Summary
Dit artikel heeft tot doel een protocol te bieden voor de isolatie en kweek van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van triple-negatieve borstkanker en hun toepassing voor de preklinische studie van nieuwe nanodeeltjes die zijn ontworpen om zich te richten op de tumormicro-omgeving.
Abstract
Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) zijn belangrijke actoren in de context van de tumor micro-omgeving. Ondanks dat ze in aantal zijn verminderd in vergelijking met tumorcellen, reguleren CAFs de tumorprogressie en bieden ze bescherming tegen antitumorimmuniteit. Opkomende antikankerstrategieën zijn gericht op het hermodelleren van de tumormicro-omgeving door de ablatie van pro-tumorigene CAFs of herprogrammering van CAFs-functies en hun activeringsstatus. Een veelbelovende aanpak is de ontwikkeling van nanosized delivery agents die zich kunnen richten op CAFs, waardoor de specifieke afgifte van geneesmiddelen en actieve moleculen mogelijk wordt. In deze context kan een cellulair model van CAFs een nuttig hulpmiddel zijn voor in vitro screening en vooronderzoek van dergelijke nanoformulaties.
Deze studie beschrijft de isolatie en cultuur van primaire CAFs van het syngeneïsche 4T1 murinemodel van triple-negatieve borstkanker. Magnetische kralen werden gebruikt in een 2-staps scheidingsproces om CAFs uit gedissocieerde tumoren te extraheren. Immunofenotyperingscontrole werd uitgevoerd met behulp van flowcytometrie na elke passage om de procesopbrengst te verifiëren. Geïsoleerde CAFs kunnen worden gebruikt om het targetingvermogen van verschillende nanoformulaties te bestuderen die zijn ontworpen om de micro-omgeving van de tumor aan te pakken. Fluorescerend gelabelde H-ferritine nanocages werden gebruikt als kandidaat-nanodeeltjes om de methode op te zetten. Nanodeeltjes, kaal of geconjugeerd met een gericht ligand, werden geanalyseerd op hun binding aan CAFs. De resultaten suggereren dat ex vivo extractie van borst-CAFs een nuttig systeem kan zijn om nanodeeltjes te testen en te valideren voor de specifieke targeting van tumorigene CAFs.
Introduction
In de afgelopen decennia is het duidelijk geworden dat het doden van tumorcellen meestal niet voldoende is om maligniteit uit te roeien, omdat de tumormicro-omgeving tumorherval kan veroorzaken en therapeutische resistentie kan induceren1,2. Er is toen een nieuw paradigma ontstaan: gericht op tumorstroma om de tumor van ondersteunende factoren te beroven en zo de werkzaamheid van chemotherapeutica te verhogen3,4,5. In het bijzonder zijn kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) een interessant stromale doelwit in veel solide tumoren6,7. CAFs zijn een zeer heterogene groep cellen die interageren met kankercellen en cellen van het immuunsysteem door de afscheiding van groeifactoren, cytokines en chemokines; de extracellulaire matrix opbouwen en hermodelleren; en metastasevorming8,9,10, 11,12mogelijk maken. Afhankelijk van het tumortype vertonen CAFs pro-tumorigene functies, terwijl andere subtypen van CAFs tumoronderdrukkende functies lijken te hebben13,14. Om deze tweedeling beter te verduidelijken, is een grondige karakterisering van CAFs van primaire en gemetastaseerde tumoren belangrijk.
In deze context heeft een opkomend onderzoeksgebied zich gericht op de ontwikkeling van nanosized agentia die zijn ontworpen om CAFs aan te vallen en / of te vernietigen door actieve moleculen en geneesmiddelen te leveren die in staat zijn om de tumormicro-omgeving te hermodelleren15,16,17,18. Verschillende soorten nanodeeltjes zijn ontworpen om CAF-ablatie te bereiken door cytotoxische geneesmiddelen, om CAF-gerichte fotodynamische therapie te induceren, of om CAFs te herprogrammeren door ze terug te brengen naar een rustige toestand of TNF-gerelateerde apoptose geïnduceerde ligandexpressie te induceren, die apoptose van naburige kankercellen induceert16,19. Bovendien geeft het potentieel van veel nanodeeltjes om zich actief te richten op specifieke biologische markers aanleiding tot de hoop om CAF-subsets te selecteren om te targeten. Hoewel de absolute specificiteit voor CAF nog steeds in twijfel wordt getrokken, is fibroblastactivatie-eiwit (FAP) een van de meest veelbelovende doelwitten van pro-tumorgeen stroma en wordt het gebruikt om de levering van nanodrugs te sturen, waardoor het pad wordt vrijgemaakt voor de ontwikkeling van CAF-gerichte nanotherapeutica20,21,22.
Dit artikel beschrijft de isolatie van primaire CAFs van een syngenetisch model van murine borstkanker en rapporteert hun gebruik in de studie van het targetingvermogen van nanodeeltjes die zijn ontworpen om de CAF-marker, FAP, te herkennen. Ferritine nanocages worden gebruikt als kandidaat nanosystemen om de methode op te zetten, omdat hun specificiteit van afgifte kan worden gevormd door de oppervlakteblootstelling van richtmoieties23,24. Bovendien is met succes bewezen dat ferritines uitstekende biocompatibele shuttles zijn voor antitumortoepassingen, waardoor een snelle accumulatie van de lading in de tumormassa25,26,27wordt veroorzaakt. Tot op heden hebben preklinische studies van CAF-gerichte nanosystemen in vitro testen op fibroblastcellijnen gestimuleerd in cultuur met transformerende groeifactor-bèta om celactivatie en de expressie van sommige immunofenotypische kenmerken van CAFs28,29te induceren. Deze methode wordt meestal toegepast op onsterfelijke cellijnen (zoals NIH3T3, LX-2) en is vrij snel en eenvoudig, waardoor geactiveerde cellen binnen een paar uur of dagen worden opgeleverd. Een beperking is dat hoewel in vitro stimulatie de expressie induceert van sommige genen die worden toegeschreven aan geactiveerde myofibroblasten, het niet volledig alle biologische kenmerken van echte CAFs kan samenvatten, vooral hun heterogeniteit in vivo.
Een andere strategie omvat de extractie van primaire CAFs uit menselijke of muistumormonsters30,31. Dit zorgt ervoor dat CAF-activering plaatsvindt in een fysiologische context en dat de heterogeniteit van CAF-subpopulaties behouden blijft. Volgens de onderzoeksdoelstelling kunnen CAFs uit verschillende bronnen worden afgeleid, waardoor de mogelijkheid wordt aangeboden om de meest betrouwbare toestand te bestuderen. Het protocol dat hier wordt gerapporteerd, zou waardevol zijn voor wetenschappers die een voorlopige evaluatie willen uitvoeren van de functionaliteit van nieuwe nanodeeltjes die zijn ontworpen om CAFs van een muizen borstkankermodel te targeten. Geïsoleerde CAFs zouden nuttig zijn voor het screenen van die nanodeeltjes die veelbelovend genoeg zijn om door te gaan voor in vivo evaluatie in diermodellen van kanker. Dit zal relevant zijn tijdens de eerste stappen van de productie van nanodeeltjes, waardoor nanotechnologen worden aangetrokken tot de verfijning van het ontwerp van nanodeeltjes door voornamelijk de strategie van ligandimmobilisatie te overwegen om optimale targetingeigenschappen te bereiken.
Protocol
1. Vaststelling van een syngenetisch 4T1-model van borstkanker
OPMERKING: Het huidige protocol beschrijft de isolatie van primaire CAFs van een muis 4T1 borsttumor. De hier beschreven dierstudie is goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (aut. nummer 110/2018-PR).
- Tumorcelkweek en implantatie
- Ontdooi 1 × 106 4T1-luc cellen in een T75-kolf met 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine (P / S) en 1% L-glutamine. Voeg Mycoplasmaverwijderingsmiddel (1:100) toe aan het kweekmedium.
OPMERKING: 4T1-luc cellen drukken stabiel luciferase uit en kunnen worden gevisualiseerd door bioluminescentie (BLI) na de juiste stimulatie met D-luciferine. Dit maakt in vivo monitoring van de levensvatbaarheid en proliferatie van tumorcellen bij implantatie bij muizen mogelijk(figuur 1). - Houd de cellen op 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer tot ~ 80% samenvloeiing, door het medium om de 2 dagen te vervangen.
OPMERKING: Ga door met de behandeling met Mycoplasma-verwijderingsmiddel gedurende 1 week (~ 2/3 passages) vóór injectie bij muizen om ervoor te zorgen dat geïnjecteerde cellen mycoplasmavrij zijn. - Maak op de dag van de procedure de cellen los met behulp van 1 ml trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) oplossing (trypsine 1:250) gedurende 5 minuten bij 37 °C. Stop de trypsine-activiteit door kweekmedium toe te voegen, tel de cellen met trypanblauw (1:1) en bereken het aantal cellen/ml.
- Pipetteer het volume dat overeenkomt met 1 × 106 cellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g. Giet het supernatant af en suspend de pellet in 1 ml RPMI 1640 basismedium. Houd de cellen op ijs totdat ze klaar zijn voor injectie.
OPMERKING: Voor elke muis zijn 1 × 105 cellen nodig; bereken echter altijd voor een overmaat van 2 muizen (overeenkomend met 2 × 105 cellen) om het laden van de spuit te vergemakkelijken. - Scheer een dag voor de operatie de vacht van 8 BALB /c-muizen (vrouwelijk, zeven weken oud) om het gebied van de abdominale borstklieren aan de rechterkant bloot te leggen. Gebruik een elektrisch scheerapparaat en breng gedurende 4 minuten een dun laagje ontharingscrème aan; spoel vervolgens de crème weg met water en een stuk papier.
- Induceer anesthesie door continue inademing van 2% isofluraangas gedurende ~ 5 minuten en voer een subcutane injectie uit in het gebied van de abdominale borstklieren met een tuberculinespuit van 27 G. Draai de naald naar boven om subcutaan de huid binnen te gaan; houd vervolgens de huid omhoog en injecteer langzaam 100 μL celsuspensie (1 × 105 cellen). Draai de naald iets om voordat u de spuit langzaam intrekt.
OPMERKING: Vergeet niet om de celsuspensie 15 minuten voor injectie op kamertemperatuur te brengen.
- Ontdooi 1 × 106 4T1-luc cellen in een T75-kolf met 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine (P / S) en 1% L-glutamine. Voeg Mycoplasmaverwijderingsmiddel (1:100) toe aan het kweekmedium.
- Tumorgroei en dissectie
- Injecteer 5 dagen na de celinjectie 150 mg/kg D-luciferine intraperitoneaal (100 μL) 5 minuten vóór de beeldvorming. Leg BLI-beelden vast met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem met een belichting van 10 s, medium binning en f/stop bij 4. Definieer het luminescerende gebied van de tumor als het interessegebied (ROI) en kwantificeer het totale signaal in de ROI (foton / sec / m2) met behulp van beeldvormingssoftware.
- Herhaal de procedure van beeldvorming (1.2.1) om de 5 dagen na de injectie om de tumorgroei te controleren in termen van een toename van BLI.
- Om het tumorvolume vast te stellen, houdt u de muis vast en legt u zijn buik bloot. Gebruik remklauwen om eenmaal per week de tumorlengte (L) en breedte (W) te meten. Bereken het tumorvolume (V) met vergelijking 1.
[V = (L x B2)/2] (1) - Offer de dieren 20 dagen na de celinjectie door cervicale dislocatie, dissocieert de tumoren van de huid met een schaar en verzamelt ze in een weefselopslagoplossing (zie de tabel met materialen).
OPMERKING: Tumormonsters kunnen onmiddellijk worden gebruikt voor dissociatie in afzonderlijke cellen (rubriek 2) of gedurende maximaal 48 uur bij 4 °C worden bewaard.
2. Tumordissociatie in afzonderlijke cellen
OPMERKING: Gebruik voor de volgende stappen steriele reagentia en disposables in een laminaire flowkap. Werk met 4 tumoren tegelijk.
- Plaats het tumormonster in een petrischaaltje en verwijder voorzichtig elk fragment van huid, vet en necrotische gebieden met behulp van een pincet en scalpel. Verminder vervolgens de tumor in kleine stukjes van ongeveer 1-2 mm en breng ze over naar een buis(figuur 2A).
OPMERKING: 4T1-tumoren worden zeer necrotisch tijdens het groeien, met een neiging tot ulceratie. Het is belangrijk om de necrotische gebieden zorgvuldig te verwijderen om interferentie van puin bij de volgende stappen te voorkomen. - Bereid een spijsverteringsmix voor tumordissociatie: meng 2,35 ml RPMI 1640 medium, 100 μl enzym D, 50 μl enzym R en 12,5 μl enzym A. Week de tumorfragmenten in de oplossing en sluit de buis goed.
OPMERKING: De aangegeven volumes van de spijsvertering mix zijn geldig voor tumoren tot 1 g en kunnen worden aangepast voor grotere tumoren op basis van hun gewicht. 4T1-tumoren die gedurende 20 dagen zijn gegroeid, bevinden zich normaal gesproken in een bereik van 0,5-0,8 g. - Draai de buis ondersteboven en controleer of alle stukjes tumor in de bodem van de buis in de richting van de dop staan. Bevestig de buis aan een mechanische dissociator in de juiste behuizing en voer een specifiek dissociatieprogramma uit dat is ontworpen voor taaie tumoren (zie de instructies van de fabrikant).
OPMERKING: Speciale buizen kunnen nodig zijn om in de dissociator te passen. C-buizen dragen een rotor in de dop om mechanische dissociatie van het weefsel te bevorderen. - Maak de buis los, houd deze ondersteboven en incubeer het monster gedurende 40 minuten bij 37 °C met zacht schudden. Bevestig vervolgens de buis aan de dissociator in de juiste behuizing en voer het volgende specifieke dissociatieprogramma uit dat is ontworpen voor taaie tumoren twee keer. Zorg ervoor dat er aan het einde van de procedure geen grote stukken weefsel zijn(figuur 2B).
OPMERKING: Om de tumor te dissociëren, kunnen andere enzymcocktails worden gebruikt om de extracellulaire matrix af te breken. In dit protocol werd echter een in de handel verkrijgbare Tumor Dissociation kit gebruikt met een geoptimaliseerde enzymmix (enzymen D, R, A) en een semi-geautomatiseerde dissociator die het weefsel mechanisch dissocieert. Deze combinatie zorgde voor een goede afbraak van de extracellulaire matrix samen met behoud van celintegriteit en celoppervlak epitopen. - Filtreer het monster door een celzeef van 40 μm in een buis van 50 ml, was het filter met 10 ml RPMI 1640 medium en centrifugeer de buis gedurende 7 minuten bij 300 × g. Als de celkorrel rood lijkt, lyseer dan erytrocyten door 1 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) lyseerbuffer toe te voegen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, was met 10 ml RPMI 1640, breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer opnieuw.
- Resuspend de pellet in 1 ml PBE-buffer bestaande uit fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA, en tel de cellen met trypanblauw (1:1). In het geval van celklonten, filter de celsuspensie door een celzeef van 70 μm, eerder gedrenkt met PBS.
OPMERKING: Vooral wanneer tumoren groot zijn, is het belangrijk om het celgetal te controleren en uiteindelijk elk tumormonster in verschillende buizen te splitsen met niet meer dan 107 cellen in elke buis voordat u doorgaat naar stap 2.7. - Bereid de dode celverwijderingsbindende buffer voor door de 20x bindende buffervoorraadoplossing (zie de tabel met materialen)te verdunn met steriel dubbel gedestilleerd water. Wascellen met 5 ml van 1× bindingsbuffer(figuur 2C).
OPMERKING: Houd de buffer op 4 °C. - Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 300 × g en resuspend de celkorrel met 0,1 ml dode celverwijderingsmicroeads (zie de tabel met materialen). Meng goed en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Bereid tijdens de incubatie met kralen een magnetische standaard onder de motorkap voor en hang er ferromagnetische scheidingskolommen (één kolom voor maximaal 107 cellen) aan met de uiteinden naar beneden gericht. Balanceer de kolommen met 0,5 ml koude 1× bindingsbuffer. Wacht tot de oplossing onder zwaartekracht is doorgestroomd.
OPMERKING: Het is belangrijk om het aantal cellen per kolom niet te overschrijden om elk risico op stolling van het kolombed en het verminderen van de herstelopbrengst te voorkomen. Wanneer u met meer dan 107 cellen werkt, gebruikt u meer kolommen op basis van het totale aantal cellen of gebruikt u grotere kolommen. Pas in dergelijke gevallen de in de volgende stappen beschreven reagensvolumes aan op de door de fabrikant aangegeven volumes. - Voeg aan het einde van de incubatie 400 μL koude 1× bindingsbuffer toe aan de kraal/celsuspensie, laad het volledige volume op de kolom en verzamel het effluent (overeenkomend met niet-gelabelde cellen) in een buis van 15 ml.
- Was de kolom vier keer met 0,5 ml koude 1× bindingsbuffer en verzamel het totale effluent (overeenkomend met de levende celfractie) in dezelfde buis.
- Tel de cellen met trypan blauw (1:1). Plaats 1 × 105 cellen in twee buizen voor fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) en houd ze op 4 °C tot procesvalidatie (zie stap 4.1): gebruik de eerste buis om de analyseparameters en de positiviteitsgebieden in te stellen (controlebuis) en de andere voor biomarkeranalyse (monsterbuis). Gebruik de resterende cellen voor de extractie van CAFs (zie rubriek 3).
OPMERKING: Verwijdering van dode cellen is belangrijk om niet-specifieke reacties met de microbeads in rubriek 3 te verminderen. Om de opbrengst te verbeteren, vermijdt u echter de verwijdering van dode cellen als het aandeel dode cellen <20% is.
3. Extractie van primaire CAFs uit borsttumor
OPMERKING: Gebruik voor rubriek 3 de tumor-geassocieerde fibroblastisolatiekit van de muis met niet-tumorge geassocieerde fibroblastdepletiecocktail en tumorge geassocieerde fibroblastmicroeads die geschikt zijn voor magnetische etikettering van de cellen (zie de tabel met materialen).
- Uitputting van niet-kanker-geassocieerde fibroblasten
- Bevochtig een celzeef van 70 μm met PBS en filter de celsuspensie om eventuele klonten te verwijderen. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende 10 minuten bij 300 × g en aspirateer het supernatant.
OPMERKING: Als een enkele tumor voor stap 2.7 in twee monsters is verdeeld, poolt u de celsuspensie twee aan twee voordat u verdergaat met stap 3.1.2. - Resuspend de pellet in 80 μL koude PBE-buffer en voeg 20 μL niet-tumorge geassocieerde fibroblastdepletiecocktail toe. Meng goed en incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten in het donker.
- Bereid tijdens de incubatie met kralen ferromagnetische depletiekolommen (1 per monster) voor op een magnetische standaard en balanceer de kolommen met 2 ml koude PBE-buffer. Wacht tot de oplossing is doorgevloeid.
- Voeg aan het einde van de incubatie 400 μL koude PBE-buffer toe aan de kraal/celsuspensie, laad het volledige volume op de kolom en verzamel het effluent (overeenkomend met niet-gelabelde cellen) in een buis van 15 ml.
- Was de kolom tweemaal met 2 ml koude PBE-buffer en verzamel het totale effluent in dezelfde buis. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 × g en resuspend in 0,1 ml koude PBE-buffer.
OPMERKING: Uitputting van niet-kanker-geassocieerde fibroblasten vermindert drastisch de totale hoeveelheid teruggewonnen cellen. Het is over het algemeen noodzakelijk en aanbevolen om celsuspensies uit vier verschillende monsters te bundelen om een zichtbare pellet en voldoende cellen voor stap 3.2 te verkrijgen. Dit zorgt voor een optimale opbrengst. - Plaats 20 μL van de celsuspensie in een FACS-buis en houd deze op 4 °C voor procesvalidatie (zie rubriek 4). Gebruik de resterende cellen voor CAF-selectie (zie stap 3.2).
- Bevochtig een celzeef van 70 μm met PBS en filter de celsuspensie om eventuele klonten te verwijderen. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende 10 minuten bij 300 × g en aspirateer het supernatant.
- Positieve selectie van kanker-geassocieerde fibroblasten
- Voeg 20 μL tumorge geassocieerde fibroblast microbeads toe aan 80 μl celsuspensie. Meng goed en incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten in het donker.
- Bereid tijdens de incubatie met kralen ferromagnetische scheidingskolommen (1 per monster) voor op een magnetische standaard en balanceer de kolommen met 0,5 ml koude PBE-buffer. Wacht tot de oplossing is doorgevloeid.
- Voeg aan het einde van de incubatie 400 μL koude PBE-buffer toe aan de kraal/celsuspensie, laad het volledige volume op de kolom en laat de ongelabelde cellen doorstromen in een buis van 15 ml.
- Was de kolom driemaal met 0,5 ml koude PBE-buffer en verzamel het totale effluent in dezelfde buis.
OPMERKING: De doorstroming bevat niet-gelabelde CD90.2-negatieve cellen, die kunnen worden weggegooid als niet-kankergeactiveerde fibroblasten. - Verwijder de kolom uit de magneet en plaats deze in een buis van 1,5 ml. Voeg 1 ml koude PBE toe aan de kolom en duw de zuiger onmiddellijk in de kolom om de cellen weg te spoelen.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 × g en resuspend in 0,1 ml koude PBE-buffer. Plaats 20 μL celsuspensie in een FACS-buis en houd deze op 4 °C voor procesvalidatie (zie rubriek 4).
OPMERKING: Na het centrifugeren kan de pellet nauwelijks zichtbaar zijn, vooral wanneer de oorspronkelijke tumoren klein zijn. Gebruik conische onderste centrifugebuizen en pas op dat u geen cellen verliest bij het streven naar het supernatant. - Verdun de resterende cellen in een geschikt volume Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / Ham's F-12 aangevuld met 15% FBS, 2 mM L-glutamine, 1% P / S en 1% niet-essentiële aminozuren, en zaai de cellen in een weefselkweekplaat.
- Controleer de celdichtheid onder een microscoop en plaats de plaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 om de cellen te laten hechten en groeien.
OPMERKING: Als de cellen te dicht zijn, splits u de celsuspensie onmiddellijk in twee putjes van de weefselkweekplaat voordat u de plaat in de incubator plaatst.
4. Procesvalidatie
- Flowcytometrie
OPMERKING: Sectie 4.1 vereist geen steriele omstandigheden en kan buiten de laminaire kap worden uitgevoerd. Voer rubriek 4.1 parallel uit voor monsters verzameld in stap 2.11 (gedissocieerde tumor), stap 3.1.6 (na uitputting van niet-kankergeactiveerde fibroblasten) en stap 3.2.6 (na verrijking van kankergeactiveerde fibroblasten).- Centrifugeer de in de stappen 2.11, 3.1.6 en 3.2.6 bereide FACS-buizen gedurende 10 minuten bij 300 × g. Gooi het supernatant weg.
OPMERKING: Bereid ten minste één extra buis voor, die niet-gekleurde cellen bevat die fungeren als een controle om de parameters voor analyse in te stellen. - Resuspend cellen in 88 μL PBE en voeg 2 μL anti-CD45-antilichaam geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC, 1:50 verdunning, volgens de instructies van de fabrikant) en 10 μL anti-CD90.2-antilichaam geconjugeerd met phycoerythrin (PE, 1:10 verdunning, volgens de instructies van de fabrikant). Meng grondig en incubeer gedurende 10 min bij 4 °C in het donker. In de controlebuis (onbevlekt) resuspend cellen in 100 μL PBE. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C in het donker om de gevolgde procedure voor met antilichamen bevlekte cellen te repliceren.
OPMERKING: Temperatuur en incubatietijd moeten zorgvuldig worden gecontroleerd, omdat een variatie in dergelijke variabelen kan leiden tot slechte of niet-specifieke kleuring, waardoor de resultaten veranderen. - Na het voltooien van de incubatiestap voert u een wasbeurt uit door 1 ml PBE toe te voegen. Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 x g. Gooi het supernatant weg.
- Resuspend cellen (alle buizen) in 500 μL PBS.
- Meng goed en ga verder met flowcytometrie-analyse. Stel de kanalen in om de fluorescentie van de antilichamen (d.w.z. FITC en PE) te meten.
- Selecteer in de controlebuis alle levensvatbare cellen door een eerste poort (P1) te tekenen op de forward versus side scatter (FSC vs SSC) plot. Stel binnen P1 een tweede poort (P2) in die alleen uit enkele cellen bestaat.
- Gebruik de specifieke fluorescentiekanalen van de antilichamen (d.w.z. FITC en PE) om de juiste poorten te plaatsen om positief gekleurde cellen te onderscheiden.
- Start de analyse en noteer ten minste 10.000 gebeurtenissen in P2. Lees signalen van beide kanalen tegelijkertijd.
OPMERKING: Als het totale aantal cellen minder is dan verwacht, kan het beter zijn om de hele buis te lezen. - (OPTIONEEL) Als verdere kleuring met extra antilichamen/fluoroforen is geprogrammeerd, stel dan een geschikte compensatiematrix in voordat u de analyse start.
- Centrifugeer de in de stappen 2.11, 3.1.6 en 3.2.6 bereide FACS-buizen gedurende 10 minuten bij 300 × g. Gooi het supernatant weg.
- Monitoring van celmorfologie en kenmerken
OPMERKING: Eenmaal gezaaid, moeten de cellen onder steriele omstandigheden worden gehanteerd.- Visualiseer de cellen op de dag na het zaaien onder een optische microscoop om de celadhesie en morfologie te controleren. Adem het supernatant op en vervang het door vers medium.
OPMERKING: CAFs zijn grote spilvormige cellen, die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van de epitheliale structuur van 4T1-tumorcellen. - Houd de cellen op 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer en verwissel het medium om de 2 dagen.
- Wanneer cellen ~80% samenvloeiing bereiken (ongeveer 4-6 dagen na het zaaien), maak de cellen los met tryple select oplossing (zie de tabel met materialen)gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vers medium (4:1) toe, centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 400 × g en suspens de pellet opnieuw in vers medium.
- Splits de cellen 1:2 en breid de cultuur uit totdat het aantal cellen dat nodig is voor het experiment is verkregen.
- Controleer bij elke passage de celmorfologie en groei onder een optische microscoop. Als de celmorfologie niet homogeen is (bijv. klonen van kleine ronde cellen die in cultuur voorkomen), analyseer dan een monster van cellen door middel van flowcytometrie zoals beschreven in rubriek 4.1. Indien homogeen, gaat u verder met stap 4.2.7.
OPMERKING: Veranderingen in de celmorfologie kunnen wijzen op besmetting door niet-kankerge geassocieerde fibroblasten, die moeten worden verwijderd om de zuiverheid van de cultuur te garanderen. - Analyseer de resultaten van de flowcytometrie en ga verder volgens een van de volgende scenario's: (i) als besmetting van CD90.2-/CD45-cellen optreedt, verzamel dan alle cellen en herhaal de positieve selectie door stap 3.2 te volgen; ii) indien ook verontreiniging van CD45+-cellen optreedt, alle cellen verzamelen en de uitputting in stap 3.1 herhalen; iii) als er geen besmetting optreedt (alleen CD90.2+/CD45-cellen zijn aanwezig), houd de cellen in cultuur en ga direct verder met 4.2.7.
OPMERKING: Omdat het herhalen van het uitputtingsproces met microbeads het celherstel zal verminderen, wordt het alleen aanbevolen wanneer cellen niet onmiddellijk hoeven te worden gebruikt. - Tel de cellen met trypan blauw (1:1), plaats 5 × 105 cellen in twee FACS-buizen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 × g. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in 0,5 ml blokkerende buffer (PBS aangevuld met 2% BSA, 2% geitenserum) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Eén buis fungeert als een controle die alleen uit niet-gekleurde cellen bestaat, terwijl cellen in de tweede buis worden gekleurd voor flowcytometrie-analyse. - Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 × g, gooi het supernatant weg en resuspend in 99 μL blokkerende buffer. Voeg 1 μg anti-FAP-antilichaam toe aan de monsterbuis en 1 ml blokkerende buffer aan de controlebuis. Meng grondig en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: FAP is een oppervlaktemarker van reactief tumorstroma en kan worden gebruikt om CAFs te identificeren en te karakteriseren. - Was driemaal met PBS, centrifuge en incubeer met het juiste secundaire antilichaam geconjugeerd met een fluorescerende kleurstof (1 μg) in blokkerende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was driemaal met PBS en analyseer met flowcytometrie (volg stappen 4.1.5 tot 4.1.7 door het juiste kanaal in te stellen om de gebruikte fluorofoor te detecteren). Gebruik vervolgens de cellen voor experimenten (stap 5.2).
- (OPTIONEEL) Vries een monster van cellen in 1 ml van 90% FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO); bewaren bij -80 °C voor verder gebruik.
- Visualiseer de cellen op de dag na het zaaien onder een optische microscoop om de celadhesie en morfologie te controleren. Adem het supernatant op en vervang het door vers medium.
5. CAFs targeting door gemanipuleerde ferritine nanodeeltjes
OPMERKING: Een recombinante variant van humane ferritine zware keten (HFn) werd gebruikt als kaal nanodeeltje of werd geconjugeerd met richtmoieties. Hier werden HFn-nanodeeltjes gefunctionaliseerd met het variabele deel van een anti-FAP-antilichaam (Fab@FAP) bereid door het NanoBioLab aan de Universiteit van Milano-Bicocca bij twee HFn: Fab@FAP molaire verhoudingen, 1: 1 en 1: 5, volgens een eerder beschreven protocol32.
- Fluorescerende etikettering van HFn-nanodeeltjes
OPMERKING: Zowel kale als gefunctionaliseerde HFn nanocages zijn fluorescerend gelabeld met FITC.- Los het FITC-poeder op in 99% ethanol om een concentratie van 2 mg/ml te verkrijgen.
OPMERKING: Deze oplossing moet vers worden bereid. - Incubeer 50 μL van de bereide oplossing (200 μg FITC) voor elke 1 mg eiwit (d.w.z. 100 μL HFn bij 10 mg/ml). Voeg 50 μL 1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3)toe en stel het volume in op 500 μL met 0,1 M NaHCO3.
OPMERKING: Schaal de volumes op volgens de experimentele behoeften. - Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur, in het donker en met continu roeren gedurende 1 uur.
- Verwijder het teveel aan FITC uit het conjugaat door gelfiltratie met behulp van een spin-ontsaltingskolom (7 kDa MWCO).
- Beoordeel de concentratie van het teruggewonnen gelabelde eiwit met behulp van een spectrofotometer. Schat de hoeveelheden eiwit en kleurstof door de absorptie te meten bij respectievelijk 280 nm en 488 nm.
- Los het FITC-poeder op in 99% ethanol om een concentratie van 2 mg/ml te verkrijgen.
- Binding van HFn-nanodeeltjes aan CAFs
OPMERKING: Gebruik CAFs van uiterlijk passages 4-5 in cultuur.- Plaats 5 × 105 cellen in elke FACS-buis, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 × g en resuspend in 0,5 ml PBS, 0,3% BSA aangevuld met 0,1 mg / ml van de verschillende preparaten van nanodeeltjes (kale HFn, HFn-Fab@FAP 1: 1, HFn-Fab@FAP 1: 5) eerder gelabeld met FITC.
OPMERKING: Voer elke voorwaarde in drievoud uit. Bereid een extra buis voor als een ongelabeld controlemonster waaraan geen nanodeeltjes worden toegevoegd. - Incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C in het donker, centrifugeer en was driemaal in PBS.
- Resuspend cellen met 0,5 ml PBS, meng goed en analyseer door flowcytometrie. Stel de kanalen in om de fluorescentie van FITC te meten.
- Na het gaten op levende enkele cellen, verwerf je 20.000 gebeurtenissen. Gebruik de ongelabelde regelbuis om de poort van FITC-positiviteit in te stellen en het percentage FITC+ -gebeurtenissen te verkrijgen (overeenkomend met nanodeeltjesbinding).
- Plaats 5 × 105 cellen in elke FACS-buis, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 × g en resuspend in 0,5 ml PBS, 0,3% BSA aangevuld met 0,1 mg / ml van de verschillende preparaten van nanodeeltjes (kale HFn, HFn-Fab@FAP 1: 1, HFn-Fab@FAP 1: 5) eerder gelabeld met FITC.
6. Statistische analyse en experimentele replicaties
- Dieren
- Voer drie onafhankelijke experimenten uit van tumorgroei en CAFs-isolatie, met behulp van 8 dieren per enkel experiment, zoals beschreven in 1.1.5. Om de isolatieopbrengst van CAFs te optimaliseren, verdeelt u de weggesneden weefsels in subgroepen (n=4) en verwerkt u deze volgens de stappen die worden beschreven in rubriek 2.
- HFn interactie met cellen
- Evalueer de interactie van gefunctionaliseerde en niet-gefunctionaliseerde HFn met doel- en niet-doelcellen (respectievelijk CAFs en 4T1) in termen van het percentage positief gekleurde cellen door fluorescerend gelabelde nanocages. Rapporteer de resultaten als gemiddelde ± standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten.
- Statistische analyse
- Om statistische significantie te berekenen in celbindingsexperimenten met HFn en HFn-FAP, gebruikt u de gewone eenrichtings-ANOVA-test.
Representative Results
In vivo modelopstelling voor optimale CAFs-isolatie
De injectie van 105 4T1-luc cellen in het borstvetkussen van vrouwelijke BALB /c-muizen leidt tot de groei van een detecteerbare tumormassa 5 dagen na implantatie. Door het tumorvolume te meten met remklauwen en de levensvatbaarheid van de tumorcel door BLI, werd de tumorgroei gedurende één maand na implantatie gevolgd. Om een offervenster te vinden dat geschikt is voor CAFs-isolatie, werd een optimaal compromis gezocht tussen een hogere tumorgrootte en BLI aan de ene kant en een opkomende tumor ulceratie en necrose aan de andere kant (figuur 1). Aangezien een necrotische kern 20 dagen na implantatie verschijnt en deze na 25 en 30 dagen toetreedt (zoals gedocumenteerd door BLI-afbeeldingen in figuur 1C),werd dag 20 ingesteld als het tijdstip om het celherstel na het isolatieproces te optimaliseren. Zelfs na het zorgvuldig verwijderen van alle zichtbare necrotische gebieden tijdens de eerste stappen van tumorbehandeling ex vivo,werd een hoog percentage dode cellen gevonden aan het einde van de dissociatie in afzonderlijke cellen(tabel 1). Omdat dit percentage relevant kan zijn, vooral met de toename van de tumorgrootte, is verwijdering van dode cellen altijd noodzakelijk bij het werken met het 4T1-model.
Optimalisatie van de isolatieprocedure, cultuur en karakterisering van CAFs
Er zijn nog twee passages nodig om de populatie van CAFs (CD90.2+ CD45-) te isoleren uit het panel van verzamelde levensvatbare cellen: de uitputting van niet-tumor-geassocieerde fibroblasten en de verrijking van tumor-geassocieerde fibroblasten (Figuur 2). De depletiekraalcocktail verwijdert efficiënt CD45+ -cellen (goed voor respectievelijk 67,35% en 0,69% van de totale cellen vóór en na depletie, tabel 2), en werd altijd gebruikt om één enkele tumor in elke kolom te verwerken. Zoals weergegeven in tabel 1daalde het aantal eluted cellen van gemiddeld 3 × 10 6 naar1 × 105 na de depletiestap. Vanwege deze enorme afname van het totale celaantal, is het handig om de verzamelde cellen van ten minste 2 tot maximaal 4 tumoren in een enkele buis te bundelen voordat u doorgaat met de verrijkingsstap. Door dit te doen, werd een voldoende aantal cellen verkregen voor incubatie met tumor-geassocieerde fibroblastparels en passeerde een enkele scheidingskolom om een eindgemiddelde van 93% van de CD90.2+ CD45- cellen te verkrijgen (tabel 2).
Eenmaal gezaaid op weefselkweekplaten, herstelden deze cellen zich aan het plastic en onthulden een grote spilvormige morfologie die typerend is voor fibroblasten (figuur 3A,B) en verschilt van 4T1-tumorcellen (figuur 3D). Het niet poolen van tumoren na uitputting zorgt ervoor dat de cellulaire opbrengst met tumor-geassocieerde fibroblast microbeads te laag is om een cultuur vast te stellen. In andere gevallen, wanneer de duur en temperatuur van de incubaties met microbeads niet zorgvuldig worden gehandhaafd, kan er een niet-specifieke binding optreden. In dergelijke gevallen waren de verrijkingsstappen minder efficiënt en werden hogere percentages CD90.2- CD45+ en CD90.2- CD45- cellen teruggevonden samen met de CD90.2+ CAFs (respectievelijk 5,97 ± 1.5 en 16,75 ± 1.1) (figuur 4 en tabel 3). Deze verontreinigingscellen waren waarschijnlijk verantwoordelijk voor de aanwezigheid in cultuur van kleine klonen met een andere morfologie(figuur 4B,zwarte pijlpunten) die sneller groeiden dan CAFs en de overhand hadden op de primaire CAF-cultuur(figuur 4C). Deze suboptimale resultaten bevestigden het belang van het altijd dubbel controleren van zowel CD90.2- als CD45-expressie, evenals celmorfologie aan het einde van het verrijkingsproces en tijdens celgroei in cultuur.
Gebruik van geïsoleerde cellen om CAF-targeting potentieel van gemanipuleerde nanodrugs te evalueren
De vers geïsoleerde CAFs kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, variërend van fundamenteel onderzoek tot farmacologische studies. Het doel van deze groep is om HFn-nanocages te ontwikkelen die zich specifiek op CAFs kunnen richten. HFn werd gefunctionaliseerd met een specifiek anti-FAP-antilichaamfragment (HFn-FAP) bij twee verschillende eiwit:antilichaamverhoudingen (een lagere 1:1 en een hogere 1:5), en hun binding met CAFs werd getest. Aangezien FAP werd gebruikt als oppervlaktebiomarker van pro-tumorigene CAFs, was het van fundamenteel belang om FAP-expressie op geïsoleerde CAFs te controleren(Figuur 3C). FAP-expressie werd gevolgd over 5 passages in de cultuur om te bevestigen dat de primaire CAF-cultuur zijn oorspronkelijke kenmerken behield.
FAP-functionalisatie op HFn bleek bij te dragen aan een significante verschuiving naar CAF-targeting in vergelijking met kale HFn, en de lagere hoeveelheid antilichaam (1:1) was voldoende om dit effect waar te nemen(Figuur 5A). Dit werd echter niet waargenomen met de tumor 4T1-cellen die werden gebruikt om het in vivo tumormodel op te zetten, waarbij kale HFn een hogere binding vertoonde dan gefunctionaliseerde HFn (figuur 5B). Dit was hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de afwezigheid van FAP-overexpressie in 4T1-cellen en de preferentiële interactie van HFn met TfR1, die de HFn-opname in cellen reguleert, zoals algemeen gerapporteerd door deze groep27,33. Deze resultaten bevestigen het nut van het gebruik van primaire culturen van borst-CAFs om voorlopig het doelgericht vermogen van nanodeeltjes te screenen die zijn ontworpen om de micro-omgeving van de tumor aan te pakken.
Figuur 1: Vaststelling van het 4T1 tumormodel. Cellen (105 cellen/muis) werden geïnjecteerd in het borstvetkussen. Tumorgroei werd gevolgd op dag 5, 10, 15, 20, 25 en 30 na implantatie (A) door het meten van tumorvolume met remklauwen en (B) door bioluminescentie beeldvorming. Tumorvolumes en BLI worden uitgedrukt als respectievelijk mm3 en tellingen. De resultaten worden gerapporteerd als gemiddelde ± SEM (n=6). (C)BLI representatieve beelden verkregen 5, 10, 15, 20, 25 en 30 dagen na celimplantatie bevestigen tumorgroei tot dag 25, wanneer het een plateau lijkt te bereiken. Op het laatste analysepunt (30 dagen) neemt de BLI niet toe ten opzichte van dag 25. Vanaf dag 20 beginnen gebieden met necrose en ulceratie zichtbaar te worden in het centrale deel van de tumor. Kleurenschaal: Min = 1.194, Max = 20.462. Afkortingen: BLI = bioluminescentie beeldvorming; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Tumormonstervoorbereiding en flowcytometriekarakterisering van geïsoleerde CAFs. Tumoren werden weggesneden en gereduceerd tot (A) kleine stukjes van ongeveer 1-2 mm met behulp van een scalpel; B)eencellige suspensie na weefselvertering en mechanische dissociatie van een weggesneden tumor; C) celkorrel verkregen na lysis van rode bloedcellen; (D) flowcytometrie analyse van CD45 en CD90.2 expressie in cellen verkregen na verwijdering van rode bloedcellen en dode cellen, (E) na uitputting van niet-kanker-geassocieerde fibroblasten, en (F) na verrijking van kanker-geassocieerde fibroblasten, waarbij de meerderheid van de cellen CD90.2+ CD45- (blauwe rechthoek) zijn. Afkortingen: CAFs = kanker-geassocieerde fibroblasten; CD = cluster van differentiatie; PE-A = oppervlakte van phycoerythrin; FITC-A = gebieden van fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfologische analyse van CAF's en FAP-expressie. (A, B) DE MORF-morfologie werd in alle passages van de cultuur gecontroleerd door optische microscopie (verschillende niveaus van samenvloeiing bij passage 2 en passage 5) en vergeleken met (D) 4T1 tumorcellen; schaalstaven = 10 μm. (C) Fibroblastactivatie-eiwit (FAP) expressie werd geëvalueerd door flowcytometrie aan het einde van het isolatieproces op de verzamelde CD90.2+ CD45- cellen om hun moleculaire kenmerken te bevestigen. Een fluorescentiedrempel werd ingesteld op niet-gekleurde controlecellen (rode grafiek) om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit en het percentage positieve cellen (FAP+) tussen antilichaam-gekleurde cellen (blauwe grafiek) te kwantificeren. Afkortingen: CAFs = kanker-geassocieerde fibroblasten; FAP = fibroblastactivatie-eiwit; CD = cluster van differentiatie; MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit; Ab = antilichaam; FITC-A = oppervlakte fluoresceïne-isothiocyanaat; FAP+ = FAP-positieve cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld van een suboptimaal CAFs isolatieproces. (A) Flowcytometrie-evaluatie na de laatste isolatiestap onthulde de aanwezigheid van verontreiniging CD90.2- CD45+ en CD90.2- CD45- cellen. (B) Deze cellen kunnen worden gezien als klonen met kleine ronde morfologie bij het zaaien (zwarte pijlpunten en inzet in de linkerbenedenhoek van het paneel) die (C) de overhand hadden op CAFs na de derde passage in de cultuur. Schaalbalken = 10 μm. Afkortingen: CAF = kanker-geassocieerde fibroblast; CD = cluster van differentiatie; PE-A = oppervlakte van phycoerythrin; FITC-A = gebieden van fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Binding van HFn nanocages op CAFs en 4T1. HFn-nanocages werden fluorescerend gelabeld met FITC, gefunctionaliseerd met een anti-FAP-antilichaamfragment (HFn-FAP) bij twee verschillende eiwit-antilichaamverhoudingen (1:1 en 1:5) en geïncubeerd met (A) doel-CAFs en (B) 4T1-cellen bij 4 °C gedurende 2 uur. De binding werd geëvalueerd door middel van flowcytometrie. (A)HFn-FAP-binding met CAFs is significant verhoogd bij beide antilichaamfragmentconcentraties met een drievoudige in vergelijking met kale HFn. (B) daarentegen werd een significant hogere binding van kale HFn waargenomen in 4T1-cellen, waar de binding niet wordt versterkt door FAP-herkenning. De resultaten worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten. p = 0,0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Afkortingen: CAFs = kanker-geassocieerde fibroblasten; FAP = fibroblastactivatie-eiwit; HFn = recombinante variant van menselijke ferritine zware keten gebruikt als kaal nanodeeltje of geconjugeerd; HFN-FAP = HFn nanodeeltjes gefunctionaliseerd met het variabele deel van een anti-FAP antilichaam bereid op twee HFn:Fab@FAP molaire verhoudingen, 1:1 en 1:5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celnummer (gemiddelde ± SD) | Extractieopbrengst Totaal (per passage) | |
| Weggesneden tumor (Verwijdering van rode bloedcellen) | 1,27 x 108 ± 9,81 x 107 | 100% |
| Weggesneden tumor (Verwijdering na verwijdering van dode cellen) | 3,01 x 106 ± 9,61 x 105 | 2.38% |
| Cocktail na uitputting | 1,15 x 105 ± 4,95 x 104 | 0.11% (3.82%) |
| Naverrijking | 3,00 x 104 ± 1,2 x 104 | 0.027% (26.09%) |
Tabel 1: Totaal celgetal na elke stap van isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten.
| Celverdeling (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Weggesneden tumor (Verwijdering na verwijdering van dode cellen) | 1,81 ± 0,98 | 10,78 ± 4,51 | 56,57 ± 14,05 | 28,20 ± 17,57 |
| Cocktail na uitputting | 69,33 ± 16,75 | 0,14 ± 0,13 | 0,55 ± 0,63 | 39,89 ± 30,31 |
| Naverrijking | 93,14 ± 3,3 | 0,09 ± 0,1 | 0,09 ± 0,08 | 6,69 ± 3,4 |
Tabel 2: Celverdeling volgens expressie van CD90.2 en CD45 na elke passage van isolatie van kankergeactiveerde fibroblasten.
| Celverdeling (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Post Enrichment (geen pooling) | 75,80 ± 2,9 | 1,49 ± 0,4 | 5,97 ± 1,5 | 16,75 ± 1,1 |
Tabel 3: CD90.2- en CD45-expressie van cellen verzameld na een suboptimaal kankergeactiveerd fibroblastisolatie-experiment.
Discussion
CAFs zijn in opkomst als belangrijke spelers in het remodellereren van extracellulaire matrix, het bevorderen van metastaseprogressie en het beperken van de toegang tot geneesmiddelen tot de tumorplaats34. Vanwege hun heterogeniteit zijn hun rollen echter nog steeds controversieel - sommige CAFs zijn tumorgeen, terwijl sommige andere subtypen een tumoronderdrukkende rol lijken te hebben. In deze context kan hun isolatie van extreem belang zijn om meer licht te werpen op hun veelbesproken rol in de progressie van kanker, die belangrijke klinische implicaties zal hebben12,31. Bovendien zou succesvolle CAF-extractie uit menselijke en preklinische muistumormodellen ook de ontwikkeling van nieuwe CAF-gerichte geneesmiddelen vergemakkelijken. Dit artikel rapporteert een methode om primaire CAFs efficiënt te isoleren en te culeren uit een syngenetisch preklinisch model van borstkanker. Op basis van ervaring hebben drie experimentele stappen vooral invloed op het succes van het protocol.
De eerste werkt snel om aggregatie van celsuspensies geassocieerd met het risico op stolling in de kolom en vertragende celefflux te voorkomen: in feite, wanneer cellen die door de kolom gingen samen werden geclusterd, nam de kans op een suboptimaal isolatieproces toe en de laatste culturen bevatten "contaminant" celklonen. De tweede is het poolen van cellen van verschillende tumoren na de depletiepassage om voldoende cellen te garanderen om door te gaan in de laatste verrijkingsstap. Het laatste kritieke probleem is het platen van de geëxtraheerde cellen bij hoge celdichtheden, hoogstwaarschijnlijk beginnend bij een enkele put van de 24-putplaat om de celgroei en kolonie-uitbreiding voor maximaal 4-5 passages te stimuleren. Als de cellen bij lage dichtheden werden gezaaid, breidden ze zich uit op het vrije oppervlak en stopten ze snel met repliceren.
Verschillende studies hebben al CAF-extractiemethoden van zowel menselijke als muisoorsprong beschreven, om hun rol bij het bevorderen van de ontwikkeling en invasiviteit van kanker te bestuderen. Dit is gedaan in vele soorten tumoren, waaronder borstkanker, melanoom, cholangiocarcinoom en pancreasadeenocarcinoom35,36,37,38. Door het ontbreken van specifieke CAF-markers en hun heterogeniteit zijn de resultaten van deze processen echter nog steeds suboptimaal.
Hier werden de geïsoleerde cellen gebruikt om het CAF-targeting vermogen van HFn nanocages gefunctionaliseerd met anti-FAP targeting moieties te valideren. Het gebruik van primaire culturen van CAFs was een belangrijk voordeel, waardoor de validatie van de nanostrategie ex vivo mogelijk was met een veel eenvoudiger en kosteneffectief bindingsexperiment dan het direct in vivo te doen in deze voorbereidende fase van nanodrug-optimalisatie.
In die zin kunnen ex vivo testen op CAFs voorafgaan aan in vivo dierproeven door de screening en selectie van de meest veelbelovende nanodeeltjes mogelijk te maken voor de optimale targeting van CAF. Het hier gepresenteerde CAF-model kan ook worden gebruikt voor voorlopige werkzaamheidsstudies, bij het laden van nanodeeltjes met actieve geneesmiddelen. Dieren zullen pas later worden gebruikt om biodistributie, farmacokinetiek en werkzaamheidsstudies te evalueren.
Verschillende CAF-gerichte nanodrugs worden ontwikkeld, zoals ferritine nanocages voor fotodynamische therapie bij borstkanker en op peptiden gebaseerde deeltjes om doxorubicine te leveren in prostaatkankermodellen39,40. Er zijn echter niet veel studies gericht op de isolatie van CAFs als celplatforms voor nanodrugsoptimalisatie.
Dit protocol heeft enkele beperkingen. Ten eerste is het een tijdrovend protocol, dat de voorbereiding en aankoop van verschillende reagentia en materialen vereist. Ten tweede, vanwege de schaarste aan CAFs in de 4T1-borsttumor, is hun opbrengst laag. Nanodeeltjesexperimenten moeten worden gepland en uitgevoerd zodra het vereiste celnummer is bereikt, omdat primaire CAFs senescentie ondergaan en niet lang in cultuur kunnen worden gehouden. Kortom, deze methode van CAFs isolatie, kweken en karakterisering kan een krachtig hulpmiddel zijn om de ontwikkeling van nieuwe gerichte nanogeneesmiddelen in de strijd tegen kanker te versnellen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) onder IG 2017-ID. 20172 project – P.I. Corsi Fabio. SM erkent Pediatric Clinical Research center "Romeo and Enrica Invernizzi" dat haar positie ondersteunt. AB bedankt AIRC (ID. 20172 project) en Universiteit van Milaan voor onderzoeksbeurs. LS en MS postdoctorale en doctorale beurzen worden ondersteund door de Universiteit van Milaan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
| Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
| BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
| CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
| CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
| Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
| CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
| Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
| D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
| DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
| Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
| Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
| Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
| LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
| L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
| Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
| Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
| NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
| Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
| RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at - 20 °C. |
| Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
| TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
| Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
| T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
| Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
| 1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
| 15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
| 4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
| 50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |
References
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer. Breast. 30, 92-100 (2016).
- Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer. Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).
- Hui, L., Chen, Y.
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- LeBleu, V. S., Kalluri, R. A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact. Disease Models & Mechanisms. 11, (2018).
- Li, X. -Y., Hu, S. -Q., Xiao, L. The cancer-associated fibroblasts and drug resistance. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F.
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Costa, A., et al. Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer. Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).
- Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment. Advances Drug Delivery Reviews. 99, Part B 186-196 (2016).
- Chen, Q., et al. Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).
- Truffi, M., et al. Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).
- Tong, R., Langer, R.
- Kaps, L., Schuppan, D. Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers. Cells. 9 (9), 2027 (2020).
- Miao, L., et al. Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors. Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).
- Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. Fibroblast activation protein-α in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).
- Falvo, E., et al. Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin. Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).
- Truffi, M., et al. Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer. Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).
- Cai, Y., et al. Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size. International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).
- Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R.
- Mazzucchelli, S., et al. Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity. Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).
- Yu, Q., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy. Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).
- Mertens, J. C., et al. Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma. Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).
- Kovács, D., et al. Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts. Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).
- Sitia, L., et al. Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax. Cells. 10 (2), 328 (2021).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells. Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).
- Dvořánková, B., Lacina, L., Smetana, K. Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research. Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).
- Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages. Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).
- Sha, M., et al. Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Zhen, Z., et al. Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control. Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).
- Ji, T., et al. Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery. Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).
