Summary
Cellecyklusanalyse med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) og fosfo-histone H3 (pH3) mærkning er en flertrinsprocedure, der kan kræve omfattende optimering. Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der beskriver alle trin for denne procedure, herunder billedanalyse og kvantificering for at skelne celler i forskellige cellecyklusfaser.
Abstract
In vivo cellecyklus progression analyse udføres rutinemæssigt i undersøgelser af gener, der regulerer mitose og DNA-replikation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) er blevet brugt til at undersøge replikativ/S-fase progression, mens antistoffer mod fosfo-histone H3 er blevet brugt til at markere mitotiske kerner og celler. En kombination af begge etiketter vil gøre det muligt at klassificere G0/G1 (Gap fase), S (replikativ), og M (mitotisk) faser og tjene som et vigtigt redskab til at vurdere virkningerne af mitotiske gen knockdowns eller null mutanter på celle cyklus progression. De reagenser, der anvendes til at mærke EDU-mærkede celler, er imidlertid uforenelige med flere sekundære antistof-fluorescerende tags. Dette komplicerer immunstaining, hvor primære og mærkede sekundære antistoffer bruges til at markere pH3-positive mitotiske celler. Dette papir beskriver en trin-for-trin protokol for dual-mærkning af EdU og pH3 i Drosophila larval neurale stamceller, et system, der anvendes i vid udstrækning til at studere mitotiske faktorer. Derudover er der fastsat en protokol til billedanalyse og kvantificering for at allokere mærkede celler i 3 forskellige kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progression fra S til G2/M) og M-faser.
Introduction
Celledelingscyklussen omfatter en G1-fase (første hulfase), en replikativ/S-fase, en G2 (anden hulfase) og en M-fase (mitotisk) fase. Passerer gennem disse faser, cellen gennemgår dramatiske ændringer i cellulære transskription, oversættelse, og re-organisation af cytoskeletal maskiner1,2. Som reaktion på udviklings- og miljømæssige signaler kan cellerne midlertidigt ophøre med at opdele og blive hvilende (G0) eller differentiere og permanent ophøre med at opdele3. Andre scenarier, såsom DNA-skader, kan forårsage for tidlig differentiering eller apoptose3,4. Reaktion på sådanne signaler medieres af cellecykluskontrolpunkter, der fungerer som et overvågningssystem for at sikre integriteten af vigtige cellulære processer, før cellen forpligter sig til næste fase afdivisionscyklussen 5. Derfor, undersøgelser af gener, der regulerer DNA-replikation, checkpoints, og mitotiske maskiner nødt til at analysere mulige celle cyklus progression defekter, der kan forekomme i mutantceller eller på siRNA knockdown af disse gener. Derudover kan sådanne analyser anvendes til at teste den samlede celle sundhed samt cellulære reaktioner på narkotikabehandling.
5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) er en thymidin analog, der er indarbejdet i DNA under replikation6. Denne metode blev brugt i vid udstrækning til at identificere celler i S-fase. Cellerne udsættes dog derefter for barske DNA-denatureringsprocedurer for at muliggøre påvisning af BrdU ved hjælp af anti-BrdU antistoffer6. Denne barske behandling kan beskadige cellulære epitoper og forhindre yderligere karakterisering af prøven gennem immunstaining. EdU inkorporering og efterfølgende påvisning af en kobber-katalyseret, 'klikreaktion' med små, celle-gennemtrængelige, fluorescerende mærkede azid farvestoffer eliminerer behovet for barske denaturering procedurer7. Denne metode viste sig derfor at være et mere praktisk alternativ til BrdU-inkorporering.
Endvidere er pH3 blevet beskrevet som en pålidelig markør for mitotiske/M faseceller8. Histone H3 er en DNA-associeret kerne histone protein, der bliver fosforyleret i omkring den sene G2 fase til begyndelsen af M fase og er af-fosforyleret mod slutningen af anaphase8. Flere kommercielle antistoffer kan bruges til at opdage pH3 ved hjælp af standard immunstaining protokoller. Dobbeltfarvning af EdU og pH3 vil derfor gøre det muligt at detektere celler i S-fase såvel som M-fase. Derudover ville celler i G1 og begyndelsen af G2 fase ikke plette positivt for nogen af markører.
Drosophila neurale stamceller eller neuroblaster (NBs) tilbyder en velkarakteriseret stamcellemodel, hvori celler deler asymmetrisk for at producere en identisk selvfornyende NB og en ganglion modercelle (GMC), som er skæbnebestemt til differentiering9. Derudover, flere genetiske værktøjer og NB-specifikke antistoffer gør dette system egnet til genetisk manipulation og levende celle billeddannelse. Derfor har flere undersøgelser brugt NBs til at studere gener, der regulerer asymmetriske divisioner og celle skæbne bestemmelse9. Der findes forskellige populationer af NBs i den centrale hjerne (CB) og den optiske lap (OL) i larvehjernen9; CB NBs blev anvendt til den aktuelle undersøgelse. Disse tredje instar larval CB NBs er store celler, der også er egnede til at studere faktorer, der regulerer mitotisk spindel samling. En protokol til at analysere cellecyklus progression defekter ville være et vigtigt redskab i sådanne undersøgelser.
Protokoller offentliggjort tidligere ansat kommercielle kits, såsom Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som giver flere reaktion komponenter og jad farvestoffer mærket med en række Alexa Fluor farvestoffer til EDU inkorporering og detektion10. De reagenser, der leveres med sådanne kits, er dog ikke kompatible med nogle fluorescerende tags, der ofte bruges med sekundære antistoffer. Denne EdU detektion kit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit leveres med Alexa Fluor 647-konjugeret azide farvestof) blev testet i Drosophila tredje instar larval NBs, og co-farvning blev forsøgt med antistoffer mod pH3 og Miranda, en markør for NBs. Yderligere, Alexa Fluor 568- eller Cy3-tagged sekundære antistoffer blev brugt til påvisning af Miranda mærkning på plasmamembranen af NBs11. Den forventede signalintensitet og farvningsmønster (ikke-offentliggjorte resultater) blev imidlertid ikke observeret med disse sekundære antistoffer, når immunstaining blev udført efter EdU-påvisning.
For EdU inkorporering krævede protokollen beskrevet af Daul og kolleger fodring af larverne med Kankel-White medium blandet med EdU og bromophenolblå (BPB)10. Larverne fodret på EdU og BPB-spiked mad, som kunne ses af sin blå farve ved indtagelse i larve tarm. Selv om denne metode blev brugt til EDU inkorporering i Mms19 tab af funktion (Mms19P) tredje instar larver, mms19P larver tilsyneladende ikke foder som næsten ingen blå farve blev opdaget i larve tarm (ikke-offentliggjorte resultater). Mms19P larverne viser drastiske udviklingsmæssige deformiteter og i sidste ende anholde i den tredje instar fase. Dette kan på en eller anden måde påvirke fodringsadfærden hos de tredje instar larver og gøre EdU-fodringsprotokollen uegnet til sådanne tilfælde.
Efter at have studeret den tilgængelige litteratur og arbejdet indgående med standardiseringen af væsentlige trin blev der foreslået en alternativ tilgang til EdU/pH3 dual-labeling i Drosophila NBs, som ikke kræver fodring af EdU til larver. En tidligere undersøgelse anvendte dobbelt EdU/pH3 farvning til at analysere cellecyklussen i NBs, men fremlagde ikke en detaljeret protokol4. Dette udgør en unødvendig forhindring for laboratorier forsøger at gennemføre denne metode. Desuden kan evaluering af kompatibiliteten af forskellige reagenser med EdU-sættet og udførelse af yderligere optimering være en tidskrævende proces. Dette papir præsenterer en trin-for-trin protokol, der dækker EDU inkorporering i dissekerede larvehjerner og immunstaining med anti-pH3 antistoffer, efterfulgt af konfokal mikroskopi og billedanalyse for at tildele NBs til fire forskellige kategorier: G0 / G1 fase, S fase, S>G2 / M (progression fra S til G2 / M), og M fase. De trin, der skal optimeres, er skitseret, og tip til billedanalyse af store datasæt. Derudover analyseres EdU/pH3-udlæsningen i wild-type NBs og sammenlignes med Mms19P NBs, som for nylig blev rapporteret til at vise en cellecyklusforsinkelse11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser og lagre til Click-it EdU assay
BEMÆRK: Se materialetabellen og tabel 1 for at få oplysninger om sættet og reagenser, der følger med sættet.
- Bring hætteglassene til stuetemperatur, før du forbereder løsningerne.
- Klargør 10 mM EdU (komponent A) lageropløsning ved at tilsætte 2 mL dimethylsulfoxid (DMSO, komponent C). Bland godt og opbevares ved -20 °C.
- Forbered en arbejdsløsning af Alexa Fluor 647-azid (komponent B) ved at tilføje 70μL DMSO (komponent C). Bland godt og opbevares ved -20 °C.
- Forbered en 1x opløsning af Click-iT EdU reaktionsbuffer (komponent D) ved at blande 4 mL af denne opløsning med 36 mL deioniseret vand. Den resterende opløsning opbevares ved 2-6 °C.
- Lav en 10x bestand (200 mg/mL) af Click-iT EdU buffer additiv (komponent F) ved at tilføje 2 mL deioniseret vand. Bland godt og opbevares ved -20 °C.
- Opbevar Hoechst 33342 (komponent G) ved 2-6 °C. Opbevar DMSO (komponent C) i en udtørrer ved -20 °C.
BEMÆRK: Handsker skal bruges til at håndtere DMSO og Hoechst.
2. Dissektion af tredje instar larval hjerner og EdU inkorporering
BEMÆRK: Protokollen for hjerne dissektioner er tidligere blevet beskrevet12. Før dissektionerne påbegyndes, skal du sørge for, at tilstrækkelige mængder af EdU- og PFA-opløsningerne fremstilles og optøs som beskrevet i punkt 2.6 og 3.1.
- Forbered 10x Fosfat-buffered saltvand (PBS) ved at tilføje 25,6 g Na2HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl og 2 g KH2PO4 til 1 L deioniseret vand. PH til 7,4 justeres, og der fremstilles efterfølgende en 1x opløsning i deioniseret vand.
- Schneiders dissektion medium (SM) til to på hinanden følgende fordybninger af et glas (3 eller 9) depression glas spot plade. Tilføj 1x PBS til den næste på hinanden følgende depression.
- Brug et par sammentak, vælg vandrende tredje instar larver og læg på et væv fugtet med PBS for at rense flyve madrester. Placer larven i depressionen med PBS og derefter i den fortløbende depression med SM.
- Brug et par fine sammentværninger, fjern 3/4th af larvens underkrop.
- Tag forsigtigt larvemundkrogene med et par sammentak, og hold neglebåndet i den anden ende med de andre par sammentak.
- Vend larvehovedet vrangen ud ved at skubbe indad munden kroge og samtidig peeling off vævet i den anden ende.
- Overhold larvehjernen med vedhæftede imaginale diske. Fjern andre væv knyttet til hjernen, og overføre hjernen til den næste på hinanden følgende depression med SM.
- Optø 10 mM EdU lagerløsningen. Klargør en 100 μM opløsning ved at fortynde denne 10 mM lager i SM.
- Der tilsættes 100 μL af denne 100 μM EdU+SM-opløsning i en anden fordybning på Pyrexpladen. Inkuber ~5-10 dissekerede hjerner i 100 μL på 100 μM EdU+SM-opløsning i 2 timer ved 25 °C.
BEMÆRK: Da NBs opdele en gang i ~ 2 h, denne protokol har til formål at analysere en fuld celle cyklus. Brug kun intakte hjerner til yderligere trin. Kassér hjerner, der er beskadiget under dissektion.
3. Fiksering og immunstaining
- Tilbered 4% paraformaldehydopløsning (PFA) i en røghætte.
- Der tilsættes 4 g paraformaldehydpulver til 80 mL 1x PBS i et bægerglas, der er anbragt på en magnetisk omrører og varme til 60 °C. For at opløse PFA tilsættes et par dråber 1 N NaOH. Tjek pH, og juster til 7,0 med et par dråber på 1 M HCl, hvis det er nødvendigt.
- Juster lydstyrken til 100 mL med 1x PBS. Aliquot PFA-opløsningen og opbevares ved 2-6 °C i op til 1 måned. Tilsæt 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel (se materialetabellen) til PFA-opløsningen for effektiv fiksering af store væv som larvehjernen.
- Efter EdU inkorporering overføres hjernen til 0,6 mL mikrocentrifugerør, der indeholder 4% PFA. Inkuber ved stuetemperatur på en nutator i 15 min. Tryk på røret på laboratoriebænken, så hjernen sætter sig ned i bunden af røret.
- Fjern PFA og vask 3 gange med PBS + 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel (PBST) ved stuetemperatur. Sørg for, at hver vask holder i mindst 10 minutter på en nutator. Efter den sidste vask skal du fjerne PBST, tilføje blokeringsopløsning (PBST + 5% kvægserumalbumin) og inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fortynd anti-Miranda antistof (1:250) og anti pH3 antistof (1:200) i PBST (begge antistoffer i samme rør). Fjern blokeringsbufferen, og tilsæt den primære antistofopløsning. Inkuber natten over ved 2-6 °C på en nutator.
BEMÆRK: Miranda er et membranprotein, der findes på CB NBs. Det tjener til at identificere disse store runde celler i CB-regionen13. - Fjern den primære antistofopløsning, og vask 3 gange med PBST. Sørg for, at hver vask varer 10 minutter på en nutator ved stuetemperatur.
- Forbered sekundær antistofopløsning ved at tilføje 1:500 fortyndet Alexa Fluor 488 anti-kanin og Alexa Fluor 568 anti-rat i PBST. Fjern PBST, og tilsæt den sekundære antistofopløsning til de dissekerede hjerner. Inkuberes natten over ved 2-6 °C i mørke, på en nøddeknækker, og vask 3 gange med PBST (trin 3.5).
4. EdU-detektion, DNA-farvning og montering
- Hvis du vil tilberede EdU-detektionscocktailen, blandes komponenterne (se tabel 2) i et 1,5 mL rør.
- Efter den sidste vask (trin 3.6), fjerne PBST, og tilføje EdU detektion cocktail til dissekeret hjerner. Inkuber ved stuetemperatur i mørket i 30 minutter på en nutator. Vask 2 gange med PBST i 10 min hver, i mørke.
- Ved DNA-farvning fortyndes Hoechst 33342 (komponent G) 1:2.000 i PBST for at fremstille en 5 μg/mL-opløsning.
- Pbst fjernes efter den anden vask (trin 4.2), og der tilsættes 500 μL 5 μg/mL Hoechst-opløsning til de dissekerede hjerner. Inkuber i mørket i 10 min. Fjern Hoechst, og vask en gang med PBST i 10 min.
- Tryk på røret på laboratoriebænken, og lad hjernen slå sig ned. Fjern PBST fra røret, men efterlad kun 50-100 μL.
- Skær enden af en 200 μL mikropipetspids, og overfør forsigtigt hjernen på en ren glasrutschebane. Fjern overskydende PBST fra diaset ved blotting med filterpapirstrimler. Pas på ikke at lade filterpapiret røre hjernen.
- Sæt en dråbe vandopløselige, ikke-fluorescerende montering medium på hjernen, og orientere hjernen sådan, at ventral nerve ledningen vender diaset, og lapper ansigt opad. Arranger hjernen i en enkelt fil, så det er lettere at afbilde hjernerne serielt.
- Placer forsigtigt en coverlip oven på hjernen. Placer rutsjebanen ved 2-6 °C natten over.
BEMÆRK: Monteringsmediet hærder ved opbevaring natten over, så der ikke er behov for at forsegle dækslet med neglelak.
5. Billeddannelse
BEMÆRK: Se materialetabellen for at få oplysninger om det laserscanningsmikroskop og oliedypningsmål, der anvendes i denne protokol.
- Vælg 63x-målsætningeni anskaffelsessoftwaren .
- Sæt en dråbe nedsænkning olie på coverlip lige over de monterede hjerner for at gøre det lettere at lokalisere vævet gennem okularet.
- Ved hjælp af DAPI/Hoechst 33342-kanalen skal du finde hjernen gennem okularet og derefter skifte til anskaffelsestilstanden i softwaren.
- Konfigurer 4 kanaler til at afbilde Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) og Alexa Fluor 647 (EdU). Brug farveassistentværktøjet, som automatisk opsætter excitationslasere og emissionsfiltre til de valgte farvestoffer.
- Sæt synsfeltet sådan, at det omfatter hele hjerne lap. Billede hele volumen af hjernen lap ved at erhverve z-stakke fordelt 0,8 μm fra hinanden. Gem alle billeder fra en billedsession i *.lif-biblioteksformat.
6. Billedanalyse
BEMÆRK: Følgende trin beskriver analysen af erhvervede billeder, og hvordan man sorterer celler i G0/G1-fasen, S-fasen, S>G2/M (progression fra S til G2/M) og M-fasen ved hjælp af ImageJ-softwaren.
- Download Fiji (Fiji er ImageJ) fra følgende URL: https://fiji.sc/. Åbn Fiji, og træk og slip .lif-filerne til Fiji.
BEMÆRK: Fiji er en version af ImageJ, der kommer forudinstalleret med flere plugins14. Overførsel af .lif-filer til Fiji åbner plugin'et Bio-formater, som er nødvendigt for at behandle .lif-filerne. Bio-formater plugin er også forpligtet til at åbne billedfiler genereret fra nogle andre mikroskop mærker, f.eks nd2 filer genereret fra et Nikon mikroskop. Dette plugin kommer forudinstalleret med Fiji. - Vælg Databrowser under fanen stakvisning, og brug virtuel stak under fanen hukommelsesstyring i plugin'et til bioformater.
BEMÆRK: Lif filer med z-stakke fra 8-10 hjerner er ofte 300-400 megabyte i størrelse. På computere med lav RAM kan åbning af et par sådanne filer hurtigt nedbryde den tilgængelige RAM på ImageJ og forhindre yderligere billedbehandling. Virtuel stak er 'skrivebeskyttet', behøver ikke høj RAM til behandling og er en ideel mulighed for at indlæse store datasæt på Fiji. - Overhold det multikanalbillede, der vises i ImageJ. Ændre farven på kanalerne fra menulinjen ved hjælp af billede | farve | kanaler . Overhold de Miranda-mærkede NBs som store runde celler i CB-regionen.
- Tegn et interesseområde ved hjælp af ellipseværktøjet over hver NB for at undgå at tælle NB to gange.
- Vælg analyser | værktøjer | på menulinjen ImageJ Roi manager. Markér alle null'er i den aktuelle z-sektion, og tryk på t efter markering af hver celle.
- Når alle NBs i den nuværende z-sektion er markeret, ændre kanalerne til pH3 og EdU, og manuelt tælle antallet af EDU-positive NBs, pH3-positive NBs, NBs farvning positivt for både EdU og pH3, og NBs ikke farvning for begge markører.
- Søg efter NBs i efterfølgende z-sektioner, slet gamle INVESTERINGSAFKAST, og tilføj nye investeringsafkast for at tælle NBs i forskellige stakke.
- Forbered et regneark med følgende kolonner: 1. EdU- pH3-: Dette afsnit repræsenterer de dobbelt-negative celler, der er i G0/G1-fasen i cellecyklussen; 2. EdU+: Cellerne i denne kategori har indarbejdet EDU og gennemgår DNA-replikation (S-fase); 3. EdU+ pH3+: disse dobbeltpositive celler har afsluttet S-fasen og er gået videre til G2- eller M-fasen 4. pH3+: Disse NBs gennemgår mitose.
- Beregning af procentdele af NBs til stede i alle de ovennævnte 4 kategorier for hver lap. Forbered en søjlegraf ved hjælp af regnearkssoftwaren, der viser de puljede data for procentdele af null'er i hver kategori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den bi-fligede Drosophila tredje instar larval hjernen er blevet udnyttet som et modelsystem til at studere grundlæggende cellulære og udviklingsmæssige processer9. Fokus for den aktuelle undersøgelse var at fremlægge en protokol til analyse af cellecyklus progression i EdU- og pH3-mærket NBs af CB-regionen (figur 1). CB-NB'erne er opdelt i type I og type II, og de viser det karakteristiske asymmetriske opdelingsmønster9. Hver type I NB division genererer en NB, som er i stand til selvfornyelse, og en anden GMC, der er skæbnebestemt til differentiering9. I modsætning hertil genererer type II NBs transitforstærkende, umodne neurale stamfaderceller (INPs), der fornyer sig selv og genererer 2 GMCs9. Selv om der findes en særskilt NB-befolkning i OL-regionen, fokuserede denne undersøgelse på CB-NBs, som er store og let identificerbare med NB-specifikke markører.
Til denne undersøgelse blev Miranda brugt til at identificere og analysere CB NBs (Figur 2). Selvom Miranda også pletter andre cellepopulationer i OL, cb NBs kan identificeres med Miranda på grund af deres store størrelse og CB placering13. Andre mere specifikke markører kan også bruges til at mærke CB NBs, såsom Deadpan, som er en transskription faktor regulerer NB selvfornyelse. Men da både pH3 og EdU markerer kromatinen, blev membranmarkøren Miranda brugt til at gøre det lettere at visualisere og analysere NBs markeret med pH3 og EdU. EdU inkorporering, efterfølgende detektion, og yderligere karakterisering ved immunstaining og billedanalyse er en kompleks procedure. Det er vigtigt at standardisere hvert trin for at bestemme optimale farvnings- og billeddannelsesforhold. Selvom nogle offentliggjorte rapporter præsenterer EdU/pH3-mærkningsstrategier, uddyber disse rapporter ikke optimerings- og billedanalysetrin. Den arbejdsproces, der er beskrevet i figur 1, opsummerer trinnene fra EDU-inkorporering til billedanalyse.
Vi har for nylig karakteriseret Mms19-genet, som kræves af NBs for normal mitotisk progression11. Gennem live-celle imaging analyser, NBs mangler funktionelle Mms19 blev vist sig at tage dobbelt så lang tid som vilde-type NBs at afslutte mitose. Dette blev tydeligt afspejlet i EdU/pH3-analysen , hvori det blev konstateret, at en betydeligt højere andel af MMS19P NBs var i M-fasen sammenlignet med wild-type NBs ( figur3A). Ekspression af Mms19::eGFP fusionsproteinet i Mms19P-baggrunden havde vist sig at redde fænotypiske defekter11,15. Dette korrelerede godt med resultaterne fra cellecyklus progression analyse, hvori andelen af celler i M-fase blev reddet til vilde-type niveauer på Mms19::eGFP udtryk i Mms19P baggrund (Figur 3A,B).
Figur 1: En forenklet arbejdsgang for EdU/pH3 dual-labeling. Tredje instar larval hjerner blev dissekeret og inkuberet med 100 μM EdU i 2 timer. Efterfølgende blev hjernevævet fastgjort med PFA og immunfarvet med antistoffer mod Miranda og pH3. Billeder af de farvede hjerner blev opnået på et konfokalt mikroskop og yderligere behandlet med ImageJ / Fiji for at tildele celler til forskellige cellecyklusfaser. Forkortelser: EdU = med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; pH3 = fosfo-histone H3; PFA = paraformaldehyd; SM = Schneiders dissektion medium; PBS = fosfatbufferet saltvand; PBST = PBS + 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel; BSA = kvæg serum albumin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tildeling af celler til G1/G0; S; S>G2/M og M faser. Cellerne går gennem G1-, S-, G2- og M-faserne for at fuldføre en fuld cellecyklus. CB NBs fra vandrende tredje instar larval hjerner blev markeret med Miranda (rød), EdU (grå), pH3 (grøn), og DNA blev mærket med Hoechst 33342 (blå). Mærket NBs blev analyseret i ImageJ og tildelt 4 forskellige faser baseret på, om de farves positivt for (A) hverken EdU eller pH3 (G1/G0), (B) kun EdU (S fase), (C) både EdU og pH3 (S>G2/M), og (D) kun pH3 (M fase). Eksempler på individuelle NBs kun fra vilde-type hjerner er vist her. Skalastænger = 5 μm. Forkortelser: CB = central hjerne; NBs = neuroblaster; EdU = med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; pH3 = fosfo-histone H3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effekten af Mms19P på NB cellecyklus fase fordeling. (A) Ved analyse af wild-type (w;+;+) NBs, ~ 25% NBs blev fundet at være i M-fase. I MMS19P NBs steg denne andel imidlertid til næsten 40%. Mms19::eGFP udtryk i Mms19P baggrund er kendt for at redde Mms19P fænotyper, og andelen af M fase NBs i denne baggrund var sammenlignelig med vilde type. (B) Procentdele af NBs i 4 forskellige kategorier svarende til cellecyklusfaser G1/G0, S, S>G2/M og M blev sammenlignet på tværs af vildtype; Mms19P, og Mms19::eGFP, Mms19P genotyper. Andelen af M-fase- og G1/G0-faser varierer betydeligt i MMS19P NBs sammenlignet med wild-type NBs. I modsætning hertil er cellecyklusfordelingen af NBs i Mms19::eGFP, Mms19P hjerner sammenlignelige med den, der findes i den vilde type. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Kruskal-Wallis-testen og flere kolonner sammenlignet ved hjælp af Dunns post-test; (P<0.001). Dette tal er blevet ændret fra 11. Forkortelser: NBs = neuroblaster; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein WT = wild-type. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Beløb/diskenhed |
| EdU (komponent A) | 5 mg |
| Alexa Fluor 647 – jad (komponent B) | 1 hætteglas |
| Dimethylsulfoxid (DMSO, komponent C) | 4 mL |
| Click-iT EdU reaktionsbuffer (komponent D) | 4 mL (10x opløsning) |
| Kobbersulfat (CuSO4, komponent E) | 100 mM; 1 hætteglas |
| Klik-iT EdU buffer additiv (komponent F) | 400 mg |
| Hoechst 33342 (komponent G) | 10 mg/mL i vand, 35 μL |
Tabel 1: EdU kit komponenter. Komponenter, der leveres med Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit og de respektive mængder / mængder. Forkortelse: EdU = med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin.
| Reaktionskomponenter | Lydstyrke (mL) |
| 1x Click-iT-reaktionsbuffer (udarbejdet i trin 1.4) | 430 |
| CuSO4 (komponent E) | 20 |
| Alexa Fluor 647 – azide (komponent B, udarbejdet i trin 1.3) | 1.2 |
| Tilsætningsstof til reaktionsbufferen (komponent F, fremstillet i trin 1.5) | 50 |
| Samlet volumen | ~500 |
Tabel 2: Forberedelse af EDU-detektionscocktail. EdU-detektionscocktailen blev fremstillet ved at blande de angivne mængder af kitkomponenterne (fremstillet i afsnit 2). Forkortelse: EdU = med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EdU inkorporering og dens efterfølgende 'klik' reaktion med celle-permeable azide præsenterer praktiske fordele ved denne teknik i forhold til BrdU metode, der anvendes tidligere7. Denne reaktion er dog katalyseret af Cu (I) ioner, og flere farvestoffer kan være ustabile i nærværelse af denne kobberkatalysator, som det klart anbefales af Click-it EdU-kitproducenten. Når immunstaining eksperimenter var blevet udført efter udførelse af EdU detektion trin, den forventede signalintensitet blev ikke observeret med den røde kanal farvestoffer, Alexa Fluor 568 og Cy3. Protokollen virkede dog, da immunstainerende reaktioner blev afsluttet før EdU-detektionstrinnet. Med denne protokol blev fire kanaler brugt til at visualisere Hoechst, pH3, Miranda og EdU.
Et andet optimeret trin i denne protokol var optagelsen af EdU ved dissekeret hjerner i modsætning til fodring EdU-spiked flyve mad til larver. Som den fulde Drosophila NB celle cyklus varer i ca 2-2,5 h16, EdU optagelse af hjerner i 2,5 timer som i denne protokol, muliggør sporing af en fuld celle cyklus af NBs. Celler, der ikke pletter positivt for enten EdU eller pH3 hviler celler. I tilfælde af en tredje instar larve, hvori NBs aktivt deler, ville disse hvilende celler sandsynligvis være i G1-fasen af cellecyklussen. Men fra den sene embryonale til den tidlige anden instar faser, NBs midlertidigt bliver quiescent17. I disse tidlige udviklingsstadier vil dobbelt-negativ farvning sandsynligvis udgøre en G0/quiescent fase.
NBs under DNA-replikation bør plette positivt for EdU, mens celler, der har udviklet sig fra S-fasen (EdU inkorporering) til den sene G2 eller M fase bør plette positivt for både EdU og pH3. Karakteriseringen af G2-fasen ville imidlertid være vanskelig med denne protokol, da tidlige G2-celler ikke pletter positivt for EdU eller pH3. Men celler, der har indarbejdet EDU og har udviklet sig til begyndelsen af G2 ville også plette positivt for EDU og kunne komplicere analysen af G2-fasen. Flere lægemidler, der hæmmer DNA-replikation forårsage celle cyklus anholdelse på S-fase18,19,20. Denne protokol kunne være et praktisk værktøj til at analysere og identificere effekten af sådanne lægemiddelbehandlinger som S-fase-blokerede celler ville ikke gå videre til M-fase og fraktionen af EdU, pH3 dobbelt-positive celler ville blive reduceret eller endda fraværende i dette tilfælde.
I en nyligt offentliggjort undersøgelse evaluerede vi effekten af Mms19-genet på mitotisk progression i NBs11. Gennem live-celle billeddannelse, demonstrerede vi en dramatisk forsinkelse af Mms19P NBs i M-fase progression. Mens wild-type NBs fuldføre M-fase i ~ 10 min, Mms19P NBs tog omkring dobbelt så meget tid til at afslutte M-fase11. Derfor afspejlede denne EdU/pH3 dual-labeling protokol også en mitotisk forsinkelse, da vi observerede næsten 1,5x så mange NBs farvning positivt for pH3 i Mms19P hjerner i forhold til vilde hjerner. Data fra denne EDU-protokol kan således sammenlignes med de direkte live-cellebilleddannelsesresultater. Som sådan direkte, live-celle tilgange er tidskrævende og har brug for omfattende optimering, denne protokol kunne udnyttes til at udføre en hurtig indledende screening af sådanne celle cyklus mutanter til at forstå defekter på bestemte stadier. Når en fase af interesse er identificeret, dette kunne derefter følges op af direkte celle visualisering assays.
Varigheden af cellecyklusfaser kan variere betydeligt mellem forskellige celletyper og udviklingsstadier. For eksempel, i udviklingen af Drosophila embryoner, downregulation af mitotiske kinaser resulterer i en længere varighed af S-fasen, mens der i celler skæbnebestemt til differentiering, såsom fritte (Mustela putorius furo) hjernen neurale forfædre, S fase varighed er markant kort21,22. EdU pulsmærkningstid bør således optimeres afhængigt af længden af S- og G-faser i den givne celletype. Varigheden af EdU-pulsen vil også afhænge af de eksperimentelle mål, f.eks. er en kort puls tilstrækkelig til at måle den del af cellerne, der i øjeblikket er i S-fasen, mens en længere puls muliggør analyse af cellernes progression gennem S-fasen.
Omfattende optimering af EDU puls kan også tillade vurdering af S fase, som det blev elegant demonstreret af Pereira og kolleger23. Disse forskere demonstrerede en ny, flow cytometri-baseret metode, hvor HCT116 celler blev puls-mærket med EdU for trinvise tidsperioder. Forfatterne viste, at den maksimale fluorescerende intensitet af EDU opnås, når den pulserende tid matcher længden af S fase23. Desuden muliggjorde analysen af den tidsmæssige progression af EdU-mærkede celler også kvantificeringen af G1- og G2/M-faserne. Selv om den nuværende protokol for EdU/pH3 dual-labeling muliggør analyse af S- og M-fasefejl, er det ikke muligt at måle den præcise varighed af faser med denne protokol. Protokollen beskrevet af Pereira og kolleger kunne være et passende alternativ til assays, der kræver bestemmelse af celle cyklus fase længder. Tilpasning af denne protokol med en ekstra pH3-mærkning kan også resultere i højere følsomhed ved detektering af M-faseceller.
Bortset fra EdU/pH3-metoden er den fluorescent ubiquitin-baserede cellecyklusindikator (FUCCI) metode også blevet brugt til at studere cellecyklus progression i pattedyrsceller samt i Drosophila væv24,25. Dette system anvender to fluorescerende mærkede proteiner, geminin og Cdt1, som indeholder motiver til specifik allestedsnærværende og proteasomal nedbrydning af henholdsvis APC / C og SCFSkp2. Da APC/C kun er aktiv fra slutningen af mitose til G1, og SCFSkp2 er aktiv i S- og G2-faserne, muliggør cellecyklusstadietsspecifik nedbrydning af fluorescerende mærket geminin og Cdt1 bestemmelse af cellecyklusfase24. En let modificeret 'Fly-FUCCI'-metode til drosophilavæv er i stedet afhængig af fluorescerende mærkede cykliske B og E2F1, som nedbrydes af henholdsvis APC/C (under mitose) og CRL4Cdt2 (under S-fasedebut)henholdsvis 25. En tidligere undersøgelse, der karakteriserer for tidlig differentiering af Drosophila larval NBs som reaktion på aneuploidy analyseret celle cyklus defekter ved både Fly-FUCCI og EdU / pH3 metoder4. Aneuploidi fremkalder for tidlig differentiering af NBs, og derfor forlader en høj brøkdel af NBs cellecyklussen.
Dette blev nøjagtigt afspejlet i både Fly-FUCCI og EdU/pH3 data4. Data fra EdU/pH3-metoden kan derfor også sammenlignes med andre metoder til sporing af cellecyklusser såsom Fly-FUCCI. Fly-FUCCI er et kraftfuldt værktøj, og alle fluelagre med allestedsnærværende lysstofrørsmarkører eller markører smeltet sammen til vævsspecifikke initiativtagere er tilgængelige fra lagercentre. Men ved hjælp af disse konstruktioner til at analysere celle cyklus defekter i null mutanter eller med siRNA knockdown ville indebære genetisk rekombination at skabe en flue bestand, der bærer FUCCI elementer, væv-specifikke drivere, en bestemt mutation, eller en siRNA af interesse. Denne proces vil forsinke det faktiske eksperiment i flere uger, mens EdU/pH3-metoden let kan anvendes til at flyve linjer med en genetisk null-baggrund. Alternativt kan en et-trins krydsning mellem en driverbestand og en siRNA-bestand anvendes til EdU /pH3-analyse for siRNA-knockdowns.
En ulempe ved denne tilgang er billeddannelse og billedanalyse pipeline, som indebærer manuel kvantificering af et stort antal celler fra flere hjerneprøver. For nylig, en flow cytometri tilgang er blevet præsenteret som en high-throughput alternativ til en konventionel mikroskopi-baseret assay for celle cyklus analyse26. Den hurtige analyse af tusindvis af celler på samme tid med denne tilgang er fordelagtig, og evnen til at opdage flere markører muliggør kvantificering af specifikke celletyper. Selvom let anvendelige med kultiverede cellelinjer, denne protokol kan være vanskeligt at anvende på store vævsprøver såsom Drosophila larve hjernen. Men, et par protokoller er blevet offentliggjort, der beskriver hjernevæv dissociation og analyse af isolerede larval NBs af flow cytometri27,28. Yderligere innovative tilgange i denne retning kan præsentere nye muligheder for high-throughput celle cyklus analyse i Drosophila væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Swiss National Science Foundation (projekttilskud 31003A_173188; www.snf.ch) og Universitetet i Bern (www.unibe.ch) til BS. Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberede manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J.
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
