Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تطبيق التداخل CRISPR (CRISPRi) لإسكات الجينات في الأنواع المسببة للأمراض من Leptospira

Published: August 14, 2021 doi: 10.3791/62631
Automatic Translation
1,2, 1, *2, *1
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas, Instituto Butantan
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، يتم وصف تطبيق تداخل CRISPR (CRISPRi) لإسكات الجينات المحددة في أنواع Leptospira. يتم تحويل خلايا Leptospira عن طريق الاقتران مع البلازميدات التي تعبر عن dCas9 (Cat9 "الميت" بشكل تحفيزي) والجيش الملكي النيبالي ذو الدليل الواحد (sgRNA) ، المسؤول عن الاقتران الأساسي بالهدف الجينومي المطلوب. يتم تقديم طرق للتحقق من صحة إسكات الجينات.

Abstract

داء اللبتوسبيروسيس هو داء حيواني عالمي مهمل، مسؤول عن ما لا يقل عن مليون حالة سنويا وحوالي 60 ألف حالة وفاة. ويتسبب هذا المرض من البكتيريا المسببة للأمراض والضراوة من جنس Leptospira, إما عن طريق الاتصال المباشر مع البكتيريا أو بشكل غير مباشر عن طريق التعرض للمياه الملوثة أو التربة. تعمل الحيوانات المنزلية والبرية كمضيفين للإصابة بالدمن ، حيث تتخلص من اللبتوسبير من الأنابيب الكلوية المستعمرة للكلى ، عن طريق البول ، في البيئة. إن توليد سلالات متحولة من اللبتوسبيرا أمر بالغ الأهمية لتقييم وفهم الآليات المسببة للأمراض للعدوى. وقد ثبت كريسبر التدخل (CRISPRi) لتكون أداة واضحة وبأسعار معقولة، ومحددة لإسكات الجينات في Leptospiraالمسببة للأمراض . لذلك ، سيتم وصف التفاصيل المنهجية للحصول على بنيات البلازميد التي تحتوي على كل من dCas9 ودليل الحمض النووي الريبي ، وتسليم البلازميدات إلى Leptospira عن طريق التلازم مع سلالة الإشريكية القولونية β2163 ، والتعافي والتقييم العابرين. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وسائل الإعلام التي وصفت مؤخرا Hornsby - Alt - Nally (HAN) تسمح بالعزلة السريعة نسبيا واختيار المستعمرات المتحولة على لوحات أجار.

Introduction

داء اللبتوسبيروسيس هو مرض حيواني مهمل في جميع أنحاء العالم بسبب الأنواع المسببة للأمراض والضراوة من جنس Leptospira. في البشر، والمرض مسؤولة عن أكثر من مليون حالة و 60،000 حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم1،2. وحتى الآن، لا يوجد لقاح طويل الأجل وفعال للمرض. تحديد عوامل الفوعة والآليات المسببة للأمراض أمر محوري لتطوير استراتيجيات علاجية ووقاية أفضل. لذلك ، فإن القدرة على توليد الطفرات الجينية وتقييم النمط الظاهري الناتج أمر بالغ الأهمية للتحليل الجينومي الوظيفي3.

كان بناء المسوخ في اللبتوسبيرا المسببة للأمراض يعتبر، حتى الآن، غير فعال بطبيعته، وشاق، ومكلف، ويصعب تنفيذه. تغير هذا السيناريو بشكل كبير مع تطبيق التداخل CRISPR الأخيرة (CRISPRi) إلى saprophytic4 ومسببات الأمراض5 leptospires.

ويتحقق إسكات الجينات من خلال التعبير عن عنصرين: متغير من CRISPR / Cas (جلامع صegularly interspaced short palindromic repeat /CRISPR كمامؤنس) إنزيم Cas9 من المكورات العقدية pyogenes، ودعا Cas9 القتلى حفاز (dCas9) ومرشد واحد الجيش الملكي النيبالي (sgRNA) ، التي يمكن تحريرها وفقا للهدف المطلوب6،7،8. dCas9 البروتين، عندما ملزمة إلى sgRNA، يتم توجيهها إلى أهداف الحمض النووي محددة من قبل واتسون وقران قاعدة كريك، مما تسبب في انسداد steric إلى استطالة البوليميراز الحمض النووي الريبي، مما أدى إلى إسكات الجينات بسبب النسخ الجيني عرقلة7 (الشكل 1).

تهدف هذه المخطوطة إلى وصف بناء البلازميد للتعبير عن كل من dCas9 و sgRNA ، والالتلازم بين المتبرع E. coli β2163 وخلايا Leptospira المتلقية ، والاسترداد العابر ، وأخيرا التحقق من صحة مستعمرات متحولة مختارة.

Protocol

1. تعريف بروتوسبيسر والبناء البلازميد

ملاحظة: في هذا القسم، يتم وصف الخطوة الأولى من اختيار protospacers المناسبة لبناء sgRNA ومزيد من الربط في pMaOri.dCas9،(الشكل 1). ويتألف هذا التسلسل الأولي من تسلسل 20 نيوكليوتيدات مقابل الهدف المنشود.

  1. الحصول على تسلسل النيوكليوتيدات من الجين من الفائدة لإسكات في GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). إرساله إلى CHOPCHOP الويبفير (http://chopchop.cbu.uib.no/)، مع المعلمات المحددة لSterptococcus pyogenes Cas9 وبروتوسبيسر المجاورة عزر NGG بعد اختيار"فاستا الهدف". تعريف المعلمات إلى "CRISPR/Cas9" و PAM (بروتوسبيسر عزر المجاورة) NGG.
  2. استنادا إلى النتائج التي تم الحصول عليها، حدد protospacers مع أفضل درجة ممكنة (السهم الأخضر)، التي تقع في أقرب وقت ممكن إلى 5'end من منطقة الترميز، والأهم من ذلك، وترد في قالب (ناقص) حبلا منذ SgRNA يجب أن يقترن حبلا الترميز من الجين لإسكات الجينات كاملة.
    ملاحظة: لا يتم تضمين عزر NGG في تسلسل sgRNA النهائي.
  3. استخدام المروج lipL32 للتعبير عن دليل واحد الجيش الملكي النيبالي الذي يحتوي على تسلسل متغير 20 النيوكليوتيدات في نهاية 5 'وتسلسل سقالة dCas9 المحفوظة. دمج تسلسل 20-NT، يطلق عليها بروتوسبيسر، إلى المروج lipL32 (في نهايتها 5' وسقالة SGRNA (3'end)(الشكل 1B).
    ملاحظة: بالنسبة لمروج lipL32 محدد جيدا ، استخدم منطقة المروج التي تتألف من -334 إلى TSS (موقع بدء النسخ ، استنادا إلى Zhukovaوآخرون. 9). تحقق من الملف التكميلي للكاسيت sgRNA النهائي.
  4. توليد كاسيت SGRNA بواسطة PCR5 متسلسلة أو يكون توليفها من قبل مزود تجاري.
  5. بعد الحصول على كاسيت، ligate في pMaOri.dCas9 plasmid في موقع تقييد XMAI في كلا الطرفين (cccggg)4.
    1. هضم كل من كاسيت SGRNA وpMaOri.dCas9 البلازميد مع XMAI تقييد انزيم والمضي قدما في الربط (الشكل 1B).
    2. تنفيذ خطوات الاستنساخ في سلالة DT auxotrophic E. القولونية π110، بسبب pMaOri11 (وبالتالي ، pMaOri.dCas9) أصل النسخ المتماثل ، R6K - غاما.
      ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل لتحديد الربط واستنساخ، راجع المنشورات السابقة من قبل فرنانديز وناسيمنتو12. سوف sgRNA الموجهة dCas9 ربط حبلا الترميز من الجين المحدد من الفائدة، وبالتالي، سوف تعرقل استطالة البوليميراز الحمض النووي الريبي(الشكل 1C)،مما أدى إلى إسكات الجينات.

2. تحويل اللبتوسبيرا عن طريق اقتران

ملاحظة: يتم تقديم مخطط رسومية لهذه الخطوة في الشكل 2. لجعل هان وسائل الإعلام ولوحات هان، راجع Hornsbyوآخرون.

  1. تنمو الخلايا اللبتوسبيرا المسببة للأمراض في 29 أو 37 درجة مئوية في وسائل الإعلام هان13 تحت التحريض عن طريق تمييع ثقافة مشبعة في هان الطازجة في 1:100; عادة، L. بين الروجان سيروفار كوبنهاغني سلالة فيوكروز L1-130 يستغرق 4-6 أيام للوصول إلى كثافة الخلية المناسبة.
    1. ضمان وصول الثقافات إلى O.D. من 0.2-0.4 في 420 نانومتر (2 إلى 5 × 108 خلايا / مل) قبل استخدامها للتقارب.
      ملاحظة: منذ التغيرات وسائل الإعلام هان اللون ككثافة الخلية زيادة (بسبب فينول الأحمر الواردة في وسائط DMEM)، والطرد المركزي (4000 × ز،15 دقيقة، درجة حرارة الغرفة) 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة لإزالة leptospires وتطبيق supernatant كفراغ لقياس O.D.
  2. تحويل سلالة E. القولونية المقترنة β2163، أوكستروفيك لحمض ديامينوبيميليك (DAP)، مع pMaOri.dCas9 البلازميد التي تحتوي على كاسيت SgRNA. لE. تحويل القولونية، استخدم إما بروتوكولات الصدمة الحرارية أو الكهرومporation. تضمين التحويل مع pMaOri.dCas9 البلازميد مع عدم وجود كاسيت SgRNA كعنصر تحكم.
    1. لتحويل الصدمة الحرارية، اخلطي الحمض النووي البلازميد (100 نانوغرام) مع خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا واحتضني على الجليد لمدة 30 دقيقة. أداء صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ووضعها مرة أخرى على الجليد لمدة 5 دقائق. استعادة الخلايا بإضافة 1 مل من وسائل الإعلام LB، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والمضي قدما إلى الطلاء.
    2. للكهرومporation، استخدم خلايا الكهروكومبيت مختلطة مع 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد. استخدم المعلمات التالية للنبض: 1.8 كيلو فولت و100 Ω و25 ميكروفولت.
    3. لوحة الخلايا E. القولونية المانحة المحولة في LB أجار المتوسطة تكملها حمض ديامينوبيميليك (DAP) (0.3 mM) وspectinomycin (40 ميكروغرام / مل) لتحديد لplasmids.
  3. من أجل التواؤم، اختر مستعمرة واحدة من كل طبق قبل يوم واحد من يوم التواؤم (والذي يتم تحديده من خلال مراقبة O.D. لثقافات اللبتوسبير).
    1. حدد مستعمرة واحدة من E. coli β2163 من pMaOri.dCas9 فارغة، وواحدة من لوحات pMaOri.dCas9sgRNA. السماح لهم بالنمو بين عشية وضحاها في 10 مل من LB بالإضافة إلى DAP وspectinomycin في 37 درجة مئوية.
    2. في اليوم التالي، تمييع الثقافات المشبعة 1:100 في 10 مل من LB الطازجة بالإضافة إلى DAP (لا تشمل المضادات الحيوية هنا) حتى OD420nm من 0.2-0.4. عادة، يستغرق 2-3 ساعة للإشريكية القولونية للوصول إلى هذه الكثافات.
  4. داخل غطاء BSL2 السلامة البيولوجية، وتجميع جهاز الترشيح عن طريق وضع قطر 25 ملم، 0.1 ميكرومتر حجم المسام، مختلطة مرشح غشاء استرات السليلوز على الجزء العلوي من قاعدة الزجاج. ضع قمع زجاجي سعة 15 مل في الأعلى واحمل كلا القطعتين بمشابك الربيع. ربط الزجاج إلى مضخة فراغ وإضافة الثقافات إلى القمع للترشيح.
  5. أضف 5 مل من ثقافة اللبتوسبيرا إلى القمع. إضافة حجم من الإشريكية القولونية لتشكيل نسبة 1:1 استنادا إلى قيم OD420nm من كلا الثقافتين. بدوره على مضخة فراغ وتركيز الخلايا عن طريق الترشيح. بعد تركيز الخلية في فلتر الغشاء، استرجعه بعناية. تأكد من تصفية المتوسطة من خلال الغشاء.
    ملاحظة: الترشيح يستغرق 5 إلى 10 دقيقة.
  6. ضع الفلتر على لوحة EMJH متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)مع استكمال DAP (0.3 mM). تأكد من أن جانب البكتيريا هو ما يصل. احتضان لوحات في 29 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: إذا تم استخدام HAN أو مكملة في المنزل EMJH14 لوحات, E. القولونية يمكن أن تتكاثر والتغلب على نسبة 1:1 المقصود, والتي بدورها يمكن أن تقلل من كفاءة اقتران5.
  7. بعد 24 ساعة، واستعادة المرشحات من لوحات ووضع كل مرشح الفردية في أنبوب مخروطي 50 مل.
  8. استخدام 1 مل من السائل هان المتوسطة للافراج عن الخلايا من سطح مرشح عن طريق pipetting واسعة ودوامة.
  9. تصور الحلول البكتيرية المختلطة المستردة عن طريق المجهر الحقل المظلم للتحقق من جدوى الخلية والحركة، وLeptospira:E. نسب القولونية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن رؤية أعداد مكافئة من الإشريكية القولونية وLeptospira.
  10. انتشار 100-200 ميكرولتر من هذه الثقافة على لوحات هان التي تحتوي على 0.4٪ مصل الأرنب المعطل و 40 ميكروغرام / مل spectinomycin. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية في جو CO2 3٪.
    ملاحظة: عادة، L. interrogans سيروفار كوبنهاغني سلالة فيوكروز L1-130 الخلايا تشكل المستعمرات في 5-7 أيام على لوحات التحكم وفي 8-10 أيام على لوحات spectinomycin. في هذه المرحلة، لن تنمو الإشريكية القولونية لأنها أوكستروفيك لDAP.
  11. كتحكم، تمييع الثقافات في 104 leptospires/mL وإضافة 100 ميكرولتر على لوحات دون مضاد حيوي، لرصد نمو اللبتوسبيرال.

3. اختيار مستعمرة والنمو العابر والتحقق من صحة

ملاحظة: يجب أن تكون المستعمرات واضحة قبل يوم 10. ومع ذلك ، فهي ليست سهلة جدا لتصور. عادة في هذه المرحلة الزمنية ، لوحات هان مبهمة بعض الشيء بسبب الخلايا المجففة التي انتشرت ومستعمرات Leptospira يمكن أن تظهر كهالة شفافة على خلفية بيضاء. فمن المستحسن لعرض لوحات في زوايا مختلفة لتحقيق حدوث ضوء مختلف، وبالتالي، مما يجعل المستعمرات أكثر وضوحا. في أوقات الحضانة الأطول ، يمكن للمستعمرات الحصول على مظهر أكثر كثافة ، وفي هذه الحالة ، تقدم هالات حليبية على خلفية داكنة.

  1. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام هان السائلة إلى كل 1.5 مل microtube لاسترداد المسوخ. خذ على الأقل 3 مستعمرات من كل طبق.
    1. بمساعدة طرف micropipette ، "حفر" أجار لاسترداد المستعمرات من لوحات منذ المستعمرات اللبتوسبيرال يمكن أن تكون تحت سطح الأرض.
      ملاحظة: من المتوقع أن يتم أخذ أغار في هذه المرحلة. يجب أن تؤخذ المستعمرات من لوحات التحكم التي تحتوي على pMaOri.dCas9 plasmid فارغة ، ولوحات مع leptospires تحتوي على البلازميدات التي تعبر عن كل من dCas9 ودليل واحد الجيش الملكي النيبالي ، والمصممة للجين المستهدف.
    2. الاستغناء عن مستعمرة التي تم جمعها في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام هان في الأنابيب الدقيقة 1.5 مل وتجانس بقوة. في هذه المرحلة، وضمان كسر أقصى من سلامة أجار للافراج عن الخلايا. دوامة تعليق لمدة 10 ق.
  2. تصور الخلايا المستردة عن طريق المجهر حقل الظلام في التكبير 200-400x عن طريق إضافة قطرة 5 ميكرولتر على شريحة زجاجية وتغطية العينات على الفور مع غطاء.
    1. تأكيد وجود leptospires حية وقابلة للحياة تعافى من المستعمرات.
    2. بعد التصور وتأكيد leptospires قابلة للحياة، ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى وسائل الإعلام هان السائلة التي تحتوي على 40 ميكروغرام / مل spectinomycin.
  3. بعد النمو في وسائل الإعلام هان السائلة، وتقييم الثقافات لوجود البلازميد مع التمهيدي pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) و R (ATAGGTGAAGTAGGCCCACC)، والتي تعترف المنطقة التي تحيط كاسيت SgRNA.
    1. جمع 200 ميكرولتر من الثقافة، والطرد المركزي (4000 × ز، 15 دقيقة)، والتخلص من supernatant، وإعادة إنفاق بيليه الناتجة في 20 ميكرولتر من الماء.
    2. استخدام هذا التعليق كقالب لPCR إضافية، دون الحاجة لاستخراج الحمض النووي12.
      ملاحظة: الخلايا مع pMaOri.dCas9 سوف تجعل أمبليكون من 281 نقطة أساس، مقارنة بتلك التي تحتوي على البلازميدات مع كاسيت SgRNA التي سوف تجعل أمبليكون من 723 نقطة أساس.
  4. لتأكيد إسكات الجينات، قم بإجراء مناعة باستخدام مقتطفات الخلايا من المحولات التي تحتوي فقط على pMaOri.dCas9 (التحكم السلبي) وpMaOri.dCas9sgRNA.
    1. تطبيق ما يعادل 5 × 107 خلايا لكل حارة من كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) هلام البولي أكريلاميد.
    2. بروتينات كهربائية إلى غشاء لاحتضان مع الأجسام المضادة المناسبة. إلى جانب الأجسام المضادة ضد الجين المستهدف لإسكات، واستخدام واحد آخر لتحميل السيطرة.
  5. الحفاظ على الثقافات المتحولة في وسائل الإعلام هان بالإضافة إلى spectinomycin للحفاظ على البلازميد. إذا لم يتم تطبيق المضادات الحيوية على وسائل الإعلام ، يمكن ملاحظة إسكات الجينات الكامل لمدة ثلاثة مقاطع على الأقل5.

Representative Results

على الرغم من أن محتوى CG في جينوم Leptospira spp. عادة ما يكون حوالي 35٪؛ تقريبا كل جين من المرجح أن تحتوي على PAM 5'NGG 3'; هذا عزر يحتاج إلى النظر في حبلا قالب. بعد إدخال تسلسل الترميز للجين (من البداية إلى إيقاف الكودونات) ، استنادا إلى نتائج CHOPCHOP ، يجب تحديد المسافات الأولية في حبلا ناقص (-، قالب). من المهم عدم تضمين عزر NGG في بروتوسبيسر SgRNA 20-nt.

إذا تم إجراء اقتران مع 1:1 المانحة: نسبة الخلية المتلقي, ل 24 ح على سطح لوحات أجار EMJH بالإضافة إلى DAP, و 200 μL من تعليق البكتيرية المستردة تنتشر على HAN بالإضافة إلى لوحات أجار spectinomycin, يجب أن تكون مرئية المستعمرات transconjugants في ما يقرب من 8-10 أيام. انتشار هذا الحجم عادة ما يؤدي إلى 20-40 مستعمرة لكل لوحة(الشكل 3A). من أجل التحقق من صلاحية الخلية بعد اقترانها ، يمكن أن تنتشر الخلايا على لوحات HAN دون اختيار المضادات الحيوية. في هذه الحالة، يمكن ملاحظة المستعمرات في أقرب وقت 7 أيام. لوحات هان تتحول إلى اللون الأصفر الشاحب في جو CO2 3٪.

بعد التقاط المستعمرة والنمو في وسائل الإعلام السائلة بالإضافة إلى spectinomycin، PCR باستخدام خلايا كاملة وpMaOri2 التمهيديات يمكن استخدامها لفحص الجودة الأولية للمتحولات(الشكل 3B). وينبغي أن الخلايا اللبتوسبيرال التي تحتوي على pMaOri.dCas9 plasmid السيطرة يؤدي إلى أمبليكون من 281 نقطة أساس، في حين أن تلك الخلايا التي تحتوي على البلازميد لإسكات، وهذا هو، التي تحتوي على كل من dCas9 وsgRNA، ينبغي أن يؤدي إلى أمبليكون 723 نقطة أساس. تم تصميم pMaOri2 F وR التمهيدية لتطويق موقع تقييد XmaI ، وهو الموقع المستخدم أثناء ربط كاسيت sgRNA.

مع تأكيد وجود البلازميد ، يمكن حصاد الخلايا من وسائل الإعلام ، وغسلها مرتين مع PBS ، ثم استخدامها لإعداد مستخلص الخلايا الكاملة للانتفاخ المناعي. إذا حدث إسكات, البروتينات المستهدفة, في هذه الحالة, إما LipL32 أو كل من LigA وLigB, ينبغي أن يلاحظ فقط في الخلايا البرية نوع وتلك التي تحتوي على pMaOri.dCas9; حتى مع ارتفاع مرات التعرض، لا ينبغي أن تكون مرئية البروتينات المقابلة في الخلايا التي تحتوي على pMaOri.dCas9sgRNA(الشكل 3C).

إذا تم التخطيط لتجارب لتقييم الفوعة اللبتوسبيرية بعد إسكات الجينات ، يجب أن تكون الثقافات المستخدمة في التوازج منخفضة المرور اللاذعة Leptospira. بعد تأكيد إسكات الجينات ، يمكن تجميد العديد من الاقتباسات كدعم. إذا كان الجين الصامت يحتوي على نمط الظاهري قابل للقياس ، على سبيل المثال ، استنادا إلى العمل السابق مع البروتينات المؤتلفة ، يمكن استخدام الثقافات للتحقق من الصحة ، وفي هذه الحالة ، يمكن تضمين الخلايا التي تحتوي على pMaOri.dCas9 فقط ، كتحكم سلبي.

Figure 1
الشكل 1: تطوير dCas9 و sgRNA التعبير عن plasmid. (A) A 20-nt بروتوسبيسر طويلة، تليها S. pyogenes dCas9 PAM 5'-NGG-3'، يتم اختيار ضمن حبلا قالب الجين المستهدف حتى SgRNA اللاحقة يمكن أن تؤدي واتسون وقاعدة كريك الاقتران إلى حبلا الترميز المقابلة، مما أدى إلى إسكات الجينات كاملة. (ب) يتكون كاسيت SGRNA من المروج lipL32، 20-nt بروتوسبيسر، وسقالة dCas9. يستخدم pMaOri.dCas9 plasmid كعمود فقري ربط كاسيت SgRNA في موقع تقييد XmaI. يتم تسليم البلازميد الناتج ، الذي يطلق عليه pMaOri.dCas9sgRNA إلى leptospires ، والتعبير عن كل من dCas9 و sgRNA هو المسؤول عن إسكات الجينات. (C) sgRNA الموجهة dCas9 بمثابة حاجز مادي لاستطالة البوليميراز RNA، وبالتالي، تعوق النسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:التمثيل التخطيطي لبروتوكول اقتران. ويزرع الأنواع اللبتوسبيرا المطلوب في وسائل الإعلام هان، تحت التحريض، حتى O.D. من 0.2-0.4 (مرحلة منتصف السجل) في 420 نانومتر. قبل يوم واحد من اقتران, مستعمرة من المتبرع المؤتلف E. coli β2163 التي تحتوي على البلازميد من الفائدة يتم انتقاؤها من LB + DAP + SPC لوحات أجار, كما تزرع الخلايا بين عشية وضحاها في LB السائل مع نفس المكملات. في اليوم التالي، المشبعة E. يتم تخفيف ثقافات القولونية في LB بالإضافة إلى DAP وتزرع حتى O.D. من 0.2-0.4 في 420 نانومتر. يتم خلط كل من المتبرع E. coli والمتلقي Leptospira بنسبة 1:1 خلية على سطح مرشح 0.1 ميكرومتر بواسطة جهاز ترشيح تحت ضغط سلبي. ثم، يتم وضع مرشحات على رأس لوحات أجار EMJH تكملها DAP، وعائدات الحضانة لمدة 24 ساعة في 29 درجة مئوية. يحد استخدام EMJH من انتشار الإشريكية القولونية ، ويتم الحفاظ على النسبة المقصودة 1:1. يتم استرداد البكتيريا من المرشحات عن طريق الأنابيب مع 1 مل هان وسائل الإعلام، ويتم تصور تعليق تحت المجهر darkfield. وأخيرا، يتم بذر 100-200 ميكرولتر من كل تعليق على لوحات هان أغار التي تحتوي على مصل أرنب 0.4٪ واحتضانها عند 37 درجة مئوية في 3٪ CO2. في هذه المرحلة، يتم حذف DAP، ونتيجة لذلك، لن تنمو القولونية E. auxotrophic. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:يتم اختيارالنتائج التمثيلية لتقييم المسوخ. (أ) المستعمرات من لوحات تحتوي على Leptospira تحولت مع pMaOri.dCas9 فارغة (السيطرة السلبية لمزيد من التجارب) وplasmids pMaOri.dCas9sgRNA (مع الجينات المستهدفة إسكات) ، متجانسة بقوة في هان السائلة وتزرع في هان السائلة التي تحتوي على spectinomycin. يمكن التحقق من صحة الخلايا المؤتلفة بواسطة PCR مع التمهيديات التي تحيط بموقع XmaI داخل pMaOri.dCas9. (ب) في هذه الحالة، الخلايا التي تحتوي على pMaOri.dCas9 أسفرت فقط في أمبليكون من 281 نقطة أساس، في حين أن تلك الخلايا التي تحتوي على البلازميد لإسكات، تحتوي على كل من dCas9 و sgRNA، وأظهرت أمبليكون 723 نقطة أساس. بعد تأكيد وجود البلازميدات ، تم التحقق من إسكات الجينات من خلال تحليل المناعة. (ج) ينصح باحتضان الأجسام المضادة لكل من البروتين المستهدف وبروتين التحكم في التحميل؛ في مناعة تمثيلية، يتم عرض مقتطفات من الخلايا الكاملة من محولات تحتوي على pMaOri.dCas9 وحدها أو مع أشرطة SGRNA التي تستهدف lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) وكل من جينات LigA وLigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB). الحضانة المشتركة مع مكافحة LipL32، المضادة للليغاب ومكافحة LipL41 (غير الهدف، والتحكم في التحميل) يؤكد أن يتم إلغاء التعبير عن البروتين LipL32 في الخلايا التي تحتوي على pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 وكل من LigA وLigB في الخلايا التي تحتوي على pMaOri.dCas9sgRNAligAB. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي: دليل واحد RNA (sgRNA) تسلسل كاسيت. يتم توجيه النسخ sgRNA من قبل المروج lipL32 التأسيسية (النيوكليوتيدات جريئة). ويتكون SGRNA من 20 النيوكليوتيدات في اشارة الى protospacer ، المسؤولة عن قاعدة الاقتران إلى حبلا الترميز من الجين المستهدف ، وتسلسل سقالة dCas9 (النيوكليوتيدات المسطرة). إكسما يتم تضمين مواقع تقييد I (cccggg) في كلا طرفي الربط في pMaOri.dCas9 plasmid. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

بعد التسلسل المبكر للأنواع المسببة للأمراض15و16و17و18 وsaprophytic 19Leptospira ، يلقي تعدين البيانات للجينوم الضوء على عدة جوانب من مسببات الأمراض اللبتوسبيرية. في معظم الحالات، تم استكشاف وظيفة البروتين باستخدام النظير المؤتلف من البروتينات المفترضة المكشوفة سطح اللبتوسبيرال والمضاربة اللاحقة من وظيفة البروتين الأصلي20،21،22،23،24،25،26. 

إن توليد المسوخ، وتقييم النمط الظاهري لكل منها، هما عنصران رئيسيان في التحليل الجينومي الوظيفي. المحاولات الأولية لتوليد المسوخ في Leptospira spp. تحققت عن طريق موتاجينيسيس الإرسال والاستقبال العشوائي27،28،29،30؛ ومع ذلك، بعد تحليل مستفيض وشاق للاستدلال على هوية الجينات المعطلة، لوحظ أن 15٪ فقط من جميع الجينات في L. interrogans سيروفار مانيلا تعطلت27. وتحققت الضربة القاضية الجينات المستهدفة كذلك عن طريق إعادة التركيب متجانسة باستخدام البلازميدات الانتحارية لتقديم كاسيت مقاومة المضادات الحيوية محاطة الأسلحة متجانسة داخل الهدف المطلوب31,32.

من خلال تطبيق هذه التقنيات ، تم استكشاف العديد من جوانب البيولوجيا الأساسية اللبتوسبيرية والفوعة31،33،34،35،36،37. تطوير كولاي -اللبتوسبيرا ناقلات المكوك المترافق، pMaOri 11،سمح بتسليم مكونات لإسكات الجينات الظهارية.

وقد تبين سابقا أن كسر حبلا مزدوجة الناجمة عن Cas9 قاتلة لسبتوسبيرا spp. وكديل لذلك، البديل غير نشطة تحفيزيا من الانزيم، dCas9، يمكن استخدامها لتحقيق إسكات الجينات في كل من الأنواع saprophytic ومسببة للأمراض4،5. باستخدام pMaOri.dCas9 البلازميد باعتباره العمود الفقري للربط كاسيت SGRNA, يمكن الحصول على إسكات الجينات محددة ومستقرة بسبب التعبير عن كل من dCas9 وsgRNA; DCas9 ملزمة SGRNA سيقود البروتين إلى الهدف المطلوب من قبل واتسون كريك قاعدة الاقتران.

لإسكات الجينات كاملة، يجب أن تصمم protospacer على أساس حبلا قالب من الجين المطلوب بحيث الاقتران قاعدة من SgRNA يحدث مع حبلا الترميز. استنادا إلى متوسط محتوى C + G بنسبة 35٪ في Leptospira spp.، فإن PAM 5'-NGG-3 'سيحدث على الأقل 3 مرات كل 100 نقطة أساس. لذلك، فإن أي جين تقريبا داخل جينوم ليبتوسبيرا يحتوي على واحد على الأقل PAM. ومع ذلك، إذا لم يتم العثور على عزر NGG، يمكن تقييم عزر NAG البديل.

تقنيات إسكات الجينات السابقة ، مثل أصابع الزنك و TALE (المفعول الشبيه بمنشط النسخ) ، اعتمدت على بناء بروتين واحد مختلف لكل هدف ، مما يجعل هذه التقنيات شاقة ومكلفة38. في حالة CRISPRi ، فإن المكون المتغير هو sgRNA ، مما يجعل من الضروري تغيير 20 نقطة أساس فقط في نهاية 5. وقد لوحظ إسكات الجينات كاملة ومستقرة ومستهدفة ليس فقط في Leptospira spp.4,5, ولكن أيضا في البكتيريا الأخرى8,39,40,41.

تطوير وسائل الإعلام هان13 يفضل انتعاش المسوخ عن طريق الحد بشكل كبير من وقت الحضانة لتشكيل مستعمرة والسماح Leptospira أن تنمو في 37 سC. ومع ذلك ، خلال خطوة اقتران ، لا ينصح استخدامه لأن الإشريكية القولونية يمكن أن تتكاثر بقوة في هذه الوسائط والتغلب على النسبة المقصودة 1:1 بين الخلايا المانحة والمتلقية. في هذه المرحلة ، EMJH زائد DAP هو الخيار الأفضل ، لأن E. coli تكرار سيئة في هذه الوسائط. ومن الجدير بالذكر أن بعض المختبرات جعل EMJH المكملة في المنزل، والتي يمكن أن تحتوي على مكونات إضافية التي قد تدعم أيضا نمو خلايا الإشريكية القولونية.

تم تحسين بروتوكول اقتران المعروضة هنا ل L. interrogans سيروفار كوبنهاغني سلالة Fiocruz L1-130، وثبت أيضا أن تكون فعالة في تحويل سلالة المسببة للأمراض معزولة مؤخرا من عينات التربة5. وتشير المحاولات الأولية مع مختلف الأنواع من الأنواع Serovars L. borgpetersenii انخفاض كفاءة اقتران مع البروتوكول الموصوف. وهكذا، عند العمل مع أنواع مختلفة / سيروفارس من Leptospira،ينبغي تحديد الظروف المثلى للتحضان تجريبيا، مع الأخذ بعين الاعتبار المانحة: نسب الخلية المتلقي، وكثافات الخلية الأولية، وسائل الإعلام والتوقيت اقتران (24 و 48 ساعة). من المعقول أن نفترض أن أنواع اللبتوسبيرا المختلفة وال سيروفارس ستتصرف بشكل مختلف مع بروتوكولات اقتران مختلفة.

على الرغم من أن مستعمرات اللبتوسبيرا saprophytic سهلة نسبيا لتصور على لوحات، يمكن أن تكون المستعمرات المسببة للأمراض أكثر صعوبة لمراقبة. عادة، باستخدام وسائل الإعلام هان تكملها مع 0.4٪ مصل الأرنب وspectinomycin، يمكن ملاحظة المستعمرات العابرة في اليوم 10. في تجربتنا، المستعمرات موجودة في البداية كهالة شفافة على سطح وسائل الإعلام. في بروتوكول الفيديو ، تظهر المستعمرات الأكثر كثافة ، بعد 14 يوما من النمو ، نظرا لأنه كان من الصعب تصوير المستعمرات الشفافة. في هذه المرحلة، يمكن أن يساعد تدوير اللوحة لتحقيق حدوث ضوء مختلف والتحول بين الخلفيات البيضاء والداكنة في تحديد المستعمرات.

للتحقق من صحة متحولة، immunoblotting يقدم نهجا مباشرا. ومع ذلك ، لأن الأجسام المضادة ليست متاحة دائما ضد البروتينات المستهدفة ، يمكن اتباع استراتيجيات بديلة للتحقق من صحة إسكات الجينات. الكم عكس النسخ PCR (qRT-PCR) باستخدام التمهيديات للجين الهدف والتحكم التأسيسي فعال للتحقق من صحة إسكات الجينات منذ dCas9 الموجهة sgRNA هو المسؤول عن انسداد النسخ الجيني. إذا كان الجين المستهدف يشفر شريط بروتين محدد بوضوح في المواد الهلامية البروتينية ، يمكن أن تظهر SDS-PAGE إسكاتا ، وفقا لجين lipL32 إسكات5. إذا تم إسكات جينات التمثيل الحيوي LPS ، يمكن استخدام تلطيخ LPS ؛ في حالة إسكات الجينات ترميز للإنزيمات مع ركائز محددة جيدا، المقايسات الحركية مع الركائز الكروموجينية هي استراتيجيات صالحة؛ β-galactosidase إسكات في L. biflexa تم التحقق من صحة باستخدام X-غال و ONPG (ortho-Nitrophenyl-β-galactoside)ركائز 4.

بعد تأكيد إسكات الجينات، يمكن تصميم التجارب لزيادة تقييم النمط الظاهري. ويمكن إجراء المقايسات الملزمة في حالة إسكات الالتصاقات البكتيرية؛ أكدت المقايسات تحدي المصل دور LigA وLigB في بقاء المصل التي عرضها اللبتوسبيراالمسببة للأمراض5. ويمكن أيضا أن تستخدم المسوخ لتطعيم الحيوانات لتقييم توهين الفوعة. في هذه الحالة ، يجب مقارنة الحيوانات التي تم تلقيحها بالمتحولة بالحيوانات المصابة بالخلايا التي تحتوي على pMaOri.dCas9 فقط.

في الختام، يصف البروتوكول الحالي تطبيق CRISPRi لإسكات الجينات في أنواع اللبتوسبيرا المسببة للأمراض باستخدام وسائل الإعلام HAN لتسهيل الانتعاش متحولة في غضون 10 أيام. إسكات الجينات جنبا إلى جنب مع التحليل الجينومي الوظيفي سوف يحسن فهمنا للآليات المسببة للأمراض من Leptospira, ويؤدي في نهاية المطاف إلى وضع استراتيجيات وقائية أفضل لمكافحة الأمراض.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وزارة الزراعة هي مزود تكافؤ الفرص وصاحب العمل. يذكر هذا المنشور أسماء تجارية أو منتجات تجارية لغرض تقديم معلومات محددة فقط، ولا يعني توصية أو موافقة وزارة الزراعة الأمريكية. وقد دعمت الوكالة البرازيلية FAPESP (المنحة 2014/50981-0) هذا العمل ماليا؛ يتم تمويل LGVF بزمالة من FAPESP (2017/06731-8 و 2019/20302-8). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطات. كما يشكر المؤلفان هانا هيل وألكساندر غرايمز من الخدمات البصرية لوزارة الزراعة الأميركية على تصوير وتحرير بروتوكول الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane Millipore VCWP02500 Filtration for bacterial conjugation
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) Sigma D1377 Growth of auxotrophic E. coli β2163
Agar Noble BD & Company 214230 Used for preparation of solid EMJH and HAN plates
Bacto Agar BD & Company 214010 Used for preparation of solid LB plates
Clarity Western ECL substrate Biorad 170-5060 Chemiluminescent substrate
dNTP set Thermo Fisher 10297-018 dNTPs for PCR reaction
Glass Microanalysis Filter Holder Millipore XX1012530 Filtration for bacterial conjugation
Imaging System Biorad ChemiDoc MP Chemiluminescence detection
LB broth, Miller BD & Company 244620 Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Leptospira Enrichment EMJH BD & Company 279510 Supplementation of EMJH media
Leptospira Medium Base EMJH BD & Company 279410 EMJH medium for Leptospira
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% Biorad 4568043 Used for polyacrylamide gel eletrophoresis
Optical density reader Molecular Devices SpectraMax M2 For optical density measurements of bacterial cultures
Phosphate Buffered Saline 7.4 Sigma 806552 Saline solution for washing bacterial pellets
Spectinomycin Sigma S0692 Selection of pMaOri backbone plasmids
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher EP0402 Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction
Thermocycler Applied Biosystem GeneAmp PCR System 9700 Used for PCR reaction cycling
Thymidine (dT) Sigma T9250 Growth of auxotrophic E. coli π1
XmaI restriction enzyme New Englan BioLabs R0180L Digestion of plasmids and inserts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bharti, A. R., et al. Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance. Lancet Infectious Disease. 3 (12), 757-771 (2003).
  2. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLoS Neglected Tropical Disease. 9 (9), 0003898 (2015).
  3. Shapiro, R. S., et al. A CRISPR-Cas9-based gene drive platform for genetic interaction analysis in Candida albicans. Nature Microbiology. 3 (1), 73-82 (2018).
  4. Fernandes, L. G. V., et al. Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira. Science Reports. 9 (1), 1839 (2019).
  5. Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Genetic manipulation of pathogenic Leptospira: CRISPR interference (CRISPRi)-mediated gene silencing and rapid mutant recovery at 37 C. Science Reports. 11 (1), 1768 (2021).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  8. Choudhary, E., Thakur, P., Pareek, M., Agarwal, N. Gene silencing by CRISPR interference in mycobacteria. Nature Communication. 6, 6267 (2015).
  9. Zhukova, A., et al. Genome-wide transcriptional start site mapping and sRNA identification in the pathogen. Frontiers in Cell and Infectious Microbiology. 7, 10 (2017).
  10. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPalpha) conjugative machineries, and their cognate Escherichia coli host strains. Research in Microbiology. 156 (2), 245-255 (2005).
  11. Pappas, C. J., Benaroudj, N., Picardeau, M. A replicative plasmid vector allows efficient complementation of pathogenic Leptospira strains. Applied Environmental Microbiology. 81 (9), 3176-3181 (2015).
  12. Fernandes, L. G. V., Nascimento, A. L. T. O. Specific gene silencing in Leptospira biflexa by RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9). Methods in Molecular Biology. 2134, 109-122 (2020).
  13. Hornsby, R. L., Alt, D. P., Nally, J. E. Isolation and propagation of leptospires at 37 °C directly from the mammalian host. Science Reports. 10 (1), 9620 (2020).
  14. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 12, Unit 12E.12 (2006).
  15. Nascimento, A. L., et al. Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis. Journal of Bacteriology. 186 (7), 2164-2172 (2004).
  16. Nascimento, A. L., et al. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Brazillian Journal of Medical Biology Research. 37 (4), 459-477 (2004).
  17. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  18. Bulach, D. M., et al. Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (39), 14560-14565 (2006).
  19. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLoS One. 3 (2), 1607 (2008).
  20. Fernandes, L. G., et al. OmpL1 is an extracellular matrix- and plasminogen-interacting protein of Leptospira spp. Infections and Immunity. 80 (10), 3679-3692 (2012).
  21. Fernandes, L. G., et al. Leptospira spp.: Novel insights into host-pathogen interactions. Veterinary Immunology and Immunopathology. 176, 50-57 (2016).
  22. Castiblanco-Valencia, M. M., et al. Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H, FHL-1, FHR-1, and C4BP. Journal of Infectious Diseases. 205 (6), 995-1004 (2012).
  23. Choy, H. A., et al. The multifunctional LigB adhesin binds homeostatic proteins with potential roles in cutaneous infection by pathogenic Leptospira interrogans. PLoS One. 6 (2), 16879 (2011).
  24. Siqueira, G. H., et al. The recombinant LIC10508 is a plasma fibronectin, plasminogen, fibrinogen and C4BP-binding protein of Leptospira interrogans. Pathogen and Diseases. 74 (2), (2016).
  25. Teixeira, A. F., et al. Features of two new proteins with OmpA-like domains identified in the genome sequences of Leptospira interrogans. PLoS One. 10 (4), 0122762 (2015).
  26. Kochi, L. T., et al. The interaction of two novel putative proteins of Leptospira interrogans with E-cadherin, plasminogen and complement components with potential role in bacterial infection. Virulence. 10 (1), 734-753 (2019).
  27. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infections and Immunity. 77 (2), 810-816 (2009).
  28. Bourhy, P., Louvel, H., Saint Girons, I., Picardeau, M. Random insertional mutagenesis of Leptospira interrogans, the agent of leptospirosis, using a mariner transposon. Journal of Bacteriology. 187 (9), 3255-3258 (2005).
  29. Pětrošová, H., Picardeau, M. Screening of a Leptospira biflexa mutant library to identify genes involved in ethidium bromide tolerance. Applied Environmental Microbiology. 80 (19), 6091-6103 (2014).
  30. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods in Molecular Biology. 859, 169-176 (2012).
  31. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infections and Immunity. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  32. Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella. Molecular Microbiology. 40 (1), 189-199 (2001).
  33. King, A. M., et al. High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans. Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).
  34. Lambert, A., et al. FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath. Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).
  35. Murray, G. L., et al. Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis. Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).
  36. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathogens. 3 (7), 97 (2007).
  37. Sasaki, Y., et al. Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa. PLoS One. 13 (4), 0194923 (2018).
  38. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  39. Cress, B. F., et al. Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (9), 4472-4485 (2016).
  40. Zhao, C., Shu, X., Sun, B. Construction of a gene knockdown system based on catalytically inactive ("dead") Cas9 (dCas9) in Staphylococcus aureus. Applied Environmental Microbiology. 83 (12), (2017).
  41. Zhao, Y., et al. CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces. Biotechnology Journal. , 1800121 (2018).

Tags

علم الوراثة، العدد 174، اللبتوسبيرا،داء اللبتوسبيروسيس، موتاسيس، تدخل CRISPR، إسكات الجينات، اقتران
تطبيق التداخل CRISPR (CRISPRi) لإسكات الجينات في الأنواع المسببة للأمراض من <em>Leptospira</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., … More

Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira. J. Vis. Exp. (174), e62631, doi:10.3791/62631 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter