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Protocole de double marquage 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 pour l’analyse de la progression du cycle cellulaire dans les cellules souches neurales de la drosophile

Published: May 4, 2021 doi: 10.3791/62642
Automatic Translation
1,2, 1
1Cell Biology, University of Bern, 2Department of life sciences and medicine, University of Luxembourg

Summary

L’analyse du cycle cellulaire avec marquage de la 5-éthyhyyl-2'-désoxyuridine (EdU) et de la phospho-histone H3 (pH3) est une procédure en plusieurs étapes qui peut nécessiter une optimisation approfondie. Ici, nous présentons un protocole détaillé qui décrit toutes les étapes de cette procédure, y compris l’analyse d’images et la quantification pour distinguer les cellules dans différentes phases du cycle cellulaire.

Abstract

L’analyse in vivo de la progression du cycle cellulaire est régulièrement effectuée dans des études sur les gènes régulant la mitose et la réplication de l’ADN. La 5-éthyynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a été utilisée pour étudier la progression réplicative/phase S, tandis que les anticorps dirigés contre la phospho-histone H3 ont été utilisés pour marquer les noyaux et les cellules mitotiques. Une combinaison des deux étiquettes permettrait de classer les phases G0/G1 (phase gap), S (réplicative) et M (mitotique) et constituerait un outil important pour évaluer les effets des knockdowns de gènes mitotiques ou des mutants nuls sur la progression du cycle cellulaire. Cependant, les réactifs utilisés pour marquer les cellules marquées EdU sont incompatibles avec plusieurs étiquettes fluorescentes d’anticorps secondaires. Cela complique l’immunocoloration, où des anticorps primaires et secondaires marqués sont utilisés pour marquer les cellules mitotiques pH3 positives. Cet article décrit un protocole étape par étape pour le double marquage de l’EdU et du pH3 dans les cellules souches neurales larvaires de la drosophile, un système largement utilisé pour étudier les facteurs mitotiques. De plus, un protocole est fourni pour l’analyse et la quantification des images afin d’allouer les cellules marquées en 3 catégories distinctes, G0/G1, S>G2/M (progression de S à G2/M) et M phases M.

Introduction

Le cycle de division cellulaire comprend une phase G1 (phase de premier intervalle), une phase réplicative/S, une phase G2 (deuxième phase d’intervalle) et une phase M (mitotique). En passant par ces phases, la cellule subit des changements spectaculaires dans la transcription cellulaire, la traduction et la réorganisation de la machinerie du cytosquelette1,2. En réponse à des signaux développementaux et environnementaux, les cellules peuvent temporairement cesser de se diviser et devenir quiescentes (G0) ou se différencier et cesser définitivement de se diviser3. D’autres scénarios, tels que les dommages à l’ADN, peuvent provoquer une différenciation prématurée ou une apoptose3,4. La réponse à ces signaux est médiée par des points de contrôle du cycle cellulaire, qui agissent comme un système de surveillance pour assurer l’intégrité des processus cellulaires essentiels avant que la cellule ne s’engage dans la phase suivante du cycle de division5. Par conséquent, les études sur les gènes régulant la réplication de l’ADN, les points de contrôle et la machinerie mitotique doivent analyser les éventuels défauts de progression du cycle cellulaire qui peuvent se produire dans les cellules mutantes ou lors de la destruction de ces gènes par siRNA. De plus, de telles analyses peuvent être utilisées pour tester la santé cellulaire globale ainsi que les réponses cellulaires au traitement médicamenteux.

La 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) est un analogue de la thymidine qui est incorporé dans l’ADN lors de la réplication6. Cette méthode a été largement utilisée pour identifier les cellules en phase S. Cependant, les cellules sont ensuite soumises à des procédures de dénaturation de l’ADN sévères pour permettre la détection de BrdU grâce à l’utilisation d’anticorps anti-BrdU6. Ce traitement sévère peut endommager les épitopes cellulaires et empêcher une caractérisation plus poussée de l’échantillon par immunocoloration. L’incorporation d’EdU et la détection ultérieure par une « réaction de clic » catalysée par le cuivre avec de petits colorants azotés perméables aux cellules et marqués par fluorescence éliminent le besoin de procédures de dénaturation sévères7. Cette méthode est donc apparue comme une alternative plus pratique à l’incorporation BrdU.

De plus, le pH3 a été décrit comme un marqueur fiable pour les cellules de phase mitotique/M8. L’histone H3 est une protéine histone centrale associée à l’ADN qui devient phosphorylée vers la fin de la phase G2 à la phase M précoce et est déphospholylée vers la fin de l’anaphase8. Plusieurs anticorps commerciaux peuvent être utilisés pour détecter le pH3 à l’aide de protocoles d’immunocoloration standard. La double coloration de l’EdU et du pH3 permettrait donc de détecter les cellules en phase S ainsi qu’en phase M. De plus, les cellules de la phase G1 et du début de la phase G2 ne tacheraient pas positivement pour l’un ou l’autre des marqueurs.

Les cellules souches neurales (NB) de la drosophile offrent un modèle de cellules souches bien caractérisé dans lequel les cellules se divisent de manière asymétrique pour produire un NB auto-renouvelant identique et une cellule mère ganglionnaire (GMC), qui est destinée à la différenciation9. De plus, plusieurs outils génétiques et anticorps spécifiques au NB rendent ce système adapté à la manipulation génétique et à l’imagerie des cellules vivantes. Par conséquent, plusieurs études ont utilisé des NB pour étudier les gènes régulant les divisions asymétriques et la détermination du devenir cellulaire9. Des populations distinctes de NB existent dans le cerveau central (CB) et le lobe optique (OL) du cerveau larvaire9; Des CB NB ont été utilisés pour la présente étude. Ces CB larvaires du troisième stade sont de grandes cellules qui conviennent également à l’étude des facteurs régulant l’assemblage du fuseau mitotique. Un protocole pour analyser les défauts de progression du cycle cellulaire serait un outil essentiel dans de telles études.

Les protocoles publiés précédemment utilisaient des kits commerciaux, tels que Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, qui fournissent plusieurs composants de réaction et colorants azides marqués avec une variété de colorants Alexa Fluor pour l’incorporation et la détection EdU10. Cependant, les réactifs fournis avec de tels kits ne sont pas compatibles avec certaines étiquettes fluorescentes souvent utilisées avec des anticorps secondaires. Ce kit de détection EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit fourni avec le colorant azide conjugué Alexa Fluor 647) a été testé chez les NB larvaires de la troisième étoile de la drosophile, et la co-coloration a été tentée avec des anticorps contre le pH3 et Miranda, un marqueur des NB. De plus, des anticorps secondaires marqués Alexa Fluor 568 ou Cy3 ont été utilisés pour la détection du marquage Miranda sur la membrane plasmique des NB11. Cependant, l’intensité attendue du signal et le schéma de coloration (résultats non publiés) n’ont pas été observés avec ces anticorps secondaires lorsque l’immunocoloration a été effectuée après la détection de l’EdU.

Pour l’incorporation d’EdU, le protocole décrit par Daul et ses collègues nécessitait l’alimentation des larves avec un milieu Kankel-White mélangé à de l’EdU et du bleu de bromophénol (BPB)10. Les larves se nourrissaient de nourriture enrichie en EdU et en BPB, ce qui pouvait être vu par sa couleur bleue lors de l’ingestion dans l’intestin larvaire. Bien que cette méthode ait été utilisée pour l’incorporation d’EdU dans mms19 de perte de fonction(Mms19P)des larves du troisième stade, les larves de Mms19P ne se sont apparemment pas nourries car pratiquement aucune couleur bleue n’a été détectée dans l’intestin larvaire (résultats non publiés). Les larves de Mms19P présentent des déformations de développement drastiques et finissent par s’arrêter au stade du troisième stade. Cela peut en quelque sorte affecter le comportement alimentaire des larves du troisième stade et rendre le protocole d’alimentation EdU inadapté à de tels cas.

Après avoir étudié la littérature disponible et travaillé de manière approfondie sur la normalisation des étapes essentielles, une approche alternative a été proposée pour le double marquage EdU/pH3 chez les NB de drosophiles, qui ne nécessite pas d’alimentation des larves avec de l’EdU. Une étude précédente utilisait une double coloration EdU/pH3 pour analyser le cycle cellulaire dans les NB, mais n’a pas présenté de protocole détaillé4. Cela représente un obstacle inutile pour les laboratoires qui tentent de mettre en œuvre cette méthode. En outre, l’évaluation de la compatibilité de divers réactifs avec le kit EdU et l’optimisation ultérieure peuvent prendre beaucoup de temps. Cet article présente un protocole étape par étape qui couvre l’incorporation d’EdU dans les cerveaux larvaires disséqués et l’immunocoloration avec des anticorps anti-pH3, suivie de la microscopie confocale et de l’analyse d’images pour attribuer les NB à quatre catégories distinctes: phase G0 / G1, phase S, S>G2 / M (progression de S à G2 / M) et phase M. Les étapes à optimiser sont décrites et des conseils sont fournis pour l’analyse d’images de grands ensembles de données. De plus, la lecture EdU/pH3 dans les NB de type sauvage est analysée et comparée aux NB Mms19P, qui ont récemment montré un retard du cycle cellulaire11.

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Protocol

1. Préparation des réactifs et des stocks pour le test Click-it EdU

REMARQUE : Reportez-vous au tableau des matériaux et au tableau 1 pour plus de détails sur le kit et les réactifs fournis avec le kit.

  1. Porter les flacons à température ambiante avant de préparer les solutions.
  2. Préparer une solution mère d’EdU (composant A) de 10 mM en ajoutant 2 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO, composant C). Bien mélanger et conserver à -20 °C.
  3. Préparez une solution de travail d’Alexa Fluor 647-azide (composant B) en ajoutant 70μL de DMSO (composant C). Bien mélanger et conserver à -20 °C.
  4. Préparer une solution 1x de tampon de réaction Click-iT EdU (composant D) en mélangeant 4 mL de cette solution avec 36 mL d’eau désionisée. Conserver le reste de la solution à 2-6 °C.
  5. Faire un stock de 10x (200 mg/mL) de l’additif tampon Click-iT EdU (composant F) en ajoutant 2 mL d’eau désionisée. Bien mélanger et conserver à -20 °C.
  6. Conserver Hoechst 33342 (composant G) à 2-6 °C. Stocker le DMSO (composant C) dans un dessiccateur à -20 °C.
    REMARQUE: Des gants doivent être utilisés pour manipuler le DMSO et hoechst.

2. Dissection du cerveau larvaire du troisième stade et incorporation d’EdU

REMARQUE: Le protocole pour les dissections cérébrales a été décrit précédemment12. Avant de commencer les dissections, assurez-vous que des quantités suffisantes de solutions d’EdU et de PFA sont préparées et décongelées comme décrit aux points 2.6 et 3.1.

  1. Préparer 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en ajoutant 25,6 g de Na2HPO4,7H20, 80 g de NaCl, 2 g de KCl et 2 g de KH2PO4 à 1 L d’eau désionisée. Ajuster le pH à 7,4, puis préparer une solution 1x dans de l’eau désionisée.
  2. Ajouter le milieu de dissection de Schneiders (SM) à deux dépressions consécutives d’une plaque de verre (3 ou 9) en verre de dépression. Ajoutez 1x PBS à la prochaine dépression consécutive.
  3. À l’aide d’une paire de pinces, cueillez des larves errantes du troisième stade et placez-les sur un tissu mouillé de PBS pour nettoyer les résidus de nourriture des mouches. Placez la larve dans la dépression avec PBS, puis dans la dépression consécutive avec SM.
  4. À l’aide d’une paire de pinces fines, retirezles 3/4 du bas du corps de la larve.
    1. Attrapez doucement les crochets buccaux larvaires avec une paire de pinces et tenez la cuticule à l’autre extrémité avec l’autre paire de pinces.
    2. Tournez la tête larvaire à l’envers en poussant vers l’intérieur les crochets buccaux et en décollant simultanément le tissu à l’autre extrémité.
  5. Observez le cerveau larvaire avec des disques imaginaux attachés. Enlevez d’autres tissus attachés au cerveau et transférez le cerveau à la prochaine dépression consécutive avec SM.
  6. Décongeler la solution mère EdU de 10 mM. Préparer une solution de 100 μM en diluant cette matière de 10 mM dans du SM.
  7. Ajouter 100 μL de cette solution EdU+SM de 100 μM dans une autre dépression sur la plaque de Pyrex. Incuber ~5-10 cerveaux disséqués dans 100 μL de solution EdU+SM de 100 μM pendant 2 h à 25 °C.
    REMARQUE: Comme les NB se divisent une fois en ~ 2 h, ce protocole vise à analyser un cycle cellulaire complet. N’utilisez que des cerveaux intacts pour les étapes ultérieures. Jetez les cerveaux endommagés pendant la dissection.

3. Fixation et immunocoloration

  1. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans une hotte.
    1. Ajouter 4 g de poudre de paraformaldéhyde à 80 mL de 1x PBS dans un bécher placé sur un agitateur magnétique et chauffer à 60 °C. Pour dissoudre le PFA, ajoutez quelques gouttes de 1 N NaOH. Vérifiez le pH et ajustez-le à 7,0 avec quelques gouttes de 1 M HCl si nécessaire.
    2. Réglez le volume à 100 mL avec 1x PBS. Aliquoter la solution de PFA et conserver à 2-6 °C jusqu’à 1 mois. Ajouter un détergent non ionique à 0,3 % (voir la Table des matériaux)à la solution de PFA pour une fixation efficace des gros tissus tels que le cerveau larvaire.
  2. Après incorporation de l’EdU, transférer le cerveau dans des tubes de microcentrifugation de 0,6 mL contenant 4% de PFA. Incuber à température ambiante sur un nutateur pendant 15 min. Tapotez le tube sur le banc de laboratoire afin que les cerveaux s’installent au fond du tube.
  3. Retirez le PFA et lavez 3 fois avec du PBS + 0,3% de détergent non ionique (PBST) à température ambiante. Assurez-vous que chaque lavage dure au moins 10 minutes sur un nutateur. Après le dernier lavage, retirer le PBST, ajouter la solution bloquante (PBST + 5% d’albumine sérique bovine) et incuber pendant 30 min à température ambiante.
  4. Diluer l’anticorps anti-Miranda (1:250) et l’anticorps anti pH3 (1:200) dans le PBST (les deux anticorps dans le même tube). Retirez le tampon bloquant et ajoutez la solution d’anticorps primaire. Incuber toute la nuit à 2-6 °C sur un nutateur.
    REMARQUE: Miranda est une protéine membranaire présente sur les CB NB. Il sert à identifier ces grandes cellules rondes dans la région CB13.
  5. Retirez la solution d’anticorps primaire et lavez-la 3 fois avec pbST. Assurez-vous que chaque lavage dure 10 minutes sur un nutateur à température ambiante.
  6. Préparez une solution d’anticorps secondaire en ajoutant 1:500 dilué Alexa Fluor 488 anti-Rabbit et Alexa Fluor 568 anti-Rat dans PBST. Retirez le PBST et ajoutez la solution d’anticorps secondaire aux cerveaux disséqués. Incuber toute la nuit à 2-6 °C dans l’obscurité, sur un nutateur, et laver 3 fois avec du PBST (étape 3.5).

4. Détection de l’EdU, coloration de l’ADN et montage

  1. Pour préparer le cocktail de détection EdU, mélanger les composants (voir tableau 2)dans un tube de 1,5 mL.
  2. Après le dernier lavage (étape 3.6), retirez le PBST et ajoutez le cocktail de détection EdU aux cerveaux disséqués. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min sur un nutator. Laver 2 fois avec PBST pendant 10 min chacun, dans l’obscurité.
  3. Pour la coloration de l’ADN, diluer Hoechst 33342 (composant G) 1:2 000 dans du PBST pour préparer une solution de 5 μg/mL.
  4. Retirer le PBST après le deuxième lavage (étape 4.2) et ajouter 500 μL de solution de Hoechst de 5 μg/mL aux cerveaux disséqués. Incuber dans l’obscurité pendant 10 min. Retirez Hoechst et lavez une fois avec du PBST pendant 10 min.
  5. Tapotez le tube sur le banc de laboratoire et laissez les cerveaux s’installer. Retirez le PBST du tube, mais ne laissez derrière lui que 50-100 μL.
  6. Coupez l’extrémité d’une micropipette de 200 μL et transférez soigneusement les cerveaux sur une lame de verre propre. Retirez l’excès de PBST de la diapositive en les épongeant avec des bandes de papier filtre. Veillez à ne pas laisser le papier filtre toucher le cerveau.
  7. Mettez une goutte de milieu de montage soluble dans l’eau et non fluorescent sur le cerveau et orientez le cerveau de manière à ce que le cordon nerveux ventral fasse face à la glissière et que les lobes soient tournés vers le haut. Organisez les cerveaux dans un seul fichier afin qu’il soit plus facile d’imager les cerveaux en série.
  8. Placez doucement un couvercle sur le dessus du cerveau. Placez la glissière à 2-6 °C pendant la nuit.
    REMARQUE: Le support de montage durcit lors du stockage pendant la nuit, de sorte qu’il n’est pas nécessaire de sceller le couvercle avec du vernis à ongles.

5. Imagerie

REMARQUE: Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur le microscope à balayage laser et l’objectif d’immersion dans l’huile utilisés dans ce protocole.

  1. Dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez l’objectif 63x.
  2. Mettez une goutte d’huile d’immersion sur le couvercle juste au-dessus des cerveaux montés pour faciliter la localisation du tissu à travers l’oculaire.
  3. À l’aide du canal DAPI/Hoechst 33342, trouvez le cerveau à travers l’oculaire, puis passez en mode d’acquisition dans le logiciel.
  4. Configurez 4 canaux pour imager Hoechst 33342 (ADN), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) et Alexa Fluor 647 (EdU). Utilisez l’outil d’assistance aux colorants, qui configure automatiquement les lasers d’excitation et les filtres d’émission pour les colorants sélectionnés.
  5. Réglez le champ de vision de manière à englober tout le lobe du cerveau. Imagez tout le volume du lobe cérébral en acquérant des piles z espacées de 0,8 μm. Stockez toutes les images d’une session d’imagerie dans un format de bibliothèque *.lif.

6. Analyse d’images

REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent l’analyse des images acquises et comment trier les cellules en phase G0/G1, phase S, S>G2/M (progression de S à G2/M) et phase M à l’aide du logiciel ImageJ.

  1. Téléchargez Fidji (Fidji est ImageJ) à partir de l’URL suivante : https://fiji.sc/. Ouvrez Fidji, puis faites glisser et déposez les fichiers .lif dans Fidji.
    REMARQUE: Fiji est une version d’ImageJ qui est pré-installée avec plusieurs plugins14. Le transfert de fichiers .lif vers Fidji ouvrira le plugin Bio-formats, qui est nécessaire pour traiter les fichiers .lif. Le plugin Bio-formats est également nécessaire pour ouvrir des fichiers image générés à partir d’autres marques de microscopes, par exemple des fichiers nd2 générés à partir d’un microscope Nikon. Ce plugin est pré-installé avec Fiji.
  2. Sélectionnez Navigateur de données dans l’onglet d’affichage de la pile et utilisez la pile virtuelle dans l’onglet Gestion de la mémoire du plug-in bio-formats.
    REMARQUE: Les fichiers Lif avec des piles z de 8 à 10 cerveaux ont souvent une taille de 300 à 400 mégaoctets. Sur les ordinateurs avec une faible RAM, l’ouverture de quelques-uns de ces fichiers peut rapidement épuiser la RAM disponible sur ImageJ et empêcher tout traitement d’image ultérieur. La pile virtuelle est en lecture seule, n’a pas besoin de RAM élevée pour le traitement et constitue une option idéale pour charger de grands ensembles de données sur Fidji.
  3. Observez l’image multicanal affichée dans ImageJ. Modifiez la couleur des couches à partir de la barre de menus à l’aide de l’outil Image | couleur | couches. Observez les NB marqués Miranda comme de grandes cellules rondes dans la région CB.
  4. Dessinez une région d’intérêt (ROI) à l’aide de l’outil d’ellipse sur chaque NB pour éviter de compter le NB deux fois.
    1. Dans la barre de menus ImageJ, sélectionnez Analyser les outils | | Gestionnaire de retour sur investissement. Marquez tous les nb dans la section z actuelle et appuyez sur t après avoir marqué chaque cellule.
  5. Une fois que tous les NB de la section z actuelle sont marqués, changez les canaux en pH3 et EdU, et comptez manuellement le nombre de NB positifs à l’EdU, de NBs à pH3 positif, de NBs colorant positivement pour EdU et pH3, et de NB ne colorant pas pour les deux marqueurs.
  6. Recherchez des nb dans les sections z suivantes, supprimez les anciens rois et ajoutez de nouveaux retours sur investissement pour compter les nb dans différentes piles.
  7. Préparez une feuille de calcul avec les colonnes suivantes : 1. EdU- pH3- : cette section représente les cellules doublement négatives qui sont dans la phase G0/G1 du cycle cellulaire ; 2. EdU+ : les cellules de cette catégorie ont incorporé l’EdU et subissent une réplication de l’ADN (phase S) ; 3. EdU+ pH3+ : ces cellules doublement positives ont terminé la phase S et sont passées à la phase G2 ou M ; 4. pH3+ : ces NB subissent une mitose.
  8. Calculer les pourcentages de NB présents dans les 4 catégories ci-dessus pour chaque lobe. Préparez un graphique à barres à l’aide du tableur montrant les données regroupées pour les pourcentages de NB dans chaque catégorie.

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Representative Results

Le cerveau larvaire bi-lobé de la drosophile troisième stade a été utilisé comme système modèle pour étudier les processus cellulaires et de développement fondamentaux9. L’objectif de la présente étude était de présenter un protocole d’analyse de la progression du cycle cellulaire dans les NB marqués EdU et pH3 de la région CB (Figure 1). Les CB NB sont subdivisés en type I et type II, et ils présentent le modèle de division asymétrique caractéristique9. Chaque division NB de type I génère un NB, qui est capable de s’auto-renouveler, et un autre GMC qui est destiné à la différenciation9. En revanche, les NB de type II génèrent des cellules progénitrices neurales immatures (INP) amplifiant le transit qui s’auto-renouvellent et génèrent 2 GMC9. Bien qu’il existe une population distincte du Nouveau-Brunswick dans la région des LO, cette étude s’est concentrée sur les NB CB, qui sont grands et facilement identifiables avec des marqueurs spécifiques au NB.

Pour cette étude, Miranda a été utilisé pour identifier et analyser les CB NB (Figure 2). Bien que Miranda colore également d’autres populations cellulaires dans l’OL, les CB NB peuvent être identifiés avec Miranda en raison de leur grande taille et de leur emplacement CB13. D’autres marqueurs plus spécifiques peuvent également être utilisés pour étiqueter les CB NB, tels que Deadpan, qui est un facteur de transcription régulant l’auto-renouvellement du NB. Cependant, comme le pH3 et l’EdU marquent la chromatine, le marqueur membranaire Miranda a été utilisé pour faciliter la visualisation et l’analyse des NB marqués de pH3 et d’EdU. L’incorporation d’EdU, la détection ultérieure et la caractérisation ultérieure par immunocoloration et analyse d’images est une procédure complexe. Il est important de normaliser chaque étape pour déterminer les conditions optimales de coloration et d’imagerie. Bien que certains rapports publiés présentent des stratégies d’étiquetage EdU/pH3, ces rapports ne précisent pas les étapes d’optimisation et d’analyse d’images. Le flux de travail décrit à la figure 1 résume les étapes de l’incorporation d’EdU jusqu’à l’analyse d’image.

Nous avons récemment caractérisé le gène Mms19, qui est requis par les NB pour une progression mitotique normale11. Grâce à des analyses d’imagerie de cellules vivantes, il a été démontré que les NB dépourvus de Mms19 fonctionnels prennent deux fois plus de temps que les NB de type sauvage pour terminer la mitose. Cela a été clairement reflété dans l’analyse EdU/pH3 dans laquelle une proportion significativement plus élevée de NB Mms19P s’est avérée être dans la phase M par rapport aux NB de type sauvage (Figure 3A). Il a été démontré que l’expression de la protéine de fusion Mms19::eGFP dans le fond Mms19P sauve les défauts phénotypiques11,15. Cela correspondait bien aux résultats de l’analyse de progression du cycle cellulaire dans laquelle la proportion de cellules en phase M a été sauvée à des niveaux de type sauvage lors de l’expression de Mms19::eGFP dans le fond Mms19P (Figure 3A,B).

Figure 1
Figure 1: Un flux de travail simplifié pour le double étiquetage EdU/pH3. Les cerveaux larvaires du troisième stade ont été disséqués et incubés avec 100 μM d’EdU pendant 2 h. Par la suite, le tissu cérébral a été fixé avec du PFA et immunocoloré avec des anticorps contre Miranda et pH3. Les images des cerveaux colorés ont été obtenues au microscope confocal et traitées avec ImageJ/Fiji pour attribuer les cellules à différentes phases du cycle cellulaire. Abréviations : EdU = avec la 5-éthyhyyl-2'-désoxyuridine ; pH3 = phospho-histone H3; PFA = paraformaldéhyde; SM = milieu de dissection de Schneiders; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; PBST = PBS + 0,3 % de détergent non ionique; BSA = albumine sérique bovine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Attribution des cellules à G1/G0; S; Phases S>G2/M et M. Les cellules progressent à travers les phases G1, S, G2 et M pour compléter un cycle cellulaire complet. Les CB NB provenant de cerveaux larvaires errants du troisième stade ont été marqués avec Miranda (rouge), EdU (gris), pH3 (vert), et l’ADN a été marqué avec Hoechst 33342 (bleu). Les NB étiquetés ont été analysés dans ImageJ et répartis en 4 phases distinctes selon qu’ils se sont colorés positivement pour (A) ni EdU ni pH3 (G1 / G0), (B) seulement EdU (phase S), (C) à la fois EdU et pH3 (S>G2 / M), et (D) seulement pH3 (phase M). Des exemples de NB individuels provenant uniquement de cerveaux de type sauvage sont présentés ici. Barres d’échelle = 5 μm. Abréviations : CB = cerveau central ; NB = neuroblastes; EdU = avec la 5-éthyynyl-2'-désoxyuridine; pH3 = phospho-histone H3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Effet de Mms19P sur la distribution de phase du cycle cellulaire NB. (A)Après analyse des NB de type sauvage (w;+;+), on a constaté qu’environ 25 % des NB étaient en phase M. Dans les NB Mms19P, cependant, cette proportion est passée à près de 40%. L’expression de Mms19::eGFP dans le fond Mms19P est connue pour sauver les phénotypes Mms19P, et la proportion de NB de phase M dans ce fond était comparable au type sauvage. (B) Les pourcentages de NB dans 4 catégories différentes correspondant aux phases du cycle cellulaire G1/G0, S, S>G2/M et M ont été comparés à tous les types sauvages; Mms19P, et Mms19::eGFP, mms19P génotypes. La proportion de phases M et G1/G0 diffère considérablement dans les NB Mms19P par rapport aux NB de type sauvage. En revanche, la distribution du cycle cellulaire des NB dans les cerveaux Mms19::eGFP, Mms19P est comparable à celle trouvée dans le type sauvage. La signification statistique a été calculée à l’aide du test de Kruskal-Wallis et plusieurs colonnes ont été comparées à l’aide du post-test de Dunn; (P<0,001). Ce chiffre a été modifié à partir de 11. Abréviations : NB = neuroblastes; eGFP = protéine fluorescente verte améliorée; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Réactif Quantité/volume
EdU (composante A) 5 mg
Alexa Fluor 647 – azoture (composant B) 1 flacon
Diméthylsulfoxyde (DMSO, composant C) 4 mL
Tampon de réaction Click-iT EdU (composant D) 4 mL (solution 10x)
Sulfate de cuivre (CuSO4, composant E) 100 mM; 1 flacon
Additif tampon Click-iT EdU (composant F) 400 mg
Hoechst 33342 (composant G) 10 mg/mL dans l’eau, 35 μL

Tableau 1 : Composants du kit EdU. Composants fournis avec le kit de prolifération de cellules fluor Click-iT EdU Alexa et les quantités/volumes respectifs. Abréviation : EdU = avec 5-éthyynyl-2'-désoxyuridine.

Composants réactionnels Volume (mL)
1x tampon de réaction Click-iT (préparé à l’étape 1.4) 430
CuSO4 (composante E) 20
Alexa Fluor 647 – azoture (composant B, préparé à l’étape 1.3) 1.2
Additif tampon de réaction (composant F, préparé à l’étape 1.5) 50
Volume total ~500

Tableau 2 : Préparation du cocktail de détection de l’EdU. Le cocktail de détection de l’EdU a été préparé en mélangeant les volumes indiqués des composants du kit (préparés à la section 2). Abréviation : EdU = avec 5-éthyynyl-2'-désoxyuridine.

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Discussion

L’incorporation d’EdU et sa réaction de « clic » subséquente avec de l’azoture perméable aux cellules présentent les avantages pratiques de cette technique par rapport à la méthode BrdU utilisée précédemment7. Cependant, cette réaction est catalysée par les ions Cu(I), et plusieurs colorants peuvent être instables en présence de ce catalyseur en cuivre, comme le conseille clairement le fabricant du kit Click-it EdU. Lorsque des expériences d’immunocoloration ont été effectuées après l’exécution de l’étape de détection de l’EdU, l’intensité du signal attendue n’a pas été observée avec les colorants à canal rouge, Alexa Fluor 568 et Cy3. Cependant, le protocole fonctionnait lorsque les réactions immunocolorantes étaient terminées avant l’étape de détection de l’EdU. Avec ce protocole, quatre canaux ont été utilisés pour visualiser Hoechst, pH3, Miranda et EdU.

Une autre étape optimisée de ce protocole a été l’absorption de l’EdU par les cerveaux disséqués, par opposition à l’alimentation des larves avec de la nourriture pour mouches enrichie en EdU. Comme le cycle cellulaire complet de la drosophile NB dure environ 2-2,5 h16,l’absorption de l’EdU par le cerveau pendant 2,5 h, comme dans ce protocole, permet le suivi d’un cycle cellulaire complet de NB. Les cellules qui ne se colorent pas positivement pour l’EdU ou le pH3 sont des cellules au repos. Dans le cas d’une larve d’un troisième stade dans lequel les NB se divisent activement, ces cellules au repos seraient très probablement dans la phase G1 du cycle cellulaire. Cependant, de la fin de l’embryon au début du deuxième stade, les NB deviennent temporairement au repos17. Dans ces premiers stades de développement, la coloration double négative représenterait très probablement une phase G0 / quiescente.

Les NB subissant une réplication de l’ADN devraient se tacher positivement pour l’EdU, tandis que les cellules qui ont progressé de la phase S (incorporation de l’EdU) à la phase G2 ou M tardive devraient tacher positivement pour l’EdU et le pH3. Cependant, la caractérisation de la phase G2 serait difficile avec ce protocole car les premières cellules G2 ne se colorent pas positivement pour l’EdU ou le pH3. Cependant, les cellules qui ont incorporé l’EdU et qui ont progressé vers le G2 précoce se tacheraient également positivement pour l’EdU et pourraient compliquer l’analyse de la phase G2. Plusieurs médicaments qui inhibent la réplication de l’ADN provoquent l’arrêt du cycle cellulaire à la phase S18,19,20. Ce protocole pourrait être un outil pratique pour analyser et identifier l’effet de tels traitements médicamenteux car les cellules bloquées en phase S ne progresseraient pas vers la phase M et la fraction de cellules doublement positives EdU, pH3 serait diminuée ou même absente dans ce cas.

Dans une étude récemment publiée, nous avons évalué l’effet du gène Mms19 sur la progression mitotique chez les NB11. Grâce à l’imagerie des cellules vivantes, nous avons démontré un retard spectaculaire des NB Mms19P dans la progression de la phase M. Alors que les NB de type sauvage terminent la phase M en ~10 min, les NB Mms19P ont pris environ deux fois plus de temps pour terminer la phase M11. En conséquence, ce protocole de double marquage EdU/pH3 reflétait également un retard mitotique puisque nous avons observé près de 1,5 fois plus de NB colorant positivement pour pH3 dans les cerveaux Mms19P par rapport aux cerveaux de type sauvage. Les données de ce protocole EdU sont donc comparables aux résultats directs de l’imagerie des cellules vivantes. Comme ces approches directes et cellulaires vivantes prennent beaucoup de temps et nécessitent une optimisation approfondie, ce protocole pourrait être utilisé pour effectuer un dépistage initial rapide de ces mutants du cycle cellulaire afin de comprendre les défauts à des stades spécifiques. Une fois qu’une phase d’intérêt est identifiée, elle pourrait ensuite être suivie par des tests de visualisation cellulaire directe.

La durée des phases du cycle cellulaire peut varier considérablement entre les différents types de cellules et les stades de développement. Par exemple, dans le développement d’embryons de drosophiles, la régulation négative des kinases mitotiques entraîne une durée prolongée de la phase S, tandis que dans les cellules destinées à la différenciation, telles que les progéniteurs neuronaux cérébraux de furet (Mustela putorius furo), la durée de la phase S est nettement courte21,22. Le temps de marquage des impulsions EdU doit donc être optimisé en fonction de la longueur des phases S et G dans le type de cellule donné. La durée de l’impulsion EdU dépendrait également des objectifs expérimentaux, par exemple, une impulsion courte est suffisante pour mesurer la fraction de cellules actuellement en phase S, tandis qu’une impulsion plus longue permet d’analyser la progression des cellules à travers la phase S.

Une optimisation étendue de l’impulsion EdU peut également permettre d’estimer la phase S, comme l’ont élégamment démontré Pereira et ses collègues23. Ces chercheurs ont démontré une nouvelle méthode basée sur la cytométrie en flux dans laquelle les cellules HCT116 ont été marquées par impulsion avec de l’EdU pendant des périodes de temps incrémentielles. Les auteurs ont démontré que l’intensité fluorescente maximale de l’EdU est obtenue lorsque le temps de pulsation correspond à la longueur de la phase S23. De plus, l’analyse de la progression temporelle des cellules marquées EdU a également permis de quantifier les phases G1 et G2/M. Bien que le protocole actuel pour le double marquage EdU/pH3 permette l’analyse des défauts de phase S et M, il n’est pas possible de mesurer la durée précise des phases avec ce protocole. Le protocole décrit par Pereira et ses collègues pourrait être une alternative appropriée pour les essais qui nécessitent la détermination des longueurs de phase du cycle cellulaire. L’adaptation de ce protocole avec un marquage pH3 supplémentaire peut également entraîner une sensibilité plus élevée dans la détection des cellules en phase M.

Outre l’approche EdU/pH3, la méthode fluorescent ubiquitin-based cell cycle indicator (FUCCI) a également été utilisée pour étudier la progression du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères ainsi que dans les tissus de la drosophile24,25. Ce système utilise deux protéines marquées par fluorescence, la géminine et la Cdt1, qui contiennent des motifs pour l’ubiquitination spécifique et la dégradation protéasomique par APC / C et SCFSkp2, respectivement. Comme l’APC/C n’est actif qu’à partir de la fin de la mitose jusqu’à G1 et que le SCFSkp2 est actif dans les phases S et G2, la dégradation spécifique au cycle cellulaire de la géminine et du Cdt1 marqués par fluorescence permet de déterminer la phase24du cycle cellulaire. Une méthode « Fly-FUCCI » légèrement modifiée pour les tissus de la drosophile repose plutôt sur la cycline B et l’E2F1 marquées par fluorescence, qui sont dégradées par APC / C (pendant la mitose) et CRL4Cdt2 (pendant l’apparition de la phase S), respectivement25. Une étude antérieure caractérisant la différenciation prématurée des NB larvaires de drosophiles en réponse à l’aneuploïdie a analysé les défauts du cycle cellulaire par les méthodes Fly-FUCCI et EdU/pH34. L’aneuploïdie induit une différenciation prématurée des NB et, par conséquent, une fraction élevée de NB quitte le cycle cellulaire.

Cela a été reflété avec précision dans les données Fly-FUCCI et EdU/pH34. Les données obtenues à partir de la méthode EdU/pH3 sont donc également comparables à d’autres méthodes de suivi du cycle cellulaire telles que la Fly-FUCCI. Fly-FUCCI est un outil puissant, et tous les stocks de mouches avec des marqueurs fluorescents omniprésents ou des marqueurs fusionnés à des promoteurs spécifiques aux tissus sont disponibles dans les centres de stock. Cependant, l’utilisation de ces constructions pour analyser les défauts du cycle cellulaire chez les mutants nuls ou avec l’élimination du siRNA impliquerait une recombinaison génétique pour créer un stock de mouches qui porte les éléments FUCCI, les pilotes spécifiques aux tissus, une mutation spécifique ou un siRNA d’intérêt. Ce processus retarderait l’expérience réelle de plusieurs semaines, alors que la méthode EdU/pH3 peut facilement être appliquée à des lignées de mouches avec un fond génétique nul. Alternativement, pour les knockdowns de siRNA, un croisement en une étape entre un stock pilote et un stock siRNA peut être utilisé pour l’analyse EdU / pH3.

Un inconvénient de cette approche est le pipeline d’imagerie et d’analyse d’images, qui implique la quantification manuelle d’un grand nombre de cellules à partir de plusieurs échantillons de cerveau. Récemment, une approche de cytométrie en flux a été présentée comme une alternative à haut débit à un test conventionnel basé sur la microscopie pour l’analyse du cycle cellulaire26. L’analyse rapide de milliers de cellules en même temps avec cette approche est avantageuse, et la capacité de détecter plusieurs marqueurs permet la quantification de types de cellules spécifiques. Bien qu’il soit facilement utilisable avec des lignées cellulaires cultivées, ce protocole peut être difficile à appliquer à de grands échantillons de tissus tels que le cerveau larvaire de la drosophile. Cependant, quelques protocoles ont été publiés qui décrivent la dissociation des tissus cérébraux et l’analyse des NB larvaires isolés par cytométrie en flux27,28. D’autres approches innovantes dans ce sens pourraient présenter de nouvelles opportunités pour l’analyse du cycle cellulaire à haut débit dans les tissus de la drosophile.

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Disclosures

Les auteurs ont déclaré qu’il n’existait pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par un financement du Fonds national suisse de la recherche scientifique (subvention de projet 31003A_173188; www.snf.ch) et de l’Université de Berne (www.unibe.ch) à BS. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) Bloomington stock center #15477 P-element insertion in the third exon of Mms19
 +; Mms19::eGFP, Mms19p Generated in house eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118 Bloomington stock center #3605 wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies Dilution
Rat anti-Miranda Abcam Ab197788 1/250
Rabbit anti-pH3 Cell Signaling 9701 1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3 Jackson Immuno 112-165-167 1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 Invitrogen A11077 1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A27034 1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium Polysciences Inc 18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 Thermo Fischer Scientific C10340
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fischer Scientific 21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V Merck 10735078001
Triton X-100 Fischer Scientific 9002-93-1 non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej) https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X) Leica microsystems
PRISM Graph pad software Version 5
Microsoft Excel Microsoft office 2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper

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References

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Biologie numéro 171
Protocole de double marquage 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 pour l’analyse de la progression du cycle cellulaire dans les cellules souches neurales de la <em>drosophile</em>
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Chippalkatti, R., Suter, B. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62642, doi:10.3791/62642 (2021).

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