Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הערכה במבחנה של תכנות לב מחדש על ידי מדידת שטף סידן ספציפי לב עם כתב GCaMP3

Published: February 22, 2022 doi: 10.3791/62643
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים כאן, את הקמתו ויישום של Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze / J (המכונה αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) קו כתב עכבר להערכת תכנות לב. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מבודדים מזן העכבר מומרים לקרדיומיוציטים מושרה (iCMs), ומאפשרים הערכה נוחה ויעילה של יעילות תכנות מחדש והתבגרות תפקודית של iCMs באמצעות שטף סידן (Ca2+).

Abstract

תכנות לב הפך לטיפול מבטיח פוטנציאלי לתיקון לב פגום. על ידי החדרת גורמי שעתוק מרובים, כולל Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), פיברובלסטים ניתן לתכנת מחדש לתוך cardiomyocytes המושרה (iCMs). iCMs אלה, כאשר נוצר במקום בלב אוטם, לשלב חשמלית ומכאנית עם שריר הלב שמסביב, מה שמוביל לירידה בגודל צלקת ושיפור בתפקוד הלב. בגלל היעילות, הטוהר והאיכות הנמוכים יחסית של iCMs, אפיון iCMs נותר אתגר. השיטות הנפוצות כיום בתחום זה, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוציטוכימיה ו- qPCR, מתמקדות בעיקר בביטוי גנים וחלבון ספציפיים לב, אך לא על ההתבגרות התפקודית של iCMs. מופעל על ידי פוטנציאל פעולה, פתיחת תעלות סידן מגודר מתח cardiomyocytes מוביל זרם מהיר של סידן לתוך התא. לכן, כימות קצב זרם הסידן היא שיטה מבטיחה להעריך את תפקוד הקרדיומיוציט. כאן, הפרוטוקול מציג שיטה להערכת תפקוד iCM על ידי שטף סידן (Ca2+). זן עכבר αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 הוקם על ידי חציית Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (המכונה Myh6-Cre להלן) עם G(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (המכונה Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) עכברים. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מעכברי יילודים P0-P2 היו מבודדים ותרבותיים במבחנה, ובנייה פוליציסטרונית של MGT הוצגה ל- NCFs, מה שהוביל לתכנות מחדש שלהם ל- iCMs. מכיוון שרק iCMs המתוכנתים מחדש בהצלחה יבטאו כתב GCaMP3, ההבשלה התפקודית של iCMs יכולה להיות מוערכת חזותית על ידי שטף Ca2+ עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בהשוואה ל- NCFs שלא תוכנתו מחדש, NCF-iCMs הראו שטף סידן ארעי משמעותי והתכווצות ספונטנית, בדומה ל- CMs. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הממסד זן העכבר, בידוד ובחירה של לבבות עכברים יילודים, בידוד NCF, ייצור של רטרווירוס לתכנות מחדש של הלב, אינדוקציה iCM, הערכה של iCM Ca2 + שטף באמצעות קו הכתב שלנו, וניתוח סטטיסטי קשור ומצגת נתונים. זה צפוי כי השיטות המתוארות כאן יספק פלטפורמה חשובה כדי להעריך את ההבשלה התפקודית של iCMs עבור מחקרים תכנות לב.

Introduction

אוטם שריר הלב (MI) היא מחלה קשה ברחבי העולם. מחלות לב וכלי דם (CVDs) הן הגורם המוביל למוות ברחבי העולם ומהווה כ-18.6 מיליון מקרי מוות בשנת 20191,2. התמותה הכוללת של תקליטורי CVD ירדה במהלך חצי המאה האחרונה. עם זאת, מגמה זו הואטה או אפילו התהפכה בכמה מדינות לא מפותחות1, מה שקורא לטיפולים יעילים יותר של תקליטורי CVD. כאחד הביטויים הקטלניים של CVD, MI מהווה כמחצית מכלל מקרי המוות המיוחסים תקליטורי CVD בארצות הברית2. במהלך האיסכמיה, עם חסימת עורקים כליליים ואספקה מוגבלת של חומרים מזינים וחמצן, שריר הלב סובל משינויים מטבוליים חמורים, פוגע בתפקוד הסיסטולי של קרדיומיוציטים (CMs), ומוביל למוות CM3. גישות רבות במחקר לב וכלי דם נחקרו כדי לתקן פגיעה בלב ולשחזר את תפקוד הלב הפגום4. תכנות לב ישיר התגלה כאסטרטגיה מבטיחה אחת לתיקון הלב הפגוע ולשיקום תפקודו5,6. על ידי הצגת Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), פיברובלסטים יכולים להיות מתוכנתים מחדש iCMs במבחנה ו in vivo, ו- iCMs אלה יכולים להפחית את אזור הצלקת ולשפר את תפקוד הלב7,8.

למרות תכנות לב מחדש היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול MI, נותרו מספר אתגרים. ראשית, יעילות התכנות מחדש, הטוהר והאיכות אינם תמיד גבוהים כצפוי. תמריץ MGT יכול להשיג רק 8.4% (cTnT+) או 24.7% (αMHC-GFP+) מסך ה- CFS שיש לתכנת מחדש ל- iCMs במבחנה7, או עד 35% ב- vivo8, מה שמגביל את היישום שלו. אפילו עם גורמים נוספים המושרים במערכת, כגון Hand29 או Akt1/PKB10, יעילות התכנות מחדש עדיין בקושי משביעת רצון לשימוש בסביבה קלינית. לכן, מחקרים נוספים התמקדו בשיפור יעילות התכנות מחדש נדרשים בתחום זה. שנית, שלמות חשמלית ומאפייני התכווצות של iCMs חשובים לשיפור יעיל של תפקוד הלב, אך אלה מאתגרים להערכה. נכון לעכשיו, שיטות הערכה נפוצות בתחום, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוציטוכימיה, ו- qPCR של כמה ביטוי גנים של CMs מפתח, מתמקדים כולם בדמיון של iCMs ו- CMs, אך אינם קשורים ישירות למאפיינים התפקודיים של iCMs. יתר על כן, שיטות אלה יש הליכים מסובכים יחסית והם גוזלים זמן רב. בעוד מחקרי תכנות מחדש בדרך כלל כרוכים הקרנה של גורמי תכנות פוטנציאליים המקדמים התבגרות iCMs11, תכנות לב מחדש קורא שיטה מהירה ונוחה המבוססת על פונקציית iCMs.

CMs לפתוח את תעלות יוני סידן מגודר מתח על cytomembrane במהלך כל מחזור התכווצות, מה שמוביל זרם חולף של יון סידן (Ca2+) מהנוזל הבין תאי כדי ציטופלסמה להשתתף התכווצות myofilament. כזה Ca2 + זרם מחזור outflux הוא התכונה הבסיסית של התכווצות שריר הלב ומהווה את הפונקציה הרגילה של CMs12. לכן, שיטה המזהה Ca2+ זרם יכול להיות דרך פוטנציאלית למדוד את הפונקציה של CMs ותאים דמויי CM, כולל iCMs. יתר על כן, עבור iCMs, שיטה כזו מספקת דרך נוספת להעריך את יעילות התכנות מחדש.

אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית (GECIs) פותחו בשימוש נרחב כדי להצביע על פעילות התא, במיוחד פוטנציאל פעולה. בדרך כלל, GECIs מורכבים מתחום מחייב Ca2+ כגון calmodulin, ותחום פלואורסצנטי כגון GFP, ו- GCaMP3 הוא תחום עם זיקה גבוהה ועוצמת פלואורסצנטיות. תחום הפלואורסצנטיות של GCaMP3 יופעל כאשר ריכוז הסידן המקומי ישתנה13. במאמר זה, זן עכבר המבטא באופן ספציפי כתב GCaMP3 בתאי Myh6 + מתואר. על ידי הצגת MGT ל- NCFs המבודדים מיילודים של זן זה, ניתן לתכנת מחדש על ידי פלואורסצנטיות, אשר iCMs מתוכנתים מחדש בהצלחה יציגו. זן ושיטה כאלה של העכבר יספקו פלטפורמה חשובה לחקור תכנות לב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים והמנהגים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. כל ההליכים הניסיוניים והשיטות הכרוכות בתרבית תאים חייבים להתבצע בקבינט הבטיחות הביולוגית BSL2 בתנאים סטריליים. עבור הנהלים והנהלים הכרוכים בווירוסים, בוצעה ההנחיה לסילוק נאות של תאים שהודבקו, טיפים לצינורות וצינורות כדי למנוע את הסיכון לסכנות סביבתיות ובריאותיות.

1. הקמת Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (המכונה Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) זן עכבר (איור 1)

  1. הכן Tg (Myh6-cre)1Jmk / J זן עכבר (מלאי מעבדת ג'קסון 009074, המכונה Myh6-Cre) ו GT (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze / J זן עכבר (מלאי מעבדת ג'קסון 014538, המכונה Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), בהתאמה.
  2. לגדל כל זן עד 8 שבועות כדי להשיג מבוגר Myh6-Cre ו Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 עכברים, בהתאמה.
  3. הכלאתי את עכברי Myh6-Cre הבוגרים ואת עכברי רוזה-פלוקס-סטופ-פלוקס-GCaMP3.
    הערה: להגדיר Myh6-Cre זכר / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 נקבה או להיפך. אין הבדל משמעותי בין צאצאיהם. בדרך כלל, העכברים הנקבות יולדו 8-10 גורים 19-21 ימים לאחר הכלאה.

2. בידוד ובחירה של לבבות עכברי Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.

  1. להשיג גורים P0-P2. ודא כי 8-10 גורים נוכחים כדי לבודד 10 מיליון NCFs עם פרוטוקול זה.
  2. מאוד מרדים את הגורים על ידי היפותרמיה. מניחים את הגורים בכפפת לטקס וטובלים עד הצוואר בקרח ומים כתושים (2°C - 3°C).
  3. לחטא בקצרה את הגורים עם 75% אתנול.
  4. להקריב את הגורים על ידי עריפת ראש עם מספריים סטריליים.
  5. לעשות נתק אופקי ליד הלב, לסחוט את הלב, ולאחר מכן לבודד אותו על ידי הפרדה בשורש של בריון עם מספריים.
  6. שימו לב שהלב פועם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ודא את הלבבות עם Myh6-Cre /Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 גנוטיפ מראה Ca2 + שטף המצוין על ידי GCaMP3 עם פעימות לב. הגנוטיפים האחרים אינם מראים פלואורסצנטיות (איור 2, וידאו 1 ווידאו 2).

3. בידוד של פיברובלסטים לב יילודים (NCFs)

הערה: עבור חלק זה, פרוטוקול ממעבדה של ד"ר לי צ'יאן 14 אומץ עם אופטימיזציות קלות כאשר ישים על מחקר זה.

  1. לאחר בידוד של αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, חותכים אותם לארבעה חלקים המחוברים באופן רופף. לשטוף אותם DPBS קר כקרח בצלחת 6 ס"מ ביסודיות מספר פעמים כדי להגביל את זיהום תאי הדם בתאים המבודדים.
  2. העבר את הלבבות לצינור חרוט 15 מ"ל.
  3. לעכל את הלבבות עם 8 מ"ל של חם 0.25% טריפסין-EDTA ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
  4. השלך את הלנסין supernatant ולהוסיף 5 מ"ל של קולגנאז חם מסוג II (0.5 מ"ג / מ"ל) ב- HBSS.
  5. מערבולת את התערובת ביסודיות, ודגרה ב 37 °C (5 דקות).
  6. לאחר הדגירה, מערבולת ביסודיות ולתת לרקמה הבלתי מעוכלת להתיישב על ידי כוח המשיכה.
  7. לאסוף את supernatant בצינור חרוטי 15 מ"ל עם 5 מ"ל פיברובלסט קר (FB) בינוני (IMDM עם 20% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין).
  8. חזור על שלבים 3.4-3.7 עבור הרקמה הלא מעוקל 4-5 פעמים.
  9. לאסוף את כל supernatant יחד ולסנן את supernatant עם מסננת 40 מיקרומטר.
  10. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F) להשליך את supernatant.
  11. תגדיל את התאים ב-10 מ"ל של מאגר מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית (מאגר MACS; 1x PBS עם 2 מ"מ EDTA ו-0.5% BSA).
  12. קבע את מספר התא בר קיימא על-ידי כתמים כחולים.
    1. קח 10 μL של תאים מתוך 10 מ"ל של השעיית תא בשלב 3.11.
    2. מערבבים עם 10 μL של 0.4% פתרון כחול טריפן ודגרה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מוסיפים את התערובת להמוציטומטר וקובעים את מספר התא בר קיימא. התאים המתים מוכתמים בכחול, בעוד התאים קיימא אינם נגועים.
  13. צנטריפוגות התאים ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F) ולהשליך את supernatant.
  14. Resuspend התאים עם 10 μL של Thy1.2 microbeads ב 90 μL של חיץ MACS צונן עבור פחות מ -10 מיליון תאים קיימא. הוסף יותר חרוזים באופן פרופורציונלי אם יש יותר מ -10 מיליון תאים קיימא. פיפטה את התערובת היטב ודגרה ב 4 °C (50 °F) במשך 30-60 דקות.
  15. הוסף 10 מ"ל של מאגר MACS ומערבב היטב.
  16. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant.
  17. חזור על שלבים 3.15-3.16 פעם אחת.
  18. resuspend התאים והחרוזים עם 2 מ"ל של מאגר MACS.
  19. הגדר מפריד MACS בשכונה. הוסף עמודת LS למפריד ושויב את העמודה עם מאגר MACS של 3 מ"ל.
  20. כאשר העמודה LS מכוילת, העביר את התאים דרך העמודה.
  21. לשטוף את העמודה LS עם 2 מ"ל של מאגר MACS שלוש פעמים.
  22. קח את העמודה מהמפריד, לחמוק ממנו עם 2 מ"ל של חיץ MACS שלוש פעמים, ולאחר מכן לאסוף את ההתחמקות לצינור 50 מ"ל.
  23. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.
  24. resuspend התאים עם 5 מ"ל של מדיה FB.
  25. קבע את מספר התא עם המוצ'ימומטר.
  26. לדלל את התאים עם מדיה FB לזרוע את התאים לכלים או צלחות כרצונו. ודא כי צפיפות זריעת התאים היא סביב 2-2.5 x 104 תאים / cm2 (לייעל את הצפיפות בהתבסס על ניסויים בודדים). ודאו שלפיברובלסטים המצורפים יש צורה אליפטית לעגולה ביום השני לאחר הזריעה (איור 3).

4. ייצור של רטרווירוס קידוד וקטור MGT פוליציסטרוני לתכנות מחדש של הלב

  1. לשמור על Plat-E עם מדיה תרבות Plat-E (DMEM בתוספת עם 10% FBS, 1 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin ו 10 מיקרוגרם / מ"ל של blasticidin) ב 37 °C עם 5% CO2.
  2. ביום 1, לפצל Plat-E לצלחת 6-באר בערך 4-5 x 105 תאים / צפיפות באר.
  3. ביום 2, Plat-E בדרך כלל מגיע 80% השפעה. לבצע טרנסג'נדר את התאים בהליכים הבאים. כוונן את עוצמת הקול והכמות של כל רכיב שנמצא כאן בהתבסס על כל באר בלוח של 6 בארות.
    1. לדלל 2 מיקרוגרם של pMX-puro-MGT ביטוי רטרו-וירוס polycistronic ביטוי plasmid וקטור (Addgene 111809) כדי 500 ng/ μL עם מאגר TE.
    2. הכן את תערובת transfection על ידי ערבוב 10 μL של ליפופקטמין עם 150 μL של בינוני סרום מופחת. בזהירות pipette לערבב היטב לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. היזהרו כדי למנוע בועות בעת צנרת.
    3. בינתיים, להכין תערובת plasmid על ידי ערבוב plasmid עם 150 μL של בינוני סרום מופחת. בזהירות pipette לערבב היטב לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. היזהרו כדי למנוע בועות בעת צנרת.
    4. מערבבים בזהירות את שתי התערובות ודגר בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הפתרון עשוי להיראות מעונן.
    5. מוסיפים את התערובת טיפה אחר טיפה לתאים כדי להיות transfected.
    6. לדגור על התאים ב 37 °C (50 °F) לילה.
  4. ביום 3, לשנות את המדיום למדיום תרבית תאים מלאה טרי חסר puromycin ו blasticidin.
  5. ביום 4, 48 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף את supernatant המכיל רטרווירוס ולאחסן אותו ב 4 °C (70 °F).
  6. ביום 5, 72 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף את supernatant המכיל רטרווירוס.
  7. סנן הן את 48 h ו 72 h supernatant עם מסנן 0.45 מיקרומטר, לזרז לילה ב 4 °C (7 °F) על ידי הוספת נפח 1/5 של 40% פולי (אתילן גליקול) (PEG) פתרון כדי להפוך את הריכוז הסופי של 8% PEG.
  8. צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 30 דקות כדי לזרז את הנגיף.
    הערה: PEG8000-וירוס יוצר משקעים לבנים קטנים.
  9. Resuspend הווירוס עם iCM בינוני המכיל 8 מיקרוגרם / mL polybrene כרצונו. השתמש בוירוס הרטרו מיד.

5. תכנות מחדש של NCFs ל- iCMs עם זיהום רטרווירוס קידוד MGT

  1. לגדול או לעבור NCFs לפני זיהום וירוס.
    הערה: בדרך כלל, NCF ניתן לעבור פעמיים.
  2. ביום 0, זרע NCF לצפיפות סביב 1-2 x 104 תאים / cm2 במצב בינוני FB.
  3. ביום הראשון, החליפו את המדיום התרבותי במדיום המכיל וירוסים לכל אחד מהם, לפי הצורך. השתמש בווירוס מבאר אחת Plat-E בצלחת 6-באר כדי להדביק שתי בארות בצלחת 24-well. Titer הווירוס כדי לקבוע את ריכוז הווירוס האופטימלי.
    הערה: וירוסים המכילים גורמי תכנות מחדש אחרים של עניין ניתן להציג יחד עם רטרווירוס MGT.
  4. דגירה ב 37 °C (50 °F) לילה.
  5. ביום 2, 24 שעות לאחר ההדבקה בנגיף, החליפו את המדיום המכיל וירוס למדיום iCM רגיל.
  6. כדי לפקח על ביטוי GCaMP3, צלחת זה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטיות הפוכה. תחת 10x בערוץ GFP, לצפות הפלואורסצנטיות הבסיסית הקלה GCaMP3 של חלק מהתאים כבר ביום 5.
  7. החלף את המדיום כל 2-3 ימים במהלך התככנות מחדש. במידת הצורך, לבצע בחירה חיובית עבור תאים נגועים רטרווירוס MGT על ידי הוספת 2 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin למדיום התרבות במשך 3 ימים ושמירה על זה ב 1 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: הצג כימיקלים מעניינים (למשל, IGF-1, MM589, A83-01 ו- PTC-209, המכונה IMAP כפי שדיווחנו בעבר15) יחד עם שינוי בינוני.
  8. לאחר 14 ימים של זיהום, להחליף את המדיום עם B27 בינוני כדי לגרום עוד יותר iCM התבגרות.

6. הערכה של התבגרות פונקציונלית iCM ויעילות תכנות מחדש על ידי Ca2 + שטף

הערה: הוסף 1 μM isoproterenol לתאים להיות מוערך לפני ההערכה, במידת הצורך.

  1. להעריך את שטף Ca2 + עם מיקרוסקופ פלואורסצנטיות הפוכה בטמפרטורת החדר.
  2. בערוץ GFP, צפה בתאי GCaMP3+ תחת המטרה 10x. ודא שהוא מציג מכות תאים ספונטניות בערוץ השדה הבהיר.
  3. בחר באופן אקראי שלושה שדות מתחת ל- 20x ורשום את שטף Ca2+ של ה- iCMs למשך 3 דקות עבור כל שדה.
    הערה: כאן, השטף Ca2+ סונכרן עם מכות תאים ספונטניות (איור 4, איור 5, ווידאו 3, וידאו 4, וידאו 5, וידאו 6, וידאו 7, וידאו 8).
  4. לכמת באופן ידני את התאים עם שטף Ca2+ .

7. ניתוח סטטיסטי ומצגת נתונים

  1. לנתח את ההבדלים בין קבוצות ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ולבצע את התלמיד-ניומן-Keuls בדיקות השוואה מרובות.
    הערה: התוצאות הן ממוצעות ± S.E. עם p < 0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית. כל ניסוי בוצע לפחות שלוש פעמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זרימת העבודה הניסיונית ליצירת זן העכבר Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ומבנה הגנים של העכברים מהונדסים מוצגת באיור 1. בעוד זן העכבר נקבע, ליבם של הגורים היה מבודד ונצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לאשר את הגנוטיפ. לבבות עם גנוטיפ נכון מראים ש-Ca2+ שטף מסונכרן עם פעימות, דמיינו אותו פלואורסצנטיות GCaMP3, בעוד שלא נצפתה פלואורסצנטיות בלב שליטה (איור 2, וידאו 1 ווידאו 2). NCFs מבודדים יתחברו לבאר תוך 2 שעות ויציגו צורה אליפטית לעגולה יום אחד לאחר הזריעה (איור 3). הבגרות התפקודית ויעילות התכנות מחדש של iCMs הוערכו על ידי Ca2 + שטף 14 ימים לאחר הצגת MGT. התאים המתוכנתים מחדש ניתן להעריך תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי למדוד את שטף Ca2 + . ניתן למצוא תאי GCaMP3+ הן בקבוצות IMAP והן בקבוצות MGT, בעוד שקבוצת IMAP מציגה באופן משמעותי יותר תאים ותאים GCaMP3+ עם תבניות תנודה Ca2+ קרוב יותר ל- CMs רגילים (קטעי וידאו 3-8). כפי שמוצג באיור 4A, תא מייצג בקבוצת IMAP עם תנודה של Ca2+ יציג שינוי פלואורסצנטיות GCaMP3 בין המקסימום (החלונית האמצעית) למינימום (החלונית הימנית), והתנודה Ca2+ של תאים כאלה משתנה מעת לעת (איור 4B). לאחר כניסת IMAP, מספר אשכולות המכות היה גבוה משמעותית מזה בקבוצת הביקורת, שכן מספר תאי GCaMP3+ עם שטף Ca2+ לכל שדה בעל הספק גבוה (HPF, עדשה אובייקטיבית פי 20) גדל בקבוצה בעלת הטיפול הבינוני IMAP (איור 5).

Figure 1
איור 1: יצירת זן עכבר Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3. איור של Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ייצור זן העכבר ואת מבנה הגנים של העכברים מהונדסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שטף Ca2+ של הלב הפועם. פלואורסצנטיות GCaMP3 סונכרנה עם פעימות לב בלבבות Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 (פאנל עליון), בעוד שלא נצפתה פלואורסצנטיות בלב בקרה (פאנל תחתון). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: NCFs מבודדים המחוברים ללוח 6-בארות. (A) NCFs תחת שדה צריכת חשמל נמוכה (LPF, מטרה של 10x, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (B) NCFs תחת שדה הספק גבוה (המטרה 20x, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שטף Ca2+ של תאים מתוכנתים מחדש. (A) NCFs שטופלו ב- IMAP תוכנתו מחדש ל- iCMs תחת ערוץ GFP בשדה הספק גבוה (יעד 20x). Ca2+ שטף של iCMs היה לדמיין כמו פלואורסצנטיות GCaMP3, שבו תאים עם שטף Ca2 + להראות מהבהבים חוזרים ונשנים בין פלואורסצנטיות בסיסית (Ca2 + min, פאנל אמצעי) פלואורסצנטיות בהירה (Ca2 + מקסימום, פאנל ימני) מסונכרנים עם מכות. (B) עקומת מעקב Ca2+ של תאי Ca2+ תנודה+ בקבוצה IMAP. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. F/F0: עוצמת פלואורסצנטיות יחסית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 איור 5: הערכה של שטף Ca2+ תחת מדיום IMAP. מספר תאי GCaMP3+ עם שטף Ca2+ ל- HPF 2, 3, 4 שבועות לאחר אינדוקציה MGT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: לב פועם מבודד גורים עם αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 גנוטיפ תחת עדשת המטרה סריקה (מטרה 4x) בערוץ GFP. הלב הוא GCaMP3+ ומהבהב בין פלואורסצנטיות בסיסית (Ca2 + min) לפלורסצנטיות בהירה (Ca2+ מקסימום) המסונכרנת עם פעימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2: לב פועם מבודד גורים עם גנוטיפ שליטה תחת עדשה אובייקטיבית סריקה בערוץ GFP. הלב הוא GCaMP3 - ואינו מראה פלואורסצנטיות מהבהבת מסונכרנת עם פעימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 3: iCMs בקבוצת IMAP תחת LPF בערוץ השדה הבהיר (BF). ניתן לראות תא עם מכות משמעותיות במרכז השדה. גם וידאו 3 וגם וידאו 4 מתמקדים באותו שדה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 4: iCMs בקבוצת IMAP תחת LPF בערוץ GFP. ניתן לראות תאים מרובים עם פלואורסצנטיות מהבהבת, כולל תא הפעימות שנראה בערוץ BF. גם וידאו 3 וגם וידאו 4 מתמקדים באותו שדה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 5: iCMs בקבוצת IMAP תחת HPF בערוץ BF. מרכז השדה של וידאו 3 ווידאו 4 נצפה תחת HPF. ניתן להבחין בתא עם מכות משמעותיות במרכז השדה. גם וידאו 5 וגם וידאו 6 מתמקדים באותו שדה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 6: iCMs בקבוצת IMAP תחת HPF בערוץ GFP. חלק מרכזי של השדה של וידאו 3 וידאו 4 נצפה תחת HPF. ניתן לראות תאים מרובים עם פלואורסצנטיות מהבהבת, כולל תא הפעימות שנראה בערוץ BF. גם וידאו 5 וגם וידאו 6 מתמקדים באותו שדה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 7: iCMs בקבוצת MGT תחת HPF בערוץ BF. בניגוד לתאי מכות משמעותיים שנצפו בקבוצת IMAP, ישנם כמה תאים מכים תחת ערוץ BF בקבוצת MGT, אשר יש יעילות תכנות מחדש נמוכה יותר. גם וידאו 7 וגם וידאו 8 מתמקדים באותו שדה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 8: iCMs בקבוצת MGT תחת HPF בערוץ GFP. ניתן לראות מספר תאים עם פלואורסצנטיות מהבהבת קלה. גם וידאו 7 וגם וידאו 8 מתמקדים באותו שדה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הערכת פונקציית iCMs נחוצה לשדה תכנות מחדש של הלב. בכתב יד זה, הפרוטוקול מתאר Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze / J זן עכברים שהוקם, כיצד להשתמש ב- NCFs המבודדים מעכברי היילוד בזן זה לתכנות מחדש ל- iCMs, והערכת פונקציית iCMs על ידי שטף Ca2 + . זוהי שיטת de novo להערכת התבגרות פונקציונלית של iCMs.

מספר שלבים קריטיים חשובים לתכנות מחדש והערכה מוצלחים בשיטה זו. ראשית, NCFs צריך להיות מוכן טרי ובריא לאחר הבידוד. הליך מהיר של בידוד לב וחיתוך הוא חיוני. והכי חשוב, חשוב לעקוב אחר זמן הדגירה כדי למנוע עיכול יתר וירידה בכדאיות התא ובמצב. שנית, בין כל ההליכים, יעילות זיהום וירוס לעתים קרובות מציג וריאציה גבוהה בתוצאות. יעילות זיהום וירוס מושפעת בעיקר משני גורמים. מצד אחד, טיטר הנגיף צריך להיות קבוע בין ניסיונות שונים, אשר דורש עקביות בכמות plasmids transfected ומצב תא Plat-E דומה וצפיפות. חוקרים בעקבות פרוטוקול זה צריכים להעריך את צפיפות הזריעה האופטימלית ואת הזמן לפני הליכים אלה. הווירוס צריך לשמש מיד כדי למנוע החלשת titer בשל רגישות וירוס מחזורי הפשרה הקפאה. בנוסף, חשוב לשמור על NCFs במצב בריא וצפיפות מתאימה בזמן ההדבקה. חוקרים צריכים להכיר את מאפייני הצמיחה של NCFs. בעוד וריאציית יעילות התככנות מחדש צריכה להיות מוגבלת, ניטור תכוף יכול להיות מועיל. פרוטוקול זה יכול להיות שונה בקלות כדי להדביק NCFs עם וירוסים שונים או לטפל בהם עם כימיקלים של עניין. לכן, זה ישים כשיטה אוניברסלית לתכנות מחדש של הלב. מלבד נקודות שהוזכרו כאן, בעיות נפוצות עם שיטה זו כוללות פלואורסצנטיות נמוכה שנצפו לאחר התכנות מחדש. ייתכן שהסיבה לכך היא מספר סיבות. ראשית, הזיהום לא יכול להיות יעיל כמו הרצוי, מה שמוביל ליעילות תכנות מחדש נמוכה ומגביל את מספר iCMs. שנית, ייתכן שיהיה צורך להתאים את מצב החשיפה בצורה אופטימלית לתצפית על פלואורסצנטיות GCaMP3 של iCMs. שימוש בקרדיומיוציטים יילודים מבודדים מאותם גורים כמו שליטה חיובית יעזור לזהות את הסיבה הפוטנציאלית.

Ca2+ שטף שימש נרחב כדי להעריך את פעילות התא, כולל בתאי נוירון16, בלוטת החלב17, רקמות שומן18, וכו '. במחקר זה, Ca2 + שטף שימש להערכת ההתבגרות התפקודית של iCMs. בעבר, דווח כי Ca2 + שטף ניתן למדוד על ידי כימיקלים ספציפיים בשם מולקולה קטנה רגישים סידן צבעים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הפונקציה של תאים מתוכנתים מחדש19. עם זאת, לשיטה כזו יש כמה מגבלות: הכימיקל שהוכנס לתאים עשוי להיות רעילות פוטנציאלית ולהשפיע על התהליכים התאיים, מה שהופך את התוצאות פחות אמין מאשר אלה שהושגו עם השיטה המוצגת כאן. חוץ מזה, תהליך הכתמים הוא מסובך וגוזל זמן תוך מניעת הערכות נוספות של תאים אלה. השיטה המוצגת כאן, לעומת זאת, מתגברת על מגבלות אלה. GCaMP3 אינו פולשני עבור התאים, אשר ממזער את ההשפעות על פעילויות התא ומאפשר הערכה נוספת של התאים. מאז פלואורסצנטיות של iCMs תלוי רק בזהותם, כלומר, ביטוי Myh6 ושינוי ריכוז Ca2 + המקומי, פלואורסצנטיות Ca2 + שטף של תאים הופך גלוי כל עוד NCFs מתוכנתים מחדש, המאפשר ניטור תכוף של תהליך התכנות מחדש ללא אסטרטגיה גוזלת זמן. בעוד שטף Ca2+ ניתן לפקח ולתעד בקלות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, המכות החוזרות ונשנות ופעילות אלקטרונית קשורה על פני קרום התא, כלומר, Ca2 + שטף, ניתן לכמת באופן זמני עוד יותר20. כפי שמוצג באיור 4B, כימות כזה יכול לספק מידע נוסף על הבגרות של iCMs ולהמחיש מבנים מפורטים יותר של שינוי שטף Ca2+ במהלך תכנות מחדש של הלב.

לשיטה זו יש מספר יתרונות. ראשית, שטף Ca2+ נצפה באופן בלעדי ב- iCMs. מכיוון ש- Myh6 הוא מאוד ספציפי ל- CMs אך לא ל- CFs, רק התאים המתוכנתים מחדש בהצלחה יבטאו את כתב GCaMP3 ויהפכו לפלורסנט. שנית, שטף Ca2+ מספק דרך להעריך את ההבשלה התפקודית של iCMs מלבד שיטת ניטור הביטוי של גנים ספציפיים ל- CM. בשל ההליך הניסיוני הארוך יחסית וריאציה הקשורה לזה, הפונקציה של iCMs לא תמיד מקובלת על מחקר נוסף ושימוש קליני פוטנציאלי. בעוד ביטוי הגן הספציפי ל- CM חושף רק חלק מהמאפיינים של התא המתוכנת מחדש, שטף Ca2+ מספק היבט נוסף של שדה תכנות הלב כדי להעריך את איכות ויעילות התא המתוכנת מחדש. יתר על כן, התבגרות פונקציונלית קשורה יותר לתפקוד הלב, אשר יכול להיות אינדיקטור טוב יותר כדי להעריך את היעילות. שיטות בשימוש נרחב בתחום זה כוללות ציטומטריית זרימה, טכניקה הדורשת עיכול טריפסין של כל קבוצות התאים. בעוד עיכול יכול להשפיע על תפקודי התא ומאפיינים, הוא מציג וריאציה למערכת, הפחתת הפוטנציאל לשחזר את התוצאות שנצפו ולהעריך עוד יותר תאים אלה. בהשוואה לשיטות אלה, זן העכבר הטרנסגני המוצג כאן הגביל את ההשפעה הפוטנציאלית של כימיקלים או הליכים ניסיוניים הדרושים להערכה. עם יתרונות אלה, זן עכבר זה מפשט את הליכי ההערכה הדרושים לתכנות מחדש של הלב ומשפר את יכולת הרבייה של התוצאות בתחום זה.

עם זאת, ישנן כמה מגבלות למחקר זה. ראשית, מפעל מאמץ העכבר גוזל זמן רב. פניות של זן העכבר מעמיתים בתחום זה מתקבלות בברכה כדי לקצר את הזמן הדרוש לממסד המתח. שנית, תכנות הלב מחדש ל- iCMs עם פרוטוקול זה כרוך בגורמים וצעדים מרובים, אשר מציגים וריאציה גבוהה יחסית למערכת. בקיאות בתחום זה תסייע להתגבר על בעיה זו. לבסוף, מכיוון שה- GCaMP3 הופך לפלואורסצנט רק במצב Ca2+ flux, לא ניתן להשתמש בשיטת ההערכה הנוכחית עבור FACS כתכנות מחדש של הלב עם זן Myh6-GFP7. עם זאת, בעוד זן הנוכחי יש יותר ושונה יישומים לעומת זן Myh6-GFP, אי נוחות כזו ניתן להתגבר.

בסך הכל, כפי שהפרוטוקול תיאר לעיל, זן העכבר Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ולאחר הערכה של התבגרות iCMs מספקים אסטרטגיה לניטור כל התהליך של תכנות מחדש של הלב. אסטרטגיית מדידת שטף Ca2+ בתיווך GCaMP3 יכולה להתבצע בתאים חיים מבלי לפגוע הכדאיות של התא. מכיוון שפלואורסצנטיות GCaMP3 מונעת על ידי ביטוי גנים ספציפיים בשריר הלב, ניתן לכמת עוד יותר את נתוני הפלואורסצנטי GCaMP3 שנרכשו כדי לחשוף את יעילות התכנות מחדש ואת פעילות ה- iCMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מעריכים את מאמציו של ליאו גנובסקי בעריכת הטקסט האנגלי של כתב יד זה. איור 1 נוצר עם BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) של ארצות הברית (1R01HL109054) מענק לד"ר וואנג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates Alkali Scientific TP9006
A83-01 Stemgent 04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X800E Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder Thermo Fisher Scientific BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-049-101 Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2 Thermo Fisher Scientific NC9693955
Counting Chamber Thermo Fisher Scientific 02-671-51B Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine Thermo Fisher Scientific 11960069
DPBS, calcium, magnesium Thermo Fisher Scientific 14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%) Thermo Fisher Scientific 04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) Thermo Fisher Scientific E478-500
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14025092
IMDM media Thermo Fisher Scientific 12440053
IX73 Inverted Microscope Olympus IX73P2F Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11-668-019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Medium 199, Earle's Salts Thermo Fisher Scientific 11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore Sigma SLHV033RB
MM589 Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31-985-070
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line Cell Biolabs RV-101
pMx-puro-MGT Addgene 111809
Poly(ethylene glycol) Millipore Sigma P5413-1KG PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G
PTC-209 Sigma SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride Thermo Fisher Scientific A1113803
Recombinant Human IGF-I Peprotech 100-11
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093
ST 16 Centrifuge Series Thermo Fisher Scientific 75-004-381
Sterile Cell Strainers Thermo Fisher Scientific 22-363-547 40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes Thermo Fisher Scientific FB012921
TE Buffer Thermo Fisher Scientific 12090015
Trypan Blue solution Millipore Sigma T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25300054
Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 02215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
  2. Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
  3. Frangogiannis, N. G. Pathophysiology of myocardial infarction. Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).
  4. Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
  5. Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
  6. Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
  7. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  8. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  11. Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
  12. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  13. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  14. Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
  15. Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
  16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  17. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  18. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  19. Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
  20. Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).

Tags

רפואה גיליון 180
הערכה במבחנה של תכנות לב מחדש על ידי מדידת שטף סידן ספציפי לב עם כתב GCaMP3
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Liu, L., Wang, Z. In vitro… More

Li, Z., Liu, L., Wang, Z. In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter. J. Vis. Exp. (180), e62643, doi:10.3791/62643 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter