacitet. TPC blev målt både i ferulinsyreækvivalent og gallinsyreækvivalent med henblik på sammenligning. TPC varierede mellem 1,16 og 2,78 mg FAE/g mel og 0,63 til 1,48 mg GAE/g mel på tørvægtsbasis. Uanset den tilsvarende enhed faldt TPC for prøverne i følgende rækkefølge: sojabønne > hvede = gul majs = nyrebønne > cowpea bønne.
DPPH's radikale oprensningskapacitet af prøverne varierede mellem 4,48 og 14,87 μmol TE / g mel på tørvægtsbasis. Sojabønne havde den højeste DPPH-oprensningskapacitet efterfulgt af nyrebønne, mens gul majs og cowpea bønne havde sammenlignelige værdier. Hvede havde den laveste evne til at opsle DPPH-radikalet. Prøvernes Trolox-ækvivalente antioxidantkapacitet (TEAC) varierede mellem 12,82 og 57,24 μmol TE/g mel på tørvægtsbasis. Igen havde sojabønne den højeste TEAC-værdi, efterfulgt af nyrebønne og derefter hvede, mens gul majs og cowpea bønne havde forholdsvis lave TEAC-værdier. Prøvernes iltradikale absorbanskapacitet var mellem 0,35 og 1,67 μmol TE/g mel på tørvægtsbasis, hvor kornkornene havde den laveste værdi, mens sojabønnen havde den højeste værdi. Da alle antioxidantkapaciteterne blev opsummeret, faldt deres værdier i prøverne i følgende rækkefølge: sojabønne > nyrebønne > gul majs = cowpea bønne > hvede.
Der var en stærk positiv korrelation mellem de to TPC-værdier og værdierne for TEAC, ORAC og total antioxidantkapacitet (TAC) (tabel 4). Der var imidlertid svag sammenhæng mellem TPC-værdierne og DPPH.
Figur 1: Hydroxybenzoesyrer identificeret i korn og bælgfrugter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Hydroxycinnaminsyrer identificeret i korn og bælgfrugter.
Tabel 1: Fremstilling af Trolox-koncentrationer for DPPH- og ABTS-standardkurver. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Phenolsyreindhold i visse fuldkornsprodukter og bælgfrugter. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Samlet phenolindhold (TPC) og antioxidantkapacitet i visse fuldkornsprodukter og bælgfrugter. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Pearson korrelationsmatrix for det samlede phenolindhold og antioxidantkapaciteten i nogle korn- og bælgfrugtkorn. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fuldkornene blev udvalgt som repræsentative kornkorn og bælgfrugter, der finder brede fødevareapplikationer over hele verden. Mens variationer kan eksistere blandt sorter af hvert korn, var fokus for denne undersøgelse at demonstrere en generaliseret metode til fri phenolsyreekstraktion og analyse for fuldkorn. Ekstraktionsmetoden blev modificeret ved væsentligt at reducere mængden af prøver og opløsningsmidler for at reducere mængden af kemikalier, der ville blive frigivet i miljøet, når sådanne eksperimenter udføres. Modifikationen muliggør også phenolekstraktion fra milligrammængder af fuldkorn.
HPLC-analyse frembringer et kromatogram af de phenolsyrer, der indgår i prøven. Hver kromatografisk top, der repræsenterer en phenolsyre, kan identificeres ved at sammenligne dens retentionstid ved en foruddefineret bølgelængde med autentiske phenolsyrestandarder. Ultraviolette (UV) detektorer bruges normalt til at identificere phenolsyrer inden for UV-bølgelængdeområdet. Hydroxybenzoesyrer identificeres normalt mellem 254-280 nm, mens hydroxycinnaminsyrer normalt identificeres mellem 300-330 nm15. Fotodiode array-detektorer kan bruges til at scanne hele det UV-synlige bølgelængdeområde og er især nyttige til bestemmelse af de UV-synlige spektre af forbindelser, der er til stede i prøver, der aldrig er blevet undersøgt. R. J. Robbins og S. R. Bean15 rapporterede følgende bølgelængder for maksimal absorption for henholdsvis vanillsyre, koffeinsyre, p-coumarsyre og ferulinsyre: 260 nm; 325 nm; 310 nm; 325 nm. HPLC-identifikationsmetoden er normalt acceptabel for prøver med kendt phenolsyresammensætning, hvis retentionstider og UV-spektrale data tidligere er blevet fastslået. Dette er vigtigt, fordi nogle forbindelser kan co-elutere, når der ikke opnås god adskillelse på søjlen. For prøver med ukendt phenolsyresammensætning anvendes et massespektrometer ud over de autentiske standarder for identifikation. Offentliggjort litteratur giver nyttige oplysninger om phenolforbindelser, der tidligere er blevet identificeret i den undersøgte prøve eller i lignende prøver 3,9,14. Det er værd at bemærke, at phenolsyretoppe i kromatogrammet under HPLC-analyse kun kan identificeres, når autentiske standarder er tilgængelige til sammenligning. Der kan derfor være andre toppe, der ikke kan identificeres uden deres tilsvarende standarder. Dette er en begrænsning med HPLC-analyse, som kan overvindes, når HPLC er koblet til et massespektrometer. Derfor vil den samlede koncentration af kvantificerede phenolsyrer afhænge af antallet af identificerede phenolsyrer.
Folin-Ciocalteu-metoden, som først blev offentliggjort af V. L. Singleton og J. A. Rossi (1965)16 , er et elektronoverførselsbaseret assay, der bruges til at estimere TPC for en analyt17. Det er baseret på analyttens evne til at reducere phosphomolybdat-phosphotungstate i et alkalisk medium og derved omdanne det fra gul til en mørkeblå opløsning18. Absorbansen af den resulterende opløsning kan derefter måles ved 765 nm19. Reagenset er ikke specifikt for phenolforbindelser alene, men kan reagere med flere andre forbindelser med reducerende egenskaber såsom thioler, reducerende sukkerarter og nogle aminosyrer (f.eks. Tyrosin). Det foreslås derfor, at TPC kan anvendes til at estimere den reducerende egenskab ved en prøve eller analyt17. Under phenolekstraktionen udelukkes de fleste interfererende forbindelser, og da phenolforbindelser er de mest allestedsnærværende fytokemikalier, forbliver Folin-Ciocalteu-assay en nyttig metode til at estimere TPC for en prøve. I de fleste prøver, hvis phenolsammensætning ikke er kendt, anvendes gallinsyre som standard til at tegne en kalibreringskurve til estimering af TPC. Det er dog ikke alle prøver, der indeholder gallinsyre. I den aktuelle undersøgelse brugte vi ferulinsyre til at sammenligne resultaterne med gallinsyre. En T-test med to prøver viste, at TPC bestemt som ferulinsyreækvivalent havde signifikant højere værdier end TPC udtrykt som en gallinsyreækvivalent. Da vi bekræftede, at ferulinsyre var til stede i alle prøverne baseret på vores HPLC-analyse og andre rapporterede resultater, ville vi læne os mere mod at udtrykke TPC-resultaterne som en ferulinsyreækvivalent. Det er nyttigt at udtrykke TPC i forhold til en fremherskende bestanddel phenolforbindelse i prøven.
Ved hjælp af tre forskellige antioxidantassays blev det observeret, at de forskellige korn reagerede forskelligt i deres evner til at fjerne frie radikaler. DPPH radikal scavenging kapacitet og TEAC assay er baseret på elektronoverførsel (ET) mekanisme, mens ORAC assay er baseret på hydrogenatomoverførsel (HAT) mekanisme20. Derfor giver kombinationen af de tre assays en bedre indikation af antioxidantkapaciteten i en prøve. Det er værd at bemærke, at ORAC-analysen måler en prøves evne til at fjerne det fysiologisk relevante peroxylradikal, som i et fysiologisk system kan forårsage lipidperoxidation, der er relateret til skumcelledannelse og atherogenese21,22. På den anden side bruger DPPH- og TEAC-assays radikaler, der ikke er af fysiologisk relevans. Imidlertid gør deres brugervenlighed dem nyttige som hurtige metoder til at estimere en prøves radikale oprensningskapacitet. ORAC-assay sammenligner sig også godt med andre in vitro- eller ex vivo-antioxidantassays, der bruger celler og DNA som biomarkører23.
Alle de ovenfor beskrevne metoder til ekstraktion og identifikation af frie phenolsyrer, estimering af det samlede phenolindhold og bestemmelse af antioxidantegenskaber er ikke standardiserede. Forskellige producenter af flydende kromatografiske kolonner anbefaler forskellige gradientelutningssystemer af opløsningsmidler til at adskille phenolsyrer til deres identifikation. Selvom Folin-Ciocalteu-metoden er den mest almindelige til estimering af det samlede phenolindhold i prøver, udfører forskellige laboratorier dette assay forskelligt. Det samme kan siges om antioxidantmetoderne. Der er derfor behov for harmonisering af disse metoder for at fremme sammenligning af resultater mellem laboratorier. Der er også behov for udvikling af robuste prædiktive modeller, der kan relatere phenolsyresammensætningen til antioxidantegenskaberne målt ved disse vigtige analysemetoder.
Det konkluderes af denne undersøgelse, at den anvendte opløsningsmiddelekstraktionsmetode er effektiv til at ekstrahere friopløselige phenolsyrer fra melet af fuldkornsprodukter og bælgfrugter og derved lette identifikationen og kvantificeringen heraf. HPLC-metoden muliggør identifikation og kvantificering af friopløselige phenolsyrer i fuldkornsekstrakter, forudsat at der er autentiske standarder for sammenligning. Ved hjælp af de tre forskellige antioxidantmetoder: DPPH, TEAC og ORAC kan antioxidantkapaciteten af frit opløselige phenolekstrakter fra fuldkorn bestemmes effektivt baseret på hydrogenatomoverførsels- og elektronoverførselsmekanismerne. Denne undersøgelse bekræfter yderligere, at fuldkorn adskiller sig i deres phenolsyresammensætning og antioxidantkapacitet. Korrelationsanalysen viser, at den målte antioxidantkapacitet er relateret til de phenolsyrer, der indgår i de fuldkornsfrie opløselige ekstrakter. Selvom både TEAC og DPPH scavenge frie radikaler ved elektronoverførselsmekanisme, korrelerede de forskelligt med TPC. Forskellen i adfærd af forskellige antioxidantassays nødvendiggør behovet for at bestemme antioxidantkapaciteten af prøver ved hjælp af en række assays. Blandt de fem undersøgte fuldkorn har sojabønner den højeste phenolsyrekoncentration og tilsvarende højeste antioxidantkapacitet. Undersøgelsen viser også, at fuldkornsfrie opløselige phenolsyrer kan ekstraheres, og deres antioxidantkapacitet undersøges i så lidt som 1 ml vandig methanolopløsning, hvilket reducerer mængden af laboratoriekemikalier, der frigives i miljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender taknemmeligt den tekniske støtte fra alison Ser og hannah Oduro-Obeng samt videoredigeringsstøtten fra fru Janice Fajardo og hr. Miguel del Rosario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L. Encyclopedia of Food Safety. Motarjemi, Y. 3, Academic Press. 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook - Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , Rome, Italy. (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. Official Methods of Analysis. 17th edn. , Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, MD, USA. (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, Pt A 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L.
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
