Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Påføring av CRISPR Interference (CRISPRi) for genaktivering i patogene arter av leptospira

Published: August 14, 2021 doi: 10.3791/62631
Automatic Translation
1,2, 1, *2, *1
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas, Instituto Butantan
* These authors contributed equally

Summary

Her beskrives anvendelsen av CRISPR-interferens (CRISPRi) for spesifikk genaktivering i Leptospira-arter. Leptospira celler er forvandlet ved konjugering med plasmider som uttrykker dCas9 (katalytisk "død" Cas9) og en enkelt guide RNA (sgRNA), ansvarlig for base paring til ønsket genomisk mål. Metoder for å validere genaktivering presenteres.

Abstract

Leptospirose er en global forsømt zoonose, ansvarlig for minst 1 million tilfeller per år og nesten 60 tusen dødsfall. Sykdommen er forårsaket av patogene og virulente bakterier i slekten Leptospira, enten ved direkte kontakt med bakteriene eller indirekte ved eksponering for forurenset vann eller jord. Husdyr og ville dyr fungerer som reservoarverter for infeksjon, kaster leptospirer fra koloniserte nyrekarule av nyrene, via urin, inn i miljøet. Genereringen av mutante stammer av Leptospira er avgjørende for å evaluere og forstå patogene infeksjonsmekanismer. CRISPR-interferens (CRISPRi) har vist seg å være et greit, rimelig og spesifikt verktøy for genaktivering i patogen Leptospira. Derfor vil de metodologiske detaljene for å oppnå plasmidkonstruksjonene som inneholder både dCas9 og guide RNA, levering av plasmider til Leptospira ved konjugering med E. coli-stammen β2163, og transkonjugant gjenoppretting og evaluering, bli beskrevet. I tillegg åpner de nylig beskrevne Hornsby-Alt-Nally (HAN) mediene for relativt rask isolasjon og utvelgelse av mutante kolonier på agarplater.

Introduction

Leptospirose er en forsømt verdensomspennende zoonose forårsaket av patogene og virulente arter av slekten Leptospira. Hos mennesker står sykdommen for mer enn en million tilfeller og 60.000 dødsfall per år over hele verden1,2. Så langt er det ingen langsiktig og effektiv vaksine for sykdommen. Identifisering av virulensfaktorer og patogene mekanismer er avgjørende for utviklingen av bedre terapeutiske og profylaktiske strategier. Derfor er evnen til å generere genetiske mutasjoner og vurdere den resulterende fenotypen avgjørende for funksjonell genomisk analyse3.

Byggingen av mutanter i patogen Leptospira ble vurdert, til nå, iboende ineffektiv, arbeidskrevende, kostbar og vanskelig å implementere. Dette scenariet endret seg drastisk ved bruk av den nylige CRISPR-interferensen (CRISPRi) til saprofytiske4 og patogene5 leptospirer.

Genaktivering oppnås ved uttrykk for to komponenter: en variant av CRISPR / Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeat /CRISPR associated) enzym Cas9 fra Streptococcus pyogenes, kalt katalytisk døde Cas9 (dCas9) og en enkelt guide RNA (sgRNA), som kan redigeres i henhold til ønsket mål6,7,8. dCas9-protein, når det er bundet til sgRNA, er rettet mot spesifikke DNA-mål av Watson og Crick base pairing, forårsaker en sterisk blokkering til RNA polymerase forlengelse, noe som resulterer i genaktivering på grunn av den blokkerte gentranskripsjonen7 (Figur 1).

Dette manuskriptet tar sikte på å beskrive konstruksjonen av plasmidet for å uttrykke både dCas9 og sgRNA, konjugering mellom donor E. coli β2163 og mottaker Leptospira celler, transkonjugant utvinning, og til slutt validering av utvalgte mutantkolonier.

Protocol

1. Protospacer definisjon og plasmid konstruksjon

MERK: I denne delen er det første trinnet for å velge passende protospacers for å konstruere sgRNA og ytterligere ligasjon i pMaOri.dCas9, beskrevet (Figur 1). Denne protospacersekvensen består av en 20 nukleotider sekvens mot ønsket mål.

  1. Oppnå nukleotidsekvensen av genet av interesse for silencing i GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Send den til CHOPCHOP webserver (http://chopchop.cbu.uib.no/), med parametere definert for Streptococcus pyogenes Cas9 og protospacer tilstøtende motiv NGG etter å ha valgt "Fasta Target". Definer parameterne til "CRISPR/Cas9" og PAM (protospacer tilstøtende motiv) NGG.
  2. Basert på resultatene som er oppnådd, velg protospacers med best mulig poengsum (grønn pil), som ligger så nært som mulig til 5'enden av kodingsregionen, og viktigst av alt, finnes i malen (minus) tråd siden sgRNA må parre seg med genets kodestreng for fullstendig genaktivering.
    MERK: NGG-motivet er ikke inkludert i den endelige sgRNA-sekvensen.
  3. Bruk lipL32-promotoren til å uttrykke enkeltføreren RNA som inneholder en variabel 20 nukleotidsekvens i 5' enden og en bevart dCas9 stillassekvens. Slå sammen 20-nt-sekvensen, kalt protospacer, til lipL32-promotoren (ved slutten av 5' og sgRNA stillas (3'end) (Figur 1B).
    MERK: For en veldefinert lipL32-promotør, bruk promotorregionen som består av -334 til TSS (Transcription Start Site, basert på Zhukova et al.9). Sjekk tilleggsfilen for den endelige sgRNA-kassetten.
  4. Generer sgRNA-kassetten etter sekvensiell PCR5 eller få den syntetisert av en kommersiell leverandør.
  5. Etter å ha fått kassetten, ligate den inn pMaOri.dCas9 plasmid på XmaI begrensningsstedet i begge ender (cccggg)4.
    1. Fordøye både sgRNA-kassetten og pMaOri.dCas9-plasmiden med XmaI-begrensningsenzym og fortsett til ligasjon (figur 1B).
    2. Utfør kloningstrinnene i den dT auxotrofiske E. coli-stammen π110, på grunn av pMaOri11 (og i forlengelsen, pMaOri.dCas9) opprinnelsen til replikering, R6K-gamma.
      MERK: For en detaljert protokoll for ligation og klonevalg, se tidligere publikasjoner av Fernandes og Nascimento12. sgRNA-guidet dCas9 vil binde seg til kodestrengen til det valgte genet av interesse og vil derfor hindre RNA polymerase forlengelse (Figur 1C), noe som resulterer i genaktivering.

2. Leptospira transformasjon ved konjugering

MERK: Et grafisk oppsett av dette trinnet presenteres i figur 2. For å lage HAN-medier og HAN-plater, se Hornsby et al.13 og Fernandes et al.5.

  1. Vokse patogene Leptospira celler ved 29 eller 37 °C i HAN media13 under agitasjon ved å fortynne en mettet kultur i frisk HAN ved 1:100; vanligvis tar L. interrogans serovar Copenhageni stamme Fiocruz L1-130 4-6 dager å nå riktig celletetthet.
    1. Sørg for at kulturene når en O.D. på 0,2-0,4 ved 420 nm (2 til 5 x 108 celler/ml) før bruk til konjugering.
      MERK: Siden HAN-medier endrer farge etter hvert som celletettheten øker (på grunn av fenolrødt i DMEM-medier), sentrifuge (4000 x g, 15 min, romtemperatur) 1 ml av kulturmediene for å fjerne leptospirer og bruke supernatant som blank for måling av O.D.
  2. Transformer den konjugative E. coli-stammen β2163, auxotrofisk for diaminopimelic acid (DAP), med plasmid pMaOri.dCas9 som inneholder sgRNA-kassetten. For E. coli-transformasjon, bruk enten varmesjokkprotokoller eller elektroporasjon. Inkluder transformasjon med plasmid pMaOri.dCas9 uten sgRNA-kassett som kontroll.
    1. For transformasjon av varmesjokk blander du det plasmide DNA-et (100 ng) med kjemisk kompetente E. coli-celler og inkuberer på is i 30 minutter. Utfør varmesjokk ved 42 °C i 90 s og legg det igjen på is i 5 minutter. Gjenopprett cellene ved å legge til 1 ml LB-medier, inkuber ved 37 °C i 1 time og fortsett til platingen.
    2. For elektroporasjon, bruk elektrokompetente celler blandet med 100 ng plasmid DNA. Bruk følgende parametere for puls: 1,8 kV, 100 Ω og 25 μF. Gjenopprett cellene som forklart ovenfor.
    3. Plate den transformerte donor E. coli celler i LB agar medium supplert med Diaminopimelic acid (DAP) (0,3 mM) og spectinomycin (40 μg / ml) for å velge for plasmider.
  3. For konjugering, velg en koloni fra hver tallerken en dag før konjugeringsdagen (som bestemmes ved å overvåke O.D. av kulturer av leptospirer).
    1. Velg en koloni av E. coli β2163 fra den tomme pMaOri.dCas9, og en fra pMaOri.dCas9sgRNA-plater. La dem vokse over natten i 10 ml LB pluss DAP og spectinomycin ved 37 °C.
    2. Neste dag fortynner du de mettede kulturene 1:100 i 10 ml fersk LB pluss DAP (ikke inkluder antibiotika her) til OD420nm på 0,2-0,4. Normalt tar det 2-3 timer for E. coli å nå disse tetthetene.
  4. Inne i en BSL2 biosikkerhetshette monterer du et filtreringsapparat ved å plassere en 25 mm diameter, 0,1 μm porestørrelse, blandet cellulosestere membranfilter på toppen av glassbasen. Plasser en 15 ml glasstrakt på toppen og hold begge delene med fjærklemmer. Koble glasset til en vakuumpumpe og legg kulturene til trakten for filtrering.
  5. Legg til 5 ml Leptospira-kultur i trakten. Legg til et volum av E. coli for å utgjøre 1: 1-andelen basert på OD420nm-verdiene til begge kulturer. Slå på vakuumpumpen og konsentrer cellene ved filtrering. Etter cellekonsentrasjon i membranfilteret, må du forsiktig hente den. Sørg for at mediet filtreres gjennom membranen.
    MERK: Filtrering tar 5 til 10 min.
  6. Plasser filteret på en kommersielt tilgjengelig EMJH-plate (se Materialliste) supplert med DAP (0,3 mM). Sørg for at bakteriesiden er oppe. Inkuber platene ved 29 °C i 24 timer.
    MERK: Hvis HAN eller supplerte interne EMJH14-plater brukes, kan E. coli spre seg og overvinne den tiltenkte 1:1-andelen, noe som igjen kan redusere konjugeringseffektiviteten5.
  7. Etter 24 timer, gjenopprett filtrene fra platene og plasser hvert enkelt filter i et 50 ml konisk rør.
  8. Bruk 1 ml flytende HAN-medium for å frigjøre cellene fra filteroverflaten ved omfattende pipettering og virveling.
  9. Visualiser de gjenvunne blandede bakterieløsningene ved mørk feltmikroskopi for å se etter celle levedyktighet og bevegelighet, og Leptospira:E. coli proporsjoner.
    MERK: På dette stadiet kan du se tilsvarende antall E. coli og Leptospira.
  10. Spred 100-200 μL av denne kulturen på HAN-plater som inneholder 0,4% inaktivert kaninserum og 40 μg/ml spectinomycin. Inkuber tallerkener ved 37 °C i en 3 % CO2-atmosfære.
    MERK: Normalt danner L. interrogans serovar Copenhageni stamme Fiocruz L1-130 celler kolonier i 5-7 dager på kontrollplater og i 8-10 dager på spectinomycinplater. På dette stadiet vil E. coli ikke vokse siden de er auxotrofiske for DAP.
  11. Som en kontroll, fortynn kulturer ved 104 leptospirer / ml og tilsett 100 μL på plater uten antibiotika, for overvåking av leptospiral vekst.

3. Kolonivalg og transkonjugant vekst og validering

MERK: Koloniene skal være tydelige ved dag 10. Imidlertid er de ikke for enkle å visualisere. Normalt på dette tidspunktet er HAN-plater litt ugjennomsiktige på grunn av de tørkede cellene som ble spredt, og Leptospira-kolonier kan vises som en gjennomsiktig glorie mot den hvite bakgrunnen. Det anbefales å se platene i forskjellige vinkler for å oppnå forskjellig lysforekomst, noe som gjør koloniene tydeligere. Ved lengre inkubasjonstider kan kolonier skaffe seg et tettere utseende, og i dette tilfellet presenterer de som melkeaktige glorier mot en mørk bakgrunn.

  1. Tilsett 100 μL flytende HAN-medier til hvert 1,5 ml mikrorør for å gjenopprette mutanter. Ta minst 3 kolonier fra hver tallerken.
    1. Ved hjelp av en mikropipettespiss " grave" agaren for å hente koloniene fra platene siden leptospirale kolonier kan være undergrunn.
      MERK: Agar forventes å bli tatt med på dette stadiet. Kolonier bør tas fra kontrollplater som inneholder tom pMaOri.dCas9 plasmid, og plater med leptospirer som inneholder plasmider som uttrykker både dCas9 og single guide RNA, designet for målgenet.
    2. Dispenser den innsamlede kolonien i 100 μL HAN-medier i et 1,5 ml mikrorør og homogeniser kraftig. På dette stadiet, sørg for maksimal pause av agarintegriteten for å frigjøre celler. Virvel suspensjonen i 10 s.
  2. Visualiser de gjenvunne cellene ved mørk feltmikroskopi ved en 200-400x forstørrelse ved å legge til en 5 μL dråpe på et glasssklie og dekke prøvene umiddelbart med en deksleslip.
    1. Bekreft tilstedeværelsen av levende og levedyktige leptospirer gjenopprettet fra koloniene.
    2. Etter visualisering og bekreftelse av levedyktige leptospirer, overfør 100 μL celler til flytende HAN-medier som inneholder 40 μg / ml spectinomycin.
  3. Etter vekst i flytende HAN media, vurdere kulturer for tilstedeværelsen av plasmid med primer pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) og R (ATAGGTGAAGTAGGCCCACCC), som anerkjenner regionen som flankerer sgRNA-kassetten.
    1. Samle 200 μL kultur, sentrifuge (4000 x g, 15 min), kast supernatanten og resuspend den resulterende pellet i 20 μL vann.
    2. Bruk denne suspensjonen som mal for ekstra PCR, uten behov for DNA-ekstraksjon12.
      MERK: Celler med pMaOri.dCas9 vil gjengi en amplikon på 281 bp, sammenlignet med de som inneholder plasmidene med sgRNA-kassetten som vil gjengi en amplikon på 723 bp.
  4. For bekreftelse av genaktivering, utfør en immunoblot ved hjelp av celleekstrakter fra transkonjuganter som bare inneholder pMaOri.dCas9 (negativ kontroll) og pMaOri.dCas9sgRNA.
    1. Påfør tilsvarende 5 x 107 celler per bane av natrium dodecylsulfat (SDS) polyakrylamidgel.
    2. Elektrotransferproteiner til en membran for inkubasjon med passende antistoffer. Foruten antistoffet mot målgenet for silencing, bruk en annen for lastkontroll.
  5. Hold mutantkulturene i HAN-medier pluss spectinomycin for å opprettholde plasmidet. Hvis ingen antibiotika påføres media, kan fullstendig genaktivering observeres i minst tre passasjer5.

Representative Results

Selv om CG-innholdet i Leptospira spp. genomer vanligvis er rundt 35%; nesten hvert gen vil sannsynligvis inneholde PAM 5'NGG 3'; dette motivet må vurderes i malstrengen. Etter å ha lagt inn kodesekvensen til et gen (fra start til stopp codons), basert på CHOPCHOP-resultatene, må protospacers velges ved minus (-, mal) tråden. Det er viktig å ikke inkludere NGG-motivet i 20-nt sgRNA protospacer.

Hvis konjugering utføres med en 1:1 donor: mottakercelleproporsjon, i 24 timer på overflaten av EMJH agarplater pluss DAP, og 200 μL av den gjenvunne bakterielle suspensjonen spres på HAN pluss spectinomycin agarplater, bør transkonjugantskolonier være synlige på omtrent 8-10 dager. Spredning av dette volumet resulterer normalt i 20-40 kolonier per plate (Figur 3A). For å se etter celle levedyktighet etter konjugering, kan celler spres på HAN-plater uten antibiotikavalg. I dette tilfellet kan kolonier observeres så snart som 7 dager. HAN-plater blir blekgule i en 3% CO2 atmosfære.

Etter koloniplukking og vekst i flytende medier pluss spectinomycin, kan PCR ved hjelp av hele celler og pMaOri2 primere brukes til en innledende kvalitetskontroll av transkonjugantene (Figur 3B). Leptospirale celler som inneholder kontrollen pMaOri.dCas9 plasmid bør resultere i en amplikon på 281 bp, mens de cellene som inneholder plasmid for silencing, det vil si inneholder både dCas9 og sgRNA, bør resultere i en 723 bp amplicon. pMaOri2 F- og R-primere ble designet for å flanke XmaI-begrensningsstedet, som er nettstedet som brukes under sgRNA-kassettligasjon.

Med bekreftelse av plasmid tilstedeværelse kan celler høstes fra media, vaskes to ganger med PBS, og deretter brukes til å forberede et helcellet ekstrakt for immunoblotting. Hvis silencingen skjedde, bør målproteinene, i dette tilfellet enten LipL32 eller både LigA og LigB, bare observeres i de ville typecellene og hos de som inneholder pMaOri.dCas9; selv med høyere eksponeringstid, bør ingen tilsvarende proteiner være synlige i cellene som inneholder pMaOri.dCas9sgRNA (Figur 3C).

Hvis eksperimenter for å vurdere leptospiral virulens etter genaktivering er planlagt, bør kulturer som brukes til konjugering være lav passasje virulente Leptospira. Etter at genaktivering er bekreftet, kan flere aliquots fryses som en sikkerhetskopi. Hvis det stillede genet har en målbar fenotype, for eksempel basert på tidligere arbeid med rekombinante proteiner, kan kulturer bare brukes til validering, og i dette tilfellet kan celler som bare inneholder pMaOri.dCas9, inkluderes som en negativ kontroll.

Figure 1
Figur 1: Utvikling av dCas9 og sgRNA som uttrykker plasmid. (A) En 20-nt lang protospacer, etterfulgt av S. pyogenes dCas9 PAM 5'-NGG-3', velges innenfor malstrengen til målgenet slik at den påfølgende sgRNA kan utføre Watson og Crick baseparing til den tilsvarende kodingsstrengen, noe som resulterer i fullstendig genaktivering. (B) SgRNA-kassetten består av lipL32-promotoren, 20-nt protospacer og dCas9 stillas. pMaOri.dCas9-plasmiden brukes som ryggrad for sgRNA-kassettligasjon på XmaI-begrensningsstedet. Den resulterende plasmid, kalt pMaOri.dCas9sgRNA leveres til leptospirer, og uttrykket av både dCas9 og sgRNA er ansvarlig for genaktivering. (C) sgRNA-regissert dCas9 fungerer som en fysisk barriere for RNA polymerase forlengelse, derfor hemmer transkripsjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk representasjon av konjugeringsprotokoll. De ønskede Leptospira-artene dyrkes i HAN-medier, under agitasjon, til O.D. på 0,2-0,4 (midtloggfase) ved 420 nm. En dag før konjugering plukkes en koloni av rekombinant donor E. coli β2163 som inneholder plasmid av interesse fra LB + DAP + Spc agarplater, da celler dyrkes over natten i flytende LB med samme tilskudd. Neste dag, mettet E. coli-kulturer fortynnes i LB pluss DAP og dyrkes til O.D. på 0,2-0,4 ved 420 nm. Både donor E. coli og mottaker Leptospira blandes med 1:1 celleproporsjoner på overflaten av et 0,1 μm filter av et filtreringsapparat under negativt trykk. Deretter plasseres filtre på toppen av EMJH agarplater supplert med DAP, og inkubasjon fortsetter i 24 timer ved 29 °C. Bruken av EMJH begrenser E. coli-spredning, og den tiltenkte 1:1-andelen opprettholdes. Bakterier gjenvinnes fra filtre ved pipettering med 1 ml HAN-medier, og suspensjoner visualiseres under darkfieldmikroskopi. Til slutt blir 100-200 μL av hver suspensjon sådd på HAN agarplater som inneholder 0,4% kaninserum og inkuberes ved 37 °C i 3 % CO2. På dette stadiet utelates DAP, og som et resultat vil auxotrofisk E. coli ikke vokse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater for mutanters evaluering. (A) Kolonier fra plater som inneholder Leptospira forvandlet med tom pMaOri.dCas9 (negativ kontroll for videre eksperimenter) og plasmider pMaOri.dCas9sgRNA (med målrettet gen stilnet) plukkes, homogeniseres kraftig i flytende HAN og dyrkes i flytende HAN som inneholder spectinomycin. Rekombinante celler kan valideres av PCR med primere som flankerer XmaI-nettstedet i pMaOri.dCas9. (B) I dette tilfellet resulterte celler som inneholder pMaOri.dCas9 bare i en amplikon på 281 bp, mens de cellene som inneholder plasmid for silencing, som inneholder både dCas9 og sgRNA, viste en 723 bp amplicon. Etter bekreftelse av tilstedeværelsen av plasmidene ble genaktivering validert ved immunoblotanalyse. (C) Inkubasjon med antistoffer mot både målprotein og et lastkontrollprotein anbefales; i den representative immunobloten vises helcelleekstrakter fra transkonjuganter som inneholder pMaOri.dCas9 alene eller med sgRNA-kassetter rettet mot lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) og både LigA og LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB) gener. Samtidig inkubasjon med anti-LipL32, anti-LigAB og anti-LipL41 (ikke-mål, lastekontroll) bekrefter at uttrykket av LipL32-protein avskaffes i celler som inneholder pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 og både LigA og LigB i celler som inneholder pMaOri.dCas9sgRNAligAB. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil: Kassettsekvens med én guide RNA (sgRNA). SgRNA-transkripsjonen er regissert av den konstituerende lipL32-promotoren (dristige nukleotider). sgRNA består av 20 nukleotider som refererer til protospaceren, ansvarlig for baseparing til kodingsstrengen til målgenet, og dCas9 stillassekvens (understrekede nukleotider). Xma Jeg begrensning nettsteder (cccggg) er inkludert i begge ender for ligation på pMaOri.dCas9 plasmid. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Etter tidlig sekvensering avpatogene 15,16,17,18 og saprofytiske19Leptospira-arter, kaster datautvinning av genomet lys over flere aspekter av leptospiral patogenese. I de fleste tilfeller ble proteinfunksjonen utforsket ved hjelp av den rekombinante motstykket til putative leptospirale overflateutsatte proteiner og påfølgende spekulasjoner om den opprinnelige proteinfunksjonen20,21,22,23,24,25,26. 

Genereringen av mutanter, og evaluering av deres respektive fenotype, er viktige komponenter i funksjonell genomisk analyse. Innledende forsøk på å generere mutanter i Leptospira spp. ble oppnådd ved tilfeldig transposonmutagenese27,28,29,30; Men etter omfattende og arbeidskrevende analyse for å utlede identiteten til forstyrrede gener, ble det bemerket at bare 15% av alle gener i L. interrogans serovar Manilae ble forstyrret27. Målrettet gen knockout ble videre oppnådd ved homolog rekombinasjon ved hjelp av selvmordsplasmider for å levere en antibiotikaresistenskassett flankert av homologe armer innenfor ønsket mål31,32.

Ved å bruke disse teknologiene ble flere aspekter av leptospiral grunnleggende biologi og virulens utforsket31,33,34,35,36,37. Utviklingen av E. coli-Leptospira konjugativ shuttle vektor, pMaOri 11, tillot levering av komponenter for episomal genaktivering.

Det ble tidligere vist at den Cas9-induserte dobbeltstrengsbruddet er dødelig for Leptospira spp. og som et alternativ kan den katalytisk inaktive varianten av enzymet, dCas9, brukes til å oppnå genaktivering i både saprofytiske og patogene arter4,5. Ved å bruke plasmid pMaOri.dCas9 som ryggrad for sgRNA kassett ligation, kan spesifikk og stabil genaktivering oppnås på grunn av uttrykket av både dCas9 og sgRNA; dCas9-bundet sgRNA vil lede proteinet til ønsket mål av Watson-Crick base pairing.

For fullstendig genaktivering bør protospaceren utformes basert på malstrengen til ønsket gen slik at baseparing av sgRNA oppstår med kodestrengen. Basert på et gjennomsnittlig C+G-innhold på 35% i Leptospira spp., vil PAM 5'-NGG-3' forekomme minst 3 ganger hver 100 bp. Derfor vil praktisk talt ethvert gen i Leptospiras genom inneholde minst ett PAM. Men hvis motivet NGG ikke blir funnet, kan det alternative NAG-motivet evalueres.

Tidligere genaktiveringsteknikker, som sinkfingre og TALE (transkripsjonsaktivatorlignende effektorer), stolte på byggingen av ett annet protein til hvert mål, noe som gjorde disse teknikkene arbeidskrevende og kostbare38. Når det gjelder CRISPRi, er variabelkomponenten sgRNA, noe som gjør det nødvendig å bare endre 20 bp ved 5'enden. Fullstendig, stabil og målrettet genaktivering er observert ikke bare i Leptospira spp.4,5, men også i andre bakterier8,39,40,41.

Utviklingen av HAN media13 favoriserte utvinning av mutanter ved å drastisk redusere inkubasjonstiden for kolonidannelse og la Leptospira vokse ved 37 oC. Under konjugeringstrinnet anbefales imidlertid ikke bruken siden E. coli kraftig kan spre seg i dette mediet og overvinne den tiltenkte 1: 1-andelen mellom donor- og mottakerceller. På dette stadiet er EMJH pluss DAP det bedre valget, siden E. coli replikerer dårlig i dette mediet. Det er verdt å nevne at noen laboratorier lager intern supplert EMJH, som kan inneholde tilleggskomponenter som også kan støtte veksten av E. coli-celler.

Konjugeringsprotokollen som presenteres her ble optimalisert for L. interrogans serovar Copenhageni stamme Fiocruz L1-130, og det ble også vist seg å være effektivt i transformasjonen av en nylig isolert patogen stamme fra jordprøver5. Innledende forsøk med forskjellige serovars av L. borgpetersenii arter indikerer lavere konjugeringseffektivitet med den beskrevne protokollen. Således, når du arbeider med forskjellige arter / serovars av Leptospira, bør optimale forhold for konjugering bestemmes empirisk, med tanke på donor: mottakercelleproporsjoner, innledende celletetthet, konjugeringsmedier og tid (24 og 48 timer). Det er rimelig å anta at forskjellige Leptospira-arter og serovars vil oppføre seg annerledes med forskjellige konjugeringsprotokoller.

Selv om saprofytiske Leptospira-kolonier er relativt enkle å visualisere på plater, kan patogene kolonier være vanskeligere å observere. Normalt, ved å bruke HAN-medier supplert med 0,4% kaninserum og spectinomycin, kan transkonjugante kolonier observeres på dag 10. Vår erfaring er at kolonier i utgangspunktet presenterer seg som en gjennomsiktig glorie på medieoverflaten. I videoprotokollen vises tettere kolonier, etter 14 dager med vekst, siden de gjennomsiktige var vanskelige å filme. På dette stadiet kan rotering av platen for å oppnå forskjellig lysforekomst og skifte mellom hvit og mørk bakgrunn bidra til å identifisere kolonier.

For mutantvalidering tilbyr immunoblotting en enkel tilnærming; Men siden antistoffer ikke alltid er tilgjengelige mot målproteiner, kan alternative strategier for å validere genaktivering forfølges. Kvantitativ omvendt transkripsjon PCR (qRT-PCR) ved hjelp av primere for målgenet og en konstituerende kontroll er effektiv for å validere genaktivering siden sgRNA-veiledede dCas9 er ansvarlig for blokkering av gentranskripsjon. Hvis målgenet koder et klart definert proteinbånd i proteingeler, kan SDS-PAGE demonstrere silencing, og i henhold til lipL32 genaktivering5. Hvis LPS biosyntesegener blir stilnet, kan LPS-farging brukes; Ved silencinggener som koder for enzymer med veldefinerte substrater, er kinetiske analyser med kromogene substrater gyldige strategier; β-galaktosidase siloring i L. biflexa ble validert ved bruk av X-gal og ONPG (ortho-Nitrophenyl-β-galactoside) substrater4.

Etter bekreftelse av genaktivering kan eksperimenter utformes for å evaluere fenotypen ytterligere. Bindende analyser kan utføres ved silencing bakterielle adhesiner; serum-utfordringsanalyser bekreftet rollen som LigA og LigB i serumoverlevelse vist av patogen Leptospira5. Mutanter kan også brukes til å inokulere dyr for å vurdere demping av virulens; I dette tilfellet bør dyr inokulert med mutanten sammenlignes med de som bare er smittet med celler som inneholder pMaOri.dCas9.

Til slutt beskriver den nåværende protokollen anvendelsen av CRISPRi for genaktivering i patogene Leptospira-arter ved hjelp av HAN-medier for å lette mutant utvinning innen 10 dager. Genaktivering kombinert med funksjonell genomisk analyse vil forbedre vår forståelse av patogene mekanismer i Leptospira, og til slutt føre til utvikling av bedre profylaktiske strategier for sykdomskontroll.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

USDA er en leverandør og arbeidsgiver med like muligheter. Omtale av varenavn eller kommersielle produkter i denne publikasjonen er utelukkende med det formål å gi spesifikk informasjon, og innebærer ikke anbefaling eller godkjenning fra det amerikanske landbruksdepartementet. Det brasilianske byrået FAPESP (grant 2014/50981-0) støttet dette arbeidet økonomisk; LGVF er finansiert med et stipend fra FAPESP (2017/06731-8 og 2019/20302-8). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller manuskriptforberedelse. Forfatterne takker også Hannah Hill og Alexander Grimes fra USDA Visual Services for filming og redigering av videoprotokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane Millipore VCWP02500 Filtration for bacterial conjugation
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) Sigma D1377 Growth of auxotrophic E. coli β2163
Agar Noble BD & Company 214230 Used for preparation of solid EMJH and HAN plates
Bacto Agar BD & Company 214010 Used for preparation of solid LB plates
Clarity Western ECL substrate Biorad 170-5060 Chemiluminescent substrate
dNTP set Thermo Fisher 10297-018 dNTPs for PCR reaction
Glass Microanalysis Filter Holder Millipore XX1012530 Filtration for bacterial conjugation
Imaging System Biorad ChemiDoc MP Chemiluminescence detection
LB broth, Miller BD & Company 244620 Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Leptospira Enrichment EMJH BD & Company 279510 Supplementation of EMJH media
Leptospira Medium Base EMJH BD & Company 279410 EMJH medium for Leptospira
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% Biorad 4568043 Used for polyacrylamide gel eletrophoresis
Optical density reader Molecular Devices SpectraMax M2 For optical density measurements of bacterial cultures
Phosphate Buffered Saline 7.4 Sigma 806552 Saline solution for washing bacterial pellets
Spectinomycin Sigma S0692 Selection of pMaOri backbone plasmids
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher EP0402 Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction
Thermocycler Applied Biosystem GeneAmp PCR System 9700 Used for PCR reaction cycling
Thymidine (dT) Sigma T9250 Growth of auxotrophic E. coli π1
XmaI restriction enzyme New Englan BioLabs R0180L Digestion of plasmids and inserts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bharti, A. R., et al. Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance. Lancet Infectious Disease. 3 (12), 757-771 (2003).
  2. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLoS Neglected Tropical Disease. 9 (9), 0003898 (2015).
  3. Shapiro, R. S., et al. A CRISPR-Cas9-based gene drive platform for genetic interaction analysis in Candida albicans. Nature Microbiology. 3 (1), 73-82 (2018).
  4. Fernandes, L. G. V., et al. Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira. Science Reports. 9 (1), 1839 (2019).
  5. Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Genetic manipulation of pathogenic Leptospira: CRISPR interference (CRISPRi)-mediated gene silencing and rapid mutant recovery at 37 C. Science Reports. 11 (1), 1768 (2021).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  8. Choudhary, E., Thakur, P., Pareek, M., Agarwal, N. Gene silencing by CRISPR interference in mycobacteria. Nature Communication. 6, 6267 (2015).
  9. Zhukova, A., et al. Genome-wide transcriptional start site mapping and sRNA identification in the pathogen. Frontiers in Cell and Infectious Microbiology. 7, 10 (2017).
  10. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPalpha) conjugative machineries, and their cognate Escherichia coli host strains. Research in Microbiology. 156 (2), 245-255 (2005).
  11. Pappas, C. J., Benaroudj, N., Picardeau, M. A replicative plasmid vector allows efficient complementation of pathogenic Leptospira strains. Applied Environmental Microbiology. 81 (9), 3176-3181 (2015).
  12. Fernandes, L. G. V., Nascimento, A. L. T. O. Specific gene silencing in Leptospira biflexa by RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9). Methods in Molecular Biology. 2134, 109-122 (2020).
  13. Hornsby, R. L., Alt, D. P., Nally, J. E. Isolation and propagation of leptospires at 37 °C directly from the mammalian host. Science Reports. 10 (1), 9620 (2020).
  14. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 12, Unit 12E.12 (2006).
  15. Nascimento, A. L., et al. Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis. Journal of Bacteriology. 186 (7), 2164-2172 (2004).
  16. Nascimento, A. L., et al. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Brazillian Journal of Medical Biology Research. 37 (4), 459-477 (2004).
  17. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  18. Bulach, D. M., et al. Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (39), 14560-14565 (2006).
  19. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLoS One. 3 (2), 1607 (2008).
  20. Fernandes, L. G., et al. OmpL1 is an extracellular matrix- and plasminogen-interacting protein of Leptospira spp. Infections and Immunity. 80 (10), 3679-3692 (2012).
  21. Fernandes, L. G., et al. Leptospira spp.: Novel insights into host-pathogen interactions. Veterinary Immunology and Immunopathology. 176, 50-57 (2016).
  22. Castiblanco-Valencia, M. M., et al. Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H, FHL-1, FHR-1, and C4BP. Journal of Infectious Diseases. 205 (6), 995-1004 (2012).
  23. Choy, H. A., et al. The multifunctional LigB adhesin binds homeostatic proteins with potential roles in cutaneous infection by pathogenic Leptospira interrogans. PLoS One. 6 (2), 16879 (2011).
  24. Siqueira, G. H., et al. The recombinant LIC10508 is a plasma fibronectin, plasminogen, fibrinogen and C4BP-binding protein of Leptospira interrogans. Pathogen and Diseases. 74 (2), (2016).
  25. Teixeira, A. F., et al. Features of two new proteins with OmpA-like domains identified in the genome sequences of Leptospira interrogans. PLoS One. 10 (4), 0122762 (2015).
  26. Kochi, L. T., et al. The interaction of two novel putative proteins of Leptospira interrogans with E-cadherin, plasminogen and complement components with potential role in bacterial infection. Virulence. 10 (1), 734-753 (2019).
  27. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infections and Immunity. 77 (2), 810-816 (2009).
  28. Bourhy, P., Louvel, H., Saint Girons, I., Picardeau, M. Random insertional mutagenesis of Leptospira interrogans, the agent of leptospirosis, using a mariner transposon. Journal of Bacteriology. 187 (9), 3255-3258 (2005).
  29. Pětrošová, H., Picardeau, M. Screening of a Leptospira biflexa mutant library to identify genes involved in ethidium bromide tolerance. Applied Environmental Microbiology. 80 (19), 6091-6103 (2014).
  30. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods in Molecular Biology. 859, 169-176 (2012).
  31. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infections and Immunity. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  32. Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella. Molecular Microbiology. 40 (1), 189-199 (2001).
  33. King, A. M., et al. High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans. Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).
  34. Lambert, A., et al. FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath. Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).
  35. Murray, G. L., et al. Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis. Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).
  36. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathogens. 3 (7), 97 (2007).
  37. Sasaki, Y., et al. Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa. PLoS One. 13 (4), 0194923 (2018).
  38. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  39. Cress, B. F., et al. Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (9), 4472-4485 (2016).
  40. Zhao, C., Shu, X., Sun, B. Construction of a gene knockdown system based on catalytically inactive ("dead") Cas9 (dCas9) in Staphylococcus aureus. Applied Environmental Microbiology. 83 (12), (2017).
  41. Zhao, Y., et al. CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces. Biotechnology Journal. , 1800121 (2018).

Tags

Genetikk Utgave 174 Leptospira leptospirose mutagenese CRISPR-interferens genaktivering konjugering
Påføring av CRISPR Interference (CRISPRi) for genaktivering i patogene arter av <em>leptospira</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., … More

Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira. J. Vis. Exp. (174), e62631, doi:10.3791/62631 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter