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Genetics

डीएनए मिथाइलेशन के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी: मोटापे और संबंधित विशेषता अध्ययन के लिए एसोसिएशन रणनीति

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/62598
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 4, 5, 1, 1, 6, 7, 8, 9, 6
1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान अध्ययन माइक्रोएरे प्रौद्योगिकियों द्वारा प्राप्त डीएनए मिथाइलेशन डेटा का प्रबंधन करने के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल नमूना तैयारी से डेटा विश्लेषण तक के चरणों को प्रदर्शित करता है। सभी प्रक्रियाओं को विस्तार से वर्णित किया गया है, और वीडियो महत्वपूर्ण चरणों को दिखाता है।

Abstract

मोटापा सीधे जीवन शैली से जुड़ा हुआ है और डीएनए मिथाइलेशन परिवर्तनों से जुड़ा हुआ है जो रोग के विकास में योगदान देने वाली एडिपोजेनेसिस और लिपिड भंडारण प्रक्रियाओं में परिवर्तन का कारण बन सकता है। हम मोटापे के साथ और बिना रोगियों के एपिजेनेटिक डेटा विश्लेषण के लिए चयन से एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल के सभी चरणों का परीक्षण किया गया था और एक पायलट अध्ययन में मान्य किया गया था। अध्ययन में 32 महिलाओं ने भाग लिया, जिसमें 15 व्यक्तियों को बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई) (45.1 ± 5.4 किलोग्राम / एम 2) के अनुसार मोटापे के साथ वर्गीकृत किया गया था; और 17 व्यक्तियों को बीएमआई (22.6 ± 1.8 किलोग्राम / एम 2) के अनुसार मोटापे के बिना वर्गीकृत किया गया था। मोटापे के साथ समूह में, वसा द्रव्यमान से संबंधित 564 सीपीजी साइटों को रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा पहचाना गया था। सीपीजी साइटें प्रमोटर क्षेत्रों में थीं। विभेदक विश्लेषण में मोटापे वाले व्यक्तियों में 470 सीपीजी हाइपोमेथिलेटेड और 94 हाइपरमेथिलेटेड साइटें पाई गईं। सबसे hypomethylated समृद्ध pathways RUNX, WNT सिग्नलिंग, और हाइपोक्सिया की प्रतिक्रिया में थे। हाइपरमेथिलेटेड मार्ग इंसुलिन स्राव, ग्लूकागन सिग्नलिंग और Ca2 + से संबंधित थे। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि प्रोटोकॉल ने प्रभावी रूप से डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न और विशेषता से संबंधित डीएनए मिथाइलेशन की पहचान की। इन पैटर्नों को परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है, जो एडिपोजेनेसिस और लिपिड भंडारण को प्रभावित करता है। हमारे परिणामों ने पुष्टि की कि एक ओबेसोजेनिक जीवन शैली मानव डीएनए में एपिजेनेटिक परिवर्तनों को बढ़ावा दे सकती है।

Introduction

बड़े पैमाने पर ओमिक्स प्रौद्योगिकियों का उपयोग पुरानी बीमारियों के अध्ययन में तेजी से किया गया है। इन विधियों की एक दिलचस्प विशेषता वैज्ञानिक समुदाय के लिए बड़ी मात्रा में उत्पन्न डेटा की उपलब्धता है। इसलिए, अध्ययनों के बीच तकनीकी तुलना की अनुमति देने के लिए प्रोटोकॉल को मानकीकृत करने की मांग उत्पन्न हुई है। वर्तमान अध्ययन डीएनए मिथाइलेशन डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल के मानकीकरण का सुझाव देता है, एक लागू उदाहरण के रूप में एक पायलट अध्ययन का उपयोग करता है।

नकारात्मक ऊर्जा व्यय आधुनिक मानव जीवन शैली में प्रबल होता है, जिससे वसा ऊतक का अत्यधिक संचय होता है और परिणामस्वरूप, मोटापे का विकास होता है। कई कारकों ने मोटापे की दर में वृद्धि की है, जैसे कि sedentarism, उच्च कैलोरी आहार, और तनावपूर्ण दिनचर्या। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) का अनुमान है कि 2016 में 1.9 बिलियन वयस्क मोटापे से ग्रस्त थे, जिसका अर्थ है कि दुनिया की 20% से अधिक आबादी में 30 किलोग्राम / एम 2 बीएमआई 2 है। 2018 के सबसे हालिया अपडेट से पता चला कि संयुक्त राज्य अमेरिका (यूएसए) में मोटापे का प्रसार 42% 3 से अधिक था।

एपिजेनेटिक्स गुणसूत्र क्षेत्रों का संरचनात्मक अनुकूलन है जो परिवर्तित गतिविधि राज्यों को पंजीकृत करने, संकेत देने या बनाए रखने के लिए है। डीएनए मेथिलिकरण साइटोसिन-गुआनोसिन डाइन्यूक्लियोटाइड्स साइटों (सीपीजी साइटों) में एक प्रतिवर्ती रासायनिक परिवर्तन है, जो 5-मिथाइलसाइटोसिन-पीजी (5mCpG) बनाता है। यह डीएनए 5,6,7,8 के लिए प्रतिलेखन मशीनरी की पहुंच को विनियमित करके जीन अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकता है। इस संदर्भ में, यह समझना आवश्यक है कि कौन सी सीपीजी साइटें मोटापे से संबंधित लक्षणों से जुड़ी हैं। कई कारक साइट-विशिष्ट डीएनए मिथाइलेशन का समर्थन या रोकथाम कर सकते हैं। इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक एंजाइम, जैसे कि डीएनए मिथाइलट्रांसफरेज़ 10 (DNTMs) और दस-ग्यारह ट्रांसलोकेशन (TETs), पर्यावरणीय एक्सपोज़र 11 के तहत डीएनए मिथाइलेशन या डिमिथाइलेशन को बढ़ावा दे सकते हैं।

पिछले वर्षों में डीएनए मेथिलिकरण अध्ययनों में बढ़ती रुचि को ध्यान में रखते हुए, प्रत्येक प्रश्न का सटीक उत्तर देने के लिए सबसे उपयुक्त विश्लेषण रणनीति चुनना शोधकर्ताओं की एक आवश्यक चिंता का विषय रहा है12,13,14। 450K डीएनए मिथाइलेशन सरणी सबसे लोकप्रिय विधि है, जिसका उपयोग डीएनए मिथाइलेशन प्रोफ़ाइल को निर्धारित करने के लिए 360 से अधिक प्रकाशनों 14 में किया जाता है। यह ज्ञात जीन 15 के 99% में स्थित 485,000 सीपीजी तक के मिथाइलेशन को निर्धारित कर सकता है। हालांकि, इस सरणी को बंद कर दिया गया है और ईपीआईसी के साथ बदल दिया गया है, जिसमें 850,000 सीपीजी साइटों को शामिल किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल को 450K और EPIC16,17,18 दोनों के लिए लागू किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल को चित्रा 1 में चरण-दर-चरण प्रस्तुत किया गया है और इसमें निम्नलिखित चरण शामिल हैं: जनसंख्या चयन, नमूनाकरण, प्रयोग की तैयारी, डीएनए मिथाइलेशन पाइपलाइन, और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण। प्रस्तावित प्रोटोकॉल के चरणों को स्पष्ट करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में किए गए एक पायलट अध्ययन को यहां प्रदर्शित किया गया है।

Figure 1
चित्र 1: प्रस्तुत प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

साओ पाउलो विश्वविद्यालय (HCRP-USP) के Ribeirão Preto Medical School University Hospital की नैतिकता समिति ने अध्ययन को मंजूरी दे दी (CAAE: 14275319.7.0000.5440)। प्रतिभागियों ने सहमति फॉर्म पर हस्ताक्षर किए, और हेलसिंकी की घोषणा के बाद सभी प्रक्रियाएं आयोजित की गईं।

1. जनसंख्या और नमूना

  1. अध्ययन के लिए बीएमआई >30 kg / m2 के साथ प्रतिभागियों को भर्ती करें। वर्तमान अध्ययन के लिए, 18 से 60 वर्ष की आयु के बीच एक मिश्रण आबादी 19 से 32 महिलाओं को भर्ती किया गया था।
    नोट: HCRP-USP में, मोटापे की उच्च दर मुख्य रूप से women20 में देखी गई थी। बीएमआई ≥30 किग्रा / एम 2 (एन = 15) के साथ मोटापे के साथ प्रतिभागियों को एचसीआरपी-यूएसपी में मेटाबोलिक डिजीज आउट पेशेंट क्लिनिक से भर्ती किया गया था। मोटापे के बिना प्रतिभागियों, 18.5 kg / m2 और 24.9 kg / m2 (n = 17) के बीच बीएमआई के साथ, अन्य क्लीनिकों से भर्ती किए गए थे और उन्हें गंभीर बीमारियां नहीं थीं; नैदानिक डेटा तालिका 1 में दिखाया गया है।
  2. उन महिलाओं को बाहर रखें जो गर्भवती हैं, नर्सिंग माताओं, धूम्रपान करने वालों, और शराब का सेवन करती हैं।

2. एंथ्रोपोमेट्री और शरीर की संरचना

  1. 200 किलोग्राम डिजिटल एंथ्रोपोमेट्रिक पैमाने का उपयोग करके प्रतिभागियों के वजन को मापें। जूते और अतिरिक्त कपड़ों को हटाना सुनिश्चित करें।
  2. 0.5 सेमी स्नातक स्तर की पढ़ाई के साथ एक stadiometer का उपयोग कर ऊंचाई का आकलन करें। प्रतिभागियों को नंगे पैर, पैरों को एक साथ खड़े होने और उनके पक्षों द्वारा हथियारों को खड़े होने का निर्देश दिया गया था21।
  3. एक इलेक्ट्रिक bioimpedance का उपयोग कर वसा द्रव्यमान (एफएम) जानकारी एकत्र करें। उपवास के 12 घंटे के बाद, एक खाली मूत्राशय के साथ आकलन करें। प्रतिभागियों को शरीर को छूने के बिना पैरों को अलग करने और हाथों के समानांतर के साथ, सुपाइन स्थिति में रखें। प्रतिभागियों को सभी धातु सामान को हटाने के लिए निर्देश दें22.
  4. एक 0.1 मिमी स्नातक स्तर की पढ़ाई के साथ एक अटूट मापने टेप का उपयोग कर कमर परिधि (WC) प्राप्त करें। टेप को कूल्हे की हड्डियों के ठीक ऊपर, मध्य कमर के चारों ओर क्षैतिज रूप से रखा गया था। माप एक सांस बाहर निकलने के तुरंत बाद हुआ। रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) के अनुसार, महिलाओं के लिए डब्ल्यूसी कट-ऑफ 88 सेमी 23 है।

तालिका 1: जनसंख्या विशेषताएं। सभी चर पैरामीट्रिक (पी > 0.05, शापिरो विल्क) थे, और मतभेदों का मूल्यांकन एक स्वतंत्र टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था, जिसमें पी < 0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता था। * पी < 0.0001. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

3. जैविक सामग्री का संग्रह

  1. उपवास के 12 घंटे के बाद परिधीय रक्त एकत्र करें, जैसा कि पहले वर्णित है24।
  2. एंटीकोआगुलेंट (जैसे, ईडीटीए) के साथ संग्रह ट्यूबों में पूरे रक्त के नमूनों के 4 मिलीलीटर एकत्र करें और उन्हें परिवहन के लिए बर्फ पर स्टोर करें।

4. डीएनए निष्कर्षण

  1. 10 मिनट के लिए 2,000 x g पर रक्त युक्त प्रत्येक ट्यूब सेंट्रीफ्यूज। बफी कोट (सफेद इंटरफ़ेज़) के लगभग 300 μL इकट्ठा करें।
  2. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण का उपयोग करके परिधीय रक्त से डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें), जैसा कि पहले वर्णित है25। अल्ट्राप्योर H2O के 480 μL में डीएनए को एल्यूट करें।
  3. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता और गुणवत्ता का आकलन करें। अखंडता का मूल्यांकन 1% agarose जेल analysis25 का उपयोग करके किया गया था। -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में स्टोर करें।

5. मिथाइलेशन विश्लेषण से पहले तैयारी

  1. सुनिश्चित करें कि नमूनों में न्यूनतम डीएनए एकाग्रता है (500 एनजी शुरू करने के लिए आदर्श प्रारंभिक इनपुट है), लेकिन कमजोर पड़ने इस चरण में नमूनों के बीच भिन्न हो सकता है।
  2. कुछ अभिकर्मकों को माइक्रोएरे किट 26 में शामिल नहीं किया गया है, इसलिए उन्हें अलग से खरीदें27।
  3. जांचें कि किट में प्रक्रिया के दौरान उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मक हैं या नहीं; वे अपूरणीय हैं। सभी अभिकर्मकों की समाप्ति तिथि की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि किट में प्रदान नहीं किए गए अन्य अभिकर्मक और समाधान भी उपलब्ध हैं (95% formamide / 1 mM EDTA, 0.1 N NaOH, पूर्ण इथेनॉल, 2-propanol)।
    सावधानी: Formamide एक वाष्पशील अभिकर्मक है; परिणामों की गुणवत्ता में सुधार किया जा सकता है यदि उत्पाद ताजा है। फॉर्मामाइड और निरपेक्ष इथेनॉल की अखंडता और गुणवत्ता को महत्वपूर्ण माना जाता है क्योंकि वे निर्माता द्वारा प्रस्तावित धुंधला प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। चुने गए अल्कोहल आणविक जीव विज्ञान विश्लेषण के लिए विशिष्ट अल्ट्राप्योर उत्पाद होने चाहिए।
  4. एक बार जब माइक्रोएरे किट का अधिग्रहण हो जाता है, तो चिप्स डीकोड मैप्स (डीएमएपी) डाउनलोड करें। उन फ़ाइलों को निर्माता की वेबसाइट पर उपलब्ध हैं 24-48 घंटे के बाद किट भेज दिया गया है और समाप्ति तिथि 28 पर बाहर रखा गया है। उल्लिखित फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. सुनिश्चित करें कि इंटरनेट एक्सेस वाला कंप्यूटर उपलब्ध है। सॉफ़्टवेयर डिकोड फ़ाइल क्लाइंट का उपयोग कर डाउनलोड निष्पादित करें।
    2. प्रोग्राम स्थापित करने से पहले, सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर में संस्था द्वारा दी गई आउटबाउंड और इनबाउंड एक्सेस है; डिकोड फ़ाइल क्लाइंट सुरक्षा प्रतिबंध नहीं है।
    3. बीडचिप द्वारा पहुँच विकल्प का उपयोग कर डीकोड फ़ाइल क्लाइंट सॉफ़्टवेयर में लॉग इन करें। यह लॉगिन MyIllumina उपयोगकर्ता आईडी और पासवर्ड का उपयोग करके किया जाता है। इस पृष्ठ पर पंजीकरण की आवश्यकता है28.
    4. डिकोड फ़ाइल क्लाइंट में लॉग इन करने के बाद, सॉफ़्टवेयर होम पेज 28 पर अपने संबंधित फ़ील्ड में नीचे सूचीबद्ध जानकारी दर्ज करें: बारकोड की सूची; बॉक्स आईडी की सूची; खरीद आदेश संख्या (पीओ); और विक्रय आदेश संख्या (संख्याओं का पालन करने वाले अक्षरों को शामिल नहीं करने के लिए याद रखें)।
    5. खरीद बॉक्स में बारकोड संख्या के अनुसार डाउनलोड करने के लिए DMAPs का चयन करें और DMAPs को सहेजने के लिए संवाद बॉक्स में गंतव्य निर्दिष्ट करें।
    6. डाउनलोड प्रारंभ करने के लिए बटन पर क्लिक करें.
      नोट:: डाउनलोड के अंत में, सुनिश्चित करें कि डाउनलोड किए गए फ़ोल्डर खाली नहीं हैं और फ़ाइलों को सुरक्षित रूप से संग्रहीत करें, क्योंकि वे प्रयोगों को तीव्रता डेटा फ़ाइलों (IDAT फ़ाइलों) में कनवर्ट करने के लिए अंतिम चरण के लिए आवश्यक होंगे। समाप्ति दिनांक के बाद, Illumina अपने ऑनलाइन डेटाबेस से DMAPs डेटा निकाल सकता है।

6. डीएनए मिथाइलेशन पाइपलाइन

नोट: डीएनए मिथाइलेशन प्रयोग को 4 दिनों में विभाजित किया गया है (चित्र1)। सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए निर्माता की सिफारिशों और विनिर्देशों का पालन करें।

  1. दिन 1: Bisulfite उपचार
    1. जीनोमिक डीएनए के 500 एनजी विकृत करके शुरू करें, फिर रूपांतरण अभिकर्मकों को जोड़ें। इस चरण को निष्पादित करने के लिए, bisulfite और माइक्रोएरे kits29 की सिफारिशों का पालन करें।
    2. निर्माता द्वारा प्रदान की गई मानक एकाग्रता पर bisulfite रूपांतरण अभिकर्मक के 130 μL के साथ विकृत डीएनए का इलाज करें।
    3. 30 s के लिए 95 °C पर 16 चक्रों के लिए एक thermocycler में ट्यूब incubate और 1 घंटे के लिए 50 °C. 10 मिनट के लिए थर्मोसाइकिलर को 4 डिग्री सेल्सियस तक रैंप करें।
    4. वाशिंग बफर के 100 μL को जोड़कर और फिर 30 s के लिए पूर्ण गति से centrifuging द्वारा धोने के चरण का प्रदर्शन करें। एकाग्रता उपयोगकर्ता गाइड में प्रदान नहीं की जाती है, और निर्माता वॉल्यूम को मानकीकृत करता है।
      नोट: यह अभिकर्मक किट के साथ आता है और पतला या तैयार करने की आवश्यकता नहीं है।
  2. दिन 2: प्रवर्धन - मिथाइलेशन परख, मैनुअल प्रोटोकॉल
    1. संकरण ओवन को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें और तापमान को संतुलित करने की अनुमति दें।
    2. एक 0.8 mL माइक्रोप्लेट के लिए एक बारकोड लेबल लागू करें।
    3. कमरे के तापमान पर प्रवर्धन अभिकर्मकों (मल्टी-सैंपल प्रवर्धन मिक्स 1, रैंडम प्राइमर मिक्स, और मल्टी-सैंपल एम्प मास्टर मिक्स) को पिघलाएं (उन अभिकर्मक किट के साथ आते हैं और उन्हें पतला या तैयार करने की आवश्यकता नहीं होती है)। फिर, कम से कम 10x पर एक कोमल व्युत्क्रम प्रदर्शन करें जब तक कि ट्यूबों की पूरी सामग्री मिश्रित न हो जाए।
    4. प्लेट के कुओं में मल्टी-सैंपल एम्प्लीफिकेशन मिक्स 1 (एमए 1) के 20 μL को वितरित करें।
    5. 0.8 mL प्लेट पर इसी कुओं के लिए bisulfite परिवर्तित प्लेट से डीएनए नमूने के 4 μL स्थानांतरण. इस बिंदु पर, प्लेट कुओं के अनुरूप प्रयोगशाला ट्रैकिंग फॉर्म पर मूल डीएनए नमूने की आईडी रिकॉर्ड करें।
    6. मल्टी-सैंपल प्रवर्धन मिश्रण 1 (MA1) और डीएनए नमूना युक्त प्लेट के प्रत्येक कुएं में 0.1 N NaOH के 4 μL वितरित करें।
    7. प्लेट को प्लास्टिक की सील से सील करें।
    8. 1 मिनट के लिए 1,600 आरपीएम पर नमूनों के साथ अभिकर्मकों को मिलाने के लिए प्लेट को भंवर करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और सावधानी से सील को हटा दें।
    9. प्लेट के प्रत्येक कुएं में रैंडम प्राइमर मिक्स (आरपीएम) के पिपेट 68 μL। प्लेट के प्रत्येक कुएं में बहु-नमूना Amp मास्टर मिक्स (MSM) के पिपेट 75 μL (पिछले समाधान को हटाने के बिना)। प्लेट को कवर करने के लिए एक नई मुहर का उपयोग करें।
      नोट: प्लेट के साथ कुओं को संयोजित करने और इसे सही ढंग से उन्मुख करने का ध्यान रखें।
    10. भंवर 1 मिनट के लिए 1,600 आरपीएम पर सील प्लेट सील प्लेट. संकरण ओवन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. दिन 3: संकरण - मिथाइलेशन परख, मैनुअल प्रोटोकॉल
    1. ब्लॉक को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
    2. कमरे के तापमान पर ट्यूब की सामग्री को पिघलाएं। ध्यान से और धीरे से विखंडन समाधान (FMS) ट्यूबों को कम से कम 10x पर उलटें सामग्री को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
    3. ध्यान से संकरण ओवन से प्लेट निकालें। पल्स-सेंट्रीफ्यूज प्लेट को 280 x g पर।
    4. अब थाली से सील हटा दें। एक नमूना युक्त प्लेट के प्रत्येक कुएं में, विखंडन समाधान (एफएमएस) के 50 μL जोड़ें और प्लेट को फिर से सील करें। 1 मिनट के लिए 1,600 आरपीएम पर प्लेट को भंवर करें।
    5. कुछ सेकंड के लिए 280 x g पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें (पल्स सेंट्रीफ्यूजेशन करें)। फिर, सील की गई प्लेट को हीटिंग ब्लॉक पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    6. यदि प्रयोग को रोकने और प्लेट को फ्रीज करने का निर्णय लिया गया था, तो इसे कमरे के तापमान पर पिघलाएं, और इसे 280 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। यदि यह जमे हुए नहीं है, तो इस चरण को छोड़ दें और चरण 6.3.7 पर जाएँ।
    7. हीटिंग ब्लॉक को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करने के लिए छोड़ दें।
    8. कमरे के तापमान पर पिघलने के लिए वॉश बफर छोड़ दें। जब defrosted, सामग्री मिश्रण करने के लिए इसे कम से कम 10x उलटा.
    9. थाली से सील को हटा दें।
    10. नमूने युक्त प्लेट के प्रत्येक कुएं में वर्षा समाधान (PM1) के 100 μL जोड़ें।
    11. थाली को सील के साथ फिर से सील करें।
    12. 1 मिनट के लिए 1,600 आरपीएम पर प्लेट को भंवर करें।
    13. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    14. फिर, 1 मिनट के लिए 280 x g पर पल्स सेंट्रीफ्यूज में रखें।
      नोट:: अगले चरण के लिए 4 °C पर centrifuge सेट करें।
    15. ध्यान से थाली से सील निकालें और इसे छोड़ दें।
    16. नमूना युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 2-propanol (100%) के 300 μL जोड़ें।
    17. एक नई मुहर का उपयोग कर अत्यधिक देखभाल के साथ प्लेट सील। ध्यान रखें कि प्लेट को हिलाएं नहीं।
    18. प्लेट को कम से कम 10x उलटें, पूरी सामग्री को मिलाएं।
    19. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    20. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
      नोट: चरण 6.3.20 के अंत में, तुरंत सेंट्रीफ्यूज प्लेट को हटा दें।
    21. थाली से सील को हटा दें और इसे छोड़ दें।
    22. जल्दी से प्लेट उलटें और supernatant त्यागने के लिए एक पैड पर तरल नाली। फिर, तरल को निकालने के लिए एक पेपर तौलिया पर एक सूखे क्षेत्र में प्लेट को मारो।
    23. 1 मिनट के लिए या जब तक सभी कुएं किसी भी तरल से मुक्त न हों, तब तक कई बार दृढ़ता से टैप करें।
    24. प्लेट को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए उल्टा और खुला छोड़ दें।
      नोट: यह कुओं के तल पर नीले छर्रों को देखने की उम्मीद है।
    25. संकरण ओवन को 48 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
    26. प्रीहीट करने के लिए हीट ब्लॉक चालू करें। इस प्रक्रिया के लिए 20 मिनट की अनुमति दें।
    27. कमरे के तापमान पर थाव रिस्पेंशन, संकरण, और वॉश सॉल्यूशन। कम से कम 10x उलटें। जांचें कि समाधान में कोई नमक अवक्षेपित नहीं है।
    28. प्लेट के प्रत्येक कुएं में 46 μL Resuspension, संकरण, और वॉश सॉल्यूशन (RA1) जोड़ें।
      नोट:: किसी भी शेष अभिकर्मकों धुंधला और संकरण चरणों के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए।
    29. थाली में सील लगाएं। प्लेट को कवर करने के लिए एक एल्यूमीनियम सील का उपयोग करें। सीलिंग को समान रूप से करने के लिए कसकर पकड़ो।
    30. जांचें कि क्या वाष्पीकरण से बचने के लिए सभी कुएं सुरक्षित रूप से बंद हैं।
    31. संकरण ओवन में नई सील प्लेट को ध्यान से रखें और 1 घंटे के लिए 48 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    32. 1 मिनट के लिए 1,800 आरपीएम पर प्लेट को भंवर करें।
    33. पल्स सेंट्रीफ्यूज 280 x g पर।
    34. प्लेट को 1 घंटे के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ब्लॉक में स्थानांतरित करें।
    35. संकरण (Hyb) कक्षों को एक साथ रखकर तैयार करें। Hyb Chambers के जलाशयों में Humidifying Buffer (PB2) के 400 μL वितरित करें। ढक्कन को तुरंत चालू करें।
    36. माइक्रोएरे के नमूना प्रविष्टि उद्घाटन में प्लेट से प्रत्येक नमूना लोड करें।
    37. हाइब चैंबर में माइक्रोएरे युक्त हाइब चैंबर आवेषण लोड करें। Hyb चैंबर के संभावित स्थानांतरण से बचने के लिए Hyb चैंबर crosswise बंद करें।
      नोट: हाइब चैंबर्स को कम से कम 16 घंटे के लिए 48 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने की आवश्यकता है, लेकिन 24 घंटे से अधिक नहीं।
  4. दिन 4: धुंधला - मिथाइलेशन परख, मैनुअल प्रोटोकॉल
    1. 100% EtOH के 330 mL के साथ स्टेनिंग समाधान 4 को फिर से निलंबित करें, 350 mL की अंतिम मात्रा प्राप्त करें। पूर्ण पुन: निलंबन सुनिश्चित करने के लिए स्टेनिंग समाधान 4 बोतल को सख्ती से हिलाएं। कमरे के तापमान पर रखें।
      नोट: स्टेनिंग समाधान 4 को 2 डिग्री सेल्सियस और 8 डिग्री सेल्सियस के बीच के तापमान पर 2 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. संकरण ओवन से कक्षों को हटा दें और उन्हें खोलने से पहले 30 मिनट के लिए बेंच पर ठंडा करने की अनुमति दें।
    3. जबकि हाइब चैंबर ठंडा हो रहा है, वॉश बफर (200 एमएल प्रति वॉशिंग कंटेनर) के साथ दो वॉशिंग कंटेनर भरें। प्रत्येक कंटेनर को "वॉश बफर" (PB1 और PB2) के रूप में लेबल करना याद रखें।
    4. वाश बफ़र के 150 mL के साथ माइक्रोएरे संरेखण सामान भरें।
    5. प्लास्टिक स्पेसर को अलग करें और यदि आवश्यक हो, तो ग्लास को साफ करें।
    6. माइक्रोएरे स्लाइड को धोने के लिए, तार लूप को ग्रिड में संलग्न करें और कुल 10x के लिए वॉश बफर के 200 मिलीलीटर के साथ कंटेनरों में टपकाव उपकरण को विसर्जित करें।
    7. संकरण कक्ष से सभी आवेषण निकालें और आवेषण से प्रत्येक सरणी निकालें। सील को हटा दें।
      नोट:: निकालने के दौरान, उजागर matrices स्पर्श न करें।
    8. संकरण कक्ष से माइक्रोएरे स्लाइड को हटाते समय, कुछ भी फैलाने के लिए सावधान रहें।
    9. वॉश बफर (PB1) समाधान में माइक्रोएरे को धीरे-धीरे और हल्के से धोएं, 10x ऊपर और नीचे जा रहे हैं। एक ताजा PB1 समाधान के लिए ले जाएँ और धीरे-धीरे माइक्रोएरे 10x ऊपर और समाधान में नीचे ले जाकर धोने का प्रदर्शन करें।
    10. कंटेनर से माइक्रोएरे को हटा दें और अवशेषों की अनुपस्थिति की पुष्टि करें।
    11. प्रत्येक माइक्रोएरे के शीर्ष पर एक पारदर्शी स्पेसर का उपयोग करें और स्पेसर्स को संबंधित पदों पर मार्गदर्शन करें।
      नोट: केवल पारदर्शी स्पेसर का उपयोग करने के लिए सावधान रहें, न कि सफेद लोगों का।
    12. संरेखण गौण पर संरेखण पट्टी रखें.
    13. स्पष्ट स्पेसर के शीर्ष पर एक ग्लास बैकप्लेट रखें; पूरे माइक्रोएरे को कवर करने के लिए सावधान रहें। फिर, प्रवाह कक्षों के लिए धातु clamps संलग्न करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रवाह कक्ष स्पेसर्स के सिरों को ट्रिम करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    14. तुरंत ddH2O का उपयोग कर संकरण चैंबर जलाशयों को धोएं और एक छोटे से सफाई ब्रश के साथ स्क्रब करें। जलाशय में रहने के लिए किसी भी Humidifying बफर की अनुमति न दें।
    15. विस्तार और धुंधला माइक्रोएरे के लिए जिम्मेदार है जो अगले चरण के लिए ले जाएँ।
      नोट: सभी प्रवाह कक्षों क्षैतिज रूप से प्रयोगशाला बेंच पर घुड़सवार छोड़ दें। केवल उन्हें फिर से संभालें जब पूरे धुंधला कदम तैयार है। Resuspension, संकरण, और वॉश सॉल्यूशन को 20 °C और 25 °C के बीच के तापमान पर गर्म करें। धीरे से मिलाएं जब तक कि समाधान में कोई क्रिस्टल नहीं दिखाई देता है।
    16. अनुक्रम में एक रैक में अभिकर्मकों जगह. यदि कोई जमे हुए हैं, तो उन्हें कमरे के तापमान पर छोड़ दें और फिर समाधानों को मिलाने के लिए उन्हें कम से कम 10x उलटें।
    17. पानी के परिसंचरणकर्ता को उचित स्तर पर भरें।
    18. पंप को चालू करें और तापमान को 44 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    19. कक्ष रैक से जुड़े किसी भी बुलबुले को निकालें।
    20. एक तापमान जांच का उपयोग कर कक्ष रैक पर परीक्षण प्रदर्शन. सभी परीक्षण किए गए स्थान 44 डिग्री सेल्सियस ± 0.5 डिग्री सेल्सियस के बीच होने चाहिए।
      नोट:: निम्न चरणों को बिना किसी रुकावट के निष्पादित किया जाना चाहिए।
    21. जब रैक 44 डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुंच जाता है, तो जल्दी से प्रत्येक असेंबली को प्रवाह कक्ष में रखें।
      नोट:: निम्न चरणों के लिए, सभी अभिकर्मकों को पीछे की कांच की प्लेट में पिपेट करें।
    22. पिपेट 150 μL Resuspension, संकरण, और वॉश समाधान (RA1) के। फिर, 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण को कुल 5x दोहराएँ।
    23. Pipette 450 धुंधला समाधान 1 (XC1) के μL और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
    24. Pipette 450 धुंधला समाधान 2 (XC2) के μL और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
    25. दो रंग एक्सटेंशन मास्टर मिक्स (TEM) के पिपेट 200 μL और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    26. 95% फॉर्मामाइड/1 mM EDTA का पिपेट 450 μL और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। दो बार दोहराएं।
    27. 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    28. कक्ष रैक के तापमान को 32 डिग्री सेल्सियस तक कम करें (सुपीरियर टू-कलर मास्टर मिक्स पर इंगित किया गया है)।
    29. पिपेट 450 μL स्टेन सॉल्यूशन 3 (XC3) का और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 1x दोहराएं।
    30. सही तापमान तक पहुंचने के लिए कक्ष में रैक की प्रतीक्षा करें।
      नोट:: रंग प्रक्रिया के तुरंत बाद माइक्रोएरे छवि को पढ़ने के लिए, इस चरण में स्कैनर को चालू करें।
    31. अब सुपीरियर टू-कलर मास्टर मिक्स (एसटीएम) के 250 μL को वितरित करें, इसके बाद 10 मिनट की इनक्यूबेशन।
    32. फिर, दाग समाधान 3 (XC3) के 450 μL वितरित करें, इसके बाद 1 मिनट इनक्यूबेशन। 1x दोहराएँ.
    33. 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और फिर एंटी-स्टेन 2-कलर मास्टर मिक्स (एटीएम) के 250 μL जोड़ें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    34. अब सुपीरियर टू-कलर मास्टर मिक्स (एसटीएम) के 250 μL को वितरित करें, इसके बाद 10 मिनट की इनक्यूबेशन।
    35. फिर, दाग समाधान 3 (XC3) के 450 μL वितरित करें, इसके बाद 1 मिनट इनक्यूबेशन। 1x दोहराएँ.
    36. 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    37. एंटी-स्टेन 2-कलर मास्टर मिक्स (एटीएम) के 250 μL जोड़ें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    38. स्टेन माइक्रोएरे समाधान 3 (XC3) के 450 μL जोड़ें और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर फिर से दोहराएं।
    39. 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
      नोट:: निम्न पुनरावृत्ति योजना करें: चरण 6.4.34., चरण 6.4.35। और चरण 6.4.36;; चरण 6.4.37., 6.4.38., और चरण 6.4.39;; चरण 6.4.34., चरण 6.4.35., और चरण 6.4.36.
    40. अब, तुरंत रैक से प्रवाह कक्षों को हटा दें और सावधानी से उन्हें प्रयोगशाला बेंच पर क्षैतिज रूप से रखें। सुनिश्चित करें कि तापमान परिवेश है।
    41. 6.4.41.Place 310 mL वॉश सॉल्यूशन (PB1) एक वॉश कंटेनर में प्रत्येक माइक्रोएरे के लिए।
    42. धातु clamps और कांच निकालें, और अंत में, माइक्रोएरे.
    43. एक धुंधला रैक पर माइक्रोएरे रखें और उन्हें 10x PB1 समाधान युक्त धोने के कंटेनर में रखें। सुनिश्चित करें कि बारकोड जो भी उन्हें संभाल रहा है उससे दूर का सामना कर रहे हैं और सभी माइक्रोएरे जलमग्न हैं।
    44. ऊपर और नीचे आंदोलनों 10x के साथ धीरे-धीरे और हल्के से आगे बढ़ें। माइक्रोएरे को फिर से जलमग्न होने से पहले समाधान से पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए। फिर, इसे 5 मिनट के लिए जलमग्न रहने दें।
    45. कुल पुनर्सस्पेंशन सुनिश्चित करने के लिए दाग समाधान 4 (XC4) अभिकर्मक को जोरदार ढंग से हिलाएं। एक धोने के कंटेनर में XC4 के 310 mL रखें।
      नोट: समाधान को 10 मिनट से अधिक समय तक धोने के कंटेनर में न बैठने दें।
    46. हल्के से XC4 के साथ दूसरे कंटेनर के लिए धुंधला स्टैंड ले जाएँ.
    47. ऊपर और नीचे आंदोलनों 10x के साथ धीरे-धीरे और हल्के से आगे बढ़ें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोएरे को फिर से जलमग्न होने से पहले समाधान से पूरी तरह से हटा दिया गया है।
    48. फिर, माइक्रोएरे को 5 मिनट के लिए जलमग्न रहने दें।
    49. दाग स्टैंड को समाधान से बाहर ले जाएं और इसे बारकोड के साथ एक ट्यूब धारक में रखें।
    50. लॉकिंग संदंश का उपयोग करके माइक्रोएरे को सावधानीपूर्वक हटा दें और उन्हें सूखने के लिए शेल्फ पर रखें।
    51. 675 मिमी एचजी (0.9 बार) पर 50-55 मिनट के लिए वैक्यूम डेसिकेटर का उपयोग करके उन्हें सूखाएं।
    52. EtOH का उपयोग कर प्रत्येक माइक्रोएरे के पीछे साफ करें।
      सावधानी: धारियों को छूने से बचें, और EtOH को किसी भी तरह से धारियों पर ड्रिप करने की अनुमति न दें।
    53. माइक्रोएरे छवि के लिए आगे बढ़ें।
    54. सावधानी से कमरे के तापमान पर एक भंडारण बॉक्स में माइक्रोएरे स्टोर करें।
      नोट: माइक्रोएरे छवियों को 72 घंटे के भीतर लिया जाना चाहिए।

7. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

नोट: माइक्रोएरे के प्रकार की कुछ विशेषताओं को बदलना आवश्यक है (उदाहरण के लिए, arraytype = "450k" को arraytype = "EPIC" द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए)। CHAMP पाइपलाइन के लेखक विस्तार से उन सभी क्षेत्रों का वर्णन करता है जिन्हें package30 के Bioconductor पृष्ठ पर सरणियों का विश्लेषण करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए।

  1. नमूना पत्रक
    1. BIOINFORMATICS analysis31 के साथ आगे बढ़ने के लिए कंप्यूटर पर IDAT फ़ाइलों को स्थानांतरित करें। डेटा विश्लेषण 31 करने के लिए एक नमूना पत्रक बनाएँ।
      नोट:: तीन स्तंभ इस स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए आवश्यक हैं। पहला है Sample_name। इस स्तंभ में नमूनों की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नाम या कोड शामिल होने चाहिए. दूसरा Sentrix_position है। यह स्तंभ नमूनों के संबंधित R01C01 रखता है, जिसमें R01 चिप पंक्ति के लिए जिम्मेदार है और स्तंभ को C01 के रूप में संदर्भित किया जा रहा है। तीसरा आवश्यक स्तंभ Sentrix_ID है, और यह संख्या प्राप्त करने के लिए जिम्मेदार है जो माइक्रोएरे की पहचान करता है। सही संख्याओं को रखना सुनिश्चित करें। चर मानों के रूप में नमूना पत्रक पर अन्य जानकारी जोड़ना संभव है। वर्तमान प्रयोग में, धातु विश्लेषण से डेटा शामिल किए गए थे।
  2. CHAMP पाइपलाइन
    1. Analysis30 करने के लिए कंप्यूटर पर RStudio (V.4.0.2) स्थापित करें।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर RAM की एक न्यूनतम 8 G है। डेटा विश्लेषण रैम की कम मात्रा के साथ संघर्ष या क्रैश होगा।
    2. स्थापना के बाद, RStudio खोलें और संबंधित कमांड लाइन का उपयोग कर CHAMP Bioconductor package30 स्थापित करें ( अनुपूरक सामग्री 1 देखें)।
      नोट:: स्थापना के अंत में कोई त्रुटि है, तो आवश्यक CHAMP लायब्रेरीज़ मैन्युअल रूप से स्थापित करें, एक-एक करके 26।
    3. अब, कच्चे डेटा आयात करें और विश्लेषण करें। अनुपूरक सामग्री 1 देखें।
      champ.load() कच्चे डेटा आयात करता है और फ़िल्टरिंग प्रक्रिया करता है, कम पता लगाने pval, multihit साइटों, गैर सीजी जांच, SNPs के पास CpG साइटों, और यौन गुणसूत्रों में स्थित CpGs के साथ जांच को छोड़कर.
      champ.impute() डिफ़ॉल्ट के रूप में KNN आरोपण निष्पादित करता है।
      कुतरना। QC डेटा गुणवत्ता रेखांकन (उदाहरण के लिए, घनत्व प्लॉट ग्राफ़) को पुनः प्राप्त करता है।
      कुतरना। SVD नमूना पत्रक में प्रदान किए गए मेटाडेटा के आधार पर बैच प्रभावों का मूल्यांकन करता है।
      champ.refbase() सेल प्रकार अनुमान और सुधार करता है।
      कुतरना। DMP () समूहों के बीच डीएनए मिथाइलेशन की जांच करने और मापदंडों को बदलने के लिए वसा द्रव्यमान जैसे विभेदक रूप से मेथिलेटेड पदों और विशेषता संघों को पुनर्प्राप्त करता है, जैसा कि पूरक सामग्री 1 में दिखाया गया है।
  3. संवर्धन (स्ट्रिंग डीबी)
    नोट: कार्यात्मक संवर्धन का उपयोग जीन के एक सेट के जैविक कार्यों का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है।
    1. किसी स्ट्रिंग में डेटा को समृद्ध करने के लिए, इनपुट के रूप में समृद्ध और उपयोग करने के लिए लक्ष्यों की सूची का चयन करें: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. जीव के लिए, होमो सेपियन्स का चयन करें और खोज बटन दबाएं।
    3. संवर्धन के माध्यम से नेविगेट करने के लिए, विश्लेषण बटन पर क्लिक करें।
  4. GEO सबमिशन
    1. डेटा को एनसीबीआई के जीओ जैसे सार्वजनिक भंडार में जमा करें। इसके लिए, सबमिटर खाते के लिए पंजीकरण करें।
      नोट:: समग्र प्रयोग और व्यक्तिगत नमूनों के लिए वर्णनात्मक जानकारी और प्रोटोकॉल के साथ मेटाडेटा पत्रक डाउनलोड करके GEO सबमिशन (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) को पूरा करें। GEO संग्रह प्रस्तुतियाँ किसी भी स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में बनाया जा सकता है। दूसरा, निर्देशिका में सभी पुस्तकालयों के लिए सेल-रेंजर गणना स्क्रिप्ट से उत्पन्न कच्ची डेटा फ़ाइल जोड़ें। IDAT और संबद्ध फ़ाइलें या मैट्रिक्स कार्यपत्रक में गैर-सामान्यीकृत डेटा होता है. तीसरा फ़ोल्डर संसाधित डेटा फ़ाइलें है। मैट्रिक्स तालिका एक स्प्रेडशीट है जिसमें पंक्तियों और नमूनों में तुलनीय अंतिम, सामान्यीकृत मान होते हैं और अधिमानतः किसी भी साथ पांडुलिपि में वर्णित के रूप में संसाधित होते हैं।
    2. सभी लायब्रेरीज़ के लिए सेल-रेंजर गणना स्क्रिप्ट से उत्पन्न संसाधित डेटा फ़ाइलों को निर्देशिका में रखें. सभी तीन घटकों वाली निर्देशिका को स्थानांतरित करने के लिए GEO सबमिटर के FTP सर्वर क्रेडेंशियल्स का उपयोग करें।

Representative Results

CHAMP पाइपलाइन का उपयोग करने के बाद, सभी फिल्टर (अयोग्य CpGs, गैर-CG जांच, SNPs के पास CpG, multihit साइटों, और XY से संबंधित CpGs) के बाद विश्लेषण में 409,887 जांच पर विचार किया गया था; एक योजना को चित्र 2 में दर्शाया गया है।

Figure 2
चित्र 2: जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण की पाइपलाइन। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसके अलावा, घनत्व प्लॉट से पता चला कि सभी नमूनों में गुणवत्ता नियंत्रण चरणों से संबंधित बीटा वितरण के समान घनत्व थे। यह विश्लेषण बीटा मूल्यों के वितरण का मूल्यांकन करता है और बताता है कि क्या कोई नमूना है जिसे बाहर रखने की आवश्यकता है। इस बैच में, इस विश्लेषण के आधार पर कोई भी नमूने बाहर नहीं रखे गए थे।

Figure 3
चित्र 3: बीटा मान घनत्व प्लॉट CHAMP पैकेज के साथ प्राप्त किया गया है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

एकवचन मूल्य अपघटन (एसवीडी) विश्लेषण का उपयोग उन प्रमुख घटकों को सत्यापित करने के लिए किया गया था जो डीएनए मिथाइलेशन डेटा परिवर्तनशीलता को काफी प्रभावित करते थे। डेटा से पता चला है कि बीएमआई, डब्ल्यूसी (पी < 1e10-5), और एफएम (पी < 0.05) का डेटा परिवर्तनशीलता (चित्रा 4) पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा।

Figure 4
चित्र 4: एकवचन मान अपघटन विश्लेषण। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सेल प्रकार के अनुमान से पता चला है कि दोनों प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं (एनके) और बी कोशिकाएं मोटापे से ग्रस्त महिलाओं में अधिक थीं (चित्रा 5)।

Figure 5
चित्रा 5: हाउसमैन की विधि द्वारा अनुमानित सेल अंश। ग्रैन: ग्रैनुलोसाइट। CD4T: सहायक टी सेल, लिम्फोसाइट। CD8T: साइटोटॉक्सिक टी सेल, लिम्फोसाइट। मोनो: मोनोसाइट। बी सेल: बी लिम्फोसाइट। एनके: प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, लिम्फोसाइटों। * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मोटापे से ग्रस्त और गैर-मोटापे से ग्रस्त महिलाओं के बीच डीएनए मिथाइलेशन का स्तर सेल-प्रकार के सुधार से पहले और बाद में भिन्न था। सेल प्रकारों के लिए डीएनए मिथाइलेशन डेटा सुधार से पहले, 43,463 विभेदक रूप से मेथिलेटेड पदों (डीएमपी) को देखा गया था, और 3,329 सीपीजी बाद में महत्वपूर्ण बने रहे। 445 सीपीजी साइटें इंटरजेनिक क्षेत्रों (आईजीआर) में थीं, और 2,884 जेनिक क्षेत्रों में थीं, जिनमें से अधिकांश प्रमोटर क्षेत्र (एन = 1,438) में थीं। सभी क्षेत्रों के साथ वितरण TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), पहला एक्सोन (n = 273), शरीर (n = 724), और 3'UTR (n = 59) थे। <-0.05 और >0.05 के मानों को ध्यान में रखते हुए, 162 सीपीजी हाइपोमिथाइलेटेड थे और गैर-मोटापे से ग्रस्त व्यक्तियों की तुलना में मोटापे से ग्रस्त लोगों में 576 हाइपरमिथाइलेटेड थे (चित्रा 6)। डेटा रजिस्टर कोड GSE166611 के अंतर्गत GEO डेटाबेस में उपलब्ध हैं।

Figure 6
चित्र 6: विभेदक रूप से मेथिलेटेड स्थितियाँ। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समूहों के बीच विभिन्न मिथाइलेशन का मूल्यांकन करना और मिथाइलेशन अध्ययनों में विशिष्ट लक्षणों से जुड़ी सीपीजी साइटों को ढूंढना संभव है। वसा द्रव्यमान अध्ययन के लिए, 13,222 सीपीजी साइटें पाई गईं। प्रमोटर क्षेत्र में 6,159 सीपीजी वसा द्रव्यमान से संबंधित थे, जिसमें 470 हाइपरमेथिलेटेड और 94 हाइपोमेथिलेटेड (चित्रा 7) थे, और संबंधित जीन समृद्ध थे (तालिका 2)।

Figure 7
चित्र 7: हाइपोमेथिलेटेड और हाइपरमेथिलेटेड जीन के प्रमोटर क्षेत्र, स्वतंत्र रूप से वसा द्रव्यमान से संबंधित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: विभेदक मिथाइलेटेड सीपीजी साइटों से जीन का कार्यात्मक संवर्धन। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक सामग्री 1: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

डीएनए मिथाइलेशन सरणियां उनकी लागत-लाभ अनुपात 14 के कारण डीएनए मिथाइलेशन तक पहुंचने के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधियां हैं। वर्तमान अध्ययन ने ब्राजील के एक समूह में किए गए पायलट अध्ययन में डीएनए मिथाइलेशन का मूल्यांकन करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोएरे प्लेटफॉर्म का उपयोग करके एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया। पायलट अध्ययन से प्राप्त परिणामों ने प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता की पुष्टि की। चित्रा 3 नमूना तुलनात्मकता और पूर्ण bisulfite रूपांतरण 32 से पता चलता है.

एक गुणवत्ता नियंत्रण चरण के रूप में, CHAMP एल्गोरिथ्म फ़िल्टरिंग प्रक्रिया के दौरान CpGs साइटों के बहिष्करण की सिफारिश की। जांच को बाहर करने का उद्देश्य डेटा विश्लेषण में सुधार करना और पूर्वाग्रह को खत्म करना है। डेटासेट में प्रयोगात्मक शोर को खत्म करने के लिए कम गुणवत्ता वाले CpGs (0.05 से कम p-मान) को हटा दिया गया था। लक्ष्य घनत्व प्लॉट विश्लेषण में पारित रहे। Zhou33 ने बेमेल से बचने के लिए एसएनपी के पास सीपीजी को फ़िल्टर करने के महत्व का वर्णन किया, बहुरूपी साइटोसिन के मिथाइलेशन की गलत व्याख्या, और प्रकार के स्विच रंग का कारण बनता है मैं डिजाइन 34 की जांच करता हूं। इसके अलावा, जैसा कि XY गुणसूत्रों को छापने से अलग-अलग प्रभावित किया जाता है, Heiss और Just35 ने उन जांचों को फ़िल्टर करने के महत्व को मजबूत किया क्योंकि, महिलाओं में, संकरण के साथ समस्याएं भ्रमित कारक हो सकती हैं35।

DMAPs की समय सीमा समाप्ति तिथि, formamide खोलने की तारीख, पूर्ण इथेनॉल की विश्लेषणात्मक गुणवत्ता, और कुल ल्यूकोसाइट गिनती प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम माना जाता है।

इसके अलावा, हमारी टिप्पणियों के अनुसार, जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण करने में सेल-प्रकार का अनुमान आवश्यक है। हाउसमैन विधि सेल प्रकार का अनुमान लगाती है जैसा कि तियान के अध्ययन 30 में वर्णित है। यह विधि 473 विशिष्ट सीपीजी साइटों पर आधारित है जो सबसे महत्वपूर्ण सेल प्रकारों के प्रतिशत की भविष्यवाणी कर सकती हैं, जैसे कि ग्रैनुलोसाइट्स, मोनोसाइट्स, बी कोशिकाएं और टी सेल 36। हम ChAMP पैकेज से अनुशंसित फ़ंक्शन "myRefbase" का उपयोग किया। अनुमान के बाद, CHAMP एल्गोरिथ्म बीटा मूल्यों को समायोजित करता है और डेटासेट से इस पूर्वाग्रह को समाप्त करता है। यह कदम मोटापे पर केंद्रित अध्ययनों में महत्वपूर्ण है क्योंकि इस आबादी में उनकी पुरानी भड़काऊ स्थिति के कारण सफेद रक्त कोशिकाओं में काफी अंतर है।

हमने केवल विधि संशोधन और समस्या निवारण के बारे में सामान्य पीसीआर सील के लिए मूल कैप मानचित्र को बदल दिया है। प्रत्येक centrifugation प्रक्रिया के बाद, सील एक नए एक के लिए बदल दिया गया था। हम मानक गर्मी सील का उपयोग नहीं कर सका और प्लेट के चारों ओर एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके इसे अनुकूलित किया।

यद्यपि वाणिज्यिक assays epigenetic अध्ययन के लिए एक सोने का मानक माना जाता है, प्रोटोकॉल की एक सीमा एक अद्वितीय ब्रांड 37,38,39,40 से अभिकर्मकों और उपकरणों की विशिष्टता हो सकती है। एक और सीमा संकेतकों की कमी है जो प्रयोग 41 की सही प्रगति की पहचान की अनुमति देती है।

वर्तमान प्रोटोकॉल का मानकीकरण एपिजेनेटिक अनुसंधान के लिए एक महान मार्गदर्शिका का प्रतिनिधित्व करता है, प्रक्रिया के दौरान मानव त्रुटियों को कम करता है और विभिन्न अध्ययनों के बीच सफल डेटा विश्लेषण और तुलनात्मकता की अनुमति देता है।

हमारे परिणामों के अनुसार, डीएनए मेथिलिकरण प्रयोग मोटापे के साथ और बिना व्यक्तियों की तुलना करने वाले अध्ययनों के लिए उपयुक्त हैं43। इसके अलावा, प्रस्तावित जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण ने उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्रदान किए और बड़े पैमाने पर अध्ययनों में विचार किया जा सकता है।

एसवीडी विश्लेषण का उपयोग करते हुए, हमने पहचान की कि मोटापे से संबंधित लक्षण (बीएमआई, डब्ल्यूसी और एफएम) ने डीएनए मिथाइलेशन डेटा में परिवर्तनशीलता को प्रभावित किया। एक महत्वपूर्ण परिणाम के रूप में, सेल-प्रकार का अनुमान इंगित करता है कि प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं (एनके) और बी कोशिकाएं मोटापे के बिना महिलाओं की तुलना में मोटापे वाली महिलाओं में अधिक थीं (चित्रा 5)। उन कोशिकाओं की उच्च गिनती को इन व्यक्तियों की निम्न-श्रेणी की भड़काऊ स्थिति द्वारा समझाया जा सकता है44। हमने देखा कि मोटापे वाले रोगियों में वसा द्रव्यमान से जुड़े जीन के प्रमोटर क्षेत्रों में हाइपो- और हाइपरमेथिलेटेड सीपीजी होते हैं। अधिकांश साइटें हाइपोमेथिलेटेड थीं, जो इन व्यक्तियों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर में प्राकृतिक वृद्धि से संबंधित हो सकती हैं। यह ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति डाइन्यूक्लियोटाइड साइट पर गुआनिन बेचैनी को बढ़ावा दे सकती है, जिससे 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) का निर्माण होता है, जिसके परिणामस्वरूप 5mCp-8-OHdG डाइन्यूक्लियोटाइड साइट होती है, और TET एंजाइमों की भर्ती होती है। ये सभी घटनाएं कार्रवाई के विभिन्न तंत्रों द्वारा डीएनए हाइपोमिथाइलेशन और हाइपरमिथाइलेशन को बढ़ावा देने के लिए जिम्मेदार हो सकती हैं45।

इसके अलावा, मोटापे वाले व्यक्तियों में एडिपोजेनेसिस की दर बढ़ जाती है, जिसमें पुरानी कोशिकाओं के लिए लगभग 10% नई कोशिकाएं होती हैं46,47। एपिजेनेटिक योगदान, ओबीजोजेनिक वातावरण पर जोर देते हुए, कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव दरों को बदल सकते हैं, वसा द्रव्यमान 48 के विकास के पक्ष में। एपिजेनेटिक परिवर्तन भी एडिपोजेनिक कार्यक्रमों को प्रभावित कर सकते हैं, उनके विकास को सुविधाजनक या प्रतिबंधित कर सकते हैं। प्राथमिक प्रतिलेखन कारक (पीपीएआर या सी / ईबीपीα) या मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स की असेंबली, एपिजेनेटिक संशोधित एंजाइमों को शामिल करने या बाहर करने के द्वारा संचालित डाउनस्ट्रीम प्रमोटर क्षेत्रों में स्थित है, हाइपर- या हाइपोमिथाइलेशन 45 के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करती है। पीपीएआर मार्ग को पहले डब्ल्यूएनटी मार्ग को बदलने के लिए वर्णित किया गया है, जिसमें इस अध्ययन में जीन समृद्ध थे। हालांकि यह अभी भी अज्ञात है कि एडिपोजेनेसिस के दौरान डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग कैसे होती है, हाल के अध्ययनों ने बताया है कि यह एडिपोसाइट चयापचय में आवश्यक भूमिका निभा सकता है, विशेष रूप से ओबेसोजेनिक स्थितियों के तहत।

Disclosures

इस लेख के लेखकों के पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है और घोषणा करने के लिए कोई वित्तीय प्रकटीकरण नहीं है।

Acknowledgments

हम युआन तियान, पीएचडी (tian.yuan@ucl.ac.uk) को CHAMP पैकेज के बारे में सभी संदेहों का जवाब देने के लिए उपलब्ध होने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम इस पेपर से तकनीकी और वैज्ञानिक दोनों मुद्दों पर उनके योगदान के लिए Guilherme Telles, Msc. को भी धन्यवाद देते हैं; उन्होंने एपिजेनेटिक्स और वीडियो कैप्चरिंग और स्वरूपण तकनीकों (guilherme.telles@usp.br) के बारे में महत्वपूर्ण विचार किए। उपभोग्य वित्तपोषण: साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (FAPESP) (# 2018/24069-3) और वैज्ञानिक और तकनीकी विकास के लिए राष्ट्रीय परिषद (CNPq: #408292/ व्यक्तिगत वित्त पोषण: (FAPESP: # 2014/ 16740-6) और उच्च शिक्षा स्टाफ विकास के लिए समन्वय से अकादमिक उत्कृष्टता कार्यक्रम (CAPES: 88882.180020/ 2018-01)। डेटा को सार्वजनिक रूप से और स्वतंत्र रूप से बिना किसी प्रतिबंध के उपलब्ध कराया जाएगा। NYN (ई-मेल: nataliayumi@usp.br) या CBN (ई-मेल: carla@fmrp.usp.br) को पता पत्राचार.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol J.T. Baker B5924-03
Agarose gel Kasvi K9-9100
Electric bioimpedance Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Corning 46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit ZymoResearch, Irvine, CA, USA D5001
Formamide Sigma F9037
FMS—Fragmentation solution Illumina 11203428 Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip Illumina
Maxwell Instrument Promega, Brazil AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix Illumina 11202880 Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix Illumina 11203410 Supplied Reagents
NaOH F. MAIA 114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization Illumina 11291245 Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization Illumina 11191130 Supplied Reagents
2-propanol Emsure 10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution Illumina 11292441 Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix Illumina 15010230 Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix Illumina 11288046 Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix Illumina 11208309 Supplied Reagents
Ultrapure EDTA Invitrogen 155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) ByoSystems 4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) Thermo Fisher Scientific AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1 Illumina 11208288 Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2 Illumina 11208296 Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3 Illumina 11208392 Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4 Illumina 11208430 Supplied Reagents

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References

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Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues,… More

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues, G., de Souza Pinhel, M. A., Cazier, J. B., Watanabe, L. M., Menezes, A. N., Bueno, C. R., Nicoletti, C. F., de Oliveira, B. A. P., Schineider, I. M., Yonehara Noma, I. H., Dias Alcarás, I. C., Barbosa, F., Barbosa Nonino, C. Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies. J. Vis. Exp. (183), e62598, doi:10.3791/62598 (2022).

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