Summary
A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.
Abstract
A análise de progressão do ciclo in vivo é realizada rotineiramente em estudos sobre genes que regulam mitose e replicação de DNA. 5-Ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) foi utilizado para investigar a progressão replicativa/fase S, enquanto anticorpos contra fosfo-histona H3 foram utilizados para marcar núcleos e células mitóticas. Uma combinação de ambos os rótulos permitiria a classificação das fases G0/G1 (Fase gap), S (replicativa) e M (mitostítico) e serviria como uma ferramenta importante para avaliar os efeitos de knockdowns de genes mitotísticos ou mutantes nulos na progressão do ciclo celular. No entanto, os reagentes usados para marcar células rotuladas pela EdU são incompatíveis com várias etiquetas secundárias de anticorpos fluorescentes. Isso complica a imunostaining, onde anticorpos secundários primários e marcados são usados para marcar células mitóticas pH3 positivas. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo para a rotulagem dupla de EdU e pH3 em células-tronco neurais larval Drosophila, um sistema utilizado extensivamente para estudar fatores mitóticos. Além disso, é fornecido um protocolo para análise de imagem e quantificação para alocar células rotuladas em 3 categorias distintas, G0/G1, S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e M.
Introduction
O ciclo de divisão celular compreende uma fase G1 (primeira fase de lacuna), uma fase replicativa/S, um G2 (segunda fase de lacuna) e uma fase M (mitótica). Passando por essas fases, a célula sofre mudanças drásticas na transcrição celular, tradução e reorganização das máquinas citoesquelletais1,2. Em resposta às sugestões de desenvolvimento e meio ambiente, as células podem deixar temporariamente de dividir e tornar-se quiescentes (G0) ou diferenciar e parar permanentemente de dividir3. Outros cenários, como danos ao DNA, podem causar diferenciação prematura ou apoptose3,4. A resposta a tais pistas é mediada por pontos de verificação de ciclo celular, que atuam como um sistema de vigilância para garantir a integridade dos processos celulares essenciais antes que a célula se comprometa com a próxima fase do ciclo de divisão5. Portanto, estudos sobre genes que regulam a replicação do DNA, pontos de verificação e máquinas mitóticas precisam analisar possíveis defeitos de progressão do ciclo celular que podem ocorrer em células mutantes ou no knockdown do siRNA desses genes. Além disso, tais análises podem ser empregadas para testar a saúde geral das células, bem como as respostas celulares ao tratamento medicamentoso.
5-bromo-2'-desoxyuridina (BrdU) é um analógico de timmidina que é incorporado ao DNA durante a replicação6. Este método foi utilizado extensivamente para identificar células em fase S. No entanto, as células são então submetidas a procedimentos severos de desnaturação de DNA para permitir a detecção de BrdU através do uso de anticorpos anti-BrdU6. Este tratamento severo pode danificar epítopos celulares e evitar uma caracterização adicional da amostra através da imunostainagem. A incorporação da EdU e a posterior detecção por uma "reação de clique" catalisada por cobre com corantes de azide pequenos, permeáveis e fluorescentes elimina a necessidade de procedimentos de desnaturação severos7. Esse método, portanto, emergiu como uma alternativa mais prática à incorporação da BrdU.
Além disso, o pH3 tem sido descrito como um marcador confiável para células de fase mitótica/M8. Histone H3 é uma proteína histona de núcleo associada ao DNA que se torna fosfoilada em torno da fase G2 tardia até a fase M inicial e é desfosforilada no final da anáfase8. Vários anticorpos comerciais podem ser usados para detectar pH3 usando protocolos padrão de imunossuagem. A coloração dupla de EdU e pH3 permitiria, portanto, a detecção de células em fase S, bem como em fase M. Além disso, as células do G1 e início da fase G2 não manchariam positivamente nenhum dos marcadores.
As células-tronco neurais drosophila ou neuroblastos (NBs) oferecem um modelo de células-tronco bem caracterizados onde as células se dividem assimetricamente para produzir um NB auto-renovador idêntico e uma célula-mãe de gânglio (GMC), que é fadada à diferenciação9. Além disso, várias ferramentas genéticas e anticorpos específicos do RN tornam este sistema adequado para manipulação genética e imagens de células vivas. Consequentemente, vários estudos utilizaram NBs para estudar genes que regulam divisões assimétricas e determinação do destino celular9. Populações distintas de NBs existem no cérebro central (CB) e no lobo óptico (OL) do cérebro larval9; Foram utilizados NBs cb para o presente estudo. Estas terceiras NBs cb larval instar são células grandes que também são adequadas para estudar fatores que regulam a montagem de fuso mitótico. Um protocolo para analisar defeitos de progressão do ciclo celular seria uma ferramenta vital em tais estudos.
Protocolos publicados anteriormente empregavam kits comerciais, como o Kit de Proliferação celular Click-iT EdU Alexa Fluor, que fornecem vários componentes de reação e corantes de azida marcados com uma variedade de corantes Alexa Fluor para incorporação e detecçãoedu 10. No entanto, os reagentes fornecidos com tais kits não são compatíveis com algumas etiquetas fluorescentes frequentemente usadas com anticorpos secundários. Este kit de detecção de células EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit fornecido com corante de azide alexa fluor 647) foi testado em Drosophila terceiro NBs larval instar, e co-coloração foi tentado com anticorpos contra pH3 e Miranda, um marcador para NBs. Além disso, foram utilizados anticorpos secundários alexa Fluor 568 ou Cy3 para detecção da rotulagem de Miranda na membrana plasmática de NBs11. No entanto, a intensidade esperada do sinal e o padrão de coloração (resultados inéditos) não foram observados com esses anticorpos secundários quando a imunossagem foi realizada após a detecção da EdU.
Para a incorporação da EdU, o protocolo descrito por Daul e colegas exigia alimentação das larvas com meio Kankel-Branco misturado com EdU e azul bromofenol (BPB)10. As larvas se alimentavam do alimento EdU e bpb-spiked, que podiam ser vistos por sua cor azul após a ingestão no intestino larval. Embora este método tenha sido utilizado para a incorporação da EdU em Mms19 loss-of-function(Mms19P) terceira larva instar, as larvas Mms19P aparentemente não se alimentaram, pois quase nenhuma cor azul foi detectada no intestino larval (resultados inéditos). As larvas mms19P mostram drásticas deformidades de desenvolvimento e eventualmente prendem na terceira fase instar. Isso pode de alguma forma afetar o comportamento alimentar da terceira larva instar e tornar o protocolo de alimentação da EdU inadequado para esses casos.
Após estudar a literatura disponível e trabalhar extensivamente na padronização de etapas essenciais, foi proposta uma abordagem alternativa para a rotulagem dupla EdU/pH3 em NBs Drosophila, o que não requer alimentação de EdU para larvas. Um estudo anterior utilizou coloração dupla de EdU/pH3 para analisar o ciclo celular em NBs, mas não apresentou um protocolo detalhado4. Isso representa um obstáculo desnecessário para os laboratórios que tentam implementar esse método. Além disso, avaliar a compatibilidade de vários reagentes com o kit EdU e realizar uma maior otimização pode ser um processo demorado. Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo que abrange a incorporação da EdU em cérebros larvais dissecados e imunostaining com anticorpos anti-pH3, seguido de microscopia confocal e análise de imagem para alocar NBs para quatro categorias distintas: fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e fase M. As etapas que precisam de otimização são delineadas e dicas fornecidas para análise de imagens de grandes conjuntos de dados. Além disso, a leitura de EdU/pH3 em NBs do tipo selvagem é analisada e comparada com os NBs Mms19P, que foram recentemente relatados para mostrar um atraso no ciclocelular 11.
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Protocol
1. Preparação de reagentes e estoques para ensaio click-it EdU
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1 para obter detalhes sobre o kit e os reagentes fornecidos com o kit.
- Leve os frascos à temperatura ambiente antes de preparar as soluções.
- Prepare a solução de estoque EdU de 10 mM (componente A) adicionando 2 mL de dimetilsulfoxida (DMSO, componente C). Misture bem e armazene a -20 °C.
- Prepare uma solução de trabalho do Alexa Fluor 647-azide (componente B) adicionando 70μL de DMSO (componente C). Misture bem e armazene a -20 °C.
- Prepare uma solução 1x de click-iT EdU tampão de reação (componente D) misturando 4 mL desta solução com 36 mL de água desionizada. Armazene a solução restante a 2-6 °C.
- Faça um estoque de 10x (200 mg/mL) do aditivo tampão Click-iT EdU (componente F) adicionando 2 mL de água desionizada. Misture bem e armazene a -20 °C.
- Armazene Hoechst 33342 (componente G) a 2-6 °C. Armar DMSO (componente C) em um desiccador a -20 °C.
NOTA: As luvas devem ser usadas para lidar com DMSO e Hoechst.
2. Dissecção de terceiro cérebro larval instar e incorporação da EdU
NOTA: O protocolo para dissecções cerebrais foi descrito anteriormente12. Antes de iniciar as dissecções, certifique-se de que quantidades suficientes das soluções EdU e PFA sejam preparadas e descongeladas conforme descrito em 2.6 e 3.1.
- Prepare 10x Soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) adicionando 25,6 g Na2HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl, e 2 g KH2PO4 a 1 L de água desionizada. Ajuste o pH para 7,4 e, posteriormente, prepare uma solução 1x em água desionizada.
- Adicione o meio de dissecção de Schneiders (SM) a duas depressões consecutivas de uma placa de vidro (3 ou 9) de depressão. Adicione 1x PBS à próxima depressão consecutiva.
- Usando um par de fórceps, escolha a terceira larva instar errante e coloque em um tecido molhado com PBS para limpar o resíduo de alimentos de mosca. Coloque a larva na depressão com PBS e, em seguida, na depressão consecutiva com SM.
- Usando um par de fórceps finos, remova 3/4do corpo inferior da larva.
- Pegue delicadamente os ganchos da boca larval com um par de fórceps, e segure a cutícula na outra extremidade com o outro par de fórceps.
- Gire a cabeça larval do avesso empurrando para dentro os ganchos da boca e, simultaneamente, descascando o tecido na outra extremidade.
- Observe o cérebro larval com discos imagináveis ligados. Remova outros tecidos ligados ao cérebro, e transfira o cérebro para a próxima depressão consecutiva com SM.
- Descongele a solução de ações 10 mM EdU. Prepare uma solução de 100 μM diluindo este estoque de 10 mM em SM.
- Adicione 100 μL desta solução EdU+SM de 100 μM em outra depressão na placa Pyrex. Incubar ~5-10 cérebros dissecados em 100 μL de 100 μM EdU+SM solução para 2 h a 25 °C.
NOTA: Como os NBs se dividem uma vez em ~2 h, este protocolo visa analisar um ciclo de células completa. Só use cérebros intactos para mais passos. Descarte cérebros danificados durante a dissecção.
3. Fixação e imunosstação
- Prepare 4% de solução paraformaldeída (PFA) em um capô de fumaça.
- Adicione 4 g de pó de paraformaldeído a 80 mL de 1x PBS em um béquer colocado em um agitador magnético e aqueça a 60 °C. Para dissolver o PFA, adicione algumas gotas de 1 N NaOH. Verifique o pH e ajuste para 7.0 com algumas gotas de 1 M HCl, se necessário.
- Ajuste o volume para 100 mL com 1x PBS. Aliquot a solução PFA e armazene a 2-6 °C por até 1 mês. Adicione 0,3% de detergente não iônico (ver a Tabela de Materiais) à solução PFA para fixação eficiente de tecidos grandes, como o cérebro larval.
- Após a incorporação da EdU, transfira os cérebros para tubos de microcentrífugo de 0,6 mL contendo 4% de PFA. Incubar à temperatura ambiente em um nutador por 15 minutos. Toque o tubo no banco do laboratório para que os cérebros se acalmem na parte inferior do tubo.
- Retire o PFA e lave 3 vezes com PBS + 0,3% detergente não iônico (PBST) à temperatura ambiente. Certifique-se de que cada lavagem dure pelo menos 10 minutos em um nutador. Após a última lavagem, remova o PBST, adicione a solução de bloqueio (PBST + 5% de albumina de soro bovino) e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Anticorpo anti-Miranda diluído (1:250) e anticorpo anti pH3 (1:200) em PBST (ambos anticorpos no mesmo tubo). Remova o buffer de bloqueio e adicione a solução de anticorpos primários. Incubar durante a noite a 2-6 °C em um nutador.
NOTA: Miranda é uma proteína de membrana presente em CB NBs. Serve para identificar essas grandes células redondas na região13do CB . - Remova a solução de anticorpos primários e lave 3 vezes com PBST. Certifique-se de que cada lavagem dure por 10 minutos em um nutador à temperatura ambiente.
- Prepare a solução de anticorpos secundários adicionando 1:500 Alexa Fluor 488 diluída anti-Rabbit e Alexa Fluor 568 anti-Rat no PBST. Remova o PBST e adicione a solução de anticorpos secundários aos cérebros dissecados. Incubar durante a noite a 2-6 °C no escuro, em um nutador, e lavar 3 vezes com PBST (passo 3.5).
4. Detecção de EdU, coloração de DNA e montagem
- Para preparar o coquetel de detecção da EdU, misture os componentes (ver Tabela 2) em um tubo de 1,5 mL.
- Após a última lavagem (etapa 3.6), remova o PBST e adicione o coquetel de detecção da EdU aos cérebros dissecados. Incubar à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos em um nutador. Lave 2 vezes com PBST por 10 min cada, no escuro.
- Para coloração de DNA, diluir hoechst 33342 (componente G) 1:2.000 em PBST para preparar uma solução de 5 μg/mL.
- Remova o PBST após a segunda lavagem (etapa 4.2) e adicione 500 μL de solução hoechst de 5 μg/mL aos cérebros dissecados. Incubar no escuro por 10 minutos. Remova Hoechst e lave uma vez com PBST por 10 minutos.
- Bata o tubo no banco do laboratório, e deixe os cérebros se acalmarem. Remova o PBST do tubo, mas deixe para trás apenas 50-100 μL.
- Corte a ponta de uma micropipette de 200 μL e transfira cuidadosamente os cérebros para um escorregador de vidro limpo. Remova o excesso de PBST do slide por manchas com tiras de papel do filtro. Cuidado para não deixar o papel do filtro tocar no cérebro.
- Coloque uma gota de temperatura-de-água solúvel, não fluorescing meio de montagem no cérebro, e oriente os cérebros de tal forma que o fio nervoso ventral enfrenta o slide, e os lóbulos voltados para cima. Organize o cérebro em um único arquivo para que seja mais fácil imaginar o cérebro em série.
- Coloque suavemente uma mancha em cima do cérebro. Coloque o slide em 2-6 °C durante a noite.
NOTA: O meio de montagem endurece no armazenamento durante a noite para que não haja necessidade de selar a mancha com esmalte.
5. Imagem
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o microscópio de varredura a laser e o objetivo de imersão em óleo utilizado neste protocolo.
- A partir do software de Aquisição, selecione o objetivo de 63x.
- Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa logo acima do cérebro montado para facilitar a localização do tecido através da ocular.
- Usando o canal DAPI/Hoechst 33342, encontre o cérebro através da ocular e, em seguida, mude para o modo de aquisição no software.
- Configure 4 canais para imagem Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) e Alexa Fluor 647 (EdU). Use a ferramenta assistente de corante, que configura automaticamente os lasers de excitação e filtros de emissão para os corantes selecionados.
- Defina o campo de visão de tal forma que engloba todo o lobo cerebral. Imagem de todo o volume do lobo cerebral adquirindo z-stacks espaçadas a 0,8 μm de distância. Armazene todas as imagens de uma sessão de imagem em um formato de biblioteca *.lif.
6. Análise de imagem
NOTA: As etapas a seguir descrevem a análise das imagens adquiridas e como classificar as células na fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e fase M usando o software ImageJ.
- Baixe Fiji (Fiji is ImageJ) a partir da seguinte URL: https://fiji.sc/. Abra Fiji, depois arraste e solte os arquivos .lif em Fiji.
NOTA: Fiji é uma versão do ImageJ que vem pré-instalada com vários plugins14. A transferência de arquivos .lif para Fiji abrirá o plugin Bio-formats, que é necessário para processar os arquivos .lif. O plugin de bioformitos também é necessário para abrir arquivos de imagem gerados a partir de algumas outras marcas de microscópio, por exemplo, arquivos nd2 gerados a partir de um microscópio Nikon. Este plugin vem pré-instalado com Fiji. - Selecione o navegador Data na guia de visualização de pilhas e use pilha virtual na guia gerenciamento de memória no plugin de formatos biológicos.
NOTA: Os arquivos lif com pilhas z de 8-10 cérebros são muitas vezes 300-400 megabytes de tamanho. Em computadores com memória RAM baixa, abrir alguns desses arquivos pode esgotar rapidamente a MEMÓRIA RAM disponível no ImageJ e impedir qualquer processamento adicional de imagem. A pilha virtual é 'somente leitura', não precisa de RAM alta para processamento e é uma opção ideal para carregar grandes conjuntos de dados em Fiji. - Observe a imagem multicanal exibida no ImageJ. Altere a cor dos canais da barra de menu usando a ferramenta de | de cores da Imagem |. Observe os NBs rotulados por Miranda como grandes células redondas na região do CB.
- Desenhe uma região de interesse (ROI) usando a ferramenta elipse sobre cada NB para evitar contar o NB duas vezes.
- Na barra de menu ImageJ,selecione analisar | ferramentas | Gerente de ROI. Marque todos os NBs na seção Z atual e pressione t após a marcação de cada célula.
- Uma vez que todos os NBs na seção z atual estejam marcados, mude os canais para pH3 e EdU, e conte manualmente o número de NBs EdU positivos, NBs pH3 positivos, NBs manchando positivamente tanto para EdU quanto pH3, e NBs não manchando para ambos os marcadores.
- Pesquise por NBs em seções z subsequentes, exclua ROIs antigos e adicione novos ROIs para contar NBs em pilhas diferentes.
- Prepare uma planilha com as seguintes colunas: 1. EdU-pH3-: esta seção representa as células dupla-negativas que estão na fase G0/G1 do ciclo celular; 2. EdU+: as células desta categoria incorporaram a EdU e estão passando por replicação de DNA (fase S); 3. EdU+ pH3+: essas células duplas positivas completaram a fase S e progrediram para a fase G2 ou M; 4. pH3+: estes NBs estão passando por mitose.
- Calcular percentuais de NBs presentes em todas as 4 categorias acima para cada lobo. Prepare um gráfico de barras usando o software de planilha mostrando os dados agrupados para percentuais de NBs em cada categoria.
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Representative Results
O terceiro cérebro larval de Drosophila bi-lobed tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar processos celulares e de desenvolvimento fundamentais9. O foco do presente estudo foi apresentar um protocolo para análise da progressão do ciclo celular em NBs EdU e pH3 da região do CB (Figura 1). Os NBs CB são subdivididos em tipo I e tipo II, e exibem o padrão característico de divisão assimétrica9. Cada divisão tipo I NB gera um NB, capaz de auto-renovação, e outro GMC que está fadado à diferenciação9. Em contraste, os NBs do tipo II geram células progenitoras neurais imaturas (INPs) que se auto-renovam e geram 2 GMCs9. Embora exista uma população distinta de NB na região de OL, este estudo se concentrou nos CB NBs, que são grandes e facilmente identificáveis com marcadores específicos do RN.
Para este estudo, Miranda foi utilizada para identificar e analisar CB NBs (Figura 2). Embora Miranda também manche outras populações de células na OL, os CB NBs podem ser identificados com Miranda devido ao seu grande tamanho e localização do CB13. Outros marcadores mais específicos também podem ser usados para rotular NBs CB, como Deadpan, que é um fator de transcrição que regula a auto-renovação do NB. No entanto, como tanto o pH3 quanto o EdU marcam a cromatina, o marcador de membrana Miranda foi usado para facilitar a visualização e análise de NBs marcados com pH3 e EdU. A incorporação da EdU, a detecção subsequente e a caracterização adicional por imunostaining e análise de imagem é um procedimento complexo. É importante padronizar cada passo para determinar as condições ideais de coloração e imagem. Embora alguns relatórios publicados apresentem estratégias de rotulagem edu/pH3, esses relatórios não elaboram etapas de otimização e análise de imagem. O fluxo de trabalho descrito na Figura 1 resume os passos da incorporação da EdU até a análise da imagem.
Recentemente caracterizamos o gene Mms19, que é exigido pelos NBs para progressão mitótica normal11. Através de análises de imagens de células vivas, os NBs sem Mms19 funcionais foram mostrados para levar o dobro do tempo que os NBs do tipo selvagem para terminar a mitose. Isso foi claramente refletido na análise EdU/pH3 em que uma proporção significativamente maior de NBs Mms19P foi encontrada na fase M em comparação com NBs do tipo selvagem ( Figura3A). Expressão da proteína de fusão Mms19::eGFP no fundo Mms19P foi mostrada para resgatar defeitos fenotípicos11,15. Isso se correlaciona bem com os resultados da análise de progressão do ciclo celular em que a proporção de células em fase M foi resgatada para níveis de tipo selvagem sobre a expressão Mms19::eGFP no fundo Mms19P (Figura 3A, B).
Figura 1: Um fluxo de trabalho simplificado para EdU/pH3 dupla rotulagem. O terceiro cérebro larval instar foi dissecado e incubado com 100 μM EdU por 2 h. Posteriormente, o tecido cerebral foi fixado com PFA e imunossuado com anticorpos contra Miranda e pH3. Imagens dos cérebros manchados foram obtidas em um microscópio confocal e processadas com ImageJ/Fiji para alocar células para diferentes fases do ciclo celular. Abreviaturas: EdU = com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina; pH3 = fosfo-histona H3; PFA = paraformaldeído; SM = Meio de dissecção de Schneiders; PBS = soro fisiológico tamponado por fosfato; PBST = PBS + 0,3% detergente não iônico; BSA = albumina de soro bovino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alocação de Células ao G1/G0; S; Fases S>G2/M e M. As células avançam através das fases G1, S, G2 e M para completar um ciclo celular completo. Os NBs CB de terceiros cérebros larvais errantes foram marcados com Miranda (vermelho), EdU (cinza), pH3 (verde) e DNA foi rotulado com Hoechst 33342 (azul). NBs rotulados foram analisados no ImageJ e alocados em 4 fases distintas com base em se eles mancharam positivamente para (A) nem EdU nem pH3 (G1/G0), (B) apenas EdU (fase S), (C) tanto EdU quanto pH3 (S>G2/M), e(D) apenas pH3 (fase M). Exemplos de NBs individuais apenas de cérebros selvagens são mostrados aqui. Barras de escala = 5 μm. Abreviaturas: CB = cérebro central; NBs = neuroblastos; EdU = com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina; pH3 = fosfo-histona H3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito de Mms19P na distribuição da fase do ciclo da célula NB. (A) Após a análise de NBs do tipo selvagem (w;+;+) , foram encontrados ~25% de NBs em fase M. Em Mms19P NBs, no entanto, essa proporção aumentou para quase 40%. Mms19::eGFP expressão no fundo Mms19P é conhecido por resgatar fenótipos Mms19P, e a proporção de NBs de fase M neste fundo foi comparável ao tipo selvagem. (B) Os percentuais de NBs em 4 categorias diferentes correspondentes às fases de ciclo celular G1/G0, S, S>G2/M e M foram comparados entre os tipos selvagens; Mms19P, e Mms19::eGFP, Genótipos Mms19P. A proporção de fase M e faseS G1/G0 difere consideravelmente em NBs Mms19P quando comparados aos NBs do tipo selvagem. Em contraste, a distribuição do ciclo celular de NBs em Mms19::eGFP, cérebros Mms19P são comparáveis ao encontrado no tipo selvagem. A significância estatística foi calculada utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis e várias colunas comparadas com o pós-teste de Dunn; (P<0.001). Este número foi modificado a partir de 11. Abreviaturas: NBs = neuroblastos; eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Quantidade/volume |
| EdU (componente A) | 5 mgs |
| Alexa Fluor 647 – azide (componente B) | 1 frasco |
| Dimetilsulfoxida (DMSO, componente C) | 4 mL |
| Click-iT EdU reaction buffer (componente D) | 4 mL (solução 10x) |
| Sulfato de cobre (CuSO4, componente E) | 100 mM; 1 frasco |
| Click-iT EdU aditivo tampão (componente F) | 400 mgs |
| Hoechst 33342 (componente G) | 10 mg/mL na água, 35 μL |
Tabela 1: Componentes do kit EdU. Componentes fornecidos com o Kit de Proliferação celular Click-iT EdU Alexa Fluor e as respectivas quantidades/volumes. Abreviação: EdU = com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina.
| Componentes de reação | Volume (mL) |
| 1x Tampão de reação Click-iT (preparado na etapa 1.4) | 430 |
| CuSO4 (componente E) | 20 |
| Alexa Fluor 647 – azida (componente B, preparado na etapa 1.3) | 1.2 |
| Aditivo do buffer de reação (componente F, preparado na etapa 1.5) | 50 |
| Volume total | ~500 |
Tabela 2: Preparação do coquetel de detecção da EdU. O coquetel de detecção da EdU foi preparado misturando os volumes indicados dos componentes do kit (preparados na seção 2). Abreviação: EdU = com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina.
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Discussion
A incorporação da EdU e sua reação subsequente de "clique" com azida permeável celular apresenta vantagens práticas desta técnica sobre o método BrdU utilizado anteriormente7. No entanto, essa reação é catalisada por íons Cu(I), e vários corantes podem ser instáveis na presença deste catalisador de cobre, como é claramente aconselhado pelo fabricante do kit Click-it EdU. Quando os experimentos de imunosstaining foram realizados após a execução da etapa de detecção da EdU, a intensidade esperada do sinal não foi observada com os corantes do canal vermelho, Alexa Fluor 568 e Cy3. No entanto, o protocolo funcionou quando as reações imunossusantes foram concluídas antes da etapa de detecção da EdU. Com este protocolo, quatro canais foram utilizados para visualizar Hoechst, pH3, Miranda e EdU.
Outro passo otimizado neste protocolo foi a absorção de EdU por cérebros dissecados em vez de alimentar alimentos de mosca com picos de EdU para larvas. Como o ciclo completo de células Drosophila NB dura aproximadamente 2-2,5 h16, a absorção de EdU por cérebros por 2,5 h como neste protocolo, permite o rastreamento de um ciclo celular completo de NBs. Células que não mancham positivamente para EdU ou pH3 são células de repouso. No caso de uma terceira larva instar em que os NBs estão se dividindo ativamente, essas células de repouso provavelmente estariam na fase G1 do ciclo celular. No entanto, desde o final do embrião até os estágios instar iniciais, os NBs temporariamente tornam-se quiescentes17. Nestes estágios iniciais de desenvolvimento, a coloração dupla-negativa provavelmente representaria uma fase G0/quiescente.
Os NBs submetidos à replicação de DNA devem manchar positivamente para a EdU, enquanto as células que progrediram da fase S (incorporação da EdU) para a fase G2 ou M tardia devem manchar positivamente tanto para EdU quanto para pH3. No entanto, a caracterização da fase G2 seria difícil com este protocolo, já que as primeiras células G2 não mancham positivamente para EdU ou pH3. No entanto, as células que incorporaram a EdU e progrediram para o G2 inicial também manchariam positivamente para a EdU e poderiam complicar a análise da fase G2. Várias drogas que inibem a replicação do DNA causam a prisão do ciclo celular na fase S18,19,20. Este protocolo poderia ser uma ferramenta conveniente para analisar e identificar o efeito de tais tratamentos medicamentosos, como células bloqueadas em fase S não progrediriam para a fase M e a fração de EdU, células pH3 duplamente positivas seriam diminuídas ou mesmo ausentes neste caso.
Em um estudo publicado recentemente, avaliamos o efeito do gene Mms19 na progressão mitótica em NBs11. Através de imagens de células vivas, demonstramos um atraso dramático de Mms19P NBs na progressão da fase M. Enquanto os NBs do tipo selvagem completam a fase M em ~10 min, os NBs Mms19P levaram cerca de duas vezes mais tempo para terminar a fase M11. Assim, este protocolo de rotulagem dupla EdU/pH3 também refletiu um atraso mitótico, pois observamos quase 1,5x como muitos NBs manchando positivamente para pH3 em cérebros Mms19P em comparação com cérebros do tipo selvagem. Os dados deste protocolo EdU são, portanto, comparáveis com os resultados diretos de imagens de células vivas. Como tais abordagens diretas, células vivas são demoradas e precisam de otimização extensiva, este protocolo poderia ser utilizado para realizar uma rápida triagem inicial de tais mutantes do ciclo celular para entender defeitos em estágios específicos. Uma vez identificada uma fase de interesse, isso pode ser seguido por ensaios de visualização celular direta.
A duração das fases do ciclo celular pode variar consideravelmente entre diferentes tipos de células e estágios de desenvolvimento. Por exemplo, no desenvolvimento de embriões de Drosophila, a queda da regulação das quinases mitóticas resulta em uma duração prolongada da fase S, enquanto em células fadadas à diferenciação, como progenitores neurais cerebraisde Furão (Mustela putorius furo),a duração da fase S é marcadamente curta21,22. Assim, o tempo de rotulagem do pulso edu deve ser otimizado dependendo do comprimento das fases S e G no tipo celular dado. A duração do pulso EdU também dependeria dos objetivos experimentais, por exemplo, um pulso curto é suficiente para medir a fração de células atualmente na fase S, enquanto um pulso mais longo permite a análise da progressão das células através da fase S.
A otimização extensiva do pulso EdU também pode permitir a estimativa da fase S, como foi elegantemente demonstrado por Pereira e colegas23. Esses pesquisadores demonstraram um novo método baseado em citometria de fluxo no qual as células HCT116 foram rotuladas com EdU por períodos de tempo incremental. Os autores demonstraram que a intensidade fluorescente máxima da EdU é obtida quando o tempo de pulsação corresponde ao comprimento da fase S23. Além disso, a análise da progressão temporal das células rotuladas pela EdU também possibilitou a quantificação das fases G1 e G2/M. Embora o protocolo atual para rotulagem dupla EdU/pH3 permita a análise de defeitos de fase S e M, não é possível medir a duração precisa das fases com este protocolo. O protocolo descrito por Pereira e colegas poderia ser uma alternativa adequada para ensaios que requerem a determinação dos comprimentos da fase do ciclo celular. Adaptar este protocolo com uma rotulagem pH3 adicional também pode resultar em maior sensibilidade na detecção de células de fase M.
Além da abordagem EdU/pH3, o método fluorescent ubiquitin-based cell cycle indicator (FUCCI) também foi utilizado para estudar a progressão do ciclo celular em células mamíferas, bem como nos tecidos Drosophila24,25. Este sistema utiliza duas proteínas fluorescentes marcadas, geminin e Cdt1, que contêm motivos para ubiquitina específica e degradação proteassômica por APC/C e SCFSkp2,respectivamente. Como o APC/C só está ativo a partir do final da mitose através do G1 e o SCFSkp2 está ativo nas fases S e G2, a degradação específica do estágio de ciclo celular de geminin fluorescente e O CDT1 permite a determinação da fase24do ciclo celular . Um método levemente modificado 'Fly-FUCCI' para tecidos Drosophila baseia-se, em vez disso, em Cyclin B e E2F1, que são degradados por APC/C (durante a mitose) e CRL4Cdt2 (durante o início da fase S),respectivamente 25. Um estudo anterior caracterizando a diferenciação prematura dos NBs larval Drosophila em resposta à aneuploidia analisou defeitos do ciclo celular pelos métodos Fly-FUCCI e EdU/pH34. A aneuploidia induz a diferenciação prematura dos NBs e, portanto, uma alta fração de NBs sai do ciclo celular.
Isso foi refletido com precisão nos dados Fly-FUCCI e EdU/pH34. Os dados obtidos a partir do método EdU/pH3 são, portanto, também comparáveis com outros métodos de rastreamento de ciclo celular, como o Fly-FUCCI. Fly-FUCCI é uma ferramenta poderosa, e todos os estoques de moscas com marcadores fluorescentes ou marcadores fluorescentes onipresentemente impulsionados fundidos a promotores específicos de tecidos estão disponíveis em centros de estoque. No entanto, o uso desses construtos para analisar defeitos do ciclo celular em mutantes nulos ou com o knockdown do siRNA envolveria recombinação genética para criar um estoque de moscas que carrega os elementos FUCCI, drivers específicos do tecido, uma mutação específica ou um siRNA de interesse. Esse processo atrasaria o experimento real por várias semanas, enquanto o método EdU/pH3 pode ser facilmente aplicado a linhas de mosca com um fundo genético nulo. Alternativamente, para knockdowns de siRNA, um cruzamento de um passo entre um estoque de driver e um estoque de siRNA pode ser utilizado para análise edu/pH3.
Uma desvantagem dessa abordagem é o pipeline de análise de imagens e imagens, que envolve quantificação manual de um grande número de células de várias amostras cerebrais. Recentemente, uma abordagem de citometria de fluxo tem sido apresentada como uma alternativa de alto rendimento a um ensaio convencional baseado em microscopia para análise de ciclocelular 26. A análise rápida de milhares de células ao mesmo tempo com essa abordagem é vantajosa, e a capacidade de detectar múltiplos marcadores permite a quantificação de tipos de células específicas. Embora facilmente utilizável com linhas de células cultivadas, este protocolo pode ser difícil de aplicar a grandes amostras de tecido, como o cérebro larval Drosophila. No entanto, foram publicados alguns protocolos que descrevem a dissociação do tecido cerebral e a análise de NBs larval isolados por citometria de fluxo27,28. Outras abordagens inovadoras nesse sentido podem apresentar novas oportunidades para análise de ciclo celular de alto rendimento em tecidos Drosophila.
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Disclosures
Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por financiamento da Fundação Nacional de Ciência suíça (concessão de projetos 31003A_173188; www.snf.ch) e da Universidade de Berna (www.unibe.ch) para a BS. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
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