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Medicine

एक GCaMP3 रिपोर्टर के साथ कार्डियक विशिष्ट कैल्शियम फ्लक्स को मापने के द्वारा कार्डियक Reprogramming के इन विट्रो मूल्यांकन

Published: February 22, 2022 doi: 10.3791/62643
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University
* These authors contributed equally

Summary

हम यहां वर्णन करते हैं, एक Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 के रूप में संदर्भित) की स्थापना और आवेदन कार्डियक रीप्रोग्रामिंग मूल्यांकन के लिए माउस रिपोर्टर लाइन। माउस स्ट्रेन से अलग किए गए नवजात कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (NCFs) को प्रेरित कार्डियोमायोसाइट्स (iCMs) में परिवर्तित किया जाता है, जिससे कैल्शियम (Ca2+) फ्लक्स के माध्यम से iCms की reprogramming दक्षता और कार्यात्मक परिपक्वता के सुविधाजनक और कुशल मूल्यांकन की अनुमति मिलती है।

Abstract

कार्डियक रीप्रोग्रामिंग एक क्षतिग्रस्त दिल की मरम्मत के लिए एक संभावित आशाजनक चिकित्सा बन गई है। Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) सहित कई प्रतिलेखन कारकों को पेश करके, फाइब्रोब्लास्ट्स को प्रेरित कार्डियोमायोसाइट्स (iCMs) में फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है। ये आईसीएम, जब एक इंफार्क्टेड दिल में सीटू में उत्पन्न होते हैं, तो आसपास के मायोकार्डियम के साथ विद्युत और यांत्रिक रूप से एकीकृत होते हैं, जिससे निशान के आकार में कमी आती है और हृदय समारोह में सुधार होता है। अपेक्षाकृत कम reprogramming दक्षता, शुद्धता, और iCM की गुणवत्ता के कारण, iCM का लक्षण वर्णन एक चुनौती बनी हुई है। प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री और क्यूपीसीआर सहित इस क्षेत्र में वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले तरीके, मुख्य रूप से हृदय-विशिष्ट जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित करते हैं, लेकिन आईसीएम की कार्यात्मक परिपक्वता पर नहीं। एक्शन पोटेंशियल्स द्वारा ट्रिगर किया गया, कार्डियोमायोसाइट्स में वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम चैनलों के उद्घाटन से सेल में कैल्शियम की तेजी से आमद होती है। इसलिए, कैल्शियम प्रवाह की दर को परिमाणित करना कार्डियोमायोसाइट्स फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक आशाजनक तरीका है। यहां, प्रोटोकॉल कैल्शियम (Ca2+) फ्लक्स द्वारा आईसीएम फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि का परिचय देता है। एक αMHC-Cre/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 माउस स्ट्रेन को Tg (Myh6-cre)1Jmk/J (नीचे Myh6-Cre के रूप में संदर्भित) को पार करके स्थापित किया गया था, जिसमें Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze/J (जिसे नीचे Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 के रूप में संदर्भित किया गया है) चूहों के साथ। पी0-पी 2 नवजात चूहों से नवजात कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (एनसीएफ) को विट्रो में अलग और सुसंस्कृत किया गया था, और एमजीटी का एक पॉलीसिस्ट्रोनिक निर्माण एनसीएफ में पेश किया गया था, जिससे आईसीएम के लिए उनकी रीप्रोग्रामिंग हुई। क्योंकि केवल सफलतापूर्वक rerogrammed iCmS GCaMP3 रिपोर्टर व्यक्त करेंगे, iCms की कार्यात्मक परिपक्वता नेत्रहीन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ Ca2 + फ्लक्स द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। Un-reprogrammed NCFs की तुलना में, NCF-iCMs ने महत्वपूर्ण कैल्शियम क्षणिक फ्लक्स और सहज संकुचन दिखाया, जो सीएम के समान है। यह प्रोटोकॉल विस्तार से माउस तनाव स्थापना, अलगाव और नवजात चूहों के दिल के चयन, एनसीएफ अलगाव, कार्डियक रीप्रोग्रामिंग के लिए रेट्रोवायरस का उत्पादन, आईसीएम प्रेरण, हमारे रिपोर्टर लाइन का उपयोग करके आईसीएम Ca2 + फ्लक्स का मूल्यांकन, और संबंधित सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा प्रस्तुति का वर्णन करता है। यह उम्मीद की जाती है कि यहां वर्णित तरीके कार्डियक रीप्रोग्रामिंग अध्ययनों के लिए आईसीएम की कार्यात्मक परिपक्वता का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करेंगे।

Introduction

Myocardial infarction (MI) दुनिया भर में एक गंभीर बीमारी है। कार्डियोवैस्कुलर रोग (सीवीडी) दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण हैं और 20191,2 में लगभग 18.6 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदार हैं। पिछली आधी सदी के दौरान सीवीडी की कुल मृत्यु दर में कमी आई है। हालांकि, इस प्रवृत्ति को कुछ अविकसित देशों में धीमा कर दिया गया है या यहां तक कि उलट दिया गया है1, जो सीवीडी के अधिक प्रभावी उपचार के लिए कहता है। सीवीडी की घातक अभिव्यक्तियों में से एक के रूप में, एमआई संयुक्त राज्य अमेरिका में सीवीडी के लिए जिम्मेदार सभी मौतों में से लगभग आधे के लिए जिम्मेदार है। ischemia के दौरान, कोरोनरी धमनियों को अवरुद्ध करने और पोषक तत्वों और ऑक्सीजन दोनों की सीमित आपूर्ति के साथ, मायोकार्डियम गंभीर चयापचय परिवर्तनों से पीड़ित है, कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) के सिस्टोलिक कार्य को बाधित करता है, और सीएम मृत्यु 3 की ओर जाता है। हृदय की चोट की मरम्मत और घायल दिल के कार्य को बहाल करने के लिए हृदय अनुसंधान में कई दृष्टिकोणों का पता लगाया गया है4। प्रत्यक्ष कार्डियक रीप्रोग्रामिंग क्षतिग्रस्त दिल की मरम्मत और इसके कार्य को बहाल करने के लिए एक आशाजनक रणनीति के रूप में उभरा है5,6। Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) को पेश करके, फाइब्रोब्लास्ट्स को विट्रो और विवो में iCMs में फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है, और उन iCMs निशान क्षेत्र को कम कर सकते हैं और दिल के कार्य में सुधार कर सकते हैं7,8।

हालांकि कार्डियक रीप्रोग्रामिंग एमआई उपचार के लिए एक आशाजनक रणनीति है, लेकिन कई चुनौतियां बनी हुई हैं। सबसे पहले, reprogramming दक्षता, शुद्धता, और गुणवत्ता हमेशा के रूप में उम्मीद के रूप में उच्च नहीं कर रहे हैं. MGT प्रलोभन केवल 8.4% (cTnT +) या कुल CFs के 24.7% (αMHC-GFP +) को प्राप्त कर सकता है, जिसे विट्रो 7 में iCMs में पुन: प्रोग्राम किया जा सकता है, या vivo8 में 35% तक, जो इसके आवेदन को सीमित करता है। यहां तक कि सिस्टम में प्रेरित अधिक कारकों के साथ, जैसे कि Hand29 या Akt1 / PKB10, reprogramming दक्षता अभी भी नैदानिक सेटिंग में उपयोग करने के लिए मुश्किल से संतोषजनक है। इस प्रकार, इस क्षेत्र में रीप्रोग्रामिंग दक्षता में सुधार पर ध्यान केंद्रित करने वाले अधिक अध्ययनों की आवश्यकता है। दूसरा, आईसीएम की विद्युत अखंडता और संकुचन विशेषताएं हृदय समारोह के कुशल सुधार के लिए महत्वपूर्ण हैं, फिर भी ये मूल्यांकन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। वर्तमान में, क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली मूल्यांकन विधियों, जिसमें फ्लो साइटोमेट्री, इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री और कुछ प्रमुख सीएम जीन अभिव्यक्ति के क्यूपीसीआर शामिल हैं, सभी आईसीएम और सीएम की समानता पर केंद्रित हैं, लेकिन सीधे आईसीएम की कार्यात्मक विशेषताओं से संबंधित नहीं हैं। इसके अलावा, उन तरीकों में अपेक्षाकृत जटिल प्रक्रियाएं हैं और समय लेने वाली हैं। जबकि reprogramming अध्ययन में आमतौर पर संभावित reprogramming कारकों की स्क्रीनिंग शामिल होती है जो iCm परिपक्वता 11 को बढ़ावा देती है, कार्डियक रीप्रोग्रामिंग iCm फ़ंक्शन के आधार पर एक त्वरित और सुविधाजनक विधि के लिए कॉल करती है।

सीएम प्रत्येक अनुबंध चक्र के दौरान साइटोमेंब्रेन पर वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम आयन चैनल खोलते हैं, जो मायोफिलामेंट संकुचन में भाग लेने के लिए इंटरसेलुलर तरल पदार्थ से साइटोप्लाज्म तक कैल्शियम आयन (Ca2+) की क्षणिक आमद की ओर जाता है। इस तरह के एक Ca2 + प्रवाह और outflux चक्र मायोकार्डियल संकुचन की मौलिक विशेषता है और CMs12 के सामान्य कार्य का गठन करता है। इस प्रकार, एक विधि जो Ca2 + प्रवाह का पता लगाती है, वह सीएम और सीएम जैसी कोशिकाओं के कार्य को मापने का एक संभावित तरीका हो सकता है, जिसमें आईसीएम भी शामिल हैं। इसके अलावा, आईसीएम के लिए, इस तरह की विधि रीप्रोग्रामिंग दक्षता का मूल्यांकन करने का एक और तरीका प्रदान करती है।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) विकसित किए गए हैं और व्यापक रूप से सेल गतिविधियों, विशेष रूप से कार्रवाई क्षमता को इंगित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। आम तौर पर, GECIs में एक Ca2 + बाइंडिंग डोमेन होता है जैसे कि कैलमोडुलिन, और एक फ्लोरोसेंट डोमेन जैसे कि GFP, और GCaMP3 उच्च आत्मीयता और प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ एक है। GCaMP3 के प्रतिदीप्ति डोमेन सक्रिय हो जाएगा जब स्थानीय कैल्शियम एकाग्रता बदल गया है13. इस पेपर में, एक माउस स्ट्रेन जो विशेष रूप से Myh6 + कोशिकाओं में GCaMP3 रिपोर्टर को व्यक्त करता है, का वर्णन किया गया है। इस तनाव के नवजात शिशुओं से अलग-थलग NCFs के लिए MGT पेश करके, reprogramming प्रतिदीप्ति द्वारा निगरानी की जा सकती है, जो सफलतापूर्वक rerogrammed iCm प्रदर्शित करेगा। इस तरह के माउस तनाव और विधि कार्डियक रीप्रोग्रामिंग की जांच करने के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करेगी।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और प्रथाओं को मिशिगन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सेल संस्कृति से जुड़ी सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और प्रथाओं को बाँझ परिस्थितियों में बीएसएल 2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट किया जाना चाहिए। वायरस से जुड़ी प्रक्रियाओं और प्रथाओं के लिए, पर्यावरण और स्वास्थ्य खतरों के जोखिम से बचने के लिए ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं, पिपेट युक्तियों और ट्यूबों के उचित निपटान के दिशानिर्देश का पालन किया गया था।

1. एक Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (Myh6-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) माउस तनाव (चित्रा 1 के रूप में संदर्भित) की स्थापना

  1. Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J माउस स्ट्रेन (जैक्सन लैब स्टॉक 009074, जिसे Myh6-Cre के रूप में संदर्भित किया जाता है) और Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J माउस स्ट्रेन (जैक्सन लैब स्टॉक 014538, जिसे क्रमशः Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 के रूप में जाना जाता है) तैयार करें।
  2. वयस्क Myh6-Cre और Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 चूहों को प्राप्त करने के लिए 8 सप्ताह तक के प्रत्येक तनाव को क्रमशः नस्ल करें।
  3. क्रॉसब्रीड वयस्क Myh6-Cre और Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 चूहों.
    नोट: Myh6-Cre पुरुष / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 महिला या इसके विपरीत सेट करें। उनके वंशजों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। आमतौर पर, मादा चूहे क्रॉसब्रीडिंग के 19-21 दिनों के बाद 8-10 पिल्लों को जन्म देंगी।

2. अलगाव और नवजात Myh6-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 चूहों के दिल का चयन.

  1. P0-P2 पिल्ले प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि इस प्रोटोकॉल के साथ 10 मिलियन एनसीएफ को अलग करने के लिए 8-10 पिल्ले मौजूद हैं।
  2. हाइपोथर्मिया द्वारा पिल्लों को गहराई से बेहोश कर दिया गया। पिल्लों को एक लेटेक्स दस्ताने में रखें और कुचल बर्फ और पानी (2 डिग्री सेल्सियस - 3 डिग्री सेल्सियस) में गर्दन तक विसर्जित करें।
  3. संक्षेप में 75% इथेनॉल के साथ पिल्लों को सैनिटाइज करें।
  4. बाँझ कैंची के साथ decapitation द्वारा पिल्लों का बलिदान.
  5. दिल के पास एक क्षैतिज चीरा बनाएं, दिल को निचोड़ें, और फिर कैंची के साथ महाधमनी की जड़ में अलग करके इसे अलग करें।
  6. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत दिल की धड़कन का निरीक्षण करें। Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 जीनोटाइप के साथ दिल सुनिश्चित करें, दिल की धड़कन के साथ GCaMP3 द्वारा इंगित Ca2+ फ्लक्स दिखाता है। अन्य जीनोटाइप प्रतिदीप्ति नहीं दिखाते हैं (चित्रा 2, वीडियो 1, और वीडियो 2)।

3. नवजात कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (NCFs) का अलगाव

नोट: इस भाग के लिए, डॉ ली Qian के Lab14 से प्रोटोकॉल को इस अध्ययन पर लागू होने पर मामूली अनुकूलन के साथ अपनाया गया था।

  1. αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 दिल ों के अलगाव के बाद, उन्हें चार टुकड़ों में काट लें जो शिथिल रूप से जुड़े हुए हैं। पृथक कोशिकाओं में रक्त कोशिका प्रदूषण को सीमित करने के लिए उन्हें 6 सेमी प्लेट में बर्फ-ठंडे डीपीबीएस में अच्छी तरह से कई बार धोएं।
  2. दिल को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 8 मिलीलीटर के साथ दिल को पचाएं।
  4. ट्रिप्सिन supernatant को त्यागें और HBSS में गर्म टाइप-II कोलेजेनेस (0.5 मिलीग्राम / एमएल) के 5 एमएल जोड़ें।
  5. मिश्रण को अच्छी तरह से भंवर करें, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, भंवर को अच्छी तरह से और अवचेतन ऊतक को गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने दें।
  7. 5 mL ठंडा fibroblast (FB) माध्यम (20% FBS और 1% पेनिसिलिन / streptomycin के साथ IMDM) के साथ एक 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में supernatant ले लीजिए।
  8. 4-5 बार अपाच्य ऊतक के लिए चरण 3.4-3.7 को दोहराएं।
  9. एक साथ सभी supernatant ले लीजिए और एक 40 μm छलनी के साथ supernatant फ़िल्टर.
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्याग.
  11. चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग बफर (MACS बफर; 2 mM EDTA और 0.5% BSA के साथ 1x PBS) के 10 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  12. trypan नीले धुंधला द्वारा व्यवहार्य सेल संख्या निर्धारित करें.
    1. चरण 3.11 में सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर से 10 μL कोशिकाओं को बाहर निकालें।
    2. 0.4% ट्रिपैन नीले समाधान के 10 μL के साथ मिश्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. मिश्रण को हेमोसाइटोमीटर में जोड़ें और व्यवहार्य सेल संख्या निर्धारित करें। मृत कोशिकाओं को नीले रंग में दाग दिया जाता है, जबकि व्यवहार्य कोशिकाएं अप्रकाशित होती हैं।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और supernatant को त्याग दें।
  14. 10 मिलियन से कम व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए ठंडा MACS बफर के 90 μL में Thy1.2 माइक्रोबीड्स के 10 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। यदि 10 मिलियन से अधिक व्यवहार्य कोशिकाएं हैं तो आनुपातिक रूप से अधिक मोती जोड़ें। मिश्रण को अच्छी तरह से पिपेट करें और 30-60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  15. MACS बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण।
  16. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant छोड़ दें।
  17. चरण 3.15-3.16 को एक बार दोहराएं।
  18. MACS बफर के 2 mL के साथ कोशिकाओं और मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  19. हुड में एक MACS विभाजक सेट करें। विभाजक के लिए एक LS स्तंभ सम्मिलित करें और MACS बफ़र के 3 mL के साथ स्तंभ को संतुलित करें।
  20. जब LS स्तंभ संतुलित है, तो कक्षों को स्तंभ के माध्यम से पास करें।
  21. तीन बार MACS बफर के 2 mL के साथ LS स्तंभ धोएं।
  22. विभाजक से कॉलम ले लो, इसे तीन बार MACS बफर के 2 mL के साथ elute, और फिर एक 50 mL ट्यूब के लिए क्षालन इकट्ठा।
  23. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्याग.
  24. FB मीडिया के 5 mL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  25. हेमोसाइटोमीटर के साथ सेल नंबर निर्धारित करें।
  26. एफबी मीडिया के साथ कोशिकाओं को पतला करें और कोशिकाओं को वांछित के रूप में व्यंजन या प्लेटों में बीज दें। सुनिश्चित करें कि सेल सीडिंग घनत्व लगभग 2-2.5 x 104 कोशिकाओं / सेमी 2 है (व्यक्तिगत प्रयोगों के आधार पर घनत्व का अनुकूलन करें)। सुनिश्चित करें कि संलग्न fibroblasts बीज बोने के बाद दूसरे दिन गोल आकार के लिए एक अंडाकार है (चित्रा 3).

4. रेट्रोवायरस एन्कोडिंग का उत्पादन कार्डियक reprogramming के लिए polycistronic MGT वेक्टर एन्कोडिंग

  1. प्लैट-ई संस्कृति मीडिया के साथ प्लैट-ई बनाए रखें (डीएमईएम 10% एफबीएस, 1 μg / mL puromycin और 10 μg / mL ब्लास्टिसिडिन के साथ पूरक) 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. दिन 1 पर, लगभग 4-5 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से घनत्व पर 6-अच्छी तरह से प्लेट में प्लेट-ई को विभाजित करें।
  3. दिन 2 पर, प्लैट-ई आमतौर पर 80% confluency तक पहुंचता है। निम्नलिखित प्रक्रियाओं के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करें। एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से आधार पर यहां मौजूद प्रत्येक तत्व की मात्रा और मात्रा को समायोजित करें।
    1. पीएमएक्स-प्यूरो-एमजीटी पॉलीसिस्ट्रोनिक रेट्रोवायरस अभिव्यक्ति प्लास्मिड वेक्टर (एडजीन 111809) के 2 μg को टीई बफर के साथ 500 एनजी / μL तक पतला करें।
    2. कम सीरम माध्यम के 150 μL के साथ लिपोफेक्टामाइन के 10 μL मिश्रण मिश्रण तैयार करें। ध्यान से पिपेट अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन करने के लिए। पिपेटिंग करते समय बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें।
    3. इस बीच, कम सीरम माध्यम के 150 μL के साथ प्लास्मिड मिश्रण द्वारा एक प्लास्मिड मिश्रण तैयार करें। ध्यान से पिपेट अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन करने के लिए। पिपेटिंग करते समय बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें।
    4. ध्यान से दो मिश्रणों को मिलाएं और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। समाधान बादल दिखाई दे सकता है।
    5. ट्रांसफेक्टेड होने के लिए कोशिकाओं में ड्रॉप से मिश्रण ड्रॉप जोड़ें।
    6. रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. दिन 3 पर, माध्यम को एक ताजा पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम में बदलें जिसमें प्यूरोमाइसिन और ब्लास्टिसिडिन की कमी है।
  5. दिन 4 पर, अभिकर्मक के बाद 48 घंटे, supernatant है कि रेट्रोवायरस शामिल है इकट्ठा और यह 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर.
  6. दिन 5 पर, अभिकर्मक के बाद 72 घंटे, रेट्रोवायरस युक्त supernatant इकट्ठा करें।
  7. 0.45 μm फ़िल्टर के साथ 48 h और 72 h supernatant दोनों को फ़िल्टर करें, 8% PEG की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 40% पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (PEG) समाधान की 1/5 मात्रा जोड़कर 4 °C पर रात भर अवक्षेपित करें।
  8. वायरस को अवक्षेपित करने के लिए 30 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: PEG8000-वायरस छोटे सफेद वर्षा रूपों.
  9. आईसीएम माध्यम के साथ वायरस को फिर से निलंबित कर दिया गया जिसमें वांछित के रूप में 8 μg / mL polybrene शामिल है। तुरंत रेट्रोवायरस का उपयोग करें।

5. MGT एन्कोडिंग रेट्रोवायरस संक्रमण के साथ iCMs के लिए NCFs reprogramming

  1. वायरस संक्रमण से पहले NCFs बढ़ना या पारित करना।
    नोट: आमतौर पर, NCF को दो बार पारित किया जा सकता है।
  2. दिन 0 पर, एफबी माध्यम में 1-2 x 104 कोशिकाओं / सेमी 2 के आसपास घनत्व के लिए बीज एनसीएफ।
  3. दिन 1 पर, संस्कृति माध्यम को प्रत्येक अच्छी तरह से वांछित के लिए वायरस युक्त माध्यम के साथ बदलें। 24-अच्छी तरह से प्लेट में दो कुओं को संक्रमित करने के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट में एक अच्छी तरह से प्लेट-ई से वायरस का उपयोग करें। इष्टतम वायरस एकाग्रता निर्धारित करने के लिए वायरस titer.
    नोट: ब्याज के अन्य reprogramming कारकों वाले वायरस को MGT रेट्रोवायरस के साथ पेश किया जा सकता है।
  4. रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. दिन 2 पर, वायरस संक्रमण के 24 घंटे बाद, वायरस युक्त माध्यम को एक नियमित आईसीएम माध्यम में बदलें।
  6. GCaMP3 अभिव्यक्ति की निगरानी करने के लिए, इसे एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट करें। GFP चैनल पर 10x के तहत, दिन 5 के रूप में जल्दी के रूप में कोशिकाओं के एक हिस्से के हल्के बेसल GCaMP3 प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करें।
  7. रीप्रोग्रामिंग के दौरान माध्यम को हर 2-3 दिनों में बदलें। यदि आवश्यक हो, तो 3 दिनों के लिए संस्कृति माध्यम में 2 μg / mL प्यूरोमाइसिन जोड़कर और इसे 1 μg / mL पर बनाए रखने के द्वारा MGT रेट्रोवायरस संक्रमित कोशिकाओं के लिए एक सकारात्मक चयन करें।
    नोट: ब्याज के रसायनों का परिचय (उदाहरण के लिए, IGF-1, MM589, A83-01, और PTC-209, IMAP के रूप में जाना जाता है के रूप में हम पहले की सूचना के रूप में) मध्यम परिवर्तन के साथ.
  8. संक्रमण के 14 दिनों के बाद, आईसीएम परिपक्वता को आगे बढ़ाने के लिए माध्यम को बी 27 माध्यम से बदलें।

6. आईसीएम कार्यात्मक परिपक्वता और Ca2 + फ्लक्स द्वारा reprogramming दक्षता का मूल्यांकन

नोट:: यदि आवश्यक हो, तो मूल्यांकन से पहले मूल्यांकन करने के लिए कोशिकाओं के लिए 1 μM isoproterenol जोड़ें।

  1. कमरे के तापमान पर एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ Ca2 + फ्लक्स का आकलन करें।
  2. GFP चैनल में, 10x उद्देश्य के तहत GCaMP3 + कोशिकाओं का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि यह उज्ज्वल क्षेत्र चैनल में सहज सेल की धड़कन दिखाता है।
  3. बेतरतीब ढंग से 20x के तहत तीन फ़ील्ड का चयन करें और प्रत्येक फ़ील्ड के लिए 3 मिनट के लिए iCMs के Ca2 + फ्लक्स को रिकॉर्ड करें।
    नोट: यहाँ, Ca2+ फ्लक्स को सहज सेल बीटिंग (चित्रा 4, चित्रा 5, और वीडियो 3, वीडियो 4, वीडियो 5, वीडियो 6, वीडियो 7, वीडियो 8) के साथ सिंक्रनाइज़ किया गया था।
  4. Ca2+ फ्लक्स के साथ कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से परिमाणित करें।

7. सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा प्रस्तुति

  1. विचरण (एनोवा) के समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण करें और छात्र-न्यूमैन-केल्स कई तुलना परीक्षण करें।
    नोट: परिणाम के रूप में मतलब के रूप में ± पी < 0.05 के साथ S.E सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में माना जाता है. प्रत्येक प्रयोग कम से कम तीन बार किया गया था।

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Representative Results

Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 माउस स्ट्रेन और ट्रांसजेनिक चूहों की जीन संरचना उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो को चित्र 1 में दिखाया गया है। जबकि माउस स्ट्रेन स्थापित किया गया है, पिल्लों के दिलों को अलग किया गया था और जीनोटाइप की पुष्टि करने के लिए रिवर्स प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। सही जीनोटाइप शो Ca2 + फ्लक्स के साथ दिल धड़कन के साथ सिंक्रनाइज़, GCaMP3 प्रतिदीप्ति के रूप में कल्पना की गई, जबकि नियंत्रण दिल (चित्रा 2, वीडियो 1, और वीडियो 2) में कोई प्रतिदीप्ति नहीं देखी गई थी। अलग NCFs 2 ज के भीतर अच्छी तरह से संलग्न होगा और सीडिंग के 1 दिन बाद गोल आकार के लिए एक अंडाकार दिखाएगा (चित्रा 3)। कार्यात्मक परिपक्वता और iCM की reprogramming दक्षता का मूल्यांकन MgT परिचय के 14 दिनों के बाद Ca2+ फ्लक्स द्वारा किया गया था। Reprogrammed कोशिकाओं Ca2 + फ्लक्स को मापने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मूल्यांकन किया जा सकता है। GCaMP3+ कोशिकाओं को IMAP और MGT दोनों समूहों में पाया जा सकता है, जबकि IMAP समूह सामान्य CMs (वीडियो 3-8) के करीब Ca2+ दोलन पैटर्न के साथ काफी अधिक GCaMP3 + कोशिकाओं और कोशिकाओं को दिखाता है। जैसा कि चित्रा 4A में दिखाया गया है, Ca2+ दोलन के साथ IMAP समूह में एक प्रतिनिधि कक्ष अधिकतम (मध्य पैनल) और न्यूनतम (दाएं पैनल) के बीच GCaMP3 प्रतिदीप्ति परिवर्तन दिखाएगा, और ऐसी कोशिकाओं के Ca2+ दोलन को समय-समय पर बदल दिया जाता है (चित्रा 4B)। IMAP की शुरूआत के बाद, धड़कन समूहों की संख्या नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक थी, क्योंकि उच्च-शक्ति क्षेत्र (HPF, 20x उद्देश्य लेंस) प्रति Ca2 + फ्लक्स के साथ GCaMP3 + कोशिकाओं की संख्या IMAP-मध्यम-उपचारित समूह (चित्रा 5) में बढ़ गई थी।

Figure 1
चित्रा 1: Myh6-Cre/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 माउस तनाव उत्पन्न करना। Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 माउस स्ट्रेन पीढ़ी और ट्रांसजेनिक चूहों की जीन संरचना का चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: धड़कते दिल का Ca2+ फ्लक्स। GCaMP3 प्रतिदीप्ति Myh6-Cre/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 दिलों (ऊपरी पैनल) में दिल की धड़कन के साथ सिंक्रनाइज़ किया गया था, जबकि नियंत्रण दिल (निचले पैनल) में कोई प्रतिदीप्ति नहीं देखी गई थी। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक 6-अच्छी तरह से प्लेट से जुड़े अलग-थलग NCFs. (A) कम शक्ति क्षेत्र (LPF, 10x उद्देश्य, स्केल बार = 100 μm) के तहत NCFs)। (बी) उच्च शक्ति क्षेत्र के तहत NCFs (20x उद्देश्य, स्केल बार = 50 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Ca2+ reprogrammed कोशिकाओं का फ्लक्स. (A) IMAP-treated NCFs उच्च शक्ति क्षेत्र (20x उद्देश्य) पर GFP चैनल के तहत iCMs के लिए reprogrammed. ICM के Ca2+ फ्लक्स को GCaMP3 प्रतिदीप्ति के रूप में देखा गया था, जिसमें Ca2+ फ्लक्स वाली कोशिकाएं मूल प्रतिदीप्ति (Ca2+ min, मध्य पैनल) और उज्ज्वल प्रतिदीप्ति (Ca2 + अधिकतम, दाएं पैनल) के बीच बार-बार चमकती दिखाई देती हैं। (बी) आईएमएपी समूह में Ca2 + दोलन + कोशिकाओं का Ca2 + ट्रेस वक्र। स्केल बार = 50 μm. F/F0: सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 चित्रा 5: IMAP माध्यम के तहत Ca2+ फ्लक्स का मूल्यांकन। MGT प्रेरण के बाद HPF 2, 3, 4 सप्ताह प्रति Ca2+ फ्लक्स के साथ GCaMP3+ कोशिकाओं की संख्या। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: GFP चैनल में स्कैनिंग उद्देश्य लेंस (4x उद्देश्य) के तहत αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Flox-Flox-GCaMP3 जीनोटाइप के साथ पिल्लों से अलग एक धड़कता दिल। दिल GCaMP3 + है और बुनियादी प्रतिदीप्ति (Ca2 + मिनट) और उज्ज्वल प्रतिदीप्ति (Ca2 + अधिकतम) के बीच चमकती है जो धड़कन के साथ सिंक्रनाइज़ है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2: जीएफपी चैनल में स्कैनिंग उद्देश्य लेंस के तहत नियंत्रण जीनोटाइप के साथ पिल्ले से अलग एक धड़कता दिल। दिल GCaMP3 है- और प्रतिदीप्ति चमकती धड़कन के साथ सिंक्रनाइज़ नहीं दिखाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 3: उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) चैनल में एलपीएफ के तहत आईएमएपी समूह में आईसीएम। क्षेत्र के केंद्र में महत्वपूर्ण पिटाई के साथ एक सेल देखा जा सकता है। वीडियो 3 और वीडियो 4 दोनों एक ही क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 4: GFP चैनल में LPF के तहत IMAP समूह में iCMs. चमकती प्रतिदीप्ति के साथ कई कोशिकाओं, BF चैनल में देखा धड़क सेल सहित मनाया जा सकता है. वीडियो 3 और वीडियो 4 दोनों एक ही क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 5: BF चैनल में HPF के तहत IMAP समूह में iCms. वीडियो 3 और वीडियो 4 के क्षेत्र का केंद्र एचपीएफ के तहत देखा गया था। क्षेत्र के केंद्र में महत्वपूर्ण पिटाई के साथ एक सेल को देखा जा सकता है। वीडियो 5 और वीडियो 6 दोनों एक ही क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 6: GFP चैनल में HPF के तहत IMAP समूह में iCMs. वीडियो 3 और वीडियो 4 के क्षेत्र का केंद्र भाग एचपीएफ के तहत देखा गया था। चमकती प्रतिदीप्ति के साथ कई कोशिकाओं, BF चैनल में देखा धड़क सेल सहित मनाया जा सकता है. वीडियो 5 और वीडियो 6 दोनों एक ही क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 7: बीएफ चैनल में एचपीएफ के तहत एमजीटी समूह में आईसीएम। आईएमएपी समूह में देखी गई महत्वपूर्ण धड़कन कोशिकाओं के विपरीत, एमजीटी समूह में बीएफ चैनल के तहत कुछ धड़कन कोशिकाएं हैं, जिनमें कम रीप्रोग्रामिंग दक्षता है। वीडियो 7 और वीडियो 8 दोनों एक ही क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 8: जीएफपी चैनल में एचपीएफ के तहत एमजीटी समूह में आईसीएम। हल्के चमकती प्रतिदीप्ति के साथ कई कोशिकाओं को देखा जा सकता है। वीडियो 7 और वीडियो 8 दोनों एक ही क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

आईसीएम फ़ंक्शन का मूल्यांकन कार्डियक रीप्रोग्रामिंग क्षेत्र के लिए आवश्यक है। इस पांडुलिपि में, प्रोटोकॉल एक Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J माउस स्ट्रेन का वर्णन करता है जिसे स्थापित किया गया है, इस तनाव में नवजात चूहों से अलग NCFs का उपयोग कैसे किया जाए iCMs के लिए reprogramming के लिए, और Ca2 + फ्लक्स द्वारा iCMs फ़ंक्शन का मूल्यांकन। यह आईसीएम कार्यात्मक परिपक्वता का मूल्यांकन करने के लिए एक डी नोवो विधि है।

इस विधि के साथ सफलतापूर्वक पुन: प्रोग्रामिंग और मूल्यांकन करने के लिए कई महत्वपूर्ण चरण महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, NCFs को अलगाव के बाद ताजा तैयार और स्वस्थ होना चाहिए। दिल के अलगाव और काटने की एक त्वरित प्रक्रिया आवश्यक है। सबसे महत्वपूर्ण बात, अधिक-पाचन और सेल व्यवहार्यता और स्थिति में कमी से बचने के लिए इनक्यूबेशन समय का पालन करना महत्वपूर्ण है। दूसरा, सभी प्रक्रियाओं के बीच, वायरस संक्रमण दक्षता अक्सर परिणामों में उच्च भिन्नता का परिचय देती है। वायरस संक्रमण दक्षता मुख्य रूप से दो कारकों से प्रभावित होती है। एक तरफ, वायरस टिटर को विभिन्न प्रयासों के बीच स्थिर होना चाहिए, जिसके लिए ट्रांसफेक्टेड प्लास्मिड मात्रा और इसी तरह के प्लैट-ई सेल स्थिति और घनत्व में स्थिरता की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल का पालन करने वाले शोधकर्ताओं को उन प्रक्रियाओं से पहले इष्टतम सीडिंग घनत्व और समय का मूल्यांकन करना चाहिए। फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों के लिए वायरस संवेदनशीलता के कारण टिटर क्षीणन से बचने के लिए वायरस का तुरंत उपयोग किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, संक्रमण के समय NCFs को एक स्वस्थ स्थिति और उपयुक्त घनत्व में रखना महत्वपूर्ण है। शोधकर्ताओं को NCFs की विकास विशेषताओं से परिचित होना चाहिए। जबकि reprogramming दक्षता भिन्नता सीमित होना चाहिए, लगातार निगरानी सहायक हो सकता है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न वायरस के साथ NCFs को सह-संक्रमित करने या उन्हें ब्याज के रसायनों के साथ इलाज करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस प्रकार, यह कार्डियक रीप्रोग्रामिंग अनुसंधान के लिए एक सार्वभौमिक विधि के रूप में लागू होता है। यहां उल्लिखित बिंदुओं के अलावा, इस विधि के साथ सामान्य मुद्दों में रीप्रोग्रामिंग के बाद देखी गई कम प्रतिदीप्ति शामिल है। यह कई कारणों से हो सकता है। सबसे पहले, संक्रमण वांछित के रूप में प्रभावी नहीं हो सकता है, जो कम रीप्रोग्रामिंग दक्षता की ओर जाता है और आईसीएम की संख्या को सीमित करता है। दूसरा, एक्सपोजर की स्थिति को आईसीएम के जीसीएएमपी 3 प्रतिदीप्ति के अवलोकन के लिए बेहतर ढंग से समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही पिल्ले से अलग नवजात कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करने से संभावित कारण की पहचान करने में मदद मिलेगी।

Ca2+ फ्लक्स का व्यापक रूप से सेल गतिविधियों का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया है, जिसमें न्यूरॉन कोशिकाएं 16, स्तन ग्रंथि 17, वसा ऊतक 18, आदि शामिल हैं। इस अध्ययन में, Ca2+ फ्लक्स का उपयोग iCM की कार्यात्मक परिपक्वता का आकलन करने के लिए किया गया था। इससे पहले, यह बताया गया है कि Ca2+ फ्लक्स को छोटे अणु कैल्शियम-संवेदनशील रंजक नामक विशिष्ट रसायनों द्वारा मापा जा सकता है जिनका उपयोग पुन: प्रोग्राम किए गए कोशिकाओं के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है19। हालांकि, इस तरह की विधि की कई सीमाएं हैं: कोशिकाओं को पेश किए गए रसायन में संभावित विषाक्तता हो सकती है और सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकती है, जिससे परिणाम यहां प्रस्तुत विधि के साथ प्राप्त किए गए लोगों की तुलना में कम विश्वसनीय हो सकते हैं। इसके अलावा, धुंधला प्रक्रिया जटिल और समय लेने वाली है, जबकि उन कोशिकाओं के आगे के मूल्यांकन को भी रोकती है। दूसरी ओर, यहां प्रस्तुत विधि उन सीमाओं को दूर करती है। GCaMP3 कोशिकाओं के लिए गैर-आक्रामक है, जो सेल गतिविधियों पर प्रभावों को कम करता है और कोशिकाओं के आगे के मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। चूंकि iCMs की प्रतिदीप्ति केवल उनकी पहचान पर निर्भर करती है, यानी, Myh6 अभिव्यक्ति और स्थानीय Ca2 + एकाग्रता परिवर्तन, कोशिकाओं का Ca2 + फ्लक्स प्रतिदीप्ति तब तक दिखाई देता है जब तक NCFs को फिर से प्रोग्राम किया जाता है, जो समय लेने वाली रणनीति के बिना reprogramming प्रक्रिया की लगातार निगरानी को सक्षम बनाता है। जबकि Ca2 + फ्लक्स की निगरानी की जा सकती है और एक उलटा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत आसानी से दर्ज किया जा सकता है, सेल झिल्ली में बार-बार पिटाई और संबंधित इलेक्ट्रॉनिक गतिविधि, यानी, Ca2 + फ्लक्स, को अस्थायी रूप से परिमाणित किया जा सकता है20। जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, इस तरह के परिमाणीकरण आईसीएम की परिपक्वता के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं और कार्डियक रीप्रोग्रामिंग के दौरान Ca2 + फ्लक्स परिवर्तन की अधिक विस्तृत संरचनाओं को चित्रित कर सकते हैं।

इस विधि के कई फायदे हैं। सबसे पहले, Ca2 + फ्लक्स विशेष रूप से iCMs में मनाया जाता है। क्योंकि Myh6 सीएम के लिए बहुत विशिष्ट है, लेकिन CFs नहीं, केवल सफलतापूर्वक reprogrammed कोशिकाओं GCaMP3 रिपोर्टर व्यक्त करेंगे और फ्लोरोसेंट बन जाएगा। दूसरा, Ca2+ फ्लक्स सीएम-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की निगरानी की विधि के अलावा iCM की कार्यात्मक परिपक्वता का मूल्यांकन करने का एक तरीका प्रदान करता है। अपेक्षाकृत लंबी प्रयोगात्मक प्रक्रिया और इससे जुड़ी भिन्नता के कारण, आईसीएम का कार्य हमेशा आगे के अध्ययन और संभावित नैदानिक उपयोग के लिए स्वीकार्य नहीं होता है। जबकि सीएम-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति केवल रीप्रोग्राम्ड सेल की विशेषताओं का एक हिस्सा बताती है, Ca2 + फ्लक्स रीप्रोग्राम्ड सेल की गुणवत्ता और दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए कार्डियक रीप्रोग्रामिंग क्षेत्र का एक और पहलू प्रदान करता है। इसके अलावा, कार्यात्मक परिपक्वता हृदय समारोह से अधिक संबंधित है, जो दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक बेहतर संकेतक हो सकता है। इस क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधियों में फ्लो साइटोमेट्री शामिल है, एक ऐसी तकनीक जो सभी सेल समूहों के ट्रिप्सिन पाचन की आवश्यकता होती है। जबकि पाचन सेल कार्यों और विशेषताओं को प्रभावित कर सकता है, यह सिस्टम में भिन्नता का परिचय देता है, जो देखे गए परिणामों को पुन: पेश करने की क्षमता को कम करता है और उन कोशिकाओं का आगे मूल्यांकन करता है। उन तरीकों की तुलना में, यहां दिखाए गए ट्रांसजेनिक माउस तनाव ने मूल्यांकन के लिए आवश्यक रसायनों या प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं से संभावित प्रभाव को सीमित कर दिया है। उन फायदों के साथ, यह माउस तनाव कार्डियक रीप्रोग्रामिंग के लिए आवश्यक मूल्यांकन प्रक्रियाओं को सरल बनाता है और इस क्षेत्र में परिणामों की पुनरुत्पादकता को बढ़ाता है।

हालांकि, इस अध्ययन की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, माउस तनाव स्थापना समय लेने वाली है। इस क्षेत्र में सहकर्मियों से माउस तनाव की पूछताछ का स्वागत तनाव स्थापना के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए किया जाता है। दूसरा, इस प्रोटोकॉल के साथ आईसीएम के लिए कार्डियक रीप्रोग्रामिंग में कई कारक और चरण शामिल हैं, जो सिस्टम में अपेक्षाकृत उच्च भिन्नता पेश करते हैं। इस क्षेत्र में प्रवीणता इस मुद्दे को दूर करने में मदद करेगी। अंत में, क्योंकि GCaMP3 केवल Ca2 + फ्लक्स स्थिति के तहत फ्लोरोसेंट हो जाता है, वर्तमान मूल्यांकन विधि का उपयोग सीधे FACS के लिए Myh6-GFP strain7 के साथ कार्डियक रीप्रोग्रामिंग के रूप में नहीं किया जा सकता है। हालांकि, जबकि वर्तमान तनाव में Myh6-GFP तनाव की तुलना में अधिक और अलग-अलग अनुप्रयोग हैं, इस तरह की असुविधा को दूर किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, जैसा कि प्रोटोकॉल ने ऊपर वर्णित किया है, Myh6-Cre/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 माउस तनाव और iCm परिपक्वता के मूल्यांकन के बाद कार्डियक reprogramming की पूरी प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं। इस GCaMP3-मध्यस्थता Ca2 + फ्लक्स मापने की रणनीति सेल व्यवहार्यता को नुकसान पहुंचाए बिना लाइव कोशिकाओं में किया जा सकता है। क्योंकि GCaMP3 प्रतिदीप्ति मायोकार्डियल-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति द्वारा संचालित है, अधिग्रहित GCaMP3 फ्लोरोसेंट डेटा को फिर से प्रोग्रामिंग दक्षता और iCMs गतिविधि को प्रकट करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि के अंग्रेजी पाठ के संपादन में लियो Gnatovskiy के प्रयासों की सराहना करते हैं। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था। इस अध्ययन को संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (1R01HL109054) द्वारा डॉ वांग को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates Alkali Scientific TP9006
A83-01 Stemgent 04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X800E Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder Thermo Fisher Scientific BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-049-101 Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2 Thermo Fisher Scientific NC9693955
Counting Chamber Thermo Fisher Scientific 02-671-51B Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine Thermo Fisher Scientific 11960069
DPBS, calcium, magnesium Thermo Fisher Scientific 14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%) Thermo Fisher Scientific 04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) Thermo Fisher Scientific E478-500
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14025092
IMDM media Thermo Fisher Scientific 12440053
IX73 Inverted Microscope Olympus IX73P2F Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11-668-019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Medium 199, Earle's Salts Thermo Fisher Scientific 11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore Sigma SLHV033RB
MM589 Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31-985-070
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line Cell Biolabs RV-101
pMx-puro-MGT Addgene 111809
Poly(ethylene glycol) Millipore Sigma P5413-1KG PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G
PTC-209 Sigma SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride Thermo Fisher Scientific A1113803
Recombinant Human IGF-I Peprotech 100-11
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093
ST 16 Centrifuge Series Thermo Fisher Scientific 75-004-381
Sterile Cell Strainers Thermo Fisher Scientific 22-363-547 40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes Thermo Fisher Scientific FB012921
TE Buffer Thermo Fisher Scientific 12090015
Trypan Blue solution Millipore Sigma T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25300054
Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 02215365

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References

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एक GCaMP3 रिपोर्टर के साथ कार्डियक विशिष्ट कैल्शियम फ्लक्स को मापने के द्वारा कार्डियक Reprogramming के इन विट्रो मूल्यांकन
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Li, Z., Liu, L., Wang, Z. In vitro… More

Li, Z., Liu, L., Wang, Z. In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter. J. Vis. Exp. (180), e62643, doi:10.3791/62643 (2022).

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