Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Prøvepreparering til bioinformatikk Analyse av DNA-metylering: Assosiasjonsstrategi for fedme og relaterte trekkstudier

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/62598
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 4, 5, 1, 1, 6, 7, 8, 9, 6
1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Den nåværende studien beskriver arbeidsflyten for å håndtere DNA-metyleringsdata innhentet av mikroarrayteknologier. Protokollen viser trinn fra prøveforberedelse til dataanalyse. Alle prosedyrer er beskrevet i detalj, og videoen viser de betydelige trinnene.

Abstract

Fedme er direkte knyttet til livsstil og har vært forbundet med DNA-metyleringsendringer som kan forårsake endringer i adipogenesen og lipidlagringsprosessene som bidrar til utviklingen av sykdommen. Vi demonstrerer en komplett protokoll fra utvelgelse til epigenetisk dataanalyse av pasienter med og uten fedme. Alle trinnene fra protokollen ble testet og validert i en pilotstudie. 32 kvinner deltok i studien, hvor 15 personer ble klassifisert med fedme i henhold til Body Mass Index (BMI) (45,1 ± 5,4 kg / m2); og 17 personer ble klassifisert uten fedme i henhold til BMI (22,6 ± 1,8 kg/m2). I gruppen med fedme ble 564 CpG-nettsteder relatert til fettmasse identifisert ved lineær regresjonsanalyse. CpG-nettstedene var i promotorregionene. Differensialanalysen fant 470 cpgs hypometylerte og 94 hypermetylerte steder hos personer med fedme. De mest hypometylerte berikede veiene var i RUNX-, WNT-signalisering og respons på hypoksi. De hypermetylerte banene var relatert til insulinsekresjon, glukagonsignalering og Ca2+. Vi konkluderer med at protokollen effektivt identifiserte DNA-metyleringsmønstre og trekkrelatert DNA-metylering. Disse mønstrene kan være forbundet med endret genuttrykk, som påvirker adipogenese og lipidlagring. Våre resultater bekreftet at en overvektig livsstil kunne fremme epigenetiske endringer i menneskelig DNA.

Introduction

Store omics teknologier har blitt stadig mer brukt i studier av kroniske sykdommer. Et interessant trekk ved disse metodene er tilgjengeligheten av en stor mengde genererte data til det vitenskapelige samfunnet. Derfor har det oppstått et krav om å standardisere protokollene for å tillate teknisk sammenligning mellom studier. Den nåværende studien antyder standardisering av en protokoll for å innhente og analysere DNA-metyleringsdata, ved hjelp av en pilotstudie som et applikert eksempel.

Negative energiforbruk dominerer i moderne menneskelig livsstil, noe som fører til overdreven akkumulering av fettvev og følgelig utviklingen av fedme¹. Mange faktorer har økt fedme priser, som sedentarisme, høyt kalori dietter, og stressende rutiner. Verdens helseorganisasjon (WHO) anslo at 1,9 milliarder voksne var overvektige i 2016, noe som betyr at mer enn 20% av verdens befolkning har over 30 kg / m2 BMI2. Den siste oppdateringen av 2018 viste at forekomsten av fedme i USA var høyere enn 42%3.

Epigenetikk er den strukturelle tilpasningen av kromosomale regioner for å registrere, signalisere eller opprettholde endrede aktivitetstilstander4. DNA-metylering er en reversibel kjemisk endring i cytosin-guanosin dinukleotider (CpG-steder), som danner 5-metylcytosin-pG (5mCpG). Det kan modulere genuttrykk ved å regulere tilgangen til transkripsjonsmaskineriet til DNA5,6,7,8. I denne sammenhengen er det viktig å forstå hvilke CpG-nettsteder som er forbundet med fedmerelaterte egenskaper9. Mange faktorer kan støtte eller forhindre stedsspesifikk DNA-metylering. Nødvendige enzymer for denne prosessen, som DNA-metyltransferaser10 (DNTMer) og ti-elleve translokasjoner (TETer), kan fremme DNA-metylering eller demetylering under miljøeksponeringer11.

Tatt i betraktning den økende interessen for DNA-metyleringsstudier de siste årene, har det å velge den mest hensiktsmessige analysestrategien for å svare nøyaktig på hvert spørsmål vært en viktig bekymring for forskere12,13,14. 450K DNA-metyleringsmatrisen er den mest populære metoden, brukt i mer enn 360 publikasjoner14 for å bestemme DNA-metyleringsprofilen. Det kan bestemme metylering av opptil 485 000 cpgs lokalisert i 99% av kjente gener15. Imidlertid har denne matrisen blitt avviklet og erstattet med EPIC, som dekker 850 000 CpG-nettsteder. Den nåværende protokollen kan brukes for både 450K og EPIC16,17,18.

Protokollen presenteres trinn for trinn i figur 1 og består av følgende trinn: populasjonsvalg, prøvetaking, eksperimentforberedelse, DNA-metyleringsrørledning og bioinformatikkanalyse. En pilotstudie utført i vårt laboratorium er demonstrert her for å illustrere trinnene i den foreslåtte protokollen.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for den presenterte protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Etikkkomiteen ved Ribeirão Preto Medical School University Hospital ved Universitetet i São Paulo (HCRP-USP) godkjente studien (CAAE:14275319.7.0000.5440). Deltakerne signerte samtykkeskjemaet, og alle prosedyrer ble gjennomført etter Helsinkideklarasjonen.

1. Befolkning og prøvetaking

  1. Rekrutter deltakere med BMI >30 kg/m2 for studien. For den nåværende studien ble 32 kvinner fra en blandingsbefolkning19 mellom 18 og 60 år rekruttert.
    MERK: I HCRP-USP ble det observert høyere fedme hovedsakelig hos kvinner20. Deltakere med fedme, med BMI ≥30 kg/m2 (n = 15), ble rekruttert fra metabolske sykdommer poliklinikk i HCRP-USP. Deltakerne uten fedme, med BMI mellom 18,5 kg/m2 og 24,9 kg/m2 (n = 17), ble rekruttert fra andre klinikker og hadde ikke alvorlige sykdommer; kliniske data er vist i tabell 1.
  2. Ekskluder kvinner som er gravide, ammende mødre, røykere og konsumere alkohol.

2. Antropometri og kroppssammensetning

  1. Mål vekten til deltakerne ved hjelp av en 200 kg digital antropometrisk skala. Sørg for å fjerne sko og overflødige klær.
  2. Vurder høyde ved hjelp av et stadiometer med en 0,5 cm gradering. Deltakerne ble bedt om å stå barbeint, føttene sammen og armene ved siden av dem21.
  3. Samle inn fettmasseinformasjonen (FM) ved hjelp av en elektrisk bioimpedans. Etter 12 timers faste, vurder med en tom urinblære. Plasser deltakerne i liggende stilling, med ben fra hverandre og armene parallelt uten å berøre kroppen. Be deltakerne om å fjerne alt metalltilbehør22.
  4. Oppnå midjeomkretsen (WC) ved hjelp av et uutslettelig målebånd med en 0,1 mm gradering. Båndet ble plassert horisontalt rundt midt midjen, like over hoftebenene. Målingen skjedde like etter et pust ut. Ifølge Centers for Diseases Control and Prevention (CDC) er WC-avskjæringen for kvinner 88 cm23.

Tabell 1: Populasjonskarakteristikker. Alle variablene var parametriske (p > 0,05, Shapiro Wilk), og forskjeller ble evaluert ved hjelp av en uavhengig t-test, der p < 0,05 ble ansett som signifikant. *p < 0,0001. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

3. Innsamling av biologisk materiale

  1. Samle perifert blod etter 12 timers faste, som beskrevet tidligere24.
  2. Samle 4 ml av hele blodprøvene i oppsamlingsrør med antikoagulant (f.eks. EDTA) og oppbevar dem på is for transport.

4. DNA-ekstraksjon

  1. Sentrifuger hvert rør som inneholder blodet på 2000 x g i 10 min. Samle rundt 300 μL av den buffy kappen (hvit interfase).
  2. Trekk ut DNA fra perifert blod ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig instrument (se Materialtabell), som beskrevet tidligere25. Elute DNA i 480 μL ultrapure H2O.
  3. Vurder DNA-konsentrasjon og kvalitet ved hjelp av et fluorometer. Integriteten ble evaluert ved hjelp av en 1% agarose gel analyse25. Oppbevars i fryser ved -80 °C.

5. Forberedelse før metyleringsanalyse

  1. Forsikre deg om at prøvene har minimum DNA-konsentrasjon (500 ng er den ideelle første inngangen til å starte), men fortynning kan variere mellom prøver i dette trinnet.
  2. Noen reagenser er ikke inkludert i mikroarray kit26, så kjøp dem separat27.
  3. Sjekk om settet inneholder alle reagenser som brukes under prosedyren; de er uerstattelige. Kontroller utløpsdatoen for alle reagensene. Forsikre deg om at andre reagenser og løsninger som ikke leveres i settet også er tilgjengelige (95% formamid / 1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, absolutt etanol, 2-propanol).
    FORSIKTIG: Formamid er et flyktig reagens; kvaliteten på resultatene kan forbedres hvis produktet er friskt. Integriteten og kvaliteten på formamid og absolutt etanol anses som kritisk fordi de kan påvirke fargingsprosessen foreslått av produsenten. De valgte alkoholene må være ultrarent produkter som er spesifikke for molekylærbiologisk analyse.
  4. Når mikroarraysettet er anskaffet, laster du ned Chips Decode Maps (DMAPer). Disse filene er tilgjengelige på produsentens nettsted 24-48 timer etter at settet er sendt og er utelukket på utløpsdatoen28. For å laste ned de nevnte filene, utfør trinnene nedenfor.
    1. Kontroller at en datamaskin med Internett-tilgang er tilgjengelig. Utfør nedlastingen ved hjelp av Software Decode File Client.
    2. Før du installerer programmet, må du kontrollere at datamaskinen har utgående og innkommende tilgang gitt av institusjonen; Dekodingsfilklienten har ikke sikkerhetsbegrensninger.
    3. Logg inn på Decode File Client-programvaren ved hjelp av alternativet Access by BeadChip. Denne påloggingen utføres ved hjelp av MyIllumina bruker-ID og passord. Registrering på denne siden kreves28.
    4. Etter å ha logget på Decode File Client, skriv inn informasjonen som er oppført nedenfor i deres respektive felt på programvarens hjemmeside28: Liste over strekkoder; Liste over boks-IDer; Bestillingsnummer (bestilling); og Salgsordrenummer (husk å ikke ta med bokstavene som kommer etter tallene).
    5. Velg DMAPene som skal lastes ned i henhold til strekkodenummeret i kjøpsboksen, og angi målet i dialogboksen for å lagre DMAPene.
    6. Klikk på knappen for å starte nedlastingen.
      MERK: På slutten av nedlastingen må du sørge for at de nedlastede mappene ikke er tomme og lagre filene trygt, da de vil være nødvendige for det siste trinnet for å konvertere eksperimentene til Intensity Data Files (IDAT-filer). Etter utløpsdatoen kan Illumina fjerne DMAPs data fra sin online database.

6. DNA-metyleringsrørledning

MERK: DNA-metyleringseksperimentet er delt inn i 4 dager (figur 1). Følg produsentens anbefalinger og spesifikasjoner for å oppnå nøyaktige resultater.

  1. Dag 1: Bisulfitt behandling
    1. Begynn med å denaturere 500 ng genomisk DNA, og legg deretter til konverteringsreagensene. For å utføre dette trinnet, følg anbefalingene fra bisulfitt- og mikroarraysettene29.
    2. Behandle det denaturerte DNA-et med 130 μL bisulfittkonverteringsreagens ved standardkonsentrasjonen levert av produsenten.
    3. Inkuber røret i en termosykler i 16 sykluser ved 95 °C i 30 s og 50 °C i 1 time. Ramp ned termosykleren til 4 °C i 10 min.
    4. Utfør vasketrinnet ved å legge til 100 μL av vaskebufferen og deretter sentrifugere med full hastighet i 30 s. Konsentrasjonen er ikke gitt i brukerhåndboken, og produsenten standardiserer volumene.
      MERK: Dette reagenset leveres med settet og trenger ikke fortynnes eller tilberedes.
  2. Dag 2: Forsterkning - Metyleringsanalyse, Manuell protokoll
    1. Forvarm hybridiseringsovnen til 37 °C og la temperaturen likevekte.
    2. Påfør en strekkodeetikett på en 0,8 ml mikroplate.
    3. Tine forsterkningsreagensene (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix og Multi-Sample Amp Master Mix) ved romtemperatur (disse reagensene følger med settet og trenger ikke å fortynnes eller tilberedes). Utfør deretter en mild inversjon minst 10x til rørenes hele innholdet er blandet.
    4. Dispenser 20 μL av multiprøveforsterkningsblandingen 1 (MA1) i platens brønner.
    5. Overfør 4 μL av DNA-prøven fra bisulfitt ombygd plate til tilsvarende brønner på 0,8 ml plate. På dette tidspunktet registrerer du den opprinnelige DNA-prøvens ID på laboratoriets sporingsskjema som tilsvarer platebrønnene.
    6. Dispenser 4 μL 0,1 N NaOH i hver brønn på platen som inneholder Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) og DNA-prøven.
    7. Forsegle platen med en plastforsegling.
    8. Virvel platen for å blande reagensene med prøvene ved 1600 rpm i 1 min. Inkuber i 10 min ved romtemperatur og fjern forsiktig forseglingen.
    9. Pipette 68 μL tilfeldig primerblanding (RPM) i hver brønn på platen. Pipette 75 μL multi-sample amp master mix (MSM) i hver brønn på platen (uten å fjerne den forrige løsningen). Bruk en ny forsegling for å dekke platen.
      MERK: Pass på at du kombinerer brønnene med platen og orienterer den riktig.
    10. Virvel den forseglede platen ved 1600 rpm i 1 min. Inkuber i hybridiseringsovnen i 20-24 timer ved 37 °C.
  3. Dag 3: Hybridisering - Metyleringsanalyse, Manuell protokoll
    1. Forvarm blokken til 37 °C.
    2. Tine innholdet i røret ved romtemperatur. Inverter fragmenteringsløsningen (FMS) forsiktig og forsiktig med minst 10x for å blande innholdet grundig.
    3. Fjern platen forsiktig fra hybridiseringsovnen. Puls-sentrifuger platen ved 280 x g.
    4. Fjern nå forseglingen fra platen. I hver brønn på platen som inneholder en prøve, tilsett 50 μL fragmenteringsløsning (FMS) og forsegle platen igjen. Virvel platen ved 1600 rpm i 1 min.
    5. Sentrifuger platen ved 280 x g i noen sekunder (utfør pulssentrifugering). Plasser deretter den forseglede platen på varmeblokken ved 37 °C i 1 time.
    6. Hvis det ble besluttet å pause eksperimentet og fryse platen, tin den ved romtemperatur, og sentrifuger den ved 280 x g. Hvis den ikke er frosset, hopper du over dette trinnet og går til trinn 6.3.7.
    7. La varmeblokken forvarmes til 37 °C.
    8. La vaskebufferen tine ved romtemperatur. Når det er tinet, inverter det minst 10x for å blande innholdet.
    9. Fjern forseglingen fra platen.
    10. Tilsett 100 μL utfellingsløsning (PM1) i hver brønn på platen som inneholder prøver.
    11. Forsegle platen igjen med forseglingen.
    12. Virvel platen ved 1600 rpm i 1 min.
    13. Inkuber ved 37 °C i 5 minutter.
    14. Plasser deretter i puls sentrifugen på 280 x g i 1 min.
      MERK: Still sentrifugen på 4 °C for neste trinn.
    15. Fjern forseglingen forsiktig fra platen og kast den.
    16. Tilsett 300 μL 2-propanol (100%) i hver brønn som inneholder prøven.
    17. Forsegle platen med stor forsiktighet ved hjelp av en ny forsegling. Pass på at du ikke rister på tallerkenen.
    18. Snu platen minst 10x, bland hele innholdet.
    19. Inkuber ved 4 °C i 30 minutter.
    20. Sentrifuge ved 3000 x g ved 4 °C i 20 minutter.
      MERK: På slutten av trinn 6.3.20, fjern umiddelbart sentrifugeplaten.
    21. Fjern forseglingen fra platen og kast den.
    22. Snu platen raskt og tøm væsken på en pute for å kaste supernatanten. Deretter treffer du platen i et tørt område på et papirhåndkle for å tømme væsken.
    23. Trykk godt flere ganger i 1 min eller til alle brønnene er fri for væske.
    24. La platen være invertert og avdekket i 1 time ved romtemperatur.
      MERK: Det forventes å se blå pellets på bunnen av brønnene.
    25. Forvarm hybridiseringsovnen til 48 °C.
    26. Slå på varmeblokken for å forvarme. Tillat 20 min for denne prosessen.
    27. Tine resuspension, hybridisering og vaskeløsning ved romtemperatur. Inverter minst 10x. Kontroller at det ikke er salt utfelt i løsningen.
    28. Tilsett 46 μL resuspension, hybridisering og vaskeoppløsning (RA1) i hver brønn på platen.
      MERK: Eventuelle gjenværende reagenser må reserveres for fargings- og hybridiseringstrinnene.
    29. Påfør forseglingen på platen. Bruk en aluminiumsforsegling for å dekke platen. Hold fast for å utføre forseglingen jevnt.
    30. Sjekk om alle brønnene er trygt lukket for å unngå fordampning.
    31. Plasser forsiktig den nylig forseglede platen i hybridiseringsovnen og inkuber ved 48 °C i 1 time.
    32. Virvel platen ved 1800 rpm i 1 min.
    33. Puls sentrifuge ved 280 x g.
    34. Overfør platen til varmeblokken ved 95 °C i 1 time.
    35. Forbered hybridiseringskamrene (Hyb) ved å plassere dem sammen. Dispenser 400 μL fuktbuffer (PB2) i reservoarene i Hyb Chambers. Sett på lokket umiddelbart.
    36. Legg hver prøve fra platen i prøveinngangsåpningen på mikroarrayen.
    37. Legg Hyb Chamber-innsatsene som inneholder mikroarrayene, i hybkammeret. Lukk hybkammeret på tvers for å unngå mulig forskyvning av hybkammeret.
      MERK: Hyb Chambers må inkuberes ved 48 °C i minst 16 timer, men ikke mer enn 24 timer.
  4. Dag 4: Farging - Metyleringsanalyse, Manuell protokoll
    1. Resuspend fargeløsningen 4 med 330 ml 100% EtOH, og oppnå et endelig volum på 350 ml. Rist fargeløsningen 4 flasken kraftig for å sikre fullstendig resuspensasjon. Oppbevars ved romtemperatur.
      MERK: Fargingsoppløsning 4 kan oppbevares i opptil 2 uker ved en temperatur mellom 2 °C og 8 °C.
    2. Fjern kamrene fra hybridiseringsovnen og la dem avkjøles på benken i 30 minutter før åpning.
    3. Mens Hyb Chamber kjøler, fyll to vaskebeholdere med vaskebuffer (200 ml per vaskebeholder). Husk å merke hver beholder som "Vaskebuffer" (PB1 og PB2).
    4. Fyll tilbehøret for mikroarrayjustering med 150 ml vaskebuffer.
    5. Skill plastavstandsstykkene og rengjør om nødvendig glasset.
    6. For å vaske mikroarray lysbildene, fest trådsløyfen til rutenettet og senk drypputstyret i beholderne med 200 ml vaskebuffer i totalt 10x.
    7. Fjern alle innsatser fra hybridiseringskammeret, og fjern hver matrise fra innsatsene. Fjern forseglingen.
      MERK: Ikke berør de eksponerte matrisene under fjerning.
    8. Mens du fjerner mikroarray lysbildene fra hybridiseringskammeret, vær forsiktig så du ikke søler noe.
    9. Vask mikroarrayene i vaskebufferløsningen (PB1) langsomt og lett, og beveg deg opp og ned 10x. Flytt til en frisk PB1-løsning og utfør vasken ved å sakte flytte mikroarrayene 10x opp og ned i løsningen.
    10. Fjern mikroarrayen fra beholderen og bekreft fraværet av rester.
    11. Bruk et gjennomsiktig avstandsstykke øverst i hver mikroarray og før avstandsstykkene til de tilsvarende posisjonene.
      MERK: Pass på at du bare bruker de gjennomsiktige avstandsstykkene, ikke de hvite.
    12. Plasser justeringslinjen på justeringstilbehøret.
    13. Plasser en glass bakplate på toppen av den klare avstandsstykke; pass på å dekke hele mikroarrayen. Fest deretter metallklemmer til strømningskamrene. Bruk om nødvendig saks for å trimme endene av strømningskammerets avstandsstykker.
    14. Vask straks hybridiseringskammerreservoarene ved hjelp av ddH2O og skrubb med en liten rengjøringsbørste. Ikke la det være noen fuktighetsbuffer i reservoaret.
    15. Gå til neste trinn som er ansvarlig for utvide- og fargemikroarray.
      MERK: La alle strømningskamrene være horisontalt montert på laboratoriebenken. Bare håndter dem på nytt når hele fargingstrinnet er klart. Varm opp resuspension, hybridisering og vaskeoppløsning til en temperatur mellom 20 °C og 25 °C. Bland forsiktig til ingen krystall er sett i løsningen.
    16. Plasser reagensene i et stativ i rekkefølge. Hvis noen er frosset, la dem stå ved romtemperatur og snu dem deretter minst 10x for å blande løsningene.
    17. Fyll vannsirkulasjonen til riktig nivå.
    18. Slå på pumpen og sett temperaturen til 44 °C.
    19. Fjern eventuelle bobler som er festet til kammerstativet.
    20. Utfør tester på kammerstativet ved hjelp av en temperatursonde. Alle testede steder må være mellom 44 °C ± 0,5 °C.
      MERK: Følgende trinn må utføres uten avbrudd.
    21. Når stativet når en temperatur på 44 °C, plasserer du raskt hver montering i strømningskammeret.
      MERK: For følgende trinn, pipette alle reagenser inn i bakglassplaten.
    22. Pipette 150 μL resuspension, hybridisering og vaskeoppløsning (RA1). Deretter inkuberer du i 30 min. Gjenta dette trinnet totalt 5x.
    23. Pipette 450 μL fargeløsning 1 (XC1) og inkuberes i 10 min.
    24. Pipette 450 μL fargeløsning 2 (XC2) og inkuberes i 10 min.
    25. Pipette 200 μL av Tofarget Forlengelse Master Mix (TEM) og inkubere i 15 min.
    26. Pipette 450 μL av 95% formamid/1 mM EDTA og inkuber i 1 min. Gjenta to ganger.
    27. Inkuber i 5 min.
    28. Reduser temperaturen på kammerstativet til 32 °C (angitt på Superior Two-Color Master Mix).
    29. Pipette 450 μL Flekkoppløsning 3 (XC3) og inkuber i 1 min. Gjenta 1x.
    30. Vent til stativet i kammeret når riktig temperatur.
      MERK: Hvis du vil lese mikroarraybildet umiddelbart etter fargeleggingsprosessen, slår du på skanneren på dette stadiet.
    31. Nå dispenser 250 μL superior tofarget master mix (STM), etterfulgt av en 10 min inkubasjon.
    32. Deretter dispenserer du 450 μL flekkoppløsning 3 (XC3), etterfulgt av 1 min inkubasjon. Gjenta 1x.
    33. Vent i 5 min og tilsett deretter 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) og inkuber i 10 minutter.
    34. Nå dispenser 250 μL superior tofarget master mix (STM), etterfulgt av en 10 min inkubasjon.
    35. Deretter dispenserer du 450 μL flekkoppløsning 3 (XC3), etterfulgt av 1 min inkubasjon. Gjenta 1x.
    36. Vent i 5 min.
    37. Tilsett 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) og inkuber i 10 min.
    38. Tilsett 450 μL flekkmikroarrayoppløsning 3 (XC3) og inkuber i 1 min, og gjenta deretter på nytt.
    39. Vent i 5 min.
      MERK: Gjør følgende repetisjonsplan: Trinn 6.4.34., Trinn 6.4.35. og trinn 6.4.36.; Trinn 6.4.37., 6.4.38., og trinn 6.4.39.; Trinn 6.4.34., Trinn 6.4.35., og trinn 6.4.36.
    40. Fjern nå strømningskamrene umiddelbart fra stativet og plasser dem forsiktig horisontalt på laboratoriebenken. Kontroller at temperaturen er omgivelsestemperatur.
    41. 6.4.41.Plasser 310 ml vaskeoppløsning (PB1) for hver mikroarray i en vaskebeholder.
    42. Fjern metallklemmene og glasset, og til slutt mikroarray.
    43. Plasser mikroarrayene på et fargestativ og legg dem i vaskebeholderen som inneholder 10x PB1-oppløsning. Forsikre deg om at strekkodene vender bort fra den som håndterer dem, og at alle mikroarrayene er nedsenket.
    44. Beveg deg sakte og lett med opp- og nedbevegelser 10x. Mikroarrayen bør fjernes helt fra løsningen før den nedsenkes igjen. La den deretter forbli nedsenket i 5 min.
    45. Rist flekkløsningen 4 (XC4) reagens kraftig for å sikre total resuspensasjon. Plasser 310 ml XC4 i en vaskebeholder.
      MERK: Ikke la oppløsningen sitte i vaskebeholderen i mer enn 10 min.
    46. Flytt fargestativet lett til den andre beholderen med XC4.
    47. Beveg deg sakte og lett med opp- og nedbevegelser 10x. Påse at mikroarrayen fjernes helt fra løsningen før den nedsenkes igjen.
    48. La deretter mikroarray forbli nedsenket i 5 min.
    49. Flytt fargelegget ut av løsningen og legg det i en rørholder med strekkodene vendt opp.
    50. Fjern mikroarrayen forsiktig ved hjelp av låsestøtter og legg dem på en hylle for å tørke.
    51. Tørk dem med vakuumtørkeren i 50-55 min ved 675 mm Hg (0,9 bar).
    52. Rengjør baksiden av hver mikroarray ved hjelp av EtOH.
      FORSIKTIG: Unngå å berøre stripene, og ikke la EtOH dryppe på stripene på noen måte.
    53. Fortsett å avbilde mikroarrayen.
    54. Oppbevar mikroarrayen forsiktig i en oppbevaringsboks ved romtemperatur.
      MERK: Mikroarraybilder må tas innen 72 timer.

7. Bioinformatikk analyse

MERK: Det er nødvendig å endre noen attributter av typen mikroarray (f.eks. matrisetype = "450k" bør erstattes av matrisetype = "EPIC"). Forfatteren av ChAMP-datasamlebåndet beskriver i detalj alle felt som skal endres for å analysere matriser på Bioconductor-siden i pakken30.

  1. Eksempel på ark
    1. Overfør IDAT-filene til datamaskinen for å fortsette med bioinformatikkanalyse31. Opprett et eksempelark for å utføre dataanalysen31.
      MERK: Tre kolonner er avgjørende for denne regnearkfilen. Den første er Sample_name. Denne kolonnen må inneholde navnene eller kodene som brukes til å identifisere eksemplene. Den andre er Sentrix_position. Denne kolonnen plasserer den tilsvarende R01C01 av prøvene, der R01 er ansvarlig for brikkeraden og kolonnen det refereres til som C01. Den tredje essensielle kolonnen er Sentrix_ID, og den er ansvarlig for å motta nummeret som identifiserer mikroarrayen. Pass på at du setter de riktige tallene. Det er mulig å legge til annen informasjon i eksempelarket som variabelverdier. I det nåværende eksperimentet ble data fra metallanalysen inkludert.
  2. ChAMP-rørledning
    1. Installer RStudio (V.4.0.2) på datamaskinen for å utføre analysen30.
      MERK: Kontroller at datamaskinen har minst 8 G RAM. Dataanalyse vil slite eller krasje med en lavere mengde RAM.
    2. Etter installasjon åpner du RStudio og installerer ChAMP Bioconductor-pakken30 ved hjelp av den respektive kommandolinjen (se Tilleggsmateriale 1).
      MERK: Hvis det oppstår feil på slutten av installasjonen, installerer du de nødvendige ChAMP-bibliotekene manuelt, en etter en26.
    3. Nå importerer du rådataene og utfører analysen. Se tilleggsmateriale 1.
      champ.load() importerer rådataene og gjør filtreringsprosessen, unntatt sonder med lav deteksjonspval, multihit-nettsteder, ikke-CG-sonder, CpG-nettsteder i nærheten av SNPer og CPG-er som ligger i seksuelle kromosomer.
      champ.impute() utfører KNN-imputering som standard.
      Champ. QC henter grafer for datakvalitet (f.eks. graf for tetthetsplott).
      Champ. SVD evaluerer satsvise effekter basert på angitte metadata i eksempelarket.
      champ.refbase() utfører celletypeestimering og rettelse.
      Champ. DMP( ) henter differensialt metylerte posisjoner og trekktilknytninger som fettmasse for å sjekke DNA-metylering mellom grupper og endre parametrene, som vist i Tilleggsmateriale 1.
  3. Berikelse (streng-DB)
    MERK: Funksjonell berikelse brukes til å utlede de biologiske funksjonene til et sett med gener.
    1. Hvis du vil berike data i en streng, velger du listen over mål du vil berike og bruke som inndata fra: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. For organisme velger du homo sapiens og trykker på Søk-knappen.
    3. For å navigere gjennom berikelsen, klikk på Analyse-knappen.
  4. GEO-innsending
    1. Deponer dataene i et offentlig depot som NCBI's GEO. For dette, registrer deg for innsenderkontoen.
      MERK: Fullfør GEO-innsendingen (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) ved å laste ned metadataarket med beskrivende informasjon og protokoller for det totale eksperimentet og individuelle prøver. GEO arkivinnsendinger kan opprettes i hvilken som helst regnearkprogramvare. Deretter legger du til rådatafilen som genereres fra cellevokterantallskriptet for alle biblioteker, i mappen. IDAT og tilknyttede filer eller et matriseregneark inneholder ikke-normaliserte data. Den tredje mappen er de behandlede datafilene. Matrisetabellen er et regneark som inneholder de endelige, normaliserte verdiene som kan sammenlignes på tvers av rader og prøver, og helst behandlet som beskrevet i et medfølgende manuskript.
    2. Plasser behandlede datafiler generert fra cellevokterantallskriptet for alle biblioteker i katalogen. Bruk GEO-innsenderens FTP-serverlegitimasjon til å overføre mappen som inneholder alle tre komponentene.

Representative Results

Etter bruk av ChAMP-rørledningen ble 409 887 sonder vurdert i analysen etter alle filtre (ukvalifiserte cpger, ikke-CG-sonder, CpG nær SNPer, multihit-nettsteder og CPG-er relatert til XY); en ordning er representert i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Rørledning av bioinformatikkanalysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Videre viste tetthetsplottet at alle prøver hadde lignende tettheter av betadistribusjonen relatert til kvalitetskontrolltrinnene. Denne analysen evaluerer fordelingen av betaverdier og påpeker om det finnes prøver som må utelukkes. I denne bunken ble ingen eksempler utelukket basert på denne analysen.

Figure 3
Figur 3: Betaverditetthetsplott oppnådd med ChAMP-pakken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

SVD-analysen (Singular Value Decomposition) ble brukt til å verifisere hovedkomponentene som signifikant påvirket variasjonen i DNA-metyleringsdataene. Dataene viste at BMI, WC (p < 1e10-5) og FM (p < 0,05) hadde en signifikant effekt på datavariabiliteten (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Singular value decomposition analysis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Celletypeestimering viste at både naturlige morderceller (NK) og B-celler var høyere hos overvektige kvinner (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Cellefraksjoner estimert etter Housemans metode. Gran: granulocytt. CD4T: hjelper T-celle, lymfocytt. CD8T: cytotoksisk T-celle, lymfocytt. Mono: monocytt. B Celle: B lymfocytt. NK: naturlige morderceller, lymfocytter. *p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

DNA-metyleringsnivåer mellom overvektige og ikke-overvektige kvinner var forskjellige før og etter celle-type korreksjon. Før DNA-metyleringsdatakorreksjon for celletyper ble 43 463 differensialt metylerte posisjoner (DMPer) observert, og 3329 cpgs forble signifikante etter. 445 CpG-anlegg var i intergene regioner (IGR), og 2 884 var i genic regioner, med de fleste i promotorregionen (n = 1438). Fordelingen langs alle regioner var TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), første exon (n = 273), kropp (n = 724) og 3'UTR (n = 59). Tatt i betraktning Δβ-verdier <-0,05 og >0,05, ble 162 cpgs hypometylert og 576 hypermetylert hos overvektige sammenlignet med ikke-overvektige individer (figur 6). Dataene er tilgjengelige i GEO-databasen under registerkoden GSE166611.

Figure 6
Figur 6: Differensialt metylerte posisjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Det er mulig å vurdere ulik metylering mellom grupper og finne CpG-lokaliteter knyttet til spesifikke trekk ved metyleringsstudier. For fettmassestudier ble det funnet 13 222 CpG-nettsteder. 6159 cpg i promotorregionen var relatert til fettmasse, med 470 hypermetylerte og 94 hypometylerte (figur 7), og de respektive genene ble beriket (tabell 2).

Figure 7
Figur 7: Promotorregioner av hypometylerte og hypermetylerte gener, uavhengig relatert til fettmasse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 2: Funksjonell berikelse av genene fra de differensialt metylerte CpG-anleggene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsmateriale 1: Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

DNA-metyleringskjeder er de mest brukte metodene for å få tilgang til DNA-metylering på grunn av deres nytte-kostnadsforhold14. Den nåværende studien beskrev en detaljert protokoll ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig mikroarrayplattform for å evaluere DNA-metylering i en pilotstudie utført i en brasiliansk kohort. De oppnådde resultatene fra pilotstudien bekreftet effektiviteten av protokollen. Figur 3 viser utvalgskomparabiliteten og den fullstendige bisulfittkonverteringen32.

Som et kvalitetskontrolltrinn anbefalte ChAMP-algoritmen utelukkelse av CpGs-nettsteder under filtreringsprosessen. Målet med å ekskludere sonder er å forbedre dataanalysen og eliminere skjevheter. Cpgs av lav kvalitet (p-verdier lavere enn 0,05) ble fjernet for å eliminere eksperimentell støy i datasettet. Målene forble passert i tetthetsplottanalysen. Zhou33 beskrev viktigheten av å filtrere CPG-er i nærheten av SNPer for å unngå uoverensstemmelser, feiltolkning av polymorfiske cytosiners metylering og forårsake bryterfarge av type I-sondedesign34. Også, som XY kromosomer er differensialt påvirket av avtrykk, Heiss og Just35 forsterket viktigheten av å filtrere disse sondene fordi, hos kvinner, problemene med hybridisering kan være forvirrende faktorer35.

DMAPs utløpsdato, formamid-åpningsdatoen, den analytiske kvaliteten på det absolutte etanolet og totalt antall leukocytt anses som kritiske trinn i protokollen.

Videre, ifølge våre observasjoner, er celletypeestimering avgjørende for å utføre bioinformatikkanalysen. Houseman-metoden utfører celletypeestimering som beskrevet i Tians studie30. Denne metoden er basert på 473 spesifikke CpG-områder som kan forutsi prosentandelen av de viktigste celletypene, for eksempel granulocytter, monocytter, B-celler og T-celler36. Vi brukte den anbefalte funksjonen "myRefbase" fra ChAMP-pakken. Etter beregningen justerer ChAMP-algoritmen betaverdiene og eliminerer denne skjevheten fra datasettet. Dette trinnet er avgjørende i studier fokusert på fedme fordi denne befolkningen har en betydelig forskjell i hvite blodlegemer på grunn av deres kroniske inflammatoriske tilstand.

Vi endret bare det opprinnelige hettekartet for den vanlige PCR-forseglingen angående metodeendring og feilsøking. Etter hver sentrifugeringsprosess ble forseglingen endret for en ny. Vi kunne ikke bruke standard varmeforsegling og tilpasset den ved hjelp av aluminiumsfolie rundt platen.

Selv om kommersielle analyser har blitt ansett som en gullstandard for epigenetiske studier, kan en begrensning av protokollen være spesifisiteten til reagensene og utstyret fra et unikt merke37,38,39,40. En annen begrensning er mangelen på indikatorer som tillater identifisering av riktig fremdrift av eksperimentet41.

Standardiseringen av den nåværende protokollen representerer en flott guide for epigenetisk forskning, redusere menneskelige feil under prosessen og tillate vellykket dataanalyse og sammenlignbarhet mellom ulike studier.

Ifølge våre resultater er DNA-metyleringseksperimenter egnet for studier som sammenligner individer med og uten fedme43. Den foreslåtte bioinformatikkanalysen ga også data av høy kvalitet og kunne vurderes i store studier.

Ved hjelp av SVD-analysen identifiserte vi at fedmerelaterte egenskaper (BMI, WC og FM) påvirket variasjonen i DNA-metyleringsdata. Som et betydelig resultat indikerer celletypeestimeringen at både naturlige morderceller (NK) og B-celler var høyere hos kvinner med fedme enn hos kvinner uten fedme (figur 5). De høyere tellingene av disse cellene kan forklares av den lavverdige inflammatoriske tilstanden til disse individene44. Vi observerte at pasienter med fedme har hypo- og hypermetylerte cpgs i promotorregioner av gener forbundet med fettmasse. De fleste stedene var hypometylerte, noe som kunne være relatert til den naturlige økningen i reaktive oksygenarter (ROS) nivåer hos disse individene. Denne oksidative stresstilstanden kan fremme guaninperturbance på dinukleotidstedet, som danner 8-hydroksy-2'-deoksyguanosin (8-OHdG), noe som resulterer i et 5mCp-8-OHdG dinucleotidsted, og forårsaker rekruttering av TET-enzymer. Alle disse hendelsene kan være ansvarlige for å fremme DNA-hypometylering og hypermetylering ved ulike virkningsmekanismer45.

I tillegg ser adipogenesehastigheten ut til å øke hos personer med fedme, med ca. 10% av nye celler til gamle celler46,47. Epigenetiske bidrag, som understreker det overvektige miljøet, kan endre cellenes spredning og differensieringshastigheter, og favoriserer utviklingen av fettmasse48. Epigenetiske endringer kan også påvirke adipogene programmer, legge til rette for eller begrense utviklingen. Primære transkripsjonsfaktorer (PPARγ eller C / EBPα) eller montering av multiproteinkomplekser, plassert i nedstrøms promotorregioner som drives ved å inkludere eller ekskludere epigenetiske modifiserende enzymer, regulerer genuttrykk gjennom hyper- eller hypometylering45. PPARγ-banen har tidligere blitt beskrevet for å endre WNT-banen, som hadde gener beriket i denne studien. Selv om det fortsatt er ukjent hvordan WNT-signalering skjer under adipogenese, har nyere studier rapportert at det kan ha viktige roller i adipocyttmetabolismen, spesielt under overvektige forhold49.

Disclosures

Forfatterne av denne artikkelen har ingen interessekonflikter og har ingen økonomisk avsløring å erklære.

Acknowledgments

Vi vil takke Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) for å være tilgjengelig for å svare på all tvil om ChAMP-pakken. Vi takker også Guilherme Telles, Msc. for hans bidrag både til tekniske og vitenskapelige spørsmål fra denne avisen; han tok viktige hensyn til epigenetikk og videoopptak og formateringsteknikker (guilherme.telles@usp.br). Forbruksvarer Finansiering: São Paulo Research Foundation (FAPESP) (#2018/24069-3) og National Council for Scientific and Technological Development (CNPq: #408292/2018-0). Personlig finansiering: (FAPESP: #2014/16740-6) og Academic Excellence Program fra Coordination for Higher Education Staff Development (CAPES:88882.180020/2018-01). Dataene vil bli gjort offentlig og fritt tilgjengelig uten begrensning. Adressekorrespondanse til NYN (e-post: nataliayumi@usp.br) eller CBN (e-post: carla@fmrp.usp.br).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol J.T. Baker B5924-03
Agarose gel Kasvi K9-9100
Electric bioimpedance Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Corning 46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit ZymoResearch, Irvine, CA, USA D5001
Formamide Sigma F9037
FMS—Fragmentation solution Illumina 11203428 Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip Illumina
Maxwell Instrument Promega, Brazil AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix Illumina 11202880 Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix Illumina 11203410 Supplied Reagents
NaOH F. MAIA 114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization Illumina 11291245 Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization Illumina 11191130 Supplied Reagents
2-propanol Emsure 10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution Illumina 11292441 Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix Illumina 15010230 Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix Illumina 11288046 Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix Illumina 11208309 Supplied Reagents
Ultrapure EDTA Invitrogen 155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) ByoSystems 4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) Thermo Fisher Scientific AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1 Illumina 11208288 Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2 Illumina 11208296 Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3 Illumina 11208392 Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4 Illumina 11208430 Supplied Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
  2. World Health Organization. Obesity. , Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017).
  3. Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021).
  4. Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
  5. Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  6. Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
  7. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
  8. Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  9. Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
  10. Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
  11. Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
  12. Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
  13. Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
  14. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
  15. Yong, W. -S., Hsu, F. -M., Chen, P. -Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
  16. Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
  17. Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
  18. Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
  19. Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
  20. Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
  21. Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
  22. Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
  23. Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020).
  24. Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
  25. Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
  26. Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015).
  27. Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , Humana Press. New York, NY. 31-51 (2018).
  28. Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
  29. Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
  30. Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
  31. Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
  32. Tian, Y., et al. The Chip Analysis Methylation Pipeline. , Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020).
  33. Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
  34. Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
  35. Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
  36. Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
  37. Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
  38. Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
  39. Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
  40. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  41. Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
  42. Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
  43. Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
  44. DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
  45. Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
  46. Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
  47. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
  48. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
  49. Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).

Tags

Genetikk Utgave 183 DNA-metylering fedme ChAMP bioinformatikk epigenetikk fettmasse kroppsmasseindeks
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues,… More

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues, G., de Souza Pinhel, M. A., Cazier, J. B., Watanabe, L. M., Menezes, A. N., Bueno, C. R., Nicoletti, C. F., de Oliveira, B. A. P., Schineider, I. M., Yonehara Noma, I. H., Dias Alcarás, I. C., Barbosa, F., Barbosa Nonino, C. Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies. J. Vis. Exp. (183), e62598, doi:10.3791/62598 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter