Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

إعداد عينة لتحليل المعلوماتية الحيوية لمثيلة الحمض النووي: استراتيجية جمعية السمنة ودراسات السمات ذات الصلة

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/62598
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 4, 5, 1, 1, 6, 7, 8, 9, 6
1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

تصف هذه الدراسة سير العمل لإدارة بيانات مثيلة الحمض النووي التي تم الحصول عليها بواسطة تقنيات microarray . يوضح البروتوكول الخطوات من إعداد العينات إلى تحليل البيانات. يتم وصف جميع الإجراءات بالتفصيل ، ويعرض الفيديو الخطوات المهمة.

Abstract

ترتبط السمنة ارتباطا مباشرا بنمط الحياة وقد ارتبطت بتغيرات مثيلة الحمض النووي التي قد تسبب تغيرات في عمليات تكوين الدهون وتخزين الدهون التي تسهم في تطور المرض. نحن نظهر بروتوكولا كاملا من الاختيار إلى تحليل البيانات اللاجينية للمرضى الذين يعانون من السمنة أو بدونها. تم اختبار جميع الخطوات من البروتوكول والتحقق من صحتها في دراسة تجريبية. شاركت 32 امرأة في الدراسة ، حيث تم تصنيف 15 شخصا يعانون من السمنة وفقا لمؤشر كتلة الجسم (BMI) (45.1 ± 5.4 كجم / م 2) ؛ وتم تصنيف 17 فردا بدون سمنة وفقا لمؤشر كتلة الجسم (22.6 ± 1.8 كجم / م 2). في المجموعة المصابة بالسمنة ، تم تحديد 564 موقعا من مواقع CpG المتعلقة بكتلة الدهون من خلال تحليل الانحدار الخطي. كانت مواقع CpG في مناطق المروجين. وجد التحليل التفاضلي 470 CpGs hypomethylated و 94 موقعا مفرط الميثيل في الأفراد الذين يعانون من السمنة. كانت المسارات الأكثر تخصيبا بنقص ميثيل في RUNX ، وإشارات WNT ، والاستجابة لنقص الأكسجة. كانت مسارات فرط الميثيل مرتبطة بإفراز الأنسولين ، وإشارات الجلوكاجون ، و Ca2 +. نستنتج أن البروتوكول حدد بشكل فعال أنماط مثيلة الحمض النووي ومثيلة الحمض النووي المرتبطة بالسمات. يمكن أن ترتبط هذه الأنماط بالتعبير الجيني المتغير ، مما يؤثر على تكوين الدهون وتخزين الدهون. أكدت نتائجنا أن نمط الحياة البدينة يمكن أن يعزز التغيرات اللاجينية في الحمض النووي البشري.

Introduction

تم استخدام تقنيات omics واسعة النطاق بشكل متزايد في دراسات الأمراض المزمنة. ميزة مثيرة للاهتمام لهذه الأساليب هي توافر كمية كبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها للمجتمع العلمي. لذلك ، نشأ طلب على توحيد البروتوكولات للسماح بالمقارنة الفنية بين الدراسات. تقترح هذه الدراسة توحيد بروتوكول للحصول على بيانات مثيلة الحمض النووي وتحليلها ، باستخدام دراسة تجريبية كمثال مطبق.

يسود إنفاق الطاقة السلبي في أنماط الحياة البشرية الحديثة ، مما يؤدي إلى تراكم مفرط للأنسجة الدهنية ، وبالتالي تطور السمنة¹. أدت العديد من العوامل إلى زيادة معدلات السمنة ، مثل المستقرة ، والوجبات الغذائية عالية السعرات الحرارية ، والروتين المجهد. قدرت منظمة الصحة العالمية (WHO) أن 1.9 مليار بالغ يعانون من السمنة المفرطة في عام 2016 ، مما يعني أن أكثر من 20٪ من سكان العالم لديهم أكثر من 30 كجم / م 2 BMI2. كشف آخر تحديث لعام 2018 أن انتشار السمنة في الولايات المتحدة الأمريكية كان أعلى من 42٪ 3.

علم الوراثة اللاجينية هو التكيف الهيكلي للمناطق الكروموسومية لتسجيل حالات النشاط المتغيرة أو الإشارة إليها أو إدامتها4. مثيلة الحمض النووي هي تغيير كيميائي عكسي في مواقع ثنائي النوكليوتيدات السيتوزين - غوانوزين (مواقع CpG) ، وتشكيل 5-methylcytosine-pG (5mCpG). يمكنه تعديل التعبير الجيني عن طريق تنظيم وصول آلية النسخ إلى الحمض النووي5،6،7،8. في هذا السياق، من الضروري فهم مواقع CpG المرتبطة بالسمات المرتبطة بالسمنة9. يمكن للعديد من العوامل دعم أو منع مثيلة الحمض النووي الخاصة بالموقع. ويمكن للإنزيمات الضرورية لهذه العملية، مثل ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي10 (DNTMs) وعشرة إلى أحد عشر عملية نقل (TETs)، أن تعزز مثيلة الحمض النووي أو إزالة الميثيل في ظل التعرض البيئي11.

بالنظر إلى الاهتمام المتزايد بدراسات مثيلة الحمض النووي على مدى السنوات الماضية ، كان اختيار استراتيجية التحليل الأكثر ملاءمة للإجابة بدقة على كل سؤال مصدر قلق أساسي للباحثين12،13،14. تعد مصفوفة مثيلة الحمض النووي 450K الطريقة الأكثر شيوعا ، وتستخدم في أكثر من 360 منشورا14 لتحديد ملف تعريف مثيلة الحمض النووي. يمكنه تحديد مثيلة ما يصل إلى 485000 CpGs الموجودة في 99٪ من الجينات المعروفة15. ومع ذلك ، تم إيقاف هذه الصفيف واستبدالها ب EPIC ، والتي تغطي مواقع 850,000 CpG. يمكن تطبيق البروتوكول الحالي على كل من 450K و EPIC16 و 17 و 18.

يتم عرض البروتوكول خطوة بخطوة في الشكل 1 ويشمل الخطوات التالية: اختيار السكان ، وأخذ العينات ، وإعداد التجارب ، وخط أنابيب مثيلة الحمض النووي ، وتحليل المعلوماتية الحيوية. يتم عرض دراسة تجريبية أجريت في مختبرنا هنا لتوضيح خطوات البروتوكول المقترح.

Figure 1
الشكل 1: مخطط البروتوكول المعروض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة ريبيراو بريتو كلية الطب بجامعة ساو باولو (HCRP-USP) على الدراسة (CAAE:14275319.7.0000.5440). ووقع المشاركون على استمارة الموافقة، وأجريت جميع الإجراءات عقب إعلان هلسنكي.

1. السكان وأخذ العينات

  1. تجنيد المشاركين مع مؤشر كتلة الجسم >30 كجم / م 2 للدراسة. وبالنسبة لهذه الدراسة، تم تجنيد 32 امرأة من مجموعة مختلطة19 تتراوح أعمارهن بين 18 و 60 عاما.
    ملاحظة: في HCRP-USP ، لوحظت معدلات أعلى من السمنة بشكل رئيسي في النساء20. تم تجنيد المشاركين الذين يعانون من السمنة ، مع مؤشر كتلة الجسم ≥30 كجم / م 2 (ن = 15) ، من العيادة الخارجية للأمراض الأيضية في HCRP-USP. تم تجنيد المشاركين الذين لا يعانون من السمنة ، مع مؤشر كتلة الجسم بين 18.5 كجم / م 2 و 24.9 كجم / م 2 (ن = 17) ، من عيادات أخرى ولم يكن لديهم أمراض وخيمة. وترد البيانات السريرية في الجدول 1.
  2. استبعاد النساء الحوامل والمرضعات والمدخنات واللواتي يستهلكن الكحول.

2. الأنثروبومتري وتكوين الجسم

  1. قياس وزن المشاركين باستخدام مقياس أنثروبومتري رقمي يبلغ وزنه 200 كجم. تأكد من إزالة الأحذية والملابس الزائدة.
  2. قم بتقييم الارتفاع باستخدام مقياس الملعب مع تخرج 0.5 سم. وطلب من المشاركين الوقوف حفاة القدمين، والقدمين معا، والذراعين من جانبيهم21.
  3. جمع معلومات كتلة الدهون (FM) باستخدام المعاوقة الحيوية الكهربائية. بعد 12 ساعة من الصيام ، قم بالتقييم باستخدام المثانة البولية الفارغة. ضع المشاركين في وضع الاستلقاء ، مع تباعد الساقين والذراعين بالتوازي دون لمس الجسم. اطلب من المشاركين إزالة جميع الملحقات المعدنية22.
  4. احصل على محيط الخصر (WC) باستخدام شريط قياس غير قابل للتمديد مع تدرج 0.1 مم. تم وضع الشريط أفقيا حول الخصر الأوسط ، فوق عظام الورك مباشرة. حدث القياس بعد التنفس مباشرة. وفقا لمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) ، فإن الحد الأقصى للمرحاض للنساء هو 88 سم 23.

الجدول 1: الخصائص السكانية. كانت جميع المتغيرات بارامترية (p > 0.05 ، Shapiro Wilk) ، وتم تقييم الاختلافات باستخدام اختبار t مستقل ، حيث اعتبر p < 0.05 معنويا. * ص < 0.0001. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

3. جمع المواد البيولوجية

  1. جمع الدم المحيطي بعد 12 ساعة من الصيام ، كما هو موضح سابقا24.
  2. جمع 4 مل من عينات الدم الكاملة في أنابيب جمع مع مضادات التخثر (على سبيل المثال ، EDTA) وتخزينها على الجليد للنقل.

4. استخراج الحمض النووي

  1. جهاز طرد مركزي لكل أنبوب يحتوي على الدم عند 2000 × غرام لمدة 10 دقائق. جمع حوالي 300 ميكرولتر من معطف بافي (الطور الأبيض).
  2. استخراج الحمض النووي من الدم المحيطي باستخدام أداة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)، كما هو موضح سابقا25. قم بالتخلص من الحمض النووي في 480 ميكرولتر من H2O فائق النقاء.
  3. تقييم تركيز الحمض النووي وجودته باستخدام مقياس الفلورومتر. تم تقييم النزاهة باستخدام تحليل هلام الأغاروز بنسبة 1٪25. يخزن في الفريزر على درجة حرارة -80 درجة مئوية.

5. التحضير قبل تحليل المثيلة

  1. تأكد من أن العينات تحتوي على الحد الأدنى من تركيز الحمض النووي (500 نانوغرام هو المدخلات الأولية المثالية للبدء) ، ولكن قد يختلف التخفيف بين العينات في هذه الخطوة.
  2. لا يتم تضمين بعض الكواشف في مجموعة microarray 26 ، لذا قم بشرائها بشكل منفصل27.
  3. تحقق مما إذا كانت المجموعة تحتوي على جميع الكواشف المستخدمة أثناء الإجراء ؛ لا يمكن الاستغناء عنها. تحقق من تاريخ انتهاء صلاحية جميع الكواشف. تأكد من توفر الكواشف والحلول الأخرى غير المتوفرة في المجموعة (95٪ formamide / 1 mM EDTA ، 0.1 N NaOH ، الإيثانول المطلق ، 2-propanol).
    تحذير: الفورماميد هو كاشف متطاير. يمكن تحسين جودة النتائج إذا كان المنتج طازجا. تعتبر سلامة وجودة الفورماميد والإيثانول المطلق أمرا بالغ الأهمية لأنها يمكن أن تؤثر على عملية التلطيخ التي تقترحها الشركة المصنعة. يجب أن تكون الكحوليات المختارة منتجات فائقة النقاء خاصة بتحليل البيولوجيا الجزيئية.
  4. بمجرد الحصول على مجموعة microarray ، قم بتنزيل خرائط فك تشفير الرقائق (DMAPs). تتوفر هذه الملفات على موقع الشركة المصنعة على الويب بعد 24-48 ساعة بعد شحن المجموعة ويتم استبعادها في تاريخ انتهاء الصلاحية28. لتنزيل الملفات المذكورة ، قم بتنفيذ الخطوات أدناه.
    1. تأكد من توفر جهاز كمبيوتر متصل بالإنترنت. قم بإجراء التنزيل باستخدام عميل ملف فك تشفير البرامج.
    2. قبل تثبيت البرنامج ، تأكد من أن الكمبيوتر لديه وصول صادر ووارد تمنحه المؤسسة ؛ عميل ملف فك التشفير ليس لديه قيود أمنية.
    3. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج فك تشفير عميل الملفات باستخدام خيار Access by BeadChip. يتم تسجيل الدخول هذا باستخدام معرف المستخدم وكلمة المرور MyIllumina. التسجيل في هذه الصفحة مطلوب28.
    4. بعد تسجيل الدخول إلى عميل Decode File ، أدخل المعلومات المدرجة أدناه في الحقول الخاصة بكل منها على الصفحة الرئيسية للبرنامج28: قائمة الباركود ؛ قائمة معرفات الصندوق؛ رقم أمر الشراء (PO)؛ ورقم أمر المبيعات (تذكر عدم تضمين الأحرف التي تتبع الأرقام).
    5. حدد DMAPs المراد تنزيلها وفقا لرقم الباركود في مربع الشراء وحدد الوجهة في مربع الحوار لحفظ DMAPs.
    6. انقر فوق الزر لبدء التنزيل.
      ملاحظة: في نهاية التنزيل، تأكد من أن المجلدات التي تم تنزيلها ليست فارغة وقم بتخزين الملفات بأمان، لأنها ستكون ضرورية للخطوة الأخيرة لتحويل التجارب إلى ملفات بيانات كثافة (ملفات IDAT). بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، قد تقوم Illumina بإزالة بيانات DMAPs من قاعدة بياناتها عبر الإنترنت.

6. خط أنابيب مثيلة الحمض النووي

ملاحظة: تنقسم تجربة مثيلة الحمض النووي إلى 4 أيام (الشكل 1). اتبع توصيات الشركة المصنعة ومواصفاتها للحصول على نتائج دقيقة.

  1. اليوم 1: علاج البيسولفيت
    1. ابدأ بتمسخ 500 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي ، ثم أضف كواشف التحويل. لتنفيذ هذه الخطوة ، اتبع توصيات مجموعات bisulfite و microarray 29.
    2. عالج الحمض النووي المشوه ب 130 ميكرولتر من كاشف تحويل ثنائي الكبريتيت بالتركيز القياسي الذي توفره الشركة المصنعة.
    3. احتضن الأنبوب في جهاز تدوير حراري لمدة 16 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. اخفض جهاز تدوير الحرارة إلى 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. قم بتنفيذ خطوة الغسيل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت ثم الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية. لا يتم توفير التركيز في دليل المستخدم ، وتقوم الشركة المصنعة بتوحيد وحدات التخزين.
      ملاحظة: يأتي هذا الكاشف مع المجموعة ولا يحتاج إلى تخفيفه أو إعداده.
  2. اليوم 2: التضخيم - فحص المثيلة ، البروتوكول اليدوي
    1. سخني فرن التهجين إلى 37 درجة مئوية واتركي درجة الحرارة تتوازن.
    2. قم بتطبيق ملصق الباركود على صفيحة صغيرة سعة 0.8 مل.
    3. قم بإذابة كواشف التضخيم (مزيج التضخيم متعدد العينات 1 ، ومزيج التمهيدي العشوائي ، ومزيج Amp Master متعدد العينات) في درجة حرارة الغرفة (تأتي هذه الكواشف مع المجموعة ولا تحتاج إلى تخفيفها أو تحضيرها). بعد ذلك ، قم بإجراء انعكاس لطيف لا يقل عن 10 أضعاف حتى يتم خلط محتويات الأنابيب بالكامل.
    4. قم بتوزيع 20 ميكرولتر من مزيج التضخيم متعدد العينات 1 (MA1) في آبار اللوحة.
    5. نقل 4 ميكرولتر من عينة الحمض النووي من صفيحة البيسولفيت المحولة إلى الآبار المقابلة على لوحة 0.8 مل. عند هذه النقطة، سجل معرف عينة الحمض النووي الأصلية على نموذج التتبع المختبري المقابل لآبار الصفيحة.
    6. قم بتوزيع 4 ميكرولتر من 0.1 N NaOH في كل بئر من الصفيحة التي تحتوي على مزيج التضخيم متعدد العينات 1 (MA1) وعينة الحمض النووي.
    7. ختم اللوحة مع ختم من البلاستيك.
    8. دوامة اللوحة لخلط الكواشف مع العينات عند 1600 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة الختم بعناية.
    9. ماصة 68 ميكرولتر من مزيج التمهيدي العشوائي (RPM) في كل بئر من اللوحة. ماصة 75 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الأمبير متعدد العينات (MSM) في كل بئر من اللوحة (دون إزالة المحلول السابق). استخدم ختما جديدا لتغطية اللوحة.
      ملاحظة: احرص على دمج الآبار مع اللوحة وتوجيهها بشكل صحيح.
    10. دوامة اللوحة المختومة عند 1600 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. احتضان في فرن التهجين لمدة 20-24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. اليوم 3: التهجين - فحص المثيلة ، البروتوكول اليدوي
    1. سخني الكتلة إلى 37 درجة مئوية.
    2. قم بإذابة محتويات الأنبوب في درجة حرارة الغرفة. قم بعكس أنابيب محلول التجزئة (FMS) بعناية ولطف 10 أضعاف على الأقل لخلط المحتويات جيدا.
    3. قم بإزالة اللوحة بعناية من فرن التهجين. نبض الطرد المركزي لوحة في 280 × غرام.
    4. الآن قم بإزالة الختم من اللوحة. في كل بئر من الصفائح التي تحتوي على عينة، أضف 50 ميكرولتر من محلول التجزئة (FMS) وأغلق اللوحة مرة أخرى. دوامة اللوحة عند 1600 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
    5. الطرد المركزي للصفيحة عند 280 × g لبضع ثوان (إجراء الطرد المركزي النبضي). ثم ، ضع اللوحة المختومة على كتلة التسخين عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. إذا تقرر إيقاف التجربة مؤقتا وتجميد اللوحة ، فقم بإذابتها في درجة حرارة الغرفة ، وقم بطردها مركزيا عند 280 × جم. إذا لم يتم تجميده، تخطي هذه الخطوة والانتقال إلى الخطوة 6.3.7.
    7. اترك كتلة التسخين لتسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
    8. اترك المخزن المؤقت للغسيل ليذوب في درجة حرارة الغرفة. عند إذابة الجليد ، قم بعكسه 10 أضعاف على الأقل لخلط المحتويات.
    9. قم بإزالة الختم من اللوحة.
    10. أضف 100 ميكرولتر من محلول هطول الأمطار (PM1) إلى كل بئر من الصفيحة يحتوي على عينات.
    11. ختم اللوحة مرة أخرى مع الختم.
    12. دوامة اللوحة عند 1600 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
    13. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    14. ثم ، ضع في جهاز الطرد المركزي النبضي عند 280 × g لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: اضبط جهاز الطرد المركزي على 4 درجات مئوية للخطوة التالية.
    15. قم بإزالة الختم بعناية من اللوحة وتخلص منه.
    16. أضف 300 ميكرولتر من 2-بروبانول (100٪) إلى كل بئر يحتوي على العينة.
    17. أغلق اللوحة بعناية فائقة باستخدام ختم جديد. احرص على عدم هز اللوحة.
    18. عكس اللوحة على الأقل 10x ، وخلط المحتويات بأكملها.
    19. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    20. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: في نهاية الخطوة 6.3.20، قم بإزالة لوحة جهاز الطرد المركزي على الفور.
    21. قم بإزالة الختم من اللوحة وتخلص منه.
    22. قم بعكس اللوحة بسرعة واستنزاف السائل على وسادة للتخلص من السوبرناتانت. ثم ، ضرب الطبق في منطقة جافة على منشفة ورقية لتصريف السائل.
    23. اضغط بقوة عدة مرات لمدة 1 دقيقة أو حتى تصبح جميع الآبار خالية من أي سائل.
    24. اترك اللوحة مقلوبة ومكشوفة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: من المتوقع أن نرى كريات زرقاء في قاع الآبار.
    25. سخني فرن التهجين إلى 48 درجة مئوية.
    26. قم بتشغيل كتلة الحرارة للتسخين المسبق. اسمح ب 20 دقيقة لهذه العملية.
    27. إعادة الضبط والتهجين ومحلول الغسيل في درجة حرارة الغرفة. عكس 10x على الأقل. تحقق من عدم وجود ملح مترسب في المحلول.
    28. أضف 46 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق والتهجين والغسيل (RA1) إلى كل بئر من اللوحة.
      ملاحظة: يجب حجز أي كواشف متبقية لخطوات التلطيخ والتهجين.
    29. ضع الختم على اللوحة. استخدم ختم الألومنيوم لتغطية اللوحة. امسك بإحكام لأداء الختم بالتساوي.
    30. تحقق مما إذا كانت جميع الآبار مغلقة بأمان لتجنب التبخر.
    31. ضع الطبق المختوم حديثا بعناية في فرن التهجين واحتضنه عند 48 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    32. دوامة اللوحة عند 1800 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
    33. جهاز طرد مركزي نبضي عند 280 × جم.
    34. انقل اللوحة إلى كتلة الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    35. قم بإعداد غرف التهجين (Hyb) عن طريق وضعها معا. قم بتوزيع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرطب (PB2) في خزانات غرف Hyb. ضع الغطاء على الفور.
    36. قم بتحميل كل عينة من اللوحة في فتحة إدخال العينة الخاصة بالمصفوفة الدقيقة.
    37. قم بتحميل إدخالات غرفة Hyb التي تحتوي على المصفوفات الدقيقة في غرفة Hyb. أغلق غرفة Hyb بالعرض لتجنب التحول المحتمل لغرفة Hyb.
      ملاحظة: يجب احتضان Hyb Chambers عند 48 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من 24 ساعة.
  4. اليوم 4: تلطيخ - فحص المثيلة ، بروتوكول يدوي
    1. أعد تعليق محلول التلطيخ 4 ب 330 مل من 100٪ EtOH ، والحصول على حجم نهائي يبلغ 350 مل. رج زجاجة محلول التلطيخ 4 بقوة لضمان إعادة التعليق بالكامل. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول التلطيخ 4 لمدة تصل إلى أسبوعين عند درجة حرارة تتراوح بين 2 درجة مئوية و 8 درجات مئوية.
    2. أخرج الغرف من فرن التهجين واتركها تبرد على المقعد لمدة 30 دقيقة قبل الفتح.
    3. أثناء تبريد غرفة Hyb ، املأ حاويتين للغسيل بمخزن Wash Buffer (200 مل لكل حاوية غسيل). تذكر تسمية كل حاوية باسم "المخزن المؤقت للغسيل" (PB1 و PB2).
    4. املأ ملحقات محاذاة microarray ب 150 مل من Wash Buffer.
    5. افصل الفواصل البلاستيكية ، وإذا لزم الأمر ، قم بتنظيف الزجاج.
    6. لغسل شرائح microarray ، قم بتوصيل حلقة الأسلاك بالشبكة واغمر معدات التنقيط في الحاويات مع 200 مل من Wash Buffer لما مجموعه 10x.
    7. قم بإزالة جميع الإدخالات من غرفة التهجين وقم بإزالة كل صفيف من الإدراجات. أزل الختم.
      ملاحظة: أثناء الإزالة، لا تلمس المصفوفات المكشوفة.
    8. أثناء إزالة شرائح microarray من غرفة التهجين ، احرص على عدم انسكاب أي شيء.
    9. اغسل المصفوفات الدقيقة في محلول المخزن المؤقت للغسيل (PB1) ببطء وبخفة، مع التحرك لأعلى ولأسفل 10 مرات. انتقل إلى محلول PB1 جديد وقم بإجراء الغسيل عن طريق تحريك المصفوفات الدقيقة ببطء 10x لأعلى ولأسفل في المحلول.
    10. قم بإزالة microarray من الحاوية وتأكد من عدم وجود بقايا.
    11. استخدم فاصل شفاف في الجزء العلوي من كل مصفوفة صغيرة وقم بتوجيه الفواصل إلى المواضع المقابلة.
      ملاحظة: احرص على استخدام الفواصل الشفافة فقط، وليس الفواصل البيضاء.
    12. ضع شريط المحاذاة على ملحق المحاذاة.
    13. ضع لوحة خلفية زجاجية في الجزء العلوي من الفاصل الشفاف ؛ كن حريصا على تغطية المصفوفة الدقيقة بأكملها. ثم ، قم بإرفاق المشابك المعدنية بغرف التدفق. إذا لزم الأمر ، استخدم المقص لتقليم نهايات فواصل غرفة التدفق.
    14. اغسل خزانات غرفة التهجين على الفور باستخدام ddH2O وافركها بفرشاة تنظيف صغيرة. لا تسمح لأي مخزن مؤقت مرطب بالبقاء في الخزان.
    15. انتقل إلى الخطوة التالية المسؤولة عن المصفوفة الدقيقة الموسعة والملطخة.
      ملاحظة: اترك جميع غرف التدفق مثبتة أفقيا على مقعد المختبر. أعد التعامل معها فقط عندما تكون خطوة التلطيخ بأكملها جاهزة. قم بتسخين محلول إعادة التعليق والتهجين والغسيل إلى درجة حرارة تتراوح بين 20 درجة مئوية و 25 درجة مئوية. اخلطي بلطف حتى لا ترى أي بلورة في المحلول.
    16. ضع الكواشف في رف بالتسلسل. إذا تم تجميد أي منها ، فاتركها في درجة حرارة الغرفة ثم قم بعكسها 10 أضعاف على الأقل لخلط المحاليل.
    17. املأ دورة المياه إلى المستوى المناسب.
    18. قم بتشغيل المضخة واضبط درجة الحرارة على 44 درجة مئوية.
    19. قم بإزالة أي فقاعات متصلة بحامل الغرفة.
    20. قم بإجراء اختبارات على رف الغرفة باستخدام مسبار درجة الحرارة. يجب أن تكون جميع المواقع التي تم اختبارها بين 44 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية دون انقطاع.
    21. عندما يصل الحامل إلى درجة حرارة 44 درجة مئوية ، ضع كل مجموعة بسرعة في غرفة التدفق.
      ملاحظة: بالنسبة للخطوات التالية، قم بماصة جميع الكواشف في اللوحة الزجاجية الخلفية.
    22. ماصة 150 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق والتهجين والغسيل (RA1). ثم ، احتضن لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة ما مجموعه 5x.
    23. ماصة 450 ميكرولتر من محلول التلطيخ 1 (XC1) وتحضن لمدة 10 دقائق.
    24. ماصة 450 ميكرولتر من محلول تلطيخ 2 (XC2) وتحضن لمدة 10 دقائق.
    25. ماصة 200 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتمديد ثنائي اللون (TEM) وتحضن لمدة 15 دقيقة.
    26. ماصة 450 ميكرولتر من 95٪ فورماميد / 1 mM EDTA وتحضن لمدة دقيقة واحدة كرر مرتين.
    27. احتضان لمدة 5 دقائق.
    28. اخفض درجة حرارة حامل الغرفة إلى 32 درجة مئوية (يشار إليها في المزيج الرئيسي فائق اللونين).
    29. ماصة 450 ميكرولتر من محلول وصمة عار 3 (XC3) وتحضن لمدة 1 دقيقة.
    30. انتظر حتى يصل الرف الموجود في الغرفة إلى درجة الحرارة الصحيحة.
      ملاحظة: لقراءة صورة microarray مباشرة بعد عملية التلوين، قم بتشغيل الماسح الضوئي في هذه المرحلة.
    31. الآن الاستغناء عن 250 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الفائق ثنائي اللون (STM) ، تليها حضانة لمدة 10 دقائق.
    32. ثم ، استغني عن 450 ميكرولتر من محلول البقع 3 (XC3) ، متبوعا بحضانة لمدة 1 دقيقة. كرر 1x.
    33. انتظر لمدة 5 دقائق ثم أضف 250 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المضاد للبقع 2-Color (ATM) واحتضنه لمدة 10 دقائق.
    34. الآن الاستغناء عن 250 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الفائق ثنائي اللون (STM) ، تليها حضانة لمدة 10 دقائق.
    35. ثم ، استغني عن 450 ميكرولتر من محلول البقع 3 (XC3) ، متبوعا بحضانة لمدة 1 دقيقة. كرر 1x.
    36. انتظر لمدة 5 دقائق.
    37. أضف 250 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المضاد للبقع 2-Color (ATM) واحتضنه لمدة 10 دقائق.
    38. أضف 450 ميكرولتر من Stain Microarray Solution 3 (XC3) واحتضنها لمدة 1 دقيقة ، ثم كرر مرة أخرى.
    39. انتظر لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: قم بعمل مخطط التكرار التالي: الخطوة 6.4.34.، الخطوة 6.4.35. والخطوة 6.4.36.؛ الخطوة 6-4-37 و 6-4-38 و 6-4-39؛ الخطوة 6.4.34.، الخطوة 6.4.35.، والخطوة 6.4.36.
    40. الآن ، قم بإزالة غرف التدفق على الفور من الرف ووضعها بعناية أفقيا على مقعد المختبر. تأكد من أن درجة الحرارة محيطة.
    41. 6.4.41.ضع 310 مل من محلول الغسيل (PB1) لكل مصفوفة صغيرة في حاوية غسيل.
    42. قم بإزالة المشابك المعدنية والزجاج ، وأخيرا ، المصفوفة الدقيقة.
    43. ضع المصفوفات الدقيقة على رف تلطيخ وضعها في حاوية الغسيل التي تحتوي على محلول PB1 10x. تأكد من أن الباركود يواجه بعيدا عن أي شخص يتعامل معها وأن جميع المصفوفات الدقيقة مغمورة.
    44. تحرك ببطء وبرفق مع حركات لأعلى ولأسفل 10x. يجب إزالة المصفوفة الدقيقة بالكامل من المحلول قبل غمرها مرة أخرى. ثم ، اتركه مغمورا لمدة 5 دقائق.
    45. هز كاشف Stain Solution 4 (XC4) بقوة لضمان إعادة التعليق بالكامل. ضع 310 مل من XC4 في حاوية غسيل.
      ملاحظة: لا تدع المحلول يجلس في حاوية الغسيل لأكثر من 10 دقائق.
    46. حرك حامل التلطيخ برفق إلى الحاوية الأخرى باستخدام XC4.
    47. تحرك ببطء وبرفق مع حركات لأعلى ولأسفل 10x. تأكد من إزالة المصفوفة الدقيقة بالكامل من المحلول قبل غمرها مرة أخرى.
    48. ثم ، دع microarray يبقى مغمورا لمدة 5 دقائق.
    49. حرك البقعة من المحلول وضعها في حامل أنبوب مع توجيه الرموز الشريطية لأعلى.
    50. قم بإزالة المصفوفة الدقيقة بعناية باستخدام ملقط القفل وضعها على رف حتى تجف.
    51. قم بتجفيفها باستخدام مجفف الفراغ لمدة 50-55 دقيقة عند 675 مم زئبق (0.9 بار).
    52. قم بتنظيف الجزء الخلفي من كل مصفوفة صغيرة باستخدام EtOH.
      تنبيه: تجنب لمس الخطوط ، ولا تسمح ل EtOH بالتنقيط على الخطوط بأي شكل من الأشكال.
    53. انتقل إلى تصوير المصفوفة الدقيقة.
    54. قم بتخزين microarray بعناية في صندوق تخزين في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يجب التقاط صور Microarray في غضون 72 ساعة.

7. تحليل المعلوماتية الحيوية

ملاحظة: من الضروري تغيير بعض سمات نوع المصفوفة الدقيقة (على سبيل المثال، يجب استبدال نوع الصفيف = "450k" بنوع الصفيف = "EPIC"). يصف مؤلف خط أنابيب ChAMP بالتفصيل جميع الحقول التي يجب تعديلها لتحليل المصفوفات على صفحة الموصلات الحيوية للحزمة30.

  1. ورقة عينة
    1. انقل ملفات IDAT إلى الكمبيوتر لمتابعة تحليل المعلوماتية الحيوية31. إنشاء ورقة عينة لتنفيذ تحليل البيانات31.
      ملاحظة: ثلاثة أعمدة ضرورية لملف جدول البيانات هذا. الأول هو Sample_name. يجب أن يتضمن هذا العمود الأسماء أو الرموز المستخدمة لتحديد العينات. والثاني هو Sentrix_position. يضع هذا العمود R01C01 المقابل للعينات، حيث يكون R01 مسؤولا عن صف الشريحة ويشار إلى العمود باسم C01. العمود الأساسي الثالث هو Sentrix_ID ، وهو مسؤول عن تلقي الرقم الذي يحدد المصفوفة الدقيقة. تأكد من وضع الأرقام الصحيحة. من الممكن إضافة معلومات أخرى على ورقة العينة كقيم متغيرة. في هذه التجربة ، تم تضمين بيانات من تحليل المعادن.
  2. خط أنابيب ChAMP
    1. قم بتثبيت RStudio (V.4.0.2) على الكمبيوتر لإجراء التحليل30.
      ملاحظة: تأكد من أن الكمبيوتر يحتوي على 8 G كحد أدنى من ذاكرة الوصول العشوائي. سيكافح تحليل البيانات أو يتعطل مع كمية أقل من ذاكرة الوصول العشوائي.
    2. بعد التثبيت، افتح RStudio وقم بتثبيت حزمة ChAMP Bioconductor 30 باستخدام سطر الأوامر المعني (انظر المادة التكميلية 1).
      ملاحظة: إذا كان هناك أي خطأ في نهاية التثبيت، قم بتثبيت مكتبات ChAMP المطلوبة يدويا، واحدة تلو الأخرى26.
    3. الآن ، قم باستيراد البيانات الخام وقم بإجراء التحليل. انظر المادة التكميلية 1.
      يستورد champ.load() البيانات الخام ويقوم بعملية التصفية ، باستثناء المجسات ذات ال pval المنخفض للكشف ، والمواقع متعددة الضربات ، والمجسات غير CG ، ومواقع CpG بالقرب من SNPs ، و CpGs الموجودة في الكروموسومات الجنسية.
      يقوم champ.impute() بتنفيذ إسناد KNN كافتراضي.
      بطل. تقوم مراقبة الجودة باسترداد الرسوم البيانية لجودة البيانات (على سبيل المثال ، الرسم البياني لمخطط الكثافة).
      بطل. يقوم SVD بتقييم تأثيرات الدفعات استنادا إلى بيانات التعريف المتوفرة في ورقة العينة.
      يقوم champ.refbase() بإجراء تقدير وتصحيح نوع الخلية.
      بطل. DMP( ) يسترجع المواقع الميثيلية التفاضلية وارتباطات السمات مثل كتلة الدهون للتحقق من مثيلة الحمض النووي بين المجموعات وتغيير المعلمات ، كما هو موضح في المادة التكميلية 1.
  3. الإثراء (قاعدة بيانات السلسلة)
    ملاحظة: يستخدم الإثراء الوظيفي لاستنتاج الوظائف البيولوجية لمجموعة من الجينات.
    1. لإثراء البيانات في سلسلة، حدد قائمة الأهداف المراد إثراؤها واستخدامها كمدخلات من: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. بالنسبة للكائن الحي ، حدد الإنسان العاقل واضغط على زر البحث.
    3. للتنقل عبر الإثراء ، انقر فوق الزر تحليل.
  4. تقديم توقعات البيئة العالمية
    1. قم بإيداع البيانات في مستودع عام مثل GEO التابع ل NCBI. لهذا ، قم بالتسجيل للحصول على حساب المرسل.
      ملاحظة: أكمل تقديم توقعات البيئة العالمية (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) عن طريق تنزيل ورقة البيانات الوصفية مع معلومات وصفية وبروتوكولات للتجربة الشاملة والعينات الفردية. يمكن إنشاء تقديمات أرشيف GEO في أي برنامج جداول بيانات. ثانيا، أضف ملف البيانات الخام الذي تم إنشاؤه من البرنامج النصي لعدد حراس الخلايا لجميع المكتبات إلى الدليل. يحتوي IDAT والملفات المقترنة أو ورقة عمل مصفوفة على بيانات غير طبيعية. المجلد الثالث هو ملفات البيانات التي تمت معالجتها. جدول المصفوفة عبارة عن جدول بيانات يحتوي على القيم النهائية والعادية القابلة للمقارنة عبر الصفوف والعينات ويفضل معالجتها كما هو موضح في أي مخطوطة مصاحبة.
    2. ضع ملفات البيانات المعالجة التي تم إنشاؤها من البرنامج النصي لعدد الخلايا لكافة المكتبات في الدليل. استخدم بيانات اعتماد خادم FTP الخاص بمرسل GEO لنقل الدليل الذي يحتوي على جميع المكونات الثلاثة.

Representative Results

بعد استخدام خط أنابيب ChAMP ، تم النظر في 409,887 مسبارا في التحليل بعد جميع المرشحات (CpGs غير المؤهلة ، تحقيقات غير CG ، CpG بالقرب من SNPs ، مواقع متعددة الضربات ، و CpGs المتعلقة ب XY) ؛ ويمثل الشكل 2 مخططا.

Figure 2
الشكل 2: خط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وعلاوة على ذلك، كشفت خطة الكثافة أن جميع العينات لها كثافات مماثلة لتوزيع بيتا تتعلق بخطوات مراقبة الجودة. يقيم هذا التحليل توزيع قيم بيتا ويشير إلى ما إذا كانت هناك أي عينات تحتاج إلى استبعادها. في هذه الدفعة، لم يتم استبعاد أي عينات بناء على هذا التحليل.

Figure 3
الشكل 3: مخطط كثافة القيم التجريبية الذي تم الحصول عليه باستخدام حزمة ChAMP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم استخدام تحليل تحلل القيمة المفردة (SVD) للتحقق من المكونات الرئيسية التي أثرت بشكل كبير على تباين بيانات مثيلة الحمض النووي. وكشفت البيانات أن مؤشر كتلة الجسم وWC (p < 1e10-5) وFM (p < 0.05) كان لها تأثير كبير على تباين البيانات (الشكل 4).

Figure 4
الشكل 4: تحليل تحلل القيمة المفردة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

كشف تقدير نوع الخلية أن كلا من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا البائية كانت أعلى في النساء البدينات (الشكل 5).

Figure 5
الشكل 5: كسور الخلايا المقدرة بطريقة هاوسمان. غران: الخلايا المحببة. CD4T: مساعد الخلايا التائية ، الخلايا الليمفاوية. CD8T: الخلايا التائية السامة للخلايا ، الخلايا الليمفاوية. أحادي: مونوسيت. الخلية البائية: الخلايا الليمفاوية البائية. NK: الخلايا القاتلة الطبيعية ، الخلايا الليمفاوية. * ص < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختلفت مستويات مثيلة الحمض النووي بين النساء البدينات وغير البدينات قبل وبعد تصحيح نوع الخلية. قبل تصحيح بيانات مثيلة الحمض النووي لأنواع الخلايا ، لوحظ وجود 43,463 موقعا ميثيليا تفاضليا (DMPs) ، وظل 3,329 CpGs كبيرا بعد ذلك. وكان 445 موقعا من مواقع CpG في المناطق بين الجينات (IGR)، و 2,884 موقعا في المناطق الوراثية، ومعظمها في منطقة المروج (n = 1,438). كان التوزيع على طول جميع المناطق TSS1500 (n = 612) ، TSS200 (n = 826) ، 5'UTR (n = 390) ، الإكسون الأول (n = 273) ، الجسم (n = 724) ، و 3'UTR (n = 59). وبالنظر إلى قيم Δβ <-0.05 و >0.05 ، كان 162 CpGs هيبوميثيل و 576 مفرط الميثيل في البدناء مقارنة بالأفراد غير البدناء (الشكل 6). والبيانات متاحة في قاعدة بيانات توقعات البيئة العالمية تحت رمز السجل GSE166611.

Figure 6
الشكل 6: المواضع الميثيلية التفاضلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من الممكن تقييم المثيلة المختلفة بين المجموعات والعثور على مواقع CpG المرتبطة بسمات محددة في دراسات المثيلة. بالنسبة لدراسات كتلة الدهون ، تم العثور على مواقع 13,222 CpG. وارتبط 6,159 CpGs في المنطقة المروجة بكتلة الدهون، مع 470 فرط ميثيل و 94 هيبوميثيل (الشكل 7)، وتم إثراء الجينات المعنية (الجدول 2).

Figure 7
الشكل 7: المناطق المروجة للجينات الهيبوميثيل وفرط ميثيل ، المرتبطة بشكل مستقل بكتلة الدهون.

الجدول 2: الإثراء الوظيفي للجينات من مواقع CpG الميثيلية بشكل مختلف. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المواد التكميلية 1: يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

صفائف مثيلة الحمض النووي هي الطرق الأكثر استخداما للوصول إلى مثيلة الحمض النووي بسبب نسبة التكلفة إلى العائد14. وصفت هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا باستخدام منصة microarray متاحة تجاريا لتقييم مثيلة الحمض النووي في دراسة تجريبية أجريت في مجموعة برازيلية. وأكدت النتائج التي تم الحصول عليها من الدراسة التجريبية فعالية البروتوكول. ويبين الشكل 3 قابلية العينة للمقارنة والتحويل الكامل للبيسلفيت32.

كخطوة لمراقبة الجودة ، أوصت خوارزمية ChAMP باستبعاد مواقع CpGs أثناء عملية التصفية. الهدف من استبعاد التحقيقات هو تحسين تحليل البيانات والقضاء على التحيز. تمت إزالة CpGs منخفضة الجودة (قيم p أقل من 0.05) للقضاء على الضوضاء التجريبية في مجموعة البيانات. ظلت الأهداف مرتازة في تحليل مخطط الكثافة. وصف Zhou33 أهمية تصفية CpGs بالقرب من SNPs لتجنب عدم التطابق ، وسوء تفسير مثيلة السيتوسيبين متعدد الأشكال ، والتسبب في تبديل لون تصميم المسبار من النوع الأول34. أيضا ، نظرا لأن كروموسومات XY تتأثر بشكل مختلف بالبصمة ، فقد عزز Heiss و Just35 أهمية تصفية هذه المجسات لأنه ، في الإناث ، قد تكون مشاكل التهجين عوامل مربكة 35.

يعتبر تاريخ انتهاء صلاحية DMAPs ، وتاريخ افتتاح الفورماميد ، والجودة التحليلية للإيثانول المطلق ، وإجمالي عدد الكريات البيض خطوات حاسمة في البروتوكول.

علاوة على ذلك ، وفقا لملاحظاتنا ، فإن تقدير نوع الخلية ضروري في إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية. تقوم طريقة Houseman بإجراء تقدير نوع الخلية كما هو موضح في دراسة تيان 30. تعتمد هذه الطريقة على 473 موقعا محددا ل CpG يمكنها التنبؤ بالنسب المئوية لأهم أنواع الخلايا ، مثل الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة والخلايا البائية والخلايا التائية36. استخدمنا الوظيفة الموصى بها "myRefbase" من حزمة ChAMP. بعد التقدير ، تقوم خوارزمية ChAMP بضبط قيم بيتا وإزالة هذا التحيز من مجموعة البيانات. هذه الخطوة حاسمة في الدراسات التي تركز على السمنة لأن هذه المجموعة لديها اختلاف كبير في خلايا الدم البيضاء بسبب حالتها الالتهابية المزمنة.

لقد غيرنا فقط خريطة الغطاء الأصلية لختم PCR الشائع فيما يتعلق بتعديل الطريقة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. بعد كل عملية طرد مركزي ، تم تغيير الختم لآخر جديد. لم نتمكن من استخدام الختم الحراري القياسي وتكييفه باستخدام رقائق الألومنيوم حول اللوحة.

على الرغم من أن الفحوصات التجارية قد اعتبرت معيارا ذهبيا للدراسات اللاجينية ، إلا أن أحد قيود البروتوكول يمكن أن يكون خصوصية الكواشف والمعدات من علامة تجارية فريدة من نوعها 37،38،39،40. وثمة قيد آخر يتمثل في عدم وجود مؤشرات تسمح بتحديد التقدم الصحيح للتجربة(41).

يمثل توحيد هذا البروتوكول دليلا رائعا للبحوث اللاجينية ، مما يقلل من الأخطاء البشرية أثناء العملية ويسمح بتحليل البيانات بنجاح وقابلية المقارنة بين الدراسات المختلفة.

وفقا لنتائجنا، فإن تجارب مثيلة الحمض النووي مناسبة للدراسات التي تقارن الأفراد الذين يعانون من السمنة وبدونها43. كما أن تحليل المعلوماتية الحيوية المقترح يوفر بيانات عالية الجودة ويمكن النظر فيه في الدراسات واسعة النطاق.

باستخدام تحليل SVD ، حددنا أن السمات المرتبطة بالسمنة (مؤشر كتلة الجسم ، WC ، و FM) أثرت على التباين في بيانات مثيلة الحمض النووي. ونتيجة لذلك، يشير تقدير نوع الخلية إلى أن كلا من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا البائية كانت أعلى لدى النساء المصابات بالسمنة منها في النساء غير المصابات بالسمنة (الشكل 5). ويمكن تفسير ارتفاع عدد هذه الخلايا بالحالة الالتهابية المنخفضة الدرجة لهؤلاء الأفراد44. لاحظنا أن المرضى الذين يعانون من السمنة لديهم CpGs نقص وفرط ميثيل في المناطق المروجة للجينات المرتبطة بكتلة الدهون. كانت معظم المواقع هيبوميثيل ، والتي يمكن أن تكون مرتبطة بالزيادة الطبيعية في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في هؤلاء الأفراد. قد تعزز حالة الإجهاد التأكسدي هذه الغوانين perturbance في موقع ثنائي النوكليوتيد ، وتشكل 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) ، مما يؤدي إلى موقع ثنائي النوكليوتيد 5mCp-8-OHdG ، ويسبب تجنيد إنزيمات. كل هذه الأحداث يمكن أن تكون مسؤولة عن تعزيز نقص ميثيل الحمض النووي وفرط المثيلة من خلال آليات عمل مختلفة45.

بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن معدل تكوين الدهون يزداد لدى الأفراد الذين يعانون من السمنة ، مع ما يقرب من 10 ٪ من الخلايا الجديدة إلى الخلايا القديمة46،47. يمكن للمساهمات اللاجينية، التي تؤكد على البيئة المسببة للسمنة، أن تغير معدلات انتشار الخلايا وتمايزها، مما يفضل تطور كتلة الدهون48. يمكن أن تؤثر التغيرات اللاجينية أيضا على البرامج الشحمية، مما يسهل أو يقيد تطورها. عوامل النسخ الأولية (PPARγ أو C / EBPα) أو تجميع مجمعات البروتينات المتعددة، المتمركزة في مناطق المروج النهائية التي تعمل عن طريق تضمين أو استبعاد الإنزيمات المعدلة فوق الجينية، تنظم التعبير الجيني من خلال فرط أو نقص الميثيل45. تم وصف مسار PPARγ سابقا لتغيير مسار WNT ، الذي كان يحتوي على جينات غنية في هذه الدراسة. على الرغم من أنه لا يزال من غير المعروف كيف تحدث إشارات WNT أثناء تكوين الدهون ، فقد ذكرت الدراسات الحديثة أنه قد يكون لها أدوار أساسية في استقلاب الخلايا الشحمية ، خاصة في ظل الظروف المسببة للسمنة49.

Disclosures

ليس لدى مؤلفي هذه المقالة أي تضارب في المصالح وليس لديهم إفصاح مالي للإعلان عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر يوان تيان ، دكتوراه (tian.yuan@ucl.ac.uk) لكونه متاحا للإجابة على جميع الشكوك حول حزمة ChAMP. ونشكر أيضا غيليرمي تيليس، السيدة على مساهمته في المسائل التقنية والعلمية الواردة في هذه الورقة؛ قدم اعتبارات مهمة فيما يتعلق بعلم الوراثة اللاجينية وتقنيات التقاط الفيديو وتنسيقه (guilherme.telles@usp.br). تمويل المواد الاستهلاكية: مؤسسة ساو باولو للأبحاث (FAPESP) (#2018/24069-3) والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq: #408292/2018-0). التمويل الشخصي: (FAPESP: #2014/16740-6) وبرنامج التميز الأكاديمي من التنسيق لتطوير موظفي التعليم العالي (CAPES:88882.180020/2018-01). سيتم إتاحة البيانات للجمهور ومجانا دون قيود. مراسلات العنوان إلى NYN (البريد الإلكتروني: nataliayumi@usp.br) أو CBN (البريد الإلكتروني: carla@fmrp.usp.br).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol J.T. Baker B5924-03
Agarose gel Kasvi K9-9100
Electric bioimpedance Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Corning 46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit ZymoResearch, Irvine, CA, USA D5001
Formamide Sigma F9037
FMS—Fragmentation solution Illumina 11203428 Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip Illumina
Maxwell Instrument Promega, Brazil AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix Illumina 11202880 Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix Illumina 11203410 Supplied Reagents
NaOH F. MAIA 114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization Illumina 11291245 Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization Illumina 11191130 Supplied Reagents
2-propanol Emsure 10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution Illumina 11292441 Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix Illumina 15010230 Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix Illumina 11288046 Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix Illumina 11208309 Supplied Reagents
Ultrapure EDTA Invitrogen 155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) ByoSystems 4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) Thermo Fisher Scientific AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1 Illumina 11208288 Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2 Illumina 11208296 Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3 Illumina 11208392 Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4 Illumina 11208430 Supplied Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
  2. World Health Organization. Obesity. , Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017).
  3. Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021).
  4. Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
  5. Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  6. Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
  7. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
  8. Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  9. Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
  10. Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
  11. Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
  12. Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
  13. Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
  14. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
  15. Yong, W. -S., Hsu, F. -M., Chen, P. -Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
  16. Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
  17. Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
  18. Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
  19. Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
  20. Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
  21. Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
  22. Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
  23. Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020).
  24. Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
  25. Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
  26. Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015).
  27. Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , Humana Press. New York, NY. 31-51 (2018).
  28. Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
  29. Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
  30. Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
  31. Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
  32. Tian, Y., et al. The Chip Analysis Methylation Pipeline. , Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020).
  33. Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
  34. Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
  35. Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
  36. Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
  37. Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
  38. Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
  39. Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
  40. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  41. Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
  42. Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
  43. Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
  44. DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
  45. Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
  46. Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
  47. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
  48. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
  49. Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).

Tags

علم الوراثة ، العدد 183 ، مثيلة الحمض النووي ، السمنة ، ChAMP ، المعلوماتية الحيوية ، علم الوراثة اللاجينية ، كتلة الدهون ، مؤشر كتلة الجسم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues,… More

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues, G., de Souza Pinhel, M. A., Cazier, J. B., Watanabe, L. M., Menezes, A. N., Bueno, C. R., Nicoletti, C. F., de Oliveira, B. A. P., Schineider, I. M., Yonehara Noma, I. H., Dias Alcarás, I. C., Barbosa, F., Barbosa Nonino, C. Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies. J. Vis. Exp. (183), e62598, doi:10.3791/62598 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter