Summary
We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux mogelijk is.
Abstract
Hartherprogrammering is een potentieel veelbelovende therapie geworden om een beschadigd hart te herstellen. Door meerdere transcriptiefactoren te introduceren, waaronder Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kunnen fibroblasten worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's). Deze iCM's, wanneer ze in situ worden gegenereerd in een infarcthart, integreren elektrisch en mechanisch met het omringende myocardium, wat leidt tot een vermindering van de littekengrootte en een verbetering van de hartfunctie. Vanwege de relatief lage herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit van de iCM's blijft de karakterisering van iCM's een uitdaging. De momenteel gebruikte methoden op dit gebied, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR, richten zich voornamelijk op hartspecifieke gen- en eiwitexpressie, maar niet op de functionele rijping van iCM's. Getriggerd door actiepotentialen, leidt het openen van spanningsafhankelijke calciumkanalen in cardiomyocyten tot een snelle instroom van calcium in de cel. Daarom is het kwantificeren van de snelheid van calciuminstroom een veelbelovende methode om de cardiomyocytenfunctie te evalueren. Hier introduceert het protocol een methode om de iCM-functie te evalueren door calcium (Ca2 +) flux. Een αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam werd vastgesteld door Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (hierna Myh6-Cre genoemd) te kruisen met Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (hierna Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genoemd) muizen. Neonatale cardiale fibroblasten (NCF's) van P0-P2 neonatale muizen werden geïsoleerd en in vitro gekweekt, en een polycistronische constructie van MGT werd geïntroduceerd bij NPF's, wat leidde tot hun herprogrammering naar iCM's. Omdat alleen succesvol geherprogrammeerde iCM's de GCaMP3-reporter tot expressie brengen, kan de functionele rijping van iCM's visueel worden beoordeeld door Ca2 + flux met fluorescentiemicroscopie. Vergeleken met niet-geherprogrammeerde NKK's vertoonden NCF-iCM's een significante calciumtransiënte flux en spontane contractie, vergelijkbaar met CM's. Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van muizenstam, isolatie en selectie van neonatale muizenharten, NCF-isolatie, productie van retrovirus voor cardiale herprogrammering, iCM-inductie, de evaluatie van iCM Ca2 + flux met behulp van onze reporterlijn en gerelateerde statistische analyse en gegevenspresentatie. Verwacht wordt dat de hier beschreven methoden een waardevol platform zullen bieden om de functionele rijping van iCM's voor cardiale herprogrammeringsstudies te beoordelen.
Introduction
Myocardinfarct (MI) is wereldwijd een ernstige ziekte. Hart- en vaatziekten (CVD's) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en zijn goed voor ongeveer 18,6 miljoen sterfgevallen in 20191,2. De totale sterfte van CVD's is de afgelopen halve eeuw afgenomen. Deze trend is echter vertraagd of zelfs gekeerd in sommige onontwikkelde landen1, wat vraagt om effectievere behandelingen van HVZ. Als een van de fatale manifestaties van HVZ is MI goed voor ongeveer de helft van alle sterfgevallen die worden toegeschreven aan HVZ in de Verenigde Staten2. Tijdens de ischemie, met de blokkering van kransslagaders en beperkte toevoer van zowel voedingsstoffen als zuurstof, lijdt het myocardium aan ernstige metabole veranderingen, schaadt het de systolische functie van cardiomyocyten (CMs) en leidt het tot CM-dood3. Talrijke benaderingen in cardiovasculair onderzoek zijn onderzocht om hartletsel te herstellen en de functie van het gewonde hart te herstellen4. Directe hartherprogrammering is naar voren gekomen als een veelbelovende strategie om het beschadigde hart te herstellen en de functie ervan te herstellen5,6. Door de introductie van Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) kunnen fibroblasten in vitro en in vivo worden geherprogrammeerd naar iCM's, en die iCM's kunnen het littekengebied verminderen en de hartfunctie verbeteren7,8.
Hoewel hartherprogrammering een veelbelovende strategie is voor MI-behandeling, blijven er een aantal uitdagingen. Ten eerste zijn de herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit niet altijd zo hoog als verwacht. MGT-inducering kan slechts 8,4% (cTnT+) of 24,7% (αMHC-GFP+) van de totale CF's bereiken die in vitro naar iCM's moeten worden geherprogrammeerd7, of tot 35% in vivo8, wat de toepassing ervan beperkt. Zelfs met meer factoren geïnduceerd in het systeem, zoals Hand29 of Akt1 / PKB10, is de herprogrammeringsefficiëntie nog steeds nauwelijks bevredigend om in een klinische omgeving te worden gebruikt. Daarom zijn er meer studies nodig die gericht zijn op het verbeteren van de herprogrammeringsefficiëntie op dit gebied. Ten tweede zijn de elektrische integriteit en contractiekenmerken van iCM's belangrijk voor de efficiënte verbetering van de hartfunctie, maar deze zijn een uitdaging om te evalueren. Momenteel zijn veelgebruikte evaluatiemethoden in het veld, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR van enkele belangrijke CMs-genenexpressie, allemaal gericht op de gelijkenis van iCM's en CMs, maar niet direct gerelateerd aan de functionele kenmerken van iCM's. Bovendien hebben die methoden relatief ingewikkelde procedures en zijn ze tijdrovend. Terwijl herprogrammeringsstudies meestal een screening van potentiële herprogrammeringsfactoren omvatten die de rijping van iCM's bevorderen11, vereist cardiale herprogrammering een snelle en handige methode op basis van de iCM-functie.
CMs openen de spanningsafhankelijke calciumionkanalen op het cytomembraan tijdens elke contracteringscyclus, wat leidt tot een voorbijgaande instroom van calciumion (Ca2 +) van de intercellulaire vloeistof naar het cytoplasma om deel te nemen aan de myofilamentcontractie. Zo'n Ca2+ instroom- en outfluxcyclus is de fundamentele eigenschap van myocardiale contractie en vormt de normale functie van CMs12. Een methode die Ca2+ instroom detecteert, zou dus een mogelijke manier kunnen zijn om de functie van CM's en CM-achtige cellen, waaronder iCM's, te meten. Bovendien biedt een dergelijke methode voor iCM's een andere manier om de efficiëntie van herprogrammering te evalueren.
Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) zijn ontwikkeld en op grote schaal gebruikt om celactiviteiten aan te geven, met name actiepotentialen. Over het algemeen bestaan GECI's uit een Ca2 + bindend domein zoals calmodulin en een fluorescerend domein zoals GFP, en GCaMP3 is er een met een hoge affiniteit en fluorescentie-intensiteit. Het fluorescentiedomein van GCaMP3 wordt geactiveerd wanneer de lokale calciumconcentratie wordt gewijzigd13. In dit artikel wordt een muizenstam beschreven die specifiek een GCaMP3-verslaggever in Myh6+ cellen tot expressie brengt. Door MGT te introduceren in de geïsoleerde NCF's van pasgeborenen van deze stam, kan de herprogrammering worden gevolgd door fluorescentie, die met succes geherprogrammeerde iCM's zal vertonen. Zo'n muizenstam en -methode zal een waardevol platform bieden om cardiale herprogrammering te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures en praktijken met dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care & Use Committee van de Universiteit van Michigan. Alle experimentele procedures en praktijken met celkweek moeten worden uitgevoerd BSL2 Biologische Veiligheidskast onder steriele omstandigheden. Voor de procedures en praktijken met betrekking tot virussen werd de richtlijn van de juiste verwijdering van getransfecteerde cellen, pipetpunten en buizen gevolgd om het risico van milieu- en gezondheidsrisico's te voorkomen.
1. Vaststelling van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (aangeduid als Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muizenstam (Figuur 1)
- Bereid Tg(Myh6-cre)1Jmk/J muizenstam (Jackson lab stock 009074, aangeduid als Myh6-Cre) en Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J muizenstam (Jackson lab stock 014538, aangeduid als Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), respectievelijk voor.
- Fok elke soort tot 8 weken oud om respectievelijk volwassen Myh6-Cre- en Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-muizen te verkrijgen.
- Kruiste de volwassen Myh6-Cre en de Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizen.
OPMERKING: Stel Myh6-Cre male / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 female in of vice versa. Er is geen significant verschil tussen hun nakomelingen. Meestal zullen de vrouwelijke muizen 19-21 dagen na de kruising 8-10 pups baren.
2. Isolatie en selectie van neonatale Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenharten.
- Verkrijg P0-P2 pups. Zorg ervoor dat er 8-10 pups aanwezig zijn om 10 miljoen NFC's met dit protocol te isoleren.
- Diep verdoofd de pups door onderkoeling. Plaats de pups in een latex handschoen en dompel ze tot aan de nek onder in gemalen ijs en water (2°C - 3°C).
- Ontsmet de pups kort met 75% ethanol.
- Offer de pups door onthoofding met een steriele schaar.
- Maak een horizontale incisie in de buurt van het hart, knijp in het hart en isoleer het vervolgens door het te scheiden aan de wortel van de aorta met een schaar.
- Observeer het kloppen van het hart onder een fluorescentiemicroscoop. Zorg ervoor dat de harten met Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotype Ca2+ flux aangegeven door GCaMP3 met kloppend hart vertoont. De andere genotypen vertonen geen fluorescentie (figuur 2, video 1 en video 2).
3. Isolatie van neonatale cardiale fibroblasten (NFF's)
OPMERKING: Voor dit deel werd het protocol van Dr. Li Qian's Lab14 overgenomen met kleine optimalisaties indien van toepassing op deze studie.
- Na isolatie van de αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 harten, snijdt u ze in vier stukken die losjes met elkaar verbonden zijn. Was ze in ijskoude DPBS in een plaat van 6 cm meerdere keren grondig om de bloedcelvervuiling in de geïsoleerde cellen te beperken.
- Breng de harten over naar een conische buis van 15 ml.
- Verteer de harten met 8 ml warme 0,25% Trypsine-EDTA bij 37 °C gedurende 10 minuten.
- Gooi het trypsine supernatant weg en voeg 5 ml warm type-II collagenase (0,5 mg/ml) toe aan HBSS.
- Vortex het mengsel grondig en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min.
- Vortex na de incubatie grondig en laat het onverteerde weefsel door de zwaartekracht bezinken.
- Verzamel het supernatant in een conische buis van 15 ml met 5 ml koud fibroblast (FB) medium (IMDM met 20% FBS en 1% penicilline / streptomycine).
- Herhaal stap 3,4-3,7 voor het onverteerde weefsel 4-5 keer.
- Verzamel alle supernatant bij elkaar en filter het supernatant met een zeef van 40 μm.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de cellen in 10 ml magnetisch geactiveerde celsorteerbuffer (MACS-buffer; 1x PBS met 2 mM EDTA en 0,5% BSA).
- Bepaal het levensvatbare celnummer door trypan blauwe kleuring.
- Neem 10 μL cellen uit 10 ml celsuspensie in stap 3.11.
- Meng met 10 μL 0,4% trypan blauwe oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het mengsel toe aan een hemocytometer en bepaal het levensvatbare celnummer. De dode cellen zijn blauw gekleurd, terwijl de levensvatbare cellen onbevlekt zijn.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 200 x g en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de cellen met 10 μL Thy1.2 microbeads in 90 μL gekoelde MACS-buffer voor minder dan 10 miljoen levensvatbare cellen. Voeg proportioneel meer kralen toe als er meer dan 10 miljoen levensvatbare cellen zijn. Pipetteer het mengsel goed en incubeer bij 4 °C gedurende 30-60 min.
- Voeg 10 ml MACS-buffer toe en meng goed.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg.
- Herhaal stap 3.15-3.16 eenmaal.
- Resuspend de cellen en kralen met 2 ml MACS-buffer.
- Plaats een MACS-separator in de kap. Plaats een LS-kolom in het scheidingsteken en breng de kolom in evenwicht met 3 ml MACS-buffer.
- Wanneer de LS-kolom in evenwicht is, voert u de cellen door de kolom.
- Was de LS-kolom driemaal met 2 ml MACS-buffer.
- Haal de kolom van de separator, eluteer deze drie keer met 2 ml MACS-buffer en verzamel vervolgens de elutie in een buis van 50 ml.
- Centrifugeer 5 minuten bij 200 x g en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de cellen met 5 ml FB-media.
- Bepaal het celgetal met een hemocytometer.
- Verdun de cellen met FB-media en zaai de cellen naar wens naar schotels of borden. Zorg ervoor dat de celzaaidichtheid ongeveer 2-2,5 x 104 cellen / cm2 is (optimaliseer de dichtheid op basis van individuele experimenten). Zorg ervoor dat de aangehechte fibroblasten op de tweede dag na het zaaien een ovale tot ronde vorm hebben (figuur 3).
4. Productie van retroviruscodering polycistronische MGT-vector voor hartherprogrammering
- Houd Plat-E met Plat-E kweekmedia (DMEM aangevuld met 10% FBS, 1 μg/ml puromycine en 10 μg/ml blasticidin) bij 37 °C met 5% CO2.
- Splits Plat-E op dag 1 tot een 6-well plaat met ongeveer 4-5 x 105 cellen/putdichtheid.
- Op dag 2 bereikt Plat-E meestal 80% confluentie. Transfecteer de cellen met de volgende procedures. Pas het volume en de hoeveelheid van elk element dat hier aanwezig is aan op basis van elke put in een 6-well plaat.
- Verdun 2 μg pMX-puro-MGT polycistronische retrovirusexpressie plasmide vector (Addgene 111809) tot 500 ng/μL met TE buffer.
- Bereid het transfectiemengsel door 10 μL Lipofectamine te mengen met 150 μL gereduceerd serummedium. Pipetteer voorzichtig om goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Wees voorzichtig om bubbels te vermijden bij het pipetteren.
- Bereid ondertussen een plasmidemengsel door het plasmide te mengen met 150 μL gereduceerd serummedium. Pipetteer voorzichtig om goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Wees voorzichtig om bubbels te vermijden bij het pipetteren.
- Meng de twee mengsels voorzichtig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. De oplossing kan troebel lijken.
- Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan de te transfecteren cellen.
- Incubeer de cellen bij 37 °C 's nachts.
- Verander op dag 3 het medium in een vers volledig celkweekmedium zonder puromycine en blasticidin.
- Verzamel op dag 4, 48 uur na de transfectie, het supernatant dat retrovirus bevat en bewaar het in 4 °C.
- Verzamel op dag 5, 72 uur na de transfectie, het supernatant dat retrovirus bevat.
- Filtreer zowel het 48 h als 72 h supernatant met een filter van 0,45 μm, sla 's nachts neer bij 4 °C door 1/5 volume 40% Poly (ethyleenglycol) (PEG) oplossing toe te voegen om een eindconcentratie van 8% PEG te maken.
- Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 30 minuten om het virus neer te slaan.
OPMERKING: PEG8000-virus vormt kleine witte neerslag. - Resuspend het virus met iCM-medium dat naar wens 8 μg/ml polybreen bevat. Gebruik het retrovirus onmiddellijk.
5. NNF's herprogrammeren naar iCM's met MGT-codering van retrovirusinfectie
- Groei of passeer NCF's vóór virusinfectie.
OPMERKING: Meestal kan NCF twee keer worden gepasseerd. - Op dag 0, zaad NCF tot de dichtheid rond 1-2 x 104 cellen / cm2 in FB medium.
- Vervang op dag 1 het kweekmedium door een virusbevattend medium voor elke put zoals gewenst. Gebruik het virus van één put Plat-E in een 6-putplaat om twee putten in een 24-putplaat te infecteren. Titer het virus om de optimale virusconcentratie te bepalen.
OPMERKING: Virussen die andere herprogrammeringsfactoren van belang bevatten, kunnen samen met MGT retrovirus worden geïntroduceerd. - Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Vervang op dag 2, 24 uur na de virusinfectie, het virusbevattende medium door een regulier iCM-medium.
- Om de GCaMP3-expressie te controleren, plaatst u deze onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Observeer onder 10x bij het GFP-kanaal de milde basale GCaMP3-fluorescentie van een deel van de cellen al op dag 5.
- Vervang het medium om de 2-3 dagen tijdens de herprogrammering. Voer indien nodig een positieve selectie uit voor mgt-retrovirus geïnfecteerde cellen door gedurende 3 dagen 2 μg / ml puromycine aan het kweekmedium toe te voegen en het op 1 μg / ml te houden.
OPMERKING: Introduceer interessante chemicaliën (bijv. IGF-1, MM589, A83-01 en PTC-209, aangeduid als IMAP zoals we eerder meldden15) samen met gemiddelde verandering. - Vervang na 14 dagen infectie het medium door B27-medium om iCM-rijping verder te induceren.
6. Evaluatie van de functionele rijping en herprogrammeringsefficiëntie van iCM door Ca2+ flux
OPMERKING: Voeg indien nodig 1 μM isoproterenol toe aan de te evalueren cellen vóór de beoordeling.
- Beoordeel de Ca2+ flux met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij kamertemperatuur.
- Observeer in het GFP-kanaal de GCaMP3 + -cellen onder het 10x-objectief. Zorg ervoor dat het spontane celklopperij in het heldere veldkanaal laat zien.
- Selecteer willekeurig drie velden onder de 20x en noteer de Ca2+ flux van de iCM's gedurende 3 minuten voor elk veld.
OPMERKING: Hier werd de Ca2+ flux gesynchroniseerd met spontane celslagen (Figuur 4, Figuur 5, en Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8). - Kwantificeer de cellen handmatig met Ca2+ flux.
7. Statistische analyse en presentatie van gegevens
- Analyseer de verschillen tussen groepen one-way analysis of variance (ANOVA) en voer de Student-Newman-Keuls meerdere vergelijkingstests uit.
OPMERKING: De resultaten worden als gemiddelde ± S.E met p < 0,05 als statistisch significant beschouwd. Elk experiment werd minstens drie keer uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentele workflow voor het genereren van Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam en de genstructuur van de transgene muizen is weergegeven in figuur 1. Terwijl de muizenstam is vastgesteld, werden de harten van de pups geïsoleerd en waargenomen onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om het genotype te bevestigen. Harten met correct genotype tonen Ca2+ flux gesynchroniseerd met kloppen, gevisualiseerd als GCaMP3 fluorescentie, terwijl er geen fluorescentie werd waargenomen in controleharten (Figuur 2, Video 1 en Video 2). Geïsoleerde NCP's hechten zich binnen 2 uur aan de put en vertonen 1 dag na het zaaien een ovale tot ronde vorm (figuur 3). De functionele volwassenheid en de herprogrammeringsefficiëntie van iCM's werden 14 dagen na mgt-introductie geëvalueerd door Ca2+ flux. De geherprogrammeerde cellen kunnen worden beoordeeld onder een fluorescentiemicroscoop om de Ca2+ flux te meten. GCaMP3+ cellen kunnen worden gevonden in zowel IMAP- als MGT-groepen, terwijl de IMAP-groep aanzienlijk meer GCaMP3+ cellen en cellen toont met Ca2+ oscillatiepatronen dichter bij normale CM's (Video's 3-8). Zoals weergegeven in figuur 4A, zal een representatieve cel in de IMAP-groep met Ca2+ oscillatie GCaMP3 fluorescentieverandering vertonen tussen het maximum (middelste paneel) en het minimum (rechterpaneel), en de Ca2+ oscillatie van dergelijke cellen wordt periodiek gewijzigd (Figuur 4B). Na de introductie van IMAP was het aantal kloppende clusters significant hoger dan dat in de controlegroep, omdat het aantal GCaMP3+ cellen met Ca2+ flux per high-power field (HPF, 20x objectieflens) was toegenomen in de IMAP-medium-behandelde groep (figuur 5).
Figuur 1: Het genereren van Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muis strain. Illustratie van Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstamgeneratie en de genstructuur van de transgene muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ca2+ flux van het kloppend hart. GCaMP3-fluorescentie werd gesynchroniseerd met hartkloppingen in Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-harten (bovenste paneel), terwijl er geen fluorescentie werd waargenomen in controleharten (onderste paneel). Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Geïsoleerde NCP's bevestigd aan een 6-putplaat. (A) NKK's onder laagvermogensveld (LPF, 10x objectief, schaalbalk = 100 μm). (B) NCF's onder hoogvermogensveld (20x objectief, schaalbalk = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Ca2+ flux van geherprogrammeerde cellen. (A) IMAP-behandelde NCF's geherprogrammeerd naar iCM's onder GFP-kanaal bij hoogvermogensveld (20x objectief). Ca2+ flux van iCM's werd gevisualiseerd als GCaMP3 fluorescentie, waarbij cellen met Ca2+ flux herhaaldelijk flitsen vertonen tussen basisfluorescentie (Ca2+ min, middenpaneel) en heldere fluorescentie (Ca2+ max, rechterpaneel) gesynchroniseerd met kloppen. (B) Ca2+ -traceringscurve van Ca2+- oscillatie+-cellen in de IMAP-groep. Schaalbalk = 50 μm. F/F0: relatieve fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Figuur 5: Evaluatie van Ca2+ flux onder IMAP medium. Aantal GCaMP3+ cellen met Ca2+ flux per HPF 2, 3, 4 weken na MGT inductie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Een kloppend hart geïsoleerd van pups met αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotype onder scannen objectieve lens (4x objectief) in het GFP-kanaal. Het hart is GCaMP3+ en knippert tussen basisfluorescentie (Ca2+ min) en heldere fluorescentie (Ca2+ max) gesynchroniseerd met kloppen. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Een kloppend hart geïsoleerd van pups met controlegenotype onder scannende objectieve lens in het GFP-kanaal. Het hart is GCaMP3- en vertoont geen fluorescentieflitsen gesynchroniseerd met kloppen. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: iCM's in IMAP-groep onder LPF in het bright field (BF)-kanaal. Een cel met een aanzienlijk pak slaag in het midden van het veld is te zien. Zowel Video 3 als Video 4 richten zich op hetzelfde veld. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 4: iCM's in IMAP-groep onder LPF in het GFP-kanaal. Meerdere cellen met knipperende fluorescentie, waaronder de kloppende cel in het BF-kanaal, kunnen worden waargenomen. Zowel Video 3 als Video 4 richten zich op hetzelfde veld. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 5: iCM's in IMAP-groep onder HPF in het BF-kanaal. Het centrum van het veld van Video 3 en Video 4 werd waargenomen onder HPF. Een cel met een aanzienlijk pak slaag in het midden van het veld kan worden waargenomen. Zowel Video 5 als Video 6 richten zich op hetzelfde veld. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 6: iCM's in IMAP-groep onder HPF in het GFP-kanaal. Het centrale deel van het veld van Video 3 en Video 4 werd waargenomen onder HPF. Meerdere cellen met knipperende fluorescentie, waaronder de kloppende cel in het BF-kanaal, kunnen worden waargenomen. Zowel Video 5 als Video 6 richten zich op hetzelfde veld. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 7: iCM's in MGT-groep onder HPF in het BF-kanaal. In tegenstelling tot significante kloppende cellen waargenomen in de IMAP-groep, zijn er een paar kloppende cellen onder het BF-kanaal in de MGT-groep, die een lagere herprogrammeringsefficiëntie heeft. Zowel Video 7 als Video 8 richten zich op hetzelfde veld. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 8: iCM's in de MGT-groep onder HPF in het GFP-kanaal. Verschillende cellen met milde knipperende fluorescentie kunnen worden waargenomen. Zowel Video 7 als Video 8 richten zich op hetzelfde veld. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het evalueren van de iCM-functie is noodzakelijk voor het cardiale herprogrammeringsveld. In dit manuscript beschrijft het protocol een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J muizenstam die is vastgesteld, hoe de NPF's geïsoleerd uit de neonatale muizen in deze stam te gebruiken voor de herprogrammering naar iCM's, en de evaluatie van de iCM-functie door Ca2+ flux. Dit is een de novo methode om de functionele rijping van iCM's te evalueren.
Verschillende kritische stappen zijn belangrijk voor het succesvol herprogrammeren en evalueren met deze methode. Ten eerste moeten NCP's vers worden bereid en gezond zijn na isolatie. Een snelle procedure van hartisolatie en snijden is essentieel. Het belangrijkste is dat het cruciaal is om de incubatietijd te volgen om oververtering en vermindering van de levensvatbaarheid en conditie van de cel te voorkomen. Ten tweede, van alle procedures, introduceert de efficiëntie van virusinfecties vaak een grote variatie in de resultaten. De efficiëntie van virusinfecties wordt sterk beïnvloed door twee factoren. Aan de ene kant moet de virustiter constant zijn tussen verschillende pogingen, wat consistentie vereist in de hoeveelheid getransfecteerde plasmiden en een vergelijkbare Plat-E-celconditie en -dichtheid. Onderzoekers die dit protocol volgen, moeten de optimale zaaidichtheid en tijd vóór die procedures evalueren. Het virus moet onmiddellijk worden gebruikt om te voorkomen dat de titer wordt verzwakt als gevolg van virusgevoeligheid voor vries-dooicycli. Bovendien is het belangrijk om NCF's in een gezonde conditie en geschikte dichtheid te houden op het moment van infectie. Onderzoekers moeten bekend zijn met de groeikenmerken van NPF's. Hoewel de variatie in de herprogrammeringsefficiëntie beperkt moet zijn, kan frequente monitoring nuttig zijn. Dit protocol kan eenvoudig worden gewijzigd om NCF's te co-infecteren met verschillende virussen of ze te behandelen met chemicaliën van belang. Het is dus toepasbaar als een universele methode voor cardiaal herprogrammeringsonderzoek. Naast de punten die hier worden genoemd, zijn veelvoorkomende problemen met deze methode lage fluorescentie waargenomen na de herprogrammering. Dit kan verschillende redenen hebben. Ten eerste is de infectie mogelijk niet zo effectief als gewenst, wat leidt tot een lage herprogrammeringsefficiëntie en het aantal iCM's beperkt. Ten tweede moet de blootstellingsconditie mogelijk optimaal worden aangepast voor de waarneming van GCaMP3-fluorescentie van iCM's. Het gebruik van neonatale cardiomyocyten geïsoleerd uit dezelfde pups als positieve controle zal helpen om de mogelijke reden te identificeren.
Ca2+ flux is veel gebruikt om celactiviteiten te beoordelen, onder andere in neuroncellen16, borstklier17, vetweefsel18, enz. In deze studie werd Ca2+ flux gebruikt om de functionele rijping van iCM's te beoordelen. Eerder is gemeld dat Ca2 + flux kan worden gemeten door specifieke chemicaliën genaamd kleine molecuul calciumgevoelige kleurstoffen die kunnen worden gebruikt om de functie van geherprogrammeerde cellen te evalueren19. Een dergelijke methode heeft echter verschillende beperkingen: de chemische stof die in de cellen wordt geïntroduceerd, kan potentiële toxiciteit hebben en de cellulaire processen beïnvloeden, waardoor de resultaten minder betrouwbaar zijn dan die verkregen met de hier gepresenteerde methode. Bovendien is het kleuringsproces ingewikkeld en tijdrovend, terwijl het ook verdere evaluaties van die cellen voorkomt. De hier gepresenteerde methode overwint daarentegen die beperkingen. GCaMP3 is niet-invasief voor de cellen, wat de invloeden op celactiviteiten minimaliseert en verdere evaluatie van de cellen mogelijk maakt. Aangezien de fluorescentie van iCM's alleen afhangt van hun identiteit, d.w.z. Myh6-expressie en lokale Ca2 + -concentratieverandering, wordt de Ca2 + fluxfluorescentie van cellen zichtbaar zolang NDF's worden geherprogrammeerd, wat frequente monitoring van het herprogrammeringsproces mogelijk maakt zonder een tijdrovende strategie. Hoewel de Ca2+-flux eenvoudig kan worden bewaakt en geregistreerd onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop, kan het herhaalde kloppen en de gerelateerde elektronische activiteit over het celmembraan, d.w.z. Ca2+ flux, verder tijdelijk worden gekwantificeerd20. Zoals weergegeven in figuur 4B, kan een dergelijke kwantificering meer informatie opleveren over de volwassenheid van iCM's en meer gedetailleerde structuren van Ca2+ fluxverandering tijdens cardiale herprogrammering illustreren.
Deze methode heeft verschillende voordelen. Ten eerste wordt de Ca2+ flux uitsluitend waargenomen in iCM's. Omdat Myh6 zeer specifiek is voor CM's, maar niet voor CF's, zullen alleen de succesvol geherprogrammeerde cellen de GCaMP3-reporter tot expressie brengen en fluorescerend worden. Ten tweede biedt Ca2+ flux een manier om de functionele rijping van iCM's te evalueren naast de methode om de expressie van CM-specifieke genen te monitoren. Vanwege de relatief lange experimentele procedure en variatie die hieraan verbonden is, is de functie van iCM's niet altijd acceptabel voor verder onderzoek en mogelijk klinisch gebruik. Terwijl de CM-specifieke genexpressie slechts een deel van de kenmerken van de geherprogrammeerde cel onthult, biedt Ca2 + flux een ander aspect van het cardiale herprogrammeringsveld om de geherprogrammeerde celkwaliteit en efficiëntie te evalueren. Bovendien is functionele rijping meer gerelateerd aan de hartfunctie, wat een betere indicator kan zijn om de efficiëntie te evalueren. Veel gebruikte methoden op dit gebied omvatten flowcytometrie, een techniek die trypsinevertering van alle celgroepen vereist. Hoewel de spijsvertering de celfuncties en -kenmerken kan beïnvloeden, introduceert het variatie in het systeem, waardoor het potentieel om de waargenomen resultaten te reproduceren en die cellen verder te evalueren, wordt verminderd. In vergelijking met die methoden heeft de hier getoonde transgene muizenstam de potentiële invloed van chemicaliën of experimentele procedures die nodig zijn voor de evaluatie beperkt. Met deze voordelen vereenvoudigt deze muizenstam de evaluatieprocedures die nodig zijn voor hartherprogrammering en verbetert de reproduceerbaarheid van resultaten op dit gebied.
Er zijn echter enkele beperkingen aan deze studie. Ten eerste is de vestiging van muizenstam tijdrovend. Vragen van collega's op dit gebied naar de muizenstam zijn welkom om de tijd die nodig is voor de staminstelling te verkorten. Ten tweede omvat de cardiale herprogrammering naar iCM's met dit protocol meerdere factoren en stappen, die relatief veel variatie in het systeem introduceren. Vaardigheid op dit gebied zal helpen om dit probleem te overwinnen. Ten slotte, omdat de GCaMP3 alleen fluorescerend wordt onder Ca2+ fluxconditie, kan de huidige evaluatiemethode niet direct worden gebruikt voor FACS als hartherprogrammering met Myh6-GFP-stam7. Hoewel de huidige stam meer en andere toepassingen heeft in vergelijking met de Myh6-GFP-stam, kan een dergelijk ongemak worden overwonnen.
Over het algemeen, zoals het protocol hierboven heeft beschreven, bieden de Myh6-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam en na evaluatie van iCM-rijping een strategie om het hele proces van cardiale herprogrammering te volgen. Deze GCaMP3-gemedieerde Ca2+ fluxmeetstrategie kan worden uitgevoerd in levende cellen zonder de levensvatbaarheid van cellen te schaden. Omdat GCaMP3-fluorescentie wordt aangedreven door myocardiale specifieke genexpressie, kunnen de verkregen GCaMP3-fluorescerende gegevens verder worden gekwantificeerd om de herprogrammeringsefficiëntie en iCM-activiteit te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We waarderen de inspanningen van Leo Gnatovskiy bij het redigeren van de Engelse tekst van dit manuscript. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) van de Verenigde Staten (1R01HL109054) subsidie aan Dr. Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
