Summary
Целью данной статьи является предоставление протокола выделения и культивирования первичных связанных с раком фибробластов из сингенной мышиной модели тройного негативного рака молочной железы и их применения для доклинического исследования новых наночастиц, предназначенных для нацеливания на микроокружение опухоли.
Abstract
Связанные с раком фибробласты (ЦАФ) являются ключевыми действующими лицами в контексте микроокружения опухоли. Несмотря на сокращение количества по сравнению с опухолевыми клетками, ЦАФ регулируют прогрессирование опухоли и обеспечивают защиту от противоопухоляющего иммунитета. Новые противоопухолевые стратегии направлены на ремоделирование микроокружения опухоли путем абляции проопухолевых ЦАФ или перепрограммирования функций ЦАФ и их статуса активации. Перспективным подходом является разработка наноразмерных агентов доставки, способных нацеливаться на ЦАФ, что позволяет осуществлять специфическую доставку лекарств и активных молекул. В этом контексте клеточная модель ЦАФ может стать полезным инструментом для скрининга in vitro и предварительного исследования таких наноформуляций.
Это исследование описывает выделение и культуру первичных КАФ из сингенной мышиной модели 4T1 тройного негативного рака молочной железы. Магнитные шарики использовались в 2-ступенчатом процессе разделения для извлечения ЦАФ из диссоциированных опухолей. Иммунофенотипирование контроля проводили с помощью проточной цитометрии после каждого прохода для проверки выхода процесса. Изолированные CAF могут быть использованы для изучения способности нацеливания различных наноформуляций, предназначенных для борьбы с микроокружением опухоли. Флуоресцентно меченые Н-ферритиновые нанокажи использовались в качестве наночастиц-кандидатов для создания метода. Наночастицы, либо голые, либо сопряженные с целевым лигандом, были проанализированы на их связывание с ЦАФ. Результаты показывают, что экстракция ex vivo ЦАФ молочной железы может быть полезной системой для тестирования и проверки наночастиц для специфического нацеливания на опухолевые ЦАФ.
Introduction
В течение последних десятилетий стало ясно, что уничтожения опухолевых клеток обычно недостаточно для искоренения злокачественных новообразований, так как микроокружение опухоли может вызвать рецидив опухоли и вызвать терапевтическую резистентность1,2. Затем появилась новая парадигма: нацеливание на опухолевую строму, чтобы лишить опухоль поддерживающих факторов и, таким образом, повысить эффективность химиотерапии3,4,5. В частности, связанные с раком фибробласты (ЦАФ) являются интересной стромальной мишенью во многих солидных опухолях6,7. КАФ представляют собой очень гетерогенную группу клеток, которые взаимодействуют с раковыми клетками и клетками иммунной системы посредством секреции факторов роста, цитокинов и хемокинов; наращивать и реконструирует внеклеточный матрикс; и обеспечивают образование метастазов8,9,10,11,12. В зависимости от типа опухоли, ЦАФ проявляют проопухолевые функции, в то время как другие подтипы ЦАФ, по-видимому, имеют опухолеподавляющие функции13,14. Чтобы лучше прояснить эту дихотомию, важна тщательная характеристика ЦАФ из первичных и метастатических опухолей.
В этом контексте новая область исследований была сосредоточена на разработке наноразмерных агентов, предназначенных для нацеливания и / или разрушения КАФ путем доставки активных молекул и лекарств, способных ремоделировать микросреду опухоли15,16,17,18. Несколько типов наночастиц были разработаны для достижения АБЛЯЦИИ CAF цитотоксическими препаратами, для индуцирования фотодинамической терапии, нацеленной на CAF, или для перепрограммирования CAF путем возвращения их в состояние покоя или индуцирования экспрессии лигандов, связанных с АПОПТОЗом, индуцированной апоптозом, которая индуцирует апоптоз соседних раковых клеток16,19. Более того, потенциал многих наночастиц для активного нацеливания на конкретные биологические маркеры дает надежду на выбор подмножеств CAF для нацеливания. Хотя его абсолютная специфичность для CAF все еще ставится под сомнение, белок активации фибробластов (FAP) является одной из наиболее перспективных мишеней проопухолюменной стромы и используется для управления доставкой нанопрепаратов, тем самым прокладывая путь для разработки CAF-таргетной нанотерапевтики20,21,22.
В этой статье описывается выделение первичных КАФ из сингенной модели рака молочной железы у мыша и сообщается об их использовании при изучении способности нацеливания наночастиц, разработанных для распознавания маркера CAF, FAP. Ферритиновые наноказы используются в качестве потенциальных наносистем для настройки способа, так как их специфичность доставки может быть сформирована поверхностным воздействием целевых объектов23,24. Более того, ферритины были успешно доказаны как отличные биосовместимые челноки для противоопухолевых применений, запускающие быстрое накопление полезной нагрузки в опухолевой массе25,26,27. На сегодняшний день доклинические исследования CAF-таргетных наносистем включали в себя тестирование vitro на клеточных линиях фибробластов, стимулируемых в культуре с трансформацией фактора роста-бета для индуцирования активации клеток и экспрессии некоторых иммунофенотипических особенностей CAF28,29. Этот метод обычно применяется к увековеченным клеточным линиям (таким как NIH3T3, LX-2) и является довольно быстрым и простым, давая активированные клетки за несколько часов или дней. Ограничение заключается в том, что, хотя стимуляция in vitro индуцирует экспрессию некоторых генов, приписываемых активированным миофибробластам, она не может полностью резюмировать все биологические особенности реальных CAF, особенно их гетерогенность in vivo.
Другая стратегия предполагает извлечение первичных ЦАФ из образцов опухолей человека или мыши30,31. Это гарантирует, что активация CAF происходит в физиологическом контексте и что гетерогенность субпопуляций CAF сохраняется. В соответствии с целью исследования, CAF могут быть получены из разных источников, что позволяет изучить наиболее надежное состояние. Протокол, о котором сообщается здесь, будет полезен для ученых, которые стремятся выполнить предварительную оценку функциональности новых наночастиц, предназначенных для нацеливания на CAF из модели рака молочной железы мыша. Изолированные CAF будут полезны для скрининга тех наночастиц, которые достаточно перспективны, чтобы продолжить оценку in vivo на животных моделях рака. Это будет актуально на первых этапах производства наночастиц, что приведет нанотехнологий к совершенствованию дизайна наночастиц, в основном рассматривая стратегию иммобилизации лигандов для достижения оптимальных свойств нацеливания.
Protocol
1. Создание сингенной модели рака молочной железы 4T1
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол описывает выделение первичных КАФ из опухоли молочной железы мыши 4T1. Исследование на животных, описанное здесь, было одобрено Министерством здравоохранения Италии (aut. number 110/2018-PR).
- Культивирование опухолевых клеток и имплантация
- Оттаивание 1 ×10 6 клеток 4T1-luc в колбе T75 с 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS), 1% пенициллином / стрептомицином (P / S) и 1% L-глутамином. Добавьте средство для удаления микоплазмы (1:100) в культуральная среда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки 4T1-luc стабильно экспрессированы люциферазой и могут быть визуализированы биолюминесценцией (BLI) при правильной стимуляции D-люциферином. Это позволяет in vivo контролировать жизнеспособность и пролиферацию опухолевых клеток при имплантации мышам(рисунок 1). - Поддерживают клетки при 37 °C и 5% CO2 в увлажненной атмосфере до ~80% слияния, меняя среду каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте лечение агентом для удаления микоплазмы в течение 1 недели (~ 2/3 прохода) перед инъекцией мышам, чтобы убедиться, что введенные клетки не имеют микоплазмы. - В день процедуры отсоединяют клетки с помощью 1 мл раствора трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (трипсин 1:250) в течение 5 мин при 37 °C. Остановите активность трипсина, добавив культурную среду, подсчитайте клетки с трипан-синим (1:1) и рассчитайте количество клеток/мл.
- Пипетка объемом, соответствующим 1 × 106 ячеек и центрифуга в течение 5 мин при 400 × г. Вылейте супернатант и повторно суспендьте гранулу в 1 мл базовой среды RPMI 1640. Держите клетки на льду до готовности к инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши необходимо 1 ×10 5 ячеек; однако всегда рассчитывайте для избытка 2 мышей (что соответствует 2 × 105 клеткам), чтобы облегчить нагрузку на шприц. - За день до операции побрить мех 8 мышей BALB/c (самок, семинедельного ребенка), чтобы обнажить область брюшных молочных желез с правой стороны. Используйте электробритву и нанесите тонкий слой крема для депиляции на 4 мин; затем смойте крем водой и листом бумаги.
- Индуцируют анестезию путем непрерывного вдыхания 2% газа изофлурана в течение ~5 мин и выполняют подкожную инъекцию в область брюшных молочных желез с помощью туберкулинового шприца 27 Г. Поверните иглу вверх, чтобы попасть в кожу подкожно; затем удерживайте кожу вверх и медленно вводите 100 мкл клеточной суспензии (1 × 105 клеток). Слегка поверните иглу, прежде чем медленно втянуть шприц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте довести клеточную суспензию до комнатной температуры за 15 минут до инъекции.
- Оттаивание 1 ×10 6 клеток 4T1-luc в колбе T75 с 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS), 1% пенициллином / стрептомицином (P / S) и 1% L-глутамином. Добавьте средство для удаления микоплазмы (1:100) в культуральная среда.
- Рост опухоли и рассечение
- Через 5 дней после клеточной инъекции вводят 150 мг/кг D-люциферина внутрибрюшинно (100 мкл) за 5 мин до визуализации. Делайте снимки BLI с помощью системы визуализации in vivo, устанавливая экспозицию 10 с, среднюю биннинг и f/stop на 4. Определите люминесцентную область опухоли как область интереса (ROI) и количественно оцените общий сигнал в ROI (фотон / сек /м 2)с помощью программного обеспечения для визуализации.
- Повторяют процедуру визуализации (1.2.1) каждые 5 дней после инъекции, чтобы контролировать рост опухоли с точки зрения увеличения ЛЛИ.
- Чтобы установить объем опухоли, держите мышь и обнажайте ее живот. Используйте суппорты для измерения длины и ширины опухоли (L) и ширины (W) один раз в неделю. Рассчитайте объем опухоли (V) с помощью уравнения 1.
[V = (Дх Ш 2)/2] (1) - Через 20 дней после инъекции клетки приносят животных в жертву путем вывиха шейки матки, отделяют опухоли от кожи ножницами и собирают их в раствор для хранения тканей (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы опухоли могут быть использованы немедленно для диссоциации в отдельные клетки (раздел 2) или храниться при 4 °C в течение 48 ч.
2. Диссоциация опухоли на отдельные клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующих шагов используйте стерильные реагенты и одноразовые материалы в ламинарной вытяжке. Работа с 4 опухолями одновременно.
- Поместите образец опухоли в чашку Петри и аккуратно удалите любой фрагмент кожи, жира и некротических участков с помощью пинцетом и скальпеля. Затем уменьшают опухоль на мелкие кусочки примерно 1–2 мм и переносят их в трубку(рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли 4T1 становятся высоко некротическими во время роста, с тенденцией к изъязвлению. Важно тщательно удалить некротические участки, чтобы избежать каких-либо помех мусора на следующих этапах. - Приготовьте смесь для пищеварения для диссоциации опухоли: смешайте 2,35 мл среды RPMI 1640, 100 мкл фермента D, 50 мкл фермента R и 12,5 мкл фермента А. Замочите фрагменты опухоли в растворе и плотно закройте трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные объемы смеси пищеварения действительны для опухолей до 1 г и могут быть скорректированы для более крупных опухолей в соответствии с их весом. Опухоли 4T1, выращенные в течение 20 дней, обычно находятся в диапазоне 0,5–0,8 г. - Переверните трубку вверх дном, проверив, чтобы все кусочки опухоли стояли в нижней части трубки по направлению к колпачку. Прикрепите трубку к механическому диссоциатору в соответствующем корпусе, и запустите специальную программу диссоциации, предназначенную для тяжелых опухолей (см. инструкцию производителя).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для вхождение в диссоциатор могут потребоваться специальные трубки. С-трубки несут ротор внутри колпачка, чтобы способствовать механической диссоциации ткани. - Отсоедьте пробирку, поддерживайте ее вверх дном и инкубирует образец при 37 °C в течение 40 мин с легким встряхиванием. Затем прикрепите трубку к диссоциатору в соответствующем корпусе и дважды запустите следующую специфическую программу диссоциации, предназначенную для тяжелых опухолей. Убедитесь, что в конце процедуры нет больших кусочков ткани(рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы диссоциировать опухоль, другие ферментные коктейли могут быть использованы для деградации внеклеточного матрикса. Однако в этом протоколе использовался коммерчески доступный набор для диссоциации опухоли, содержащий оптимизированную смесь ферментов (ферменты D, R, A) и полуавтоматизированный диссоциатор, который механически диссоциирует ткань. Эта комбинация обеспечила надлежащую деградацию внеклеточного матрикса вместе с поддержанием целостности клеток и эпитопов клеточной поверхности. - Отфильтруйте образец через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в пробирке 50 мл, промывайте фильтр 10 мл среды RPMI 1640 и центрифугировать трубку в течение 7 мин при 300 × г. Если клеточная гранула кажется красной, лизуют эритроциты, добавляя 1 мл буфера лизирования аммония-хлорида-калия (ACK) в течение 5 мин при комнатной температуре, промывают 10 мл RPMI 1640, переносят клеточную суспензию в 15 мл пробирки и снова центрифугируют.
- Повторно суспендировать гранулу в 1 мл буфера ПБЭ, состоящего из фосфат-буферного физиологического раствора (PBS), 0,5% бычих сывороточных альбуминов (BSA) и 2 мМ ЭДТА, и подсчитать клетки с трипан-синим (1:1). В случае клеточных сгустков фильтруйте клеточную суспензию через 70-мкм клеточный сетчатый фильтр, предварительно пропитанный PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно когда опухоли большие, важно проверить количество клеток и в конечном итоге разделить каждый образец опухоли в разных пробирках с не более чем 107 клетками в каждой трубке, прежде чем перейти к шагу 2.7. - Подготовьте буфер связывания для удаления мертвых клеток, разбавляя 20-кратный связывающий буферный раствор (см. Таблицу материалов)стерильной двухдистиллированной водой. Промывайте ячейки 5 мл 1× связывающим буфером(рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите буфер при 4 °C. - Центрифугу в течение 7 мин при 300 × г и повторно суспендировать ячейку гранулы с 0,1 мл микрограсин для удаления мертвых клеток (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Во время инкубации с шариками подготовьте магнитную подставку под капотом и повесьте на нее ферромагнитные разделительные колонны (одна колонна на10-7 ячеек) с наконечниками, направленными вниз. Уравновешивают колонны 0,5 мл холодного 1× буфера связывания. Подождите, пока раствор не протечет под действием силы тяжести.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не превышать количество ячеек на столбец, чтобы избежать любого риска свертывания слоя колонны и снижения выхода на восстановление. При работе с более чем 107 ячейками либо используйте больше столбцов в соответствии с общим количеством ячеек, либо используйте столбцы большего размера. В таких случаях отрегулируйте объемы реагентов, описанные в следующих шагах, на те, которые указаны производителем. - В конце инкубации добавьте 400 мкл холодного 1× связующего буфера в суспензию шарика/ячейки, загрузите весь объем на колонну и соберите стоки (соответствующие немаркированных ячейках) в трубку объемом 15 мл.
- Промыть колонну четыре раза 0,5 мл холодного 1× связующего буфера и собрать общий объем сточных вод (соответствующий фракции живых клеток) в той же трубке.
- Подсчитайте ячейки трипан-синим цветом (1:1). Поместите 1 × 105 ячеек в две трубки для флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS) и держите их при 4 °C до валидации процесса (см. шаг 4.1): используйте первую трубку для установки параметров анализа и областей положительности (контрольная трубка), а другую для анализа биомаркеров (пробка). Используйте оставшиеся ячейки для извлечения CAF (см. раздел 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление мертвых клеток важно для уменьшения неспецифических реакций с микрошаровами в разделе 3. Однако, чтобы улучшить выход, избегайте удаления мертвых клеток, если доля мертвых клеток составляет <20%.
3. Извлечение первичных КАФ из опухоли молочной железы
ПРИМЕЧАНИЕ: Для раздела 3 используйте набор для изоляции фибробластов, ассоциированный с опухолью, содержащий коктейль для истощения фибробластов, не связанный с опухолью, и микрогранулы, ассоциированные с опухолью, подходящие для магнитной маркировки клеток (см. Таблицу материалов).
- Истощение не связанных с раком фибробластов
- Смочите 70-мкм клеточный ситечко PBS и отфильтруйте клеточную суспензию, чтобы удалить любые сгустки. Затем центрифугируют клетки в течение 10 мин при 300 × г и аспирируют супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если одна опухоль была разделена на два образца для этапа 2.7, объедините клеточную суспензию два на два, прежде чем переходить к этапу 3.1.2. - Повторно суспендировать гранулу в 80 мкл холодного буфера ПБЭ и добавить 20 мкл коктейля истощения фибробластов, не связанных с опухолью. Хорошо перемешать и инкубировать при 4 °C в течение 15 мин в темноте.
- Во время инкубации с шариками подготовьте ферромагнитные обедненческие колонны (1 на образец) на магнитной подставке и уравновешивайте колонны 2 мл холодного буфера ПБЭ. Подождите, пока раствор не протечет.
- В конце инкубации добавьте 400 мкл холодного буфера ПБЭ в суспензию шарика/ячейки, загрузите весь объем на колонну и соберите сточные воды (соответствующие немаркированных ячейкам) в трубку объемом 15 мл.
- Дважды промыть колонну 2 мл холодного буфера ПБЭ и собрать общий объем сточных вод в одну и ту же трубу. Центрифуга в течение 10 мин при 300 × г и повторное суспендировать в 0,1 мл холодного буфера ПБЭ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение не связанных с раком фибробластов резко снижает общее количество восстановленных клеток. Как правило, необходимо и рекомендуется объединять клеточные суспензии из четырех различных образцов для получения видимой гранулы и достаточного количества клеток для этапа 3.2. Это обеспечит оптимальную урожайность. - Поместите 20 мкл клеточной суспензии в трубку FACS и держите ее при 4 °C для проверки процесса (см. раздел 4). Используйте оставшиеся ячейки для выбора CAF (см. шаг 3.2).
- Смочите 70-мкм клеточный ситечко PBS и отфильтруйте клеточную суспензию, чтобы удалить любые сгустки. Затем центрифугируют клетки в течение 10 мин при 300 × г и аспирируют супернатант.
- Положительный отбор связанных с раком фибробластов
- Добавьте 20 мкл опухолеациоциированных фибробластных микрограбластов к 80 мкл клеточной суспензии. Хорошо перемешать и инкубировать при 4 °C в течение 15 мин в темноте.
- Во время инкубации с шариками подготовьте ферромагнитные разделительные колонны (1 на образец) на магнитной подставке и уравновесьте колонны 0,5 мл холодного буфера ПБЭ. Подождите, пока раствор не протечет.
- В конце инкубации добавьте 400 мкл холодного буфера PBE в суспензию шарика/ячейки, загрузите весь объем на колонку и позвольте немаркированным клеткам пройти в трубку объемом 15 мл.
- Промыть колонну три раза 0,5 мл холодного буфера ПБЭ и собрать общий объем сточных вод в той же трубе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный содержит немаркированные CD90.2-отрицательные клетки, которые могут быть отброшены как не связанные с раком фибробласты. - Снимите столбец с магнита и поместите его в трубку 1,5 мл. Добавьте 1 мл холодного ПБЭ на столбец и немедленно втолкните плунжер в колонну, чтобы промыть ячейки.
- Центрифуга в течение 10 мин при 400 × г и повторное суспендировать в 0,1 мл холодного буфера ПБЭ. Поместите 20 мкл клеточной суспензии в пробирку FACS и держите ее при 4 °C для проверки процесса (см. раздел 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования гранула может быть едва заметна, особенно когда исходные опухоли небольшие. Используйте конические донные центрифужные трубки и будьте осторожны, чтобы не потерять никаких клеток при наддувке супернатанта. - Разбавьте оставшиеся клетки в соответствующем объеме модифицированной среды Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F-12, дополненной 15% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1% P/S и 1% носменимыми аминокислотами, и посейте клетки в тканевую культурную пластину.
- Проверьте плотность клеток под микроскопом и поместите пластину в инкубатор при 37 ° C и 5% CO2, чтобы клетки прилипли и росли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки слишком плотные, немедленно разделите клеточную суспензию на два колодца тканевой культуры пластины перед размещением пластины в инкубаторе.
4. Проверка процесса
- Проточная цитометрия
ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 4.1 не требует стерильных условий и может выполняться вне ламинарной вытяжки. Параллельно выполнять раздел 4.1 для образцов, собранных на этапе 2.11 (диссоциированная опухоль), этапе 3.1.6 (после истощения фибробластов, не связанных с раком) и этапе 3.2.6 (после обогащения фибробластов, связанных с раком).- Центрифуги из трубОК FACS готовят на этапах 2.11, 3.1.6 и 3.2.6 в течение 10 мин при 300 × г. Выбросьте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте по меньшей мере одну дополнительную трубку, которая содержит неиспорченные ячейки, выступающие в качестве элемента управления для установки параметров для анализа. - В пробах повторно суспендируют клетки в 88 мкл ПБЭ и добавляют 2 мкл антитела против CD45, конъюгированного с флуоресцеином изотиоцианатом (FITC, разведение 1:50, согласно инструкциям производителя) и 10 мкл анти-CD90.2 антител, конъюгированных с фикоэритрином (ПЭ, разведение 1:10, согласно инструкциям производителя). Тщательно перемешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 °C в темноте. В контрольной трубке (неокраженной) повторно суспендировали клетки в 100 мкл ПБЭ. Инкубировать в течение 10 мин при 4 °C в темноте, чтобы воспроизвести процедуру, выполненную для клеток, окрашенных антителами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура и время инкубации должны быть тщательно проверены, так как изменение таких переменных может привести к плохому или неспецифическому окрашиванию, что приведет к изменению результатов. - После завершения этапа инкубации выполните промывку, добавив 1 мл ПБЭ. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г. Выбросьте супернатант.
- Повторное суспендированных клеток (все пробирки) в 500 мкл PBS.
- Хорошо перемешайте и приступайте к анализу проточной цитометрии. Установите каналы для измерения флуоресценции антител (т.е. FITC и PE).
- Из контрольной трубки выберите все жизнеспособные ячейки, нарисовав первый затвор (P1) на графике рассеяния вперед и стороны (FSC против SSC). В пределах P1 установите второй затвор (P2), состоящий только из одиночных ячеек.
- Используя специфические флуоресцентные каналы антител (т.е. FITC и PE), установите надлежащие ворота для распознавания положительно окрашенных клеток.
- Начните анализ и запишите не менее 10 000 событий в P2. Считывание сигналов с обоих каналов одновременно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если общее количество ячеек меньше, чем ожидалось, может быть предпочтительнее считывать всю трубку. - (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Если запрограммировано дальнейшее окрашивание дополнительными антителами/флуорофорами, перед началом анализа установите соответствующую компенсационную матрицу.
- Центрифуги из трубОК FACS готовят на этапах 2.11, 3.1.6 и 3.2.6 в течение 10 мин при 300 × г. Выбросьте супернатант.
- Мониторинг морфологии и характеристик клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: После посева клетки должны обрабатываться в стерильных условиях.- На следующий день после посева визуализируйте клетки под оптическим микроскопом, чтобы проверить адгезию и морфологию клеток. Аспирировать супернатант и заменить свежим носителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: CAF представляют собой крупные веретенообразные клетки, которые можно легко отличить от эпителиально-подобной структуры опухолевых клеток 4T1. - Поддерживают клетки при 37 °C и 5% CO2 в увлажненной атмосфере, меняя среду каждые 2 дня.
- Когда клетки достигнут ~80% слияния (примерно через 4-6 дней после посева), отсоедините клетки с помощью раствора TrypLE Select (см. Таблицу материалов)на 5 мин при комнатной температуре. Добавить свежую среду (4:1), центрифугировать клеточную суспензию по 400 × г в течение 5 мин и повторно суспендировать гранулу в свежей среде.
- Разделите клетки 1:2 и расширяйте культуру до тех пор, пока не будет получено необходимое для эксперимента количество клеток.
- При каждом прохождении проверяйте морфологию и рост клеток под оптическим микроскопом. Если морфология клеток не однородна (например, клоны небольших клеток круглой формы, появляющиеся в культуре), проанализируйте образец клеток с помощью проточной цитометрии, как описано в разделе 4.1. Если однородный, перейдите к этапу 4.2.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения в морфологии клеток могут указывать на загрязнение фибробластами, не связанными с раком, которые необходимо удалить для обеспечения чистоты культуры. - Проанализировать результаты проточной цитометрии и действовать в соответствии с одним из следующих сценариев: (i) если происходит загрязнение CD90.2-/CD45-клеток, соберите все клетки и повторите положительный отбор, выполнив следующий шаг 3.2; (ii) если загрязнение клеток CD45+ также происходит, соберите все клетки и повторите истощение на этапе 3.1; iii) если загрязнения не происходит (присутствуют только CD90.2+/CD45- клетки), держите клетки в культуре и переходите непосредственно к 4.2.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку повторение процесса истощения с помощью микрошаров уменьшит восстановление клеток, рекомендуется только тогда, когда клетки не нужно использовать немедленно. - Подсчитайте ячейки с трипаном синего цвета (1:1), поместите 5 ×10 5 клеток в две трубки FACS и центрифугу в течение 10 мин при 300 × г. Выбросьте супернатант и повторно суспендируют гранулу в 0,5 мл блокирующего буфера (PBS, дополненный 2% BSA, 2% козьей сывороткой) в течение 15 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна трубка действует как контроль, состоящий только из неокрашивания клеток, в то время как клетки во второй трубке будут окрашены для анализа проточной цитометрии. - Центрифугу в течение 10 мин при 300 × г, отбрасывают супернатант и повторно суспендируют в 99 мкл блокирующего буфера. Добавьте 1 мкг антифап-антитела в пробирку для образцов и 1 мл блокирующего буфера в контрольную пробирку. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: FAP является поверхностным маркером реактивной стромы опухоли и может быть использован для идентификации и характеристики CAF. - Трижды промыть PBS, центрифугой и инкубировать соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентным красителем (1 мкг) в блокирующем буфере в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Трижды промыть PBS и проанализировать с помощью проточной цитометрии (выполните шаги с 4.1.5 по 4.1.7, установив соответствующий канал для обнаружения используемого флуорофора). Затем используйте клетки для экспериментов (шаг 5.2).
- (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Заморозить образец клеток в 1 мл 90% FBS и 10% диметилсульфоксида (DMSO); хранить при -80 °C для дальнейшего использования.
- На следующий день после посева визуализируйте клетки под оптическим микроскопом, чтобы проверить адгезию и морфологию клеток. Аспирировать супернатант и заменить свежим носителем.
5. Нацеливание на КАФ с помощью разработанных наночастиц ферритина
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантный вариант тяжелой цепи ферритина человека (HFn) использовался в качестве голой наночастицы или был сопряжен с целевыми частями. Здесь наночастицы HFn, функционализированные переменной частью антифап-антитела (Fab@FAP), были получены NanoBioLab в Университете Милано-Бикокка при двух молярных соотношениях HFn:Fab@FAP, 1:1 и 1:5, в соответствии с ранее описанным протоколом32.
- Флуоресцентная маркировка наночастиц HFn
ПРИМЕЧАНИЕ: Как голые, так и функционализированные наносчажки HFn флуоресцентно маркируются FITC.- Растворите порошок FITC в 99% этаноле до получения концентрации 2 мг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор должен быть приготовлен свежим. - Инкубировать 50 мкл приготовленного раствора (200 мкг FITC) на каждый 1 мг белка (т.е. 100 мкл HFn при 10 мг/мл). Добавьте 50 мкл 1 М бикарбоната натрия (NaHCO3)и отрегулируйте объем до 500 мкл с 0,1 М NaHCO3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение объемов в соответствии с экспериментальными потребностями. - Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре, в темноте и при непрерывном перемешивание в течение 1 ч.
- Удалите избыток FITC из конъюгата путем гелевой фильтрации с помощью колонки расщеливания спина (7 кДа MWCO).
- Оцените концентрацию восстановленного меченого белка с помощью спектрофотометра. Оцените количество белка и красителя, измерив абсорбсию при 280 нм и при 488 нм соответственно.
- Растворите порошок FITC в 99% этаноле до получения концентрации 2 мг/мл.
- Связывание наночастиц HFn с ЦАФ
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ВКК не позднее отрывков 4–5 в культуре.- Поместите 5 × 105 клеток в каждую трубку FACS, центрифугу в течение 10 мин при 300 × г и повторное суспендировать в 0,5 мл PBS, 0,3% BSA, дополненное 0,1 мг/мл различных препаратов наночастиц (голый HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5), предварительно помеченных FITC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните каждое условие в трех номерах. Подготовьте дополнительную трубку в качестве контрольного немаркированного образца, в который не добавляют наночастицы. - Инкубировать в течение 2 ч при 4 °C в темноте, центрифугу и трижды промыть в PBS.
- Повторное суспендирование клеток с 0,5 мл PBS, хорошо перемешивают и анализируют с помощью проточной цитометрии. Установите каналы для измерения флуоресценции FITC.
- После наживки на живые одиночные клетки приобретите 20 000 событий. Используйте контрольную немаркированную трубку для установки затвора позитивности FITC и получения процента событийFITC+ (соответствующего связыванию наночастиц).
- Поместите 5 × 105 клеток в каждую трубку FACS, центрифугу в течение 10 мин при 300 × г и повторное суспендировать в 0,5 мл PBS, 0,3% BSA, дополненное 0,1 мг/мл различных препаратов наночастиц (голый HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5), предварительно помеченных FITC.
6. Статистический анализ и экспериментальные реплики
- Животные
- Выполните три независимых эксперимента по росту опухоли и выделению CAF, используя 8 животных в одном эксперименте, как описано в 1.1.5. Чтобы оптимизировать выход выделения CAF, разделите иссеченные ткани на подгруппы (n = 4) и обработайте их, следуя шагам, описанным в разделе 2.
- Взаимодействие HFn с клетками
- Оценить взаимодействие функционализированного и нефункционализированного HFn с клетками-мишенями и нецелевые клетками (CAF и 4T1 соответственно) с точки зрения процента положительно окрашенных клеток флуоресцентно мечеными нанокажами. Сообщайте о результатах как о среднем ± стандартном отклонении трех независимых экспериментов.
- Статистический анализ
- Чтобы рассчитать статистическую значимость в экспериментах по связыванию клеток с HFn и HFn-FAP, используйте обычный односторонний тест ANOVA.
Representative Results
Настройка модели in vivo для оптимальной изоляции CAF
Инъекция 105 клеток 4T1-luc в жировую подушку молочной железы самок мышей BALB/c приводит к росту обнаруживаемой опухолевой массы через 5 дней после имплантации. Измеряя объем опухоли суппортами и жизнеспособность опухолевых клеток с помощью BLI, рост опухоли контролировали в течение одного месяца после имплантации. Чтобы найти окно жертвоприношения, адекватное для изоляции ЦАФ, был достигнут оптимальный компромисс между более высоким размером опухоли и МФО, с одной стороны, и возникающим изъязвлением и некрозом опухоли, с другой стороны(рисунок 1). Поскольку некротическое ядро появляется через 20 дней после имплантации, и оно увеличивается на 25 и 30 дней (как задокументировано изображениями BLI на рисунке 1C),день 20 был установлен в качестве точки времени для оптимизации восстановления клеток после процесса изоляции. Даже после тщательного удаления всех видимых некротических областей на первых этапах обработки опухоли ex vivo,в конце диссоциации в отдельные клетки был обнаружен высокий процент мертвых клеток(таблица 1). Поскольку этот процент может быть актуален, особенно при увеличении размера опухоли, удаление мертвых клеток всегда необходимо при работе с моделью 4T1.
Оптимизация процедуры изоляции, культуры и характеристики CAF
Для выделения популяции КАФ (CD90.2+ CD45-) из панели собранных жизнеспособных клеток необходимы еще два прохода: истощение неопухородных фибробластов и обогащение опухолеассоциированными фибробластами(рисунок 2). Коктейль из бусин истощения эффективно удаляет CD45+ клетки (на которые приходится 67,35% и 0,69% от общего количества клеток до и после истощения, соответственно, таблица 2),и всегда использовался для обработки одной опухоли в каждой колонке. Как показано в таблице 1,количество элюированных клеток снизилось в среднем с 3 × 106 до 1 × 105 после этапа истощения. Из-за этого массивного уменьшения общего количества клеток удобно объединить собранные клетки по крайней мере от 2 до максимум 4 опухолей в одной трубке, прежде чем приступить к этапу обогащения. При этом достаточное количество клеток получали для инкубации с опухолеассированными фибробластными шариками и пропускали через одну разделительную колонку для получения конечного среднего значения 93% CD90.2+ CD45- клеток(таблица 2).
После посева на пластины тканевой культуры эти восстановленные клетки прикрепляются к пластику и обнаруживают большую веретенообразную морфологию, типичную для фибробластов(Рисунок 3A,B)и отличавуюся от опухолевых клеток 4T1(Рисунок 3D). Отсутствие объединения опухолей после истощения приводит к тому, что клеточный выход с опухолеассированными микрогравами фибробластов слишком низок для создания культуры. В других случаях, когда продолжительность и температура инкубаций с микробусами не поддерживаются тщательно, может произойти некоторое неспецифическое связывание. В таких случаях этапы обогащения были менее эффективными и более высокие проценты CD90.2- CD45+ и CD90.2- CD45- клетки восстанавливались вместе с CD90.2+ CAF (5,97 ± 1,5 и 16,75 ± 1,1 соответственно)(Рисунок 4 и Таблица 3). Эти загрязняющие клетки, вероятно, были ответственны за присутствие в культуре небольших клонов с различной морфологией(рисунок 4B,черные наконечники стрел), которые росли быстрее, чем CAF, и преобладали над первичной культурой CAF(рисунок 4C). Эти неоптимальные результаты подтвердили важность постоянной двойной проверки экспрессии CD90.2 и CD45, а также морфологии клеток в конце процесса обогащения и во время роста клеток в культуре.
Использование изолированных клеток для оценки потенциала CAF-таргетинга инженерных нанолекарственных веществ
Свежеизолированные CAF могут использоваться для нескольких применений, начиная от фундаментальных исследований до фармакологических исследований. Целью этой группы является разработка нанокезонов HFn, которые могут специально нацеливаться на CAF. HFn функционализировали специфическим фрагментом антитела антиФАП (HFn-FAP) при двух различных соотношениях белок:антитела (более низкий 1:1 и более высокий 1:5), и их связывание с КАФ было протестировано. Поскольку FAP использовался в качестве поверхностного биомаркера проопухолевых ЦАФ, принципиально важно было проверить экспрессию ФАП на изолированных КАФ(рисунок 3C). Выражение FAP было продолжено в течение 5 отрывков в культуре, чтобы подтвердить, что первичная культура CAF сохранила свои первоначальные характеристики.
Было обнаружено, что функционализация FAP на HFn способствует значительному сдвигу в сторону таргетирования CAF по сравнению с голым HFn, и более низкого количества антител (1: 1) было достаточно, чтобы наблюдать этот эффект(рисунок 5A). Однако это не наблюдалось с опухолевыми клетками 4T1, используемыми для создания модели опухоли in vivo, в которой голый HFn показал более высокое связывание, чем функционализированный HFn(рисунок 5B). Это, скорее всего, было связано с отсутствием сверхэкспрессии FAP в клетках 4T1 и преимущественного взаимодействия HFn с TfR1, который регулирует поглощение HFn в клетках, о чем широко сообщалось в этой группе27,33. Эти результаты подтверждают полезность использования первичных культур КАФ молочной железы для предварительного скрининга способности нацеливания наночастиц, предназначенных для борьбы с микроокружением опухоли.
Рисунок 1: Создание модели опухоли 4T1. Клетки (105 клеток на мышь) вводили в жировую прокладку молочной железы. Рост опухоли наблюдался на 5, 10, 15, 20, 25 и 30 днях после имплантации(А)путем измерения объема опухоли с помощью суппортов и(В)путем биолюминесцентной визуализации. Объемы опухоли и БЛИ выражаются вмм3 и количестве соответственно. Результаты сообщаются как среднее ± SEM (n=6). Репрезентативные изображения BLI, полученные через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 дней после имплантации клеток, подтверждают рост опухоли до 25-го дня, когда она, по-видимому, достигает плато. В последнюю точку анализа (30 дней) БЛИ не увеличивается по сравнению с 25 днем. Начиная с 20 дня, участки некроза и изъязвления начинают становиться видимыми в центральной части опухоли. Цветовая шкала: Мин = 1,194, Макс = 20,462. Сокращения: BLI = биолюминесцентная визуализация; SEM = стандартная погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Подготовка образцов опухоли и характеристика проточной цитометрии изолированных КАФ. Опухоли иссекались и уменьшались в(А)небольшие кусочки примерно 1–2 мм с помощью скальпеля; (B)одноклеточная суспензия после переваривания тканей и механической диссоциации иссеченной опухоли; (С)клеточная гранула, полученная после лизиса эритроцитов; (D)проточный цитометрический анализ экспрессии CD45 и CD90.2 в клетках, полученных после удаления эритроцитов и мертвых клеток,(E)после истощения нераковых фибробластов, и(F)после обогащения рак-ассоциированными фибробластами, где большинство клеток составляют CD90.2+ CD45- (синий прямоугольник). Сокращения: CAFs = связанные с раком фибробласты; CD = кластер дифференциации; ПЭ-А = площадь фикоэритрина; FITC-A = области изотиоцианата флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Морфологический анализ экспрессии CAFs и FAP. (A, B)Морфология CAF проверялась на протяжении всех проходов культуры с помощью оптической микроскопии (различные уровни слияния при пассаже 2 и пассаже 5) и сравнивалась с(D)4T1 опухолевыми клетками; Шкала баров = 10 мкм.(C)Экспрессия белка активации фибробластов (FAP) оценивалась методом проточной цитометрии в конце процесса выделения на собранных CD90.2+ CD45- клетках для подтверждения их молекулярных характеристик. Порог флуоресценции был установлен на незапятнанных контрольных клетках (красный график) для количественной оценки средней интенсивности флуоресценции и процента положительных клеток (FAP+) среди клеток, окрашенных антителами (синий график). Сокращения: CAFs = связанные с раком фибробласты; FAP = белок активации фибробластов; CD = кластер дифференциации; MFI = средняя интенсивность флуоресценции; Ab = антитело; FITC-A = площадь изотиоцианата флуоресцеина; FAP+ = FAP-положительные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пример неоптимального процесса изоляции КАФ. (A) Оценка проточной цитометрии после заключительной ступени выделения выявила наличие загрязняющих CD90.2- CD45+ и CD90.2- CD45- клеток. (B) Эти клетки можно рассматривать как клоны с небольшой круглой морфологией при посеве (черные наконечники стрелок и вставка в левом нижнем углу панели), которые(C)преобладали над CAF после третьего прохода в культуре. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: CAF = связанный с раком фибробласт; CD = кластер дифференциации; ПЭ-А = площадь фикоэритрина; FITC-A = области изотиоцианата флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Связывание наносокажей HFn на ЦАФ и 4T1. Наноказания HFn были флуоресцентно помечены FITC, функционализированы фрагментом антифап-антитела (HFn-FAP) при двух различных соотношениях белок-антитело (1:1 и 1:5) и инкубированы с(A)целевыми КЭФ и(B)4T1 клетками при 4 °C в течение 2 ч. Связывание оценивали с помощью проточной цитометрии. (A)Связывание HFn-FAP с CAF значительно увеличивается при концентрации обоих фрагментов антител в три раза по сравнению с голым HFn.(B),напротив, значительно более высокое связывание голого HFn наблюдалось в клетках 4T1, где связывание не усиливается распознаванием FAP. Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. p = 0,0003; °° p = 0,0021; °°° p = 0,0008. Сокращения: CAFs = связанные с раком фибробласты; FAP = белок активации фибробластов; HFn = рекомбинантный вариант тяжелой цепи ферритина человека, используемый в качестве голой наночастицы или сопряженный; HFN-FAP = наночастицы HFn, функционализированные переменной частью антифап-антитела, приготовленного при двух молярных соотношениях HFn:Fab@FAP, 1:1 и 1:5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Номер ячейки (среднее ± SD) | Общий выход извлечения (за проход) | |
| Иссеченная опухоль (удаление эритроцитов) | 1,27 x 108 ± 9,81 x 107 | 100% |
| Иссеченная опухоль (удаление мертвых клеток) | 3,01 х 106 ± 9,61 х 105 | 2.38% |
| Коктейль после истощения | 1,15 x 105 ± 4,95 x 104 | 0.11% (3.82%) |
| Постобогащение | 3,00 x 104 ± 1,2 x 104 | 0.027% (26.09%) |
Таблица 1: Общее количество клеток после каждого этапа выделения связанных с раком фибробластов.
| Распределение ячеек (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Иссеченная опухоль (удаление мертвых клеток) | 1.81 ± 0.98 | 10.78 ± 4.51 | 56.57 ± 14.05 | 28.20 ± 17.57 |
| Коктейль после истощения | 69.33 ± 16.75 | 0,14 ± 0,13 | 0,55 ± 0,63 | 39.89 ± 30.31 |
| Постобогащение | 93.14 ± 3.3 | 0,09 ± 0,1 | 0.09 ± 0.08 | 6.69 ± 3.4 |
Таблица 2: Распределение клеток по экспрессии CD90.2 и CD45 после каждого прохождения выделения связанных с раком фибробластов.
| Распределение ячеек (%) | CD90.2+ CD45- | CD90.2+ CD45+ | CD90.2- CD45+ | CD90.2- CD45- |
| Постобогащение (без объединения) | 75.80 ± 2.9 | 1.49 ± 0.4 | 5.97 ± 1.5 | 16.75 ± 1.1 |
Таблица 3: CD90.2 и CD45 экспрессия клеток, собранных после неоптимального эксперимента по выделению фибробластов, связанных с раком.
Discussion
CAF становятся ключевыми игроками в ремоделировании внеклеточного матрикса, способствуя прогрессированию метастазирования и ограничивая доступ к лекарственным средствам к опухолевой площадке34. Однако из-за их гетерогенности их роли все еще противоречивы — некоторые КАФ являются опухолегенными, тогда как некоторые другие подтипы, по-видимому, играют роль опухолеподавляющей. В этом контексте их изоляция может представлять чрезвычайный интерес, чтобы пролить больше света на их много обсуждаемую роль в прогрессировании рака, что будет иметь важные клинические последствия12,31. Кроме того, успешная экстракция CAF из моделей опухолей человека и доклинических мышей также облегчит разработку новых препаратов, нацеленных на CAF. В этой статье сообщается о методе эффективного выделения и культивирования первичных ЦАФ из сингенной доклинической модели рака молочной железы. Основываясь на опыте, три экспериментальных шага в основном влияют на успех протокола.
Первый работает быстро, чтобы избежать агрегации клеточных суспензий, связанных с риском свертывания в колонке и замедления оттока клеток: на самом деле, когда клетки, прошедшие через столбец, были сгруппированы вместе, вероятность неоптимального процесса изоляции увеличивалась, а конечные культуры содержали «загрязняющие» клеточные клоны. Второй - объединение клеток из разных опухолей после прохождения истощения, чтобы гарантировать достаточное количество клеток для прохождения на заключительном этапе обогащения. Последней критической проблемой является покрытие извлеченных клеток с высокой плотностью клеток, скорее всего, начиная с одной скважины из 24-скважинной пластины, чтобы стимулировать рост клеток и расширение колонии до 4-5 проходов. Если клетки были посеяны при низкой плотности, они расширялись на свободной поверхности и быстро переставали размножаться.
В нескольких исследованиях уже описаны методы экстракции CAF как человеческого, так и мышиного происхождения, чтобы изучить их роль в содействии развитию рака и инвазивности. Это было сделано при многих типах опухолей, включая рак молочной железы, меланому, холангиокарциному и аденокарциному поджелудочной железы35,36,37,38. Однако из-за отсутствия специфических маркеров CAF и их неоднородности результаты этих процессов все еще являются неоптимальными.
Здесь изолированные клетки были использованы для проверки способности НАЦЕЛИВАНИЯ CAF на нанокажей HFn, функционализированных с анти-FAP-целевыми элементами. Использование первичных культур CAF было значительным преимуществом, позволяющим валидировать наностратегию ex vivo с гораздо более простым и экономически эффективным экспериментом по связыванию, чем делать это непосредственно in vivo на этом предварительном этапе оптимизации нанонаругических средств.
В этом смысле тестирование ex vivo на ЦАФ может предшествовать экспериментам in vivo на животных, позволяя проводить скрининг и отбор наиболее перспективных наночастиц для оптимального нацеливания CAF. Представленная здесь модель CAF также может быть использована для предварительных исследований эффективности при загрузке наночастиц активными лекарственными средствами. Животные будут использоваться только позже для оценки биораспределения, фармакокинетики и исследований эффективности.
В настоящее время разрабатывается несколько нанолекарственных КАФ-таргетинга, таких как ферритиновые нанокажи для фотодинамической терапии при раке молочной железы и частицы на основе пептидов для доставки доксорубицина в моделях рака предстательной железы39,40. Тем не менее, не многие исследования были сосредоточены на выделении CAF в качестве клеточных платформ для оптимизации нанонарокарственных устройств.
Этот протокол имеет некоторые ограничения. Во-первых, это трудоемкий протокол, требующий подготовки и закупки нескольких реагентов и материалов. Во-вторых, из-за дефицита ЦАФ в опухоли молочной железы 4T1 их выход низкий. Эксперименты с наночастицами должны планироваться и проводиться, как только будет достигнуто необходимое количество клеток, так как первичные КАФ подвергаются старению и не могут поддерживаться в культуре в течение длительного времени. В заключение, этот метод выделения, культивирования и характеристики КАФ может стать мощным инструментом для ускорения разработки новых целевых наномедицин в борьбе с раком.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) в рамках проекта IG 2017-ID. 20172 – P.I. Corsi Fabio. SM признает Педиатрический клинический исследовательский центр «Ромео и Энрика Инверницци», который поддерживает ее позицию. AB благодарит AIRC (id. 20172 project) и Миланский университет за исследовательскую стипендию. Постдокторские и докторские стипендии LS и MS поддерживаются Миланским университетом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
| Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
| BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
| CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
| CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
| Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
| CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
| Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
| D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
| DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
| Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
| Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
| Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
| LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
| L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
| Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
| Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
| NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
| Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
| RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
| Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at - 20 °C. |
| Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
| TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
| Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
| T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
| Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
| 1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
| 15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
| 4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
| 50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |
References
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer. Breast. 30, 92-100 (2016).
- Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer. Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).
- Hui, L., Chen, Y.
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- LeBleu, V. S., Kalluri, R. A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact. Disease Models & Mechanisms. 11, (2018).
- Li, X. -Y., Hu, S. -Q., Xiao, L. The cancer-associated fibroblasts and drug resistance. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F.
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Costa, A., et al. Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer. Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).
- Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment. Advances Drug Delivery Reviews. 99, Part B 186-196 (2016).
- Chen, Q., et al. Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).
- Truffi, M., et al. Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).
- Tong, R., Langer, R.
- Kaps, L., Schuppan, D. Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers. Cells. 9 (9), 2027 (2020).
- Miao, L., et al. Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors. Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).
- Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. Fibroblast activation protein-α in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).
- Falvo, E., et al. Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin. Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).
- Truffi, M., et al. Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer. Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).
- Cai, Y., et al. Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size. International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).
- Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R.
- Mazzucchelli, S., et al. Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity. Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).
- Yu, Q., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy. Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).
- Mertens, J. C., et al. Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma. Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).
- Kovács, D., et al. Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts. Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).
- Sitia, L., et al. Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax. Cells. 10 (2), 328 (2021).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells. Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).
- Dvořánková, B., Lacina, L., Smetana, K. Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research. Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).
- Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages. Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).
- Sha, M., et al. Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Zhen, Z., et al. Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control. Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).
- Ji, T., et al. Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery. Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).
