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Genetics

लेप्टोस्पायरा की रोगजनक प्रजातियों में जीन सिलिंग के लिए CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) का आवेदन

Published: August 14, 2021 doi: 10.3791/62631
Automatic Translation
1,2, 1, *2, *1
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas, Instituto Butantan
* These authors contributed equally

Summary

यहां लेप्टोस्पायरा प्रजातियों में विशिष्ट जीन सिलने के लिए CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) के आवेदन का वर्णन किया गया है । लेप्टोस्पायरा कोशिकाओं को dCas9 (उत्प्रेरक रूप से "मृत" Cas9) और एक एकल-गाइड आरएनए (sgRNA) व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड्स के साथ संवत् द्वारा परिवर्तित किया जाता है, जो वांछित जीनोमिक लक्ष्य के आधार बांधना के लिए जिम्मेदार होता है। जीन को मान्य करने के तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं।

Abstract

लेप्टोस्पाइरोसिस एक वैश्विक उपेक्षित ज़ूनोसिस है, जो प्रति वर्ष कम से कम 1 मिलियन मामलों और लगभग 60 हजार मौतों के लिए जिम्मेदार है। यह रोग लेप्टोस्पायराजीनस के रोगजनक और उग्र बैक्टीरिया के कारण होता है, या तो बैक्टीरिया के साथ सीधे संपर्क से या अप्रत्यक्ष रूप से दूषित पानी या मिट्टी के संपर्क में। घरेलू और जंगली जानवर संक्रमण के जलाशय मेजबान के रूप में कार्य करते हैं, मूत्र के माध्यम से, मूत्र के माध्यम से, पर्यावरण में गुर्दे के उपनिवेश गुर्दे के ट्यूबल से लेप्टोस्पायर बहाते हैं। संक्रमण के रोगजनक तंत्र का मूल्यांकन और समझने के लिए लेप्टोस्पायरा के उत्परिवर्ती उपभेदों की पीढ़ी महत्वपूर्ण है। CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) रोगजनक लेप्टोस्पायरामें जीन मुंह के लिए एक सीधा, सस्ती और विशिष्ट उपकरण साबित हुआ है। इसलिए, प्लाज्मिड दोनों dCas9 और गाइड आरएनए, ई कोलाई तनाव के साथ conjugation द्वारा लेप्टोस्पिरा के लिए प्लाज्मिड की डिलीवरी, और ट्रांसकोजुगंत वसूली और मूल्यांकन, दोनों युक्त निर्माण प्राप्त करने के पद्धतिगत विवरण का वर्णन किया जाएगा। इसके अलावा, हाल ही में वर्णित Hornsby-Alt-Nally (हान) मीडिया अपेक्षाकृत तेजी से अलगाव और आगर प्लेटों पर उत्परिवर्ती कालोनियों के चयन के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

लेप्टोस्पाइरा एक उपेक्षित दुनिया भर में ज़ूनोसिस है जो लेप्टोस्पाइराजीनस की रोगजनक और उग्र प्रजातियों के कारण होता है। मनुष्यों में, यह बीमारी दुनिया भर में 1,2मिलियन से अधिक मामलों और प्रति वर्ष 60,000 मौतोंकेलिए है। अभी तक इस बीमारी का दीर्घकालिक और कारगर टीका नहीं है। उग्रता कारकों और रोगजनक तंत्र की पहचान बेहतर चिकित्सीय और रोगनिरोधी रणनीतियों के विकास के लिए निर्णायक है। इसलिए, आनुवंशिक उत्परिवर्तन उत्पन्न करने और परिणामस्वरूप फेनोटाइप का आकलन करने की क्षमता कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण3के लिए महत्वपूर्ण है।

रोगजनक लेप्टोस्पायरा में म्यूटेंट के निर्माण पर विचार किया गया था, अब तक, स्वाभाविक रूप से अक्षम, श्रमसाध्य, महंगा और लागू करना मुश्किल था। यह परिदृश्य हाल ही में CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) के आवेदन के साथ सैप्रोफाइटिक4 और रोगजनक5 लेप्टोस्पायर में काफी बदल गया।

जीन मुंह से दो घटकों की अभिव्यक्ति द्वारा प्राप्त किया जाता है: CRISPR/Cas का एकसंस्करण(सीचमकदार आरएगुलरली मैंnterspaced short palindromic repeat/सी RISPR के रूप मेंमिलनसार) एंजाइम एंजाइम स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन सेCas9, जिसे उत्प्रेरक रूप से मृत Cas9 (dCas9) और एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) कहा जाता है, जिसे वांछित लक्ष्य6,7,8के अनुसार संपादित किया जा सकता है। dCas9 प्रोटीन, जब sgRNA के लिए बाध्य, वाटसन और क्रिकेटरों आधार बांधना द्वारा विशिष्ट डीएनए लक्ष्यों के लिए निर्देशित किया है, आरएनए बहुलक विस्तार के लिए एक स्टेरिक रुकावट के कारण, बाधित जीन प्रतिलेखन7 (चित्रा 1)के कारण जीन मुंह में जिसके परिणामस्वरूप ।

इस पांडुलिपि का उद्देश्य dCas9 और sgRNA दोनों को व्यक्त करने के लिए प्लाज्मिड के निर्माण का वर्णन करना है, दाता ई. कोलाई 2163 और प्राप्तकर्ता लेप्टोस्पिरा कोशिकाओं, ट्रांसकोन्जुगंत रिकवरी और अंत में, चयनित उत्परिवर्ती उपनिवेशों के सत्यापन के बीच संजीता।

Protocol

1. प्रोटोस्पेसर परिभाषा और प्लाज्मिड निर्माण

नोट: इस खंड में, sgRNA के निर्माण के लिए उपयुक्त प्रोटोस्पेपर्स का चयन करने का पहला कदम और pMaOri.dCas9 में आगे बंधन,(चित्र 1)वर्णित है । इस प्रोटोस्पेसर अनुक्रम में वांछित लक्ष्य के मुकाबले 20 न्यूक्लियोटाइड्स अनुक्रम शामिल हैं।

  1. जेनबैंक (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) में चुप्पी के लिए ब्याज के जीन के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम प्राप्त करें । "फास्टा टारगेट"का चयन करने के बाद स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन्स Cas9 और प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति एनजीजी के लिए परिभाषित मापदंडों के साथ, इसे CHOPCHOP वेबसेसर (http://chopchop.cbu.uib.no/) में सबमिट करें। "CRISPR/Cas9" और पाम (प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति) NGG के लिए मापदंडों को परिभाषित करें ।
  2. प्राप्त परिणामों के आधार पर, सर्वोत्तम स्कोर संभव (हरे तीर) के साथ प्रोटोस्पेपर का चयन करें, जो कोडिंग क्षेत्र के 5'अंत के लिए यथासंभव करीब स्थित हैं और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि टेम्पलेट (माइनस) स्ट्रैंड में निहित हैं क्योंकि एसजीआरएनए को पूर्ण जीन को पूरा करने के लिए जीन के कोडिंग स्ट्रैंड में जोड़ा जाना चाहिए।
    नोट: NGG आकृति अंतिम sgRNA अनुक्रम में शामिल नहीं है ।
  3. एकल गाइड आरएनए को व्यक्त करने के लिए लिपल32 प्रमोटर का उपयोग करें जिसमें 5 के अंत में एक चर 20 न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम और एक संरक्षित dCas9 पाड़ अनुक्रम शामिल है। 20-एनटी अनुक्रम को मर्ज करें, प्रोटोपेसर कहा जाता है, लिपल32 प्रमोटर (इसके 5' अंत में) और एसजीआरएनए पाड़ (3'एंड)(चित्रा 1 बी)के लिए।
    नोट: एक अच्छी तरह से परिभाषित लिपल32 प्रमोटर के लिए, प्रमोटर क्षेत्र का उपयोग करें जिसमें टीएसएस (ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट, ज़हुकोवा एट अल 9 के आधार पर) को-334शामिल किया गया है। अंतिम एसजीआरएनए कैसेट के लिए अनुपूरक फाइल की जांच करें।
  4. अनुक्रमिक पीसीआर5 द्वारा एसजीआरएनए कैसेट उत्पन्न करें या इसे वाणिज्यिक प्रदाता द्वारा संश्लेषित किया जाए।
  5. कैसेट प्राप्त करने के बाद, इसे दोनों सिरों (सीसीसीजीजीजी)4पर Xma I प्रतिबंध स्थल पर pMaOri.dCas9 प्लाज्मिड में लिगेट करें।
    1. XmaI प्रतिबंध एंजाइम के साथ sgRNA कैसेट और pMaOri.dCas9 प्लाज्मिड दोनों को पचाएं और लिगाशन(चित्रा 1B)के लिए आगे बढ़ें।
    2. डीटी ऑक्सोट्रोफिक ई. कोलाई स्ट्रेन 110में क्लोनिंग चरणों का प्रदर्शन करें, क्योंकि pMaOri11 (और विस्तार से, pMaOri.dCas9) प्रतिकृति, R6K-गामा की उत्पत्ति।
      नोट: लिगाशन और क्लोन चयन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, फर्नांडीस और नैसिमेंटो12द्वारा पिछले प्रकाशनों का उल्लेख करें । sgRNA निर्देशित dCas9 ब्याज के चयनित जीन के कोडिंग कतरा को बाध्य करेगा और इसलिए, आरएनए पॉलीमरेज विस्तार(चित्रा 1C)में बाधा डालेगा, जिसके परिणामस्वरूप जीन मुंह में डालने का परिणाम होगा।

2. संाधीनता द्वारा लेप्टोस्पायरा परिवर्तन

नोट: इस चरण की एक चित्रमय योजना चित्र 2में प्रस्तुत की गई है । हान मीडिया और हान प्लेटें बनाने के लिए, Hornsby एट अल13 और फर्नांडीस एट अल5का उल्लेख है ।

  1. 1:100 में ताजा हान में संतृप्त संस्कृति को कमजोर करके आंदोलन के तहत हान मीडिया 13 में 29 या 37 डिग्री सेल्सियस पर रोगजनक लेप्टोस्पिरा कोशिकाओं को बढ़ाएं; आमतौर पर, एल इंटररोगन सेरोवर कोपेनहेगनी स्ट्रेन फिओक्रूज़ एल1-130 को उपयुक्त सेल घनत्व तक पहुंचने में 4-6 दिन लगते हैं।
    1. सुनिश्चित करें कि संस्कृतियों को conjugation के लिए उपयोग करने से पहले ४२० एनएम (2 से 5 x 10 8 कोशिकाओं/एमएल) पर0.2-0.4 के एक O.D. तक पहुंचने ।
      नोट: चूंकि हान मीडिया सेल घनत्व में वृद्धि के रूप में रंग बदलता है (डीएमईएम मीडिया में निहित फिनॉल लाल के कारण), सेंट्रलाइज (4,000 x ग्राम,15 मिनट, कमरे का तापमान) संस्कृति मीडिया का 1 एमएल लेप्टोस्पायर को हटाने और O.D. को मापने के लिए एक खाली के रूप में सुपरनटेंट लागू करने के लिए
  2. कंजूजिटिव ई. कोलाई तनाव 12163, डायमिनोइपिलिक एसिड (डीएपी) के लिए ऑक्सोट्रोफिक को बदलना, प्लाज्मिड pMaOri.dCas9 के साथ sgRNA कैसेट युक्त। ईके लिए । कोलाई परिवर्तन, या तो गर्मी-शॉक प्रोटोकॉल या इलेक्ट्रोपाउशन का उपयोग करें। नियंत्रण के रूप में कोई sgRNA कैसेट के साथ प्लाज्मिड pMaOri.dCas9 के साथ परिवर्तन शामिल करें।
    1. हीट-शॉक ट्रांसफॉर्मेशन के लिए, प्लाज्मिड डीएनए (100 एनजी) को रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं के साथ मिलाएं और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 90 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर हीट शॉक करें और इसे फिर से 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। एलबी मीडिया के 1 एमसीएल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें, 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और चढ़ाना के लिए आगे बढ़ें।
    2. इलेक्ट्रोप्यूटेशन के लिए, प्लाज्मिड डीएनए के 100 एनजी के साथ मिश्रित इलेक्ट्रोकंपिटेंट कोशिकाओं का उपयोग करें। नाड़ी के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 1.8 केवी, 100 Ω, और 25 माइक्रोन। ऊपर बताए गए कोशिकाओं को ठीक करें।
    3. प्लेट एलबी एगर मीडियम में बदल दाता ई. कोलाई कोशिकाओं को प्लास्मिड के लिए चयन करने के लिए डायमिनोपिमिलिक एसिड (डीएपी) (०.३ mM) और स्पेक्टिनोमाइसिन (४० μg/mL) के साथ पूरक किया जाता है ।
  3. संयोजण के लिए, संाधीनता के दिन से एक दिन पहले प्रत्येक प्लेट से एक कॉलोनी का चयन करें (जो लेप्टोस्पायर की संस्कृतियों के O.D. की निगरानी करके निर्धारित किया जाता है)।
    1. खाली pMaOri.dCas9 से ई. कोलाई 1163 की एक कॉलोनी का चयन करें, और pMaOri.dCas9sgRNA प्लेटों से एक। उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी प्लस डीएपी और स्पेक्टिनोमाइसिन के 10 एमएल में रात भर बढ़ने दें।
    2. अगले दिन, ताजा एलबी प्लस डीएपी के 10 एमएल में संतृप्त संस्कृतियों 1:100 को पतला करें (यहां एंटीबायोटिक शामिल न करें)0.2-0.4 के ओडी 420एनएम तक। आम तौर पर, इन घनत्व तक पहुंचने के लिए ई कोलाई के लिए 2-3 घंटे लगते हैं।
  4. बीएसएल 2 बायोसेफ्टी हुड के अंदर, ग्लास बेस के शीर्ष पर 25 मिमी व्यास, 0.1 माइक्रोन पोर आकार, मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर झिल्ली फिल्टर रखकर एक निस्पंदन उपकरण इकट्ठा करें। शीर्ष पर 15 एमएल ग्लास कीप रखें और स्प्रिंग क्लैंप के साथ दोनों टुकड़ों को पकड़ें। एक वैक्यूम पंप करने के लिए गिलास कनेक्ट और छानने के लिए कीप के लिए संस्कृतियों को जोड़ें।
  5. कीप में लेप्टोस्पायरा कल्चर का 5 एमएल जोड़ें। दोनों संस्कृतियों के ओडी420एनएम मूल्यों के आधार पर 1:1 अनुपात का गठन करने के लिए ई. कोलाई की मात्रा जोड़ें। वैक्यूम पंप चालू करें और छानने का काम करके कोशिकाओं को एकाग्र करें। झिल्ली फिल्टर में सेल एकाग्रता के बाद, ध्यान से इसे पुनः प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि मध्यम झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है।
    नोट: छानने का काम 5 से 10 मिनट लगता है।
  6. फिल्टर को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईएमजेएच प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) डीएपी (0.3 mM) के साथ पूरक पर रखें। सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया पक्ष ऊपर है। 24 घंटे के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि हान या पूरक इन-हाउस EMJH14 प्लेटों का उपयोग किया जाता है, तो ई. कोलाई का उपयोग किया जा सकता है और इच्छित 1:1 अनुपात को दूर कर सकता है, जो बदले में कंजूगेशन दक्षता5को कम कर सकता है।
  7. 24 घंटे के बाद, प्लेटों से फिल्टर को ठीक करें और प्रत्येक व्यक्तिगत फिल्टर को 50 एमएल शंकु नली में रखें।
  8. व्यापक पाइपिंग और भंवर द्वारा फिल्टर सतह से कोशिकाओं को छोड़ने के लिए तरल हान माध्यम के 1 एमएल का उपयोग करें।
  9. सेल व्यवहार्यता और गतिशीलता की जांच करने के लिए डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा बरामद मिश्रित जीवाणु समाधानों की कल्पना करें, और लेप्टोस्पेरा: ई. कोलाई अनुपात।
    नोट: इस स्तर पर, ई. कोलाई और लेप्टोस्पायरा के समकक्ष संख्या देखी जा सकती है।
  10. 0.4% निष्क्रिय खरगोश सीरम और 40 μg/ 3% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
    नोट: आम तौर पर, एल इंटररोजेन्स सेरोवर कोपेनहेगनी तनाव फियोक्रूज़ एल1-130 कोशिकाएं नियंत्रण प्लेटों पर 5-7 दिनों में और स्पेक्टिनोमाइसिन प्लेटों पर 8-10 दिनों में उपनिवेश बनाती हैं। इस स्तर पर, ई. कोलाई विकसित नहीं होगा क्योंकि वे डीएपी के लिए ऑक्सोट्रोफिक हैं।
  11. एक नियंत्रण के रूप में, १०४ लेप्टोस्पायर/एमएल पर संस्कृतियों को पतला करें और लेप्टोस्पाइरल विकास की निगरानी के लिए एंटीबायोटिक के बिना प्लेटों पर १०० माइक्रोन जोड़ें ।

3. कॉलोनी चयन और ट्रांसकॉन्जूगेंट विकास और सत्यापन

नोट: कालोनियों 10 दिन तक स्पष्ट होना चाहिए । हालांकि, उनकी कल्पना करना भी आसान नहीं है। आम तौर पर इस समय बिंदु पर, हान प्लेटें सूखे कोशिकाओं के कारण थोड़ी अपारदर्शी होती हैं जो फैलती थीं और लेप्टोस्पिरा उपनिवेश सफ़ेद पृष्ठभूमि के खिलाफ एक पारदर्शी प्रभामंडल के रूप में दिखाई दे सकते हैं। विभिन्न प्रकाश घटनाओं को प्राप्त करने के लिए विभिन्न कोणों पर प्लेटों को देखने की सिफारिश की जाती है, इसलिए, उपनिवेशों को अधिक स्पष्ट बनाते हैं। इनक्यूबेशन समय में, उपनिवेश एक सघन उपस्थिति प्राप्त कर सकते हैं, और इस मामले में, वे एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ दूधिया प्रभामंडल के रूप में मौजूद हैं।

  1. म्यूटेंट को ठीक करने के लिए प्रत्येक 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में तरल हान मीडिया के 100 माइक्रोल जोड़ें। हर प्लेट से कम से कम 3 कॉलोनियां लें।
    1. माइक्रोपिपेट टिप की सहायता से, प्लेटों से कालोनियों को पुनः प्राप्त करने के लिए एगर को "खुदाई" करें क्योंकि लेप्टोस्पाइरल कॉलोनियां उपसतह हो सकती हैं।
      नोट: आगर को इस स्तर पर साथ ले जाने की उम्मीद है । कॉलोनाइजरों को नियंत्रण प्लेटों से लिया जाना चाहिए जिसमें खाली pMaOri.dCas9 प्लाज्मिड होते हैं, और प्लेटें जिनमें प्लेटें होती हैं जिनमें डीपीएएस 9 और एकल गाइड आरएनए दोनों व्यक्त होते हैं, जो लक्ष्य जीन के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।
    2. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में हान मीडिया के 100 माइक्रोल में एकत्र कॉलोनी को वितरित करें और सख्ती से समरूप करें। इस स्तर पर, कोशिकाओं को जारी करने के लिए आगर अखंडता का अधिकतम तोड़ सुनिश्चित करें। भंवर 10 एस के लिए निलंबन ।
  2. एक ग्लास स्लाइड पर 5 माइक्रोन ड्रॉप जोड़कर 200-400x आवर्धन पर डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा बरामद कोशिकाओं की कल्पना करें और नमूनों को तुरंत कवरलिप के साथ कवर करें।
    1. उपनिवेशों से बरामद लाइव और व्यवहार्य लेप्टोस्पायर की उपस्थिति की पुष्टि करें।
    2. व्यवहार्य लेप्टोस्पायर के विज़ुअलाइज़ेशन और पुष्टि के बाद, 100 माइक्रोन कोशिकाओं को तरल हान मीडिया में स्थानांतरित करें जिसमें 40 μg/mL spectinomycin होता है।
  3. तरल हान मीडिया में वृद्धि के बाद, प्राइमर pMaOri2 एफ (ACGCAATGTATCGATACCGAC) और आर (ATAGGTGAAGGATGGCCCCCCCCCCसी) के साथ प्लाज्मिड की उपस्थिति के लिए संस्कृतियों का मूल्यांकन करें, जो उस क्षेत्र को पहचानते हैं जो एसजीआरएनए कैसेट को फ्लैंक करता है।
    1. संस्कृति के 200 माइक्रोल, अपकेंद्रित्र (4,000 x ग्राम,15 मिनट), सुपरनैंट को त्यागें, और परिणामस्वरूप गोली को 20 माइक्रोन पानी में फिर से खर्च करें।
    2. डीएनए निष्कर्षण12की आवश्यकता के बिना, अतिरिक्त पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस निलंबन का उपयोग करें ।
      नोट: pMaOri.dCas9 के साथ कोशिकाओं को २८१ बीपी का एक एम्प्लिकॉन प्रदान करेगा, sgRNA कैसेट जो ७२३ बीपी का एक एम्प्लिकॉन प्रदान करेगा के साथ प्लाज्मिड युक्त उन लोगों की तुलना में ।
  4. जीन साइलेंसिंग की पुष्टि के लिए, केवल pMaOri.dCas9 (नकारात्मक नियंत्रण) और pMaOri.dCas9sgRNA युक्त ट्रांसकोंजुगैंट से सेल अर्क का उपयोग करते हुए एक इम्यूनोब्लॉट करें।
    1. सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट (एसडीएस) पॉलीएक्रेमाइड जेल के प्रति लेन 5 x10 7 कोशिकाओं के बराबर लागू करें।
    2. उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के लिए एक झिल्ली के लिए इलेक्ट्रोट्रांजफर प्रोटीन। मुंह के लिए लक्ष्य जीन के खिलाफ एंटीबॉडी के अलावा, नियंत्रण लोड करने के लिए एक और एक का उपयोग करें ।
  5. प्लाज्मिड को बनाए रखने के लिए हान मीडिया प्लस स्पेक्टिनोमाइसिन में उत्परिवर्ती संस्कृतियों को रखें। यदि मीडिया पर कोई एंटीबायोटिक नहीं लगाया जाता है, तो कम से कम तीन मार्ग5के लिए पूर्ण जीन सिलने का अवलोकन किया जा सकता है।

Representative Results

हालांकि लेप्टोस्पिरा एसपीपी में सीजी सामग्री आमतौर पर लगभग 35% होती है; लगभग हर जीन में पाम 5 'एनजीजी 3'; इस आकृति को टेम्पलेट स्ट्रैंड में विचार करने की आवश्यकता है। एक जीन के कोडिंग अनुक्रम इनपुट के बाद (शुरू से codons को रोकने के लिए), CHOPCHOP परिणामों के आधार पर, प्रोटोस्पेसर्स शून्य (-, टेम्पलेट) कतरा पर चुना जाना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है कि 20-एनटी sgRNA प्रोटोस्पेसर में NGG आकृति शामिल नहीं है।

यदि 1:1 दाता के साथ संयुग्मण किया जाता है: प्राप्तकर्ता सेल अनुपात, ईएमजेएच एगर प्लेटों के साथ-साथ डीएपी की सतह पर 24 घंटे के लिए, और बरामद बैक्टीरियल निलंबन के 200 माइक्रोन हान प्लस स्पेक्टिनोमाइसिन एगर प्लेटों पर फैले हुए हैं, तो ट्रांसकोन्जुगैंट्स कॉलोनियों को लगभग 8-10 दिनों में दिखाई देना चाहिए। इस मात्रा के प्रसार के परिणामस्वरूप सामान्य रूप से प्रति प्लेट 20-40 कॉलोनियां(चित्रा 3 ए)होती हैं। आदेश में संाधीनता के बाद सेल व्यवहार्यता के लिए जांच करने के लिए, कोशिकाओं को कोई एंटीबायोटिक चयन के साथ हान प्लेटों पर फैलाया जा सकता है । इस मामले में, कॉलोनाइजर को 7 दिनों के रूप में जल्द ही देखा जा सकता है। हान प्लेटें 3% सीओ 2 वातावरण में पीला पीला होजाते हैं।

लिक्विड मीडिया प्लस स्पेक्टिनोमाइसिन में कॉलोनी चुनने और विकास के बाद, पूरी कोशिकाओं और pMaOri2 प्राइमर का उपयोग कर पीसीआर का उपयोग ट्रांसकोन्जूगेंट(चित्रा 3 बी)की प्रारंभिक गुणवत्ता जांच के लिए किया जा सकता है। नियंत्रण pMaOri.dCas9 प्लाज्मिड युक्त लेप्टोस्पायरल कोशिकाओं के परिणामस्वरूप 281 बीपी का एम्प्लिकॉन होना चाहिए, जबकि उन कोशिकाओं में साइलेंसिंग के लिए प्लाज्मिड होता है, जो कि DCas9 और sgRNA दोनों युक्त होता है, 723 बीपी एम्प्लाइसन में परिणाम होना चाहिए। pMaOri2 एफ और आर प्राइमर को XmaI प्रतिबंध साइट को पार्श्व करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जो sgRNA कैसेट लिगेशन के दौरान उपयोग की जाने वाली साइट है।

प्लाज्मिड उपस्थिति की पुष्टि के साथ, कोशिकाओं को मीडिया से काटा जा सकता है, पीबीएस के साथ दो बार धोया जा सकता है, और फिर इम्यूनोब्लोटिंग के लिए एक पूरी सेल निकालने को तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है। यदि मुंह बंद हो गया, तो इस मामले में लक्षित प्रोटीन, या तो LipL32 या दोनों LigA और LigB, केवल जंगली प्रकार की कोशिकाओं में और pMaOri.dCas9 युक्त लोगों में मनाया जाना चाहिए; यहां तक कि उच्च जोखिम समय के साथ, pMaOri.dCas9sgRNA(चित्रा 3C)युक्त कोशिकाओं में कोई संबंधित प्रोटीन दिखाई नहीं देना चाहिए ।

यदि जीन को सील करने के बाद लेप्टोस्पायरल उग्रता का आकलन करने के लिए प्रयोगों की योजना बनाई जाती है, तो संजीदगी के लिए उपयोग की जाने वाली संस्कृतियों को कम मार्ग उग्र लेप्टोस्पायराहोना चाहिए। जीन मुंह से बाहर होने की पुष्टि होने के बाद, कई एलिकोट्स को बैकअप के रूप में फ्रीज किया जा सकता है। यदि खामोश जीन में एक औसत दर्जे का फेनोटाइप है, उदाहरण के लिए, पुनर्संयोजन प्रोटीन के साथ पिछले काम के आधार पर, संस्कृतियों का उपयोग सत्यापन के लिए किया जा सकता है और, इस मामले में, केवल pMaOri.dCas9 युक्त कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:dCas9 और sgRNA के विकास प्लाज्मिड व्यक्त । (A)एक 20-nt लंबे प्रोटोस्पेसर, एस pyogenes dCas9 पाम 5'-NGG-3 ' के बाद, लक्ष्य जीन के टेम्पलेट स्ट्रैंड के भीतर चुना जाता है तो बाद sgRNA वाटसन और Crick आधार इसी coding कतरा बांधना प्रदर्शन कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पूरी तरह से जीन स्नेशन । (ख)एसजीआरएनए कैसेट लिपल32 प्रमोटर, 20-एनटी प्रोटोस्पेसर और डीसीए9 पाड़ से बना है । PMaOri.dCas9 प्लाज्मिड XmaI प्रतिबंध साइट पर sgRNA कैसेट लिगेशन के लिए एक रीढ़ के रूप में प्रयोग किया जाता है। जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड, जिसे pMaOri.dCas9sgRNA कहा जाता है, लेप्टोस्पायर को दिया जाता है, और dCas9 और sgRNA दोनों की अभिव्यक्ति जीन साइलेंसिंग के लिए जिम्मेदार है। (ग)SgRNA निर्देशित dCas9 आरएनए बहुलक विस्तार के लिए एक भौतिक बाधा के रूप में कार्य करता है, इसलिए, प्रतिलेखन में बाधा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:संयोजित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। वांछित लेप्टोस्पेरा प्रजातियां आंदोलन के तहत हान मीडिया में उगाई जाती हैं, जब तक कि 420 एनएम पर 0.2-0.4 (मध्य-लॉग चरण) के O.D. नहीं होते हैं। संविलियन से एक दिन पहले, पुनर्संयोजन दाता ई. कोलाई 2163 की एक कॉलोनी जिसमें ब्याज की प्लाज्मिड होती है, एलबी + डीएपी + स्पीसी एगर प्लेटों से उठाया जाता है, क्योंकि कोशिकाओं को एक ही पूरकता के साथ तरल पौंड में रातोंरात उगाया जाता है। अगले दिन, संतृप्त ई। कोलाई संस्कृतियों को एलबी प्लस डीएपी में पतला किया जाता है और 420 एनएम पर 0.2-0.4 के O.D. तक उगाया जाता है। दोनों दाता ई. कोलाई और प्राप्तकर्ता लेप्टोस्पायरा नकारात्मक दबाव में एक छानने का तंत्र द्वारा एक 0.1 माइक्रोन फिल्टर की सतह पर 1:1 सेल अनुपात में मिलाया जाता है। फिर, फिल्टर डीएपी के साथ पूरक EMJH आगर प्लेटों के शीर्ष पर रखा जाता है, और इनक्यूबेशन 29 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए आय । EMJH का उपयोग ई. कोलाई प्रसार को सीमित करता है, और इच्छित 1:1 अनुपात बनाए रखा जाता है। बैक्टीरिया 1 एमएल हान मीडिया के साथ पाइपिंग द्वारा फिल्टर से बरामद किए जाते हैं, और डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत निलंबन की कल्पना की जाती है। अंत में, प्रत्येक निलंबन के 100-200 माइक्रोन को 0.4% खरगोश सीरम युक्त हान एगर प्लेटों पर वरीयता प्राप्त किया जाता है और 3% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड कियाजाताहै। इस स्तर पर, डीएपी को छोड़ दिया जाता है, और नतीजतन, ऑक्सोट्रोफिक ई कोलाई विकसित नहीं होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:म्यूटेंट के मूल्यांकन के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए) लेप्टोस्पिरा युक्त प्लेटों से कालोनियों खाली pMaOri.dCas9 (आगे प्रयोगों के लिए नकारात्मक नियंत्रण) और प्लाज्मिड्स pMaOri.dCas9sgRNA (लक्षित जीन खामोश के साथ) उठाया जाता है, तेजी से तरल हान में समरूप और spectinocincincin युक्त हान में उगाया । पुनः संयोजन कोशिकाओं को पीसीआर द्वारा pMaOri.dCas9 के भीतर XmaI साइट को फ्लैंक करने वाले प्राइमर के साथ मान्य किया जा सकता है। (ख)इस मामले में, pMaOri.dCas9 युक्त कोशिकाओं केवल २८१ बीपी के एक एम्प्लिकॉन के परिणामस्वरूप, जबकि उन कोशिकाओं को silencing के लिए प्लाज्मिड युक्त, दोनों dCas9 और sgRNA युक्त, एक ७२३ बीपी amplicon दिखाया । प्लाज्मिड की उपस्थिति की पुष्टि के बाद, इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा जीन साइलेंसिंग को मान्य किया गया था। (ग)प्रोटीन और लोडिंग नियंत्रण प्रोटीन दोनों को लक्षित करने के लिए एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन की सिफारिश की जाती है; प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट में, अकेले pMaOri.dCas9 युक्त ट्रांसकोन्जुगेंट से पूरे सेल अर्क या लिपएल32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) को लक्षित करने वाले sgRNA कैसेट के साथ और दोनों LigA और LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB) जीन प्रदर्शित किए जाते हैं। एंटी-लिपल32, एंटी-लिगाब और एंटी-लिपल41 (गैर-लक्षित, लोडिंग कंट्रोल) के साथ सह-इनक्यूबेशन इस बात की पुष्टि करता है कि PMaOri.dCas9sgRNAlipL32 और pMaOri.dCas9sgRNAligab युक्त कोशिकाओं में LigA और LigB दोनों युक्त कोशिकाओं में LipL32 प्रोटीन की अभिव्यक्ति समाप्त हो जाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल: एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) कैसेट अनुक्रम। एसजीआरएनए ट्रांसक्रिप्शन संविलियन लिपल32 प्रमोटर (बोल्ड न्यूक्लियोटाइड) द्वारा निर्देशित है। sgRNA 20 न्यूक्लियोटाइड्स से बना है जो प्रोटोस्पेसर की चर्चा करते हुए, लक्ष्य जीन के कोडिंग स्ट्रैंड के लिए बेस पेयरिंग के लिए जिम्मेदार है, और dCas9 पाड़ अनुक्रम (रेखांकित न्यूक्लियोटिड्स)। एक्सएमए मैं प्रतिबंध साइटों (cccggg) pMaOri.dCas9 प्लाज्मिड पर बंधन के लिए दोनों सिरों पर शामिल हैं । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

रोगजनक15, 16, 17, 18और सैप्रोफाइटिक19 लेप्टोस्पेरा प्रजातियों के प्रारंभिक अनुक्रमण के बाद, जीनोम के डेटा खनन ने लेप्टोस्पाइरल रोगजनकों के कई पहलुओं पर प्रकाश डाला। ज्यादातर मामलों में, ख्यात लेप्टोस्पाइरल सतह से उजागर प्रोटीन के पुनर्संयोजन समकक्ष और उसके बाद देशी प्रोटीन समारोह20, 21, 22, 23,24,25,25,26के पुनर्संयोजन समकक्ष का उपयोग करके प्रोटीन समारोह का पतालगायागया था। 

म्यूटेंट की पीढ़ी, और उनके संबंधित फेनोटाइप का मूल्यांकन, कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के प्रमुख घटक हैं। लेप्टोस्पिरा एसपीपी में म्यूटेंट उत्पन्न करने के प्रारंभिक प्रयास यादृच्छिक ट्रांसपोसनम्यूटेनेसिस27,28, 29,30द्वारा प्राप्तकिएगए थे। हालांकि, बाधित जीन की पहचान का अनुमान लगाने के लिए व्यापक और श्रमसाध्य विश्लेषण के बाद, यह नोट किया गया कि एल इंटररोजन सेरोवर मनीला में सभी जीनों में से केवल 15%27बाधित थे । लक्षित जीन नॉकआउट को31,32के भीतर समरूप हथियारों से घिरे एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट देने के लिए आत्मघाती प्लाज्मिड्स का उपयोग करते हुए रीकॉम्बेशन द्वारा और अधिक हासिल किया गया था ।

इन प्रौद्योगिकियों को लागू करके, लेप्टोस्पायरल बेसिक बायोलॉजी और उग्रता के कई पहलुओं का पता लगाया गया31,33,34,35, 36,37. ई. कोलाईके विकास -लेप्टोस्पाइरा कंजूगेटिव शटल वेक्टर, pMaOri 11,एपिसोमल जीन साइलेंसिंग के लिए घटकों के वितरण की अनुमति दी।

यह पहले दिखाया गया था कि Cas9-प्रेरित डबल-स्ट्रैंड ब्रेक लेप्टोस्पायरा एसपीपी के लिए घातक है। और, एक विकल्प के रूप में, एंजाइम के उत्प्रेरक निष्क्रिय संस्करण, dCas9, दोनों सप्रोफिटिक और रोगजनक प्रजातियों4, 5में जीन मुंह को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। sgRNA कैसेट लिगेशन के लिए एक रीढ़ के रूप में प्लाज्मिड pMaOri.dCas9 का उपयोग करके, dCas9 और sgRNA दोनों की अभिव्यक्ति के कारण विशिष्ट और स्थिर जीन चुप्पी प्राप्त की जा सकती है; dCas9-बाउंड sgRNA वाटसन-क्रिक बेस पेयरिंग द्वारा वांछित लक्ष्य के लिए प्रोटीन का नेतृत्व करेंगे ।

पूर्ण जीन मुंह के लिए, प्रोटोस्पेसर वांछित जीन के टेम्पलेट स्ट्रैंड के आधार पर डिजाइन किया जाना चाहिए ताकि sgRNA की आधार बांधना कोडिंग स्ट्रैंड के साथ होता है । लेप्टोस्पिरा एसपीपी में 35% की औसत सी + जी सामग्री के आधार पर, पीएपी 5'-एनजीजी-3' हर 100 बीपी में कम से कम 3 गुना हो जाएगा। इसलिए, लेप्टोस्पायरा के जीनोम के भीतर लगभग किसी भी जीन में कम से कम एक पाम शामिल होगा। हालांकि, यदि आदर्श एनजीजी नहीं मिला है, तो वैकल्पिक नाग आकृति का मूल्यांकन किया जा सकता है।

पिछले जीन चुप्पी तकनीकों, जैसे जस्ता उंगलियों और कहानी (प्रतिलेखन सक्रियक की तरह प्रभावक), प्रत्येक लक्ष्य के लिए एक अलग प्रोटीन के निर्माण पर भरोसा किया, इन तकनीकों श्रमसाध्य और महंगा३८बना । CRISPRi के मामले में, वेरिएबल कंपोनेंट sgRNA है, जिससे केवल 5 ' अंत में 20 बीपी को बदलना आवश्यक हो जाता है । पूर्ण, स्थिर और लक्षित जीन मुंह से न केवल लेप्टोस्पायरा एसपीपी में देखा गया है।4,5,बल्कि अन्य बैक्टीरिया8,39,40, 41में भी।

हान मीडिया13 के विकास ने कॉलोनी गठन के लिए इनक्यूबेशन समय को काफी कम करके म्यूटेंट की वसूली का पक्ष लिया और लेप्टोस्पायरा को 37 ओसी में बढ़ने की अनुमति दी। हालांकि, संयुग्मण चरण के दौरान, इसके उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि ई. कोलाई इस मीडिया में तेजी से पैदा हो सकता है और दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच इच्छित 1:1 अनुपात को दूर कर सकता है। इस स्तर पर, EMJH प्लस डीएपी बेहतर विकल्प है, क्योंकि ई. कोलाई इस मीडिया में खराब दोहराने । यह उल्लेखनीय है कि कुछ प्रयोगशालाएं इन-हाउस पूरक ईएमजेएच बनाती हैं, जिसमें अतिरिक्त घटक हो सकते हैं जो ई कोलाई कोशिकाओं के विकास का भी समर्थन कर सकते हैं।

यहां प्रस्तुत संयुग्म प्रोटोकॉल एल इंटररोगेन्स सेरोवर कोपेनहेगनी तनाव फियोक्रूज़ एल 1-130 के लिए अनुकूलित किया गया था, और यह मिट्टी के नमूनों से हाल ही में अलग रोगजनक तनाव के परिवर्तन में प्रभावी साबित भी हुआ था5। एल बोर्गपेटेरसेनी प्रजातियों के विभिन्न सेवरों के साथ प्रारंभिक प्रयास वर्णित प्रोटोकॉल के साथ कम संयुग्म क्षमता का संकेत देते हैं। इस प्रकार, लेप्टोस्पाइराकी विभिन्न प्रजातियों/सेवरों के साथ काम करते समय, संयुग्मण के लिए इष्टतम स्थितियों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए, दाता पर विचार करते हुए: प्राप्तकर्ता सेल अनुपात, प्रारंभिक सेल घनत्व, संयुग्मण मीडिया और समय (24 और 48 घंटे) । यह मानना उचित है कि विभिन्न लेप्टोस्पेरा प्रजातियां और सेवर अलग-अलग संजीदगी प्रोटोकॉल के साथ अलग-अलग व्यवहार करेंगे।

भले ही सैप्रोफाइटिक लेप्टोस्पेरा उपनिवेश प्लेटों पर कल्पना करना अपेक्षाकृत आसान है, रोगजनक उपनिवेशों का निरीक्षण करना अधिक कठिन हो सकता है। आम तौर पर, 0.4% खरगोश सीरम और स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ पूरक हान मीडिया का उपयोग करके, ट्रांसकोजुगंत कॉलोनियों को 10 दिन में देखा जा सकता है। हमारे अनुभव में, उपनिवेशों शुरू में मीडिया की सतह पर एक पारदर्शी प्रभामंडल के रूप में मौजूद हैं । वीडियो प्रोटोकॉल में डेंजर कॉलोनियों को 14 दिन की ग्रोथ के बाद दिखाया गया है, क्योंकि पारदर्शी लोगों को फिल्म करना मुश्किल था। इस स्तर पर, विभिन्न प्रकाश घटनाओं को प्राप्त करने और सफेद और अंधेरे पृष्ठभूमि के बीच स्थानांतरण करने के लिए प्लेट घुमाने से उपनिवेशों की पहचान करने में मदद मिल सकती है।

उत्परिवर्ती सत्यापन के लिए, इम्यूनोब्लोटिंग एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करता है; हालांकि, चूंकि एंटीबॉडी हमेशा लक्षित प्रोटीन के खिलाफ उपलब्ध नहीं होते हैं, इसलिए जीन को मान्य करने के लिए वैकल्पिक रणनीतियों को आगे बढ़ाया जा सकता है। लक्ष्य जीन के लिए प्राइमर का उपयोग करके मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्टेस पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) और जीन को मान्य करने के लिए एक संविलियन नियंत्रण प्रभावी है क्योंकि जीन ट्रांसक्रिप्शन की रुकावट के लिए एसजीआरएनए-निर्देशित dCas9 जिम्मेदार है। यदि लक्ष्य जीन प्रोटीन जैल में एक स्पष्ट रूप से परिभाषित प्रोटीन बैंड एन्कोड करता है, तो एसडीएस-पेज मुंह को प्रदर्शित कर सकता है, और लिपल32 जीन के अनुसार5। यदि एलपीएस बायोसिंथेसिस जीन को खामोश कर दिया जाता है, तो एलपीएस धुंधला को नियोजित किया जा सकता है; अच्छी तरह से परिभाषित सब्सट्रेट्स वाले एंजाइमों के लिए जीन एन्कोडिंग को मुंह में रखने के मामले में, क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट्स के साथ गतिज परख वैध रणनीतियां हैं; एल बिफ्लेक्सा में β-गैलेक्टोसिडेस साइलेंस को एक्स-गल और ओएनजीजी (ऑर्थो-नाइट्रोफेनिल-β-गैलेक्टोसाइड) सब्सट्रेट्स4के उपयोग से मान्य किया गया था।

जीन साइलेंसिंग की पुष्टि के बाद, प्रयोगों को फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। बैक्टीरियल आसंजन को मुंह में बंद करने के मामले में बाध्यकारी परख की जा सकती है; सीरम-चैलेंज परख ने रोगजनक लेप्टोस्पायरा 5द्वारा प्रदर्शित सीरम सर्वाइवल में लिगा और एलआईजीबी की भूमिका की पुष्टि की । म्यूटेंट का उपयोग जानवरों को उग्रता के क्षीण होने का आकलन करने के लिए टीका लगाने के लिए भी किया जा सकता है; इस मामले में, उत्परिवर्ती के साथ टीका लगाने वाले जानवरों की तुलना केवल pMaOri.dCas9 युक्त कोशिकाओं से संक्रमित लोगों से की जानी चाहिए।

अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल 10 दिनों के भीतर उत्परिवर्ती वसूली की सुविधा के लिए हान मीडिया का उपयोग कर रोगजनक लेप्टोस्पेरा प्रजातियों में जीन मुंह के लिए CRISPRi के आवेदन का वर्णन करता है । कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के साथ संयुक्त जीन चुप्पी लेप्टोस्पायराके रोगजनक तंत्र की हमारी समझ में सुधार करेगी, और अंततः रोग नियंत्रण के लिए बेहतर रोगनिरोधी रणनीतियों के विकास के लिए अग्रणी होगी।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यूएसडीए एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है। इस प्रकाशन में व्यापार नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए है, और अमेरिकी कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या समर्थन का मतलब नहीं है । ब्राजील की एजेंसी FAPESP (अनुदान 2014/50981-0) आर्थिक रूप से इस काम का समर्थन किया; एलजीवीएफ को FAPESP (2017/06731-8 और 2019/20302-8) से फैलोशिप के साथ वित्त पोषित किया जाता है । अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि तैयार करने में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी। लेखकों को भी फिल्माने और वीडियो प्रोटोकॉल संपादन के लिए USDA दृश्य सेवाओं से हंना हिल और अलेक्जेंडर ग्रिम्स का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane Millipore VCWP02500 Filtration for bacterial conjugation
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) Sigma D1377 Growth of auxotrophic E. coli β2163
Agar Noble BD & Company 214230 Used for preparation of solid EMJH and HAN plates
Bacto Agar BD & Company 214010 Used for preparation of solid LB plates
Clarity Western ECL substrate Biorad 170-5060 Chemiluminescent substrate
dNTP set Thermo Fisher 10297-018 dNTPs for PCR reaction
Glass Microanalysis Filter Holder Millipore XX1012530 Filtration for bacterial conjugation
Imaging System Biorad ChemiDoc MP Chemiluminescence detection
LB broth, Miller BD & Company 244620 Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Leptospira Enrichment EMJH BD & Company 279510 Supplementation of EMJH media
Leptospira Medium Base EMJH BD & Company 279410 EMJH medium for Leptospira
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% Biorad 4568043 Used for polyacrylamide gel eletrophoresis
Optical density reader Molecular Devices SpectraMax M2 For optical density measurements of bacterial cultures
Phosphate Buffered Saline 7.4 Sigma 806552 Saline solution for washing bacterial pellets
Spectinomycin Sigma S0692 Selection of pMaOri backbone plasmids
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher EP0402 Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction
Thermocycler Applied Biosystem GeneAmp PCR System 9700 Used for PCR reaction cycling
Thymidine (dT) Sigma T9250 Growth of auxotrophic E. coli π1
XmaI restriction enzyme New Englan BioLabs R0180L Digestion of plasmids and inserts

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References

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जेनेटिक्स अंक 174 लेप्टोस्पाइरा,लेप्टोस्पाइरोसिस म्यूटागेनिसिस क्रिस्पआर हस्तक्षेप जीन साइलेंसिंग संयुग्मण
<em>लेप्टोस्पायरा</em> की रोगजनक प्रजातियों में जीन सिलिंग के लिए CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) का आवेदन
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