Summary
ここでは、Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J(以下のαMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3)の確立と適用について述べています。マウス株から分離された新生児心臓線維芽細胞(NCF)は、誘導心筋細胞(iCM)に変換され、カルシウム(Ca2+)フラックスを介したiCMのリプログラミング効率と機能的成熟の便利かつ効率的な評価を可能にします。
Abstract
心臓リプログラミングは、損傷した心臓を修復するための潜在的に有望な治療法となっています。Mef2c、Gata4、Tbx5(MGT)を含む複数の転写因子を導入することにより、線維芽細胞を誘導心筋細胞(iCM)に再プログラムすることができる。これらのiCMは、梗塞した心臓 の中でその場で 発生した場合、電気的および機械的に周囲の心筋と統合し、瘢痕サイズの縮小および心臓機能の改善を招く。iCM のリプログラミング効率、純度、品質が比較的低いため、iCM の特性評価は依然として課題となっています。フローサイトメトリー、免疫細胞化学、qPCRなど、現在使用されている方法は、主に心臓特異的遺伝子とタンパク質発現に焦点を当てていますが、iCMの機能的成熟には焦点を当てていない。行動電位によって引き起こされ、心筋細胞における電圧ゲートカルシウムチャネルの開放は、細胞内にカルシウムの急速な流入をもたらす。従って、カルシウム流入率を定量化することは、心筋細胞機能を評価する有望な方法である。ここで、プロトコルはカルシウム(Ca2+)フラックスによるiCM機能を評価する方法を導入する。αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株は、Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hz/J(ローザ26A-Flox-Stop-C-G3マウス)とTg(Myh6-cre)1Jmk/J(以下のMyh6-Creと呼ばれる)を交合することによって確立されました。P0-P2新生児マウスからの新生児心臓線維芽細胞(NcF)を インビトロで単離して培養し、MGTの多元性構造をNCFに導入し、iCMへの再プログラミングにつながった。正常に再プログラムされたiCMだけがGCaMP3レポーターを発現するので、iCMの機能的成熟は蛍光顕微鏡でCa2+ フラックスによって視覚的に評価することができる。NCF-iCMは、再プログラムされていないNFと比較して、CMと同様に有意なカルシウム過渡束および自発的収縮を示した。このプロトコルは、マウス株の確立、新生児マウス心臓の単離および選択、NCF単離、心臓リプログラミング用レトロウイルスの産生、iCM誘導、レポーターラインを用いたiCM Ca2+ フラックスの評価、および関連する統計分析およびデータ提示について詳細に説明する。ここで説明する方法は、心臓リプログラミング研究のためのiCMの機能的成熟を評価するための貴重なプラットフォームを提供することが期待される。
Introduction
心筋梗塞(MI)は世界的に重篤な疾患です。心血管疾患(CVD)は世界の主要な死因であり、20191年には約1,860万人が死亡しました。過去半世紀の間にCVDの総死亡率は減少した。しかし、この傾向は、CVDのより効果的な治療法を求める一部の未開発国1では減速または逆転しています。CVDの致命的な症状の1つとして、MIは米国のCVDに起因するすべての死亡の約半分を占めています2。虚血の間、冠状動脈の遮断および栄養素および酸素の両方の供給が限られていると、心筋は重度の代謝変化に苦しみ、心筋細胞(CM)の収縮期機能を損ない、CM死3に至る。心血管研究における多数のアプローチは、心臓損傷を修復し、負傷した心臓の機能を回復するために探求されてきた4.直接心臓リプログラミングは、損傷した心臓を修復し、その機能を回復するための1つの有望な戦略として浮上しています5,6。Mef2c、Gata4、Tbx5(MGT)を導入することにより、線維芽細胞をインビトロおよびインビボでiCMに再プログラムすることができ、それらのiCMは瘢痕領域を減少させ、心臓機能を改善することができる7,8。
心臓リプログラミングはMI治療の有望な戦略ですが、多くの課題が残っています。第1に、リプログラミング効率、純度、品質が期待したほど高いとは限りません。MGT誘導は、vitro7でiCMに再プログラムされる全CFの8.4%(cTnT+)または24.7%(αMHC-GFP+)、またはvivo8で最大35%しか達成できないため、その用途は制限されています。Hand29 や Akt1/PKB10 など、システム内で誘導される因子が多くても、リプログラミング効率は臨床現場で使用されるのにほとんど満足できません。したがって、この分野では、リプログラミング効率の向上に焦点を当てたより多くの研究が必要とされている。第二に、iCMの電気的完全性と収縮特性は、心臓機能の効率的な改善のために重要であるが、これらは評価に挑戦している。現在、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、およびいくつかの主要なCM遺伝子発現のqPCRを含むこの分野で広く使用されている評価方法は、すべてiCMとCMの類似性に焦点を当てていますが、iCMの機能的特性に直接関係していません。さらに、これらの方法は比較的複雑な手順を有し、時間がかかる。リプログラミング研究は通常、iCM成熟11を促進する潜在的なリプログラミング因子のスクリーニングを伴うが、心臓リプログラミングはiCM機能に基づく迅速かつ便利な方法を求める。
CMは、収縮周期の間に細胞膜上の電圧ゲートカルシウムイオンチャネルを開き、細胞間流体から細胞質へのカルシウムイオン(Ca2+)の一過性流入を招き、筋形筋収縮に関与します。このようなCa2+ 流入および流出サイクルは心筋収縮の基本的な特徴であり、CMs12の正常な機能を構成する。したがって、Ca2+ 流入を検出する方法は、CMやCM様細胞(iCMを含む)の機能を測定する潜在的な方法となり得る。さらに、iCMの場合、このような方法は、再プログラミング効率を評価する別の方法を提供する。
遺伝子組み換えカルシウム指標(GECI)は、細胞活動、特に作用電位を示すために開発され、広く使用されています。一般に、GECはカルモジュリンなどのCa2+ 結合ドメインとGFPなどの蛍光ドメインで構成され、GCaMP3は高い親和性と蛍光強度を有するドメインです。GCaMP3の蛍光ドメインは、局所的なカルシウム濃度が変化したときに活性化される13。本論文では、Myh6+細胞においてGCaMP3レポーターを特異的に発現するマウス株について説明する。この株の新生児から分離されたNcFにMGTを導入することにより、リプログラミングは蛍光によって監視することができ、これは正常に再プログラムされたiCMが発揮されます。このようなマウス株および方法は、心臓リプログラミングを調査するための貴重なプラットフォームを提供する。
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Protocol
動物に関するすべての実験的な手順と実践は、ミシガン大学の施設動物ケア&ユース委員会によって承認されました。細胞培養に関わる実験手順および実践はすべて、無菌条件下でBSL2生物学的安全キャビネットを実施しなければならない。ウイルスに関する手順と実践については、環境や健康への危険を回避するためのトランスフェクト細胞、ピペットチップ、チューブの適切な廃棄のガイドラインに従った。
Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ローザ)26ソルトム38(CAG-GCaMP3)Hze /J(Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-ストップフロックス-GCaMP3と呼ばれる)マウス株の確立(図1)
- Tg(Myh6-cre)1Jmk/Jマウス株(ジャクソンラボストック009074、Myh6-Creと呼ばれる)とGt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/Jマウス株(ジャクソンラボストック014538、Rosa26A-Flox-ストップフロックス-GCaMP3と呼ばれる)をそれぞれ準備します。
- 生後8週間まで各株を飼育し、それぞれ生後6-CreとRosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウスを得る。
- 成体Myh6-CreとRosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウスを交配した。
注意:Myh6-Cre男性/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3女性またはその逆を設定します。子孫の間に大きな違いはありません。典型的には、雌マウスは交配後19〜21日後に8〜10匹の子犬を出産する。
2. 新生児 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 マウス心臓の分離と選択.
- P0-P2の子犬を得る。このプロトコルで 1000 万の NCF を分離するために、8 ~ 10 個の子犬が存在することを確認します。
- 低体温によって子犬を深く麻酔した。ラテックス手袋に子犬を入れ、砕いた氷と水(2°C〜3°C)で首まで浸します。
- 75%エタノールで子犬を簡単に消毒します。
- 無菌はさみで切断することによって子犬を犠牲にします。
- 心臓の近くで水平切開を行い、心臓を絞り、大間の根元をはさみで分離して分離します。
- 蛍光顕微鏡で心臓の鼓動を観察します。Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3遺伝子型で心臓を確認し、心臓の鼓動でGCaMP3によって示されるCa2+ フラックスを示しています。他の遺伝子型は蛍光を示さない(図2、 ビデオ1、 およびビデオ2)。
3. 新生児心臓線維芽細胞(NCF)の分離
注: この部分では、この研究に適用される場合、Li Qian博士のLab14 のプロトコルがマイナーな最適化で採用されました。
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3心臓を単離した後、緩く接続された4つの部分に切ります。6 cmプレートの氷冷DPBSで数回徹底的に洗浄し、単離した細胞の血球汚染を制限します。
- 心臓を15 mLの円錐形チューブに移します。
- 37°Cで8mLの温かい0.25%トリプシン-EDTAで10分間消化します。
- トリプシン上清を捨て、5 mLの温かいII型コラゲナーゼ(0.5 mg/mL)をHBSSに加えます。
- 混合物を十分にボルテックスし、37°Cで5分間インキュベートする。
- インキュベート後、渦を徹底的に、未消化の組織を重力によって落ち着かせる。
- 上清を5 mL冷線維芽細胞(FB)培地(20%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを有するIMDM)を用いた15 mL円錐形チューブに集める。
- 未消化組織に対してステップ3.4~3.7を4~5回繰り返します。
- 一緒にすべての上清を収集し、40 μmのストレーナーで上清をフィルタリングします。
- 4°Cで5分間200xgで遠心分離機を出し、上清を捨てます。
- 磁気活性化セルソーティングバッファの10 mLでセルを再中断します(MACSバッファ、2 mM EDTAと0.5%BSAを備えた1x PBS)。
- トリパンブルー染色により、生存細胞数を決定します。
- ステップ3.11の細胞懸濁液の10 mLから10μLの細胞を取り出す。
- 0.4%のトリパンブルー溶液を10 μL混合し、室温で5分間インキュベートします。
- 混合物をヘモサイトメーターに加え、生存可能な細胞数を決定する。死んだ細胞は青色に染色され、生存細胞は染色されない。
- 4°Cで5分間200xgで細胞を遠心分離し、上清を捨てます。
- 90 μLのチルドMACSバッファーに10μLのThy1.2マイクロビーズを含む細胞を1,000万個未満の生存細胞に再懸濁させます。1000万個を超える生存細胞がある場合は、ビーズを比例的に追加します。混合物をよくピペットし、30〜60分間4°Cでインキュベートします。
- 10 mLのMACSバッファを追加し、よく混ぜます。
- 200xgで5分間遠心分離機、上清を捨てます。
- ステップ 3.15~3.16 を 1 回繰り返します。
- 2 mL の MACS バッファを使用してセルとビーズを再サスペンドします。
- フードに MACS セパレータを設置します。LS 列をセパレータに挿入し、3 mL の MACS バッファでカラムを平衡化します。
- LS 列が平衡化されたら、列を通してセルを渡します。
- 2 mL の MACS バッファで LS カラムを 3 回洗浄します。
- セパレータからカラムを取り出し、2 mLのMACSバッファで3回溶出し、50 mLチューブへの溶出を集めます。
- 5分間200× g で遠心分離機を出し、上清を捨てます。
- FBメディアの5 mLでセルを再サスペンドします。
- ヘモサイトメーターで細胞数を決定します。
- FB培地で細胞を希釈し、必要に応じて皿やプレートに細胞を播種します。細胞の播種密度が2~2.5 x 104 セル/cm2 程度であることを確認します(個々の実験に基づいて密度を最適化します)。付属の線維芽細胞は、播種後2日目に円形に楕円形を持っていることを確認します(図3)。
4. 心臓リプログラミング用ポリシストロニックMGTベクターをコードするレトロウイルスの製造
- Plat-E培養培地(DMEMは10%FBS、1 μg/mLのピューロマイシン、10 μg/mLのブラストシジン)を5%CO2で37°Cに維持します。
- 1日目に、Plat-Eを約4-5 x 105 細胞/ウェル密度で6ウェルプレートに分割します。
- 2日目には、Plat-Eは通常80%の合流度に達する。次の手順で細胞をトランスフェクトします。6ウェルプレートの各ウェルに基づいて、ここに存在する各要素の体積と量を調整します。
- PMX-puro-MGTポリシストロニックレトロウイルス発現プラスミドベクター(アプジェネ111809)を2μg希釈し、TEバッファーを用いて500ng/μLに希釈した。
- 10 μLのリポフェクタミンを150 μLの減らされた血清培地と混合してトランスフェクション混合物を調製します。慎重にピペットをよく混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートします。ピペットの場合は泡を避けるように注意してください。
- 一方、プラスミドと150μLの還元血清培地を混合してプラスミド混合物を調製する。慎重にピペットをよく混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートします。ピペットの場合は泡を避けるように注意してください。
- 慎重に2つの混合物を混合し、室温で5分間インキュベートします。ソリューションが曇っているように見えることがあります。
- トランスフェクトされる細胞にドロップして混合物を追加します。
- 細胞を一晩37°Cでインキュベートする。
- 3日目に、ピューロマイシンおよびブラストシジンを欠いた新鮮な完全な細胞培養培地に培地を変更する。
- トランスフェクション後4日目、48時間後にレトロウイルスを含む上清を回収し、4°Cで保存します。
- トランスフェクションの5日目、72時間後に、レトロウイルスを含む上清を収集する。
- 48時間と72時間の両方の上清を0.45 μmフィルターでフィルターし、40%ポリ(エチレングリコール)(PEG)溶液の1/5体積を加えて4°Cで一晩沈殿し、8%PEGの最終濃度を作ります。
- ウイルスを沈殿させるために30分間4,000 x g で遠心分離機。
注:PEG8000-ウイルスは小さな白い沈殿物を形成します。 - 必要に応じて8μg/mLポリブレンを含むiCM培地でウイルスを再中断します。すぐにレトロウイルスを使用してください。
5. レトロウイルス感染をコードするMGTを用いたiCMへのNCFのリプログラミング
- ウイルス感染前に拡大または通過NCFs。
注: 通常、NCF は 2 回通過できます。 - 0日目に、FB培地で1-2 x 104 セル/cm2 の周りの密度にNCFをシードします。
- 1日目に、必要に応じて各々のウイルス含有培地で培地を交換する。1つの井戸Plat-Eからウイルスを6ウェルプレートに使用して、24ウェルプレートの2つの井戸に感染します。ウイルスを引き立て、最適なウイルス濃度を決定する。
注: 他のリプログラミング要因を含むウイルスは、MGT レトロウイルスと共に導入される可能性があります。 - 一晩で37°Cでインキュベートする。
- ウイルス感染後2日目、24時間後に、ウイルス含有培地を通常のiCM培地に交換する。
- GCaMP3発現を監視するには、反転蛍光顕微鏡の下にプレートします。GFPチャネルで10xの下で、早ければ5日目に細胞の一部の軽度の基礎GCaMP3蛍光を観察する。
- リプログラミング中に2〜3日ごとに培地を交換してください。必要に応じて、2 μg/mLのピューロマイシンを培地に3日間添加し、1μg/mLで維持することにより、MGTレトロウイルス感染細胞に対して陽性選択を行います。
注:中程度の変化と共に、関心のある化学物質(例えば、IGF-1、MM589、A83-01、PTC-209、以前報告されたIMAPと呼ばれる)を導入してください。 - 14日間の感染後、培地をB27培地に置き換えて、iCM成熟をさらに誘導する。
6. Ca2+ フラックスによるiCM機能成熟と再プログラミング効率の評価
注:必要に応じて、評価前に評価する細胞に1μMイソプロテレノールを加えます。
- 室温で蛍光顕微鏡を反転してCa2+ フラックスを評価します。
- GFP チャンネルでは、GCaMP3+ セルを 10x の目標で観察します。明視野チャネルで自発的な細胞拍動を示していることを確認します。
- 20x の下の 3 つのフィールドをランダムに選択し、各フィールドの 3 分間、iCM の Ca2+ フラックスを記録します。
注: ここでは、Ca2+ フラックスは自発的なセルの拍動と同期していました(図 4、図 5、およびビデオ 3、ビデオ 4、ビデオ 5、ビデオ 6、ビデオ 7、ビデオ 8)。 - Ca2+フラックスを使用して細胞を手動で定量化します。
7. 統計分析とデータの表示
- グループ間の差異を一方向分散分析(ANOVA)で分析し、学生-ニューマン・キュースの多重比較検定を実行します。
注: 結果は S.E±平均値であり、p < 0.05 は統計的に有意であると見なされます。各実験は少なくとも3回行った。
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Representative Results
Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株およびトランスジェニックマウスの遺伝子構造を生成する実験的ワークフローを図1に示す。マウス株が確立されている間、子犬の心臓を単離し、逆蛍光顕微鏡で観察し、遺伝子型を確認した。正しい遺伝子型を持つ心臓は、Ca2+フラックスが拍動と同期し、GCaMP3蛍光として視覚化され、コントロール心臓では蛍光は観察されなかった(図2、ビデオ1、 およびビデオ2)。隔離された NCF は 2 時間以内にウェルに接続し、シードの 1 日後に円形から円形までの楕円を示します(図 3)。iCMの機能成熟度とリプログラミング効率は、MGT導入後14日後にCa2+フラックスによって評価された。再プログラムされた細胞は、蛍光顕微鏡下で評価してCa2+フラックスを測定することができる。GCaMP3+細胞はIMAP群とMGT群の両方で見つけることができ、IMAPグループは通常のCMに近いCa2+発振パターンを持つGCaMP3+セルおよび細胞を有意に多く示しています(ビデオ3-8)。図4Aに示すように、Ca2+振動を有するIMAP群の代表セルは、最大(中央パネル)と最小(右パネル)の間のGCaMP3蛍光変化を示し、そのような細胞のCa2+振動は周期的に変化する(図4B)。IMAP導入後、高出力場当たりのCa2+フラックスを有するGCaMP3+細胞数(HPF,20x対物レンズ)がIMAP中処理群で増加したため、打ち上げクラスター数は対照群のそれよりも有意に多かった(図5)。
図1:Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-ストップ-フロークス-GCaMP3マウス株の生成。 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株発生およびトランスジェニックマウスの遺伝子構造の図。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:鼓動心臓のCa2+ フラックス。 GCaMP3蛍光は、Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3心臓(上パネル)の心臓拍動と同期し、コントロール心臓(下部パネル)には蛍光は認められなかった。スケールバー= 200 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:6ウェルプレートに取り付けられた隔離されたNCF(A)低電力場下(LPF、10x目標、スケールバー=100μm)の下でのNcF。(B) 高出力フィールド下のNCF(20xの目標、スケールバー= 50 μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:再プログラムされた細胞のCa2+フラックス(A)は、高出力フィールドでGFPチャネル下でiCMに再プログラムされたIMAP処理NCF(20x目的)。ICMのCa2+フラックスはGCaMP3蛍光として視覚化され、Ca2+フラックスを持つ細胞は、基本蛍光(Ca2+分、中間パネル)と明るい蛍光(Ca2+max、右パネル)との間で繰り返し点滅を示す。(B) CA2+ のトレース曲線の CA2+ オシレーション+ IMAP グループ内のセル.スケールバー= 50 μm F/F0: 相対蛍光強度。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 図5:IMAP培地下でのCa2+ フラックスの評価 HPF 1回あたりCa2+ フラックスを有するGCaMP3+細胞の数は、MGT誘導後4週間、3、4週間。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:gFPチャンネルの走査対物レンズ(4x目的)下のαMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3遺伝子型を有する子犬から隔離された鼓動心臓。 心臓はGCaMP3+であり、鼓動と同期して、基本蛍光(Ca2+ 分)と明るい蛍光(Ca2+ max)の間で点滅します。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ2:GFPチャンネルのスキャン対物レンズの下でコントロール遺伝子型を持つ子犬から分離された鼓動心臓。 心臓はGCaMP3-であり、拍動と同期して蛍光点滅を示さない。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ 3: 明視野 (BF) チャネルの LPF の下の IMAP グループ内の iCM。 フィールドの中央に大きな拍動を持つセルが見られます。ビデオ 3 とビデオ 4 の両方が同じフィールドに焦点を当てています。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ 4: GFP チャネルの LPF の下の IMAP グループ内の iCM。 BFチャネルに見られる拍動細胞を含む蛍光を点滅させる複数の細胞が観察され得る。ビデオ 3 とビデオ 4 の両方が同じフィールドに焦点を当てています。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ 5: BF チャネルの HPF の下の IMAP グループ内の iCM。 ビデオ3とビデオ4の分野の中心は、HPF下で観察された。フィールドの中心に顕著な拍動を有する細胞が観察される。ビデオ 5 とビデオ 6 の両方が同じフィールドに焦点を当てています。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ 6: GFP チャネルの HPF の下の IMAP グループ内の iCM。 ビデオ3とビデオ4の分野の中央部分はHPF下で観察された。BFチャネルに見られる拍動細胞を含む蛍光を点滅させる複数の細胞が観察され得る。ビデオ 5 とビデオ 6 の両方が同じフィールドに焦点を当てています。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ 7: BF チャネルの HPF の下の MGT グループ内の iCM。 IMAP群で観察された有意な拍動細胞とは対照的に、MGT群のBFチャネル下に数個の拍動細胞があり、これはより低いリプログラミング効率を有する。ビデオ7とビデオ8の両方が同じフィールドに焦点を当てています。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ 8: GFP チャネルの HPF の下の MGT グループの iCM。 軽度の蛍光を伴ういくつかの細胞が観察される。ビデオ7とビデオ8の両方が同じフィールドに焦点を当てています。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
iCM機能の評価は、心臓リプログラミング分野で必要です。本稿では、プロトコルは、確立されたTg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/Jマウス株、この株の新生児マウスから分離されたNDFを使用してiCmに再プログラミングする方法、およびCa2+ フラックスによるiCMs関数の評価について説明しています。これは、iCM機能成熟を評価する デノボ 法である。
この方法を使用して正しく再プログラミングおよび評価を行う場合、いくつかの重要な手順が重要です。まず、NCFは、孤立後に新たに準備され、健康でなければなりません。心臓の分離と切断の迅速な手順が不可欠です。最も重要なことは、過剰消化と細胞の生存率と状態の減少を避けるためにインキュベーション時間に従うことが重要です。第二に、すべての手順の中で、ウイルス感染効率は、多くの場合、結果に高い変動を導入します。ウイルス感染効率は、主に2つの要因によって影響される。一方で、ウイルス力計は、トランスフェクトされたプラスミド量および類似のPlat-E細胞の状態および密度の一貫性を必要とする異なる試みの間で一定であるべきである。このプロトコルに従う研究者は、最適な播種密度とこれらの手順の前に時間を評価する必要があります。凍結融解サイクルに対するウイルス感受性による、刺激を避けるために、ウイルスを直ちに使用する必要があります。さらに、感染時にNCFを健康な状態と適切な密度に保つことが重要です。研究者は、NCFの成長特性に精通している必要があります。リプログラミングの効率の変動は制限されますが、頻繁な監視が役立つ場合があります。このプロトコルは、異なるウイルスに対してNCFを共同感染させたり、関心のある化学物質で処理したりするために簡単に変更できます。したがって、心臓リプログラミング研究のための普遍的な方法として適用可能である。ここで述べた点以外にも、この方法に関する一般的な問題は、リプログラミング後に観察される低蛍光を含む。これは、いくつかの理由が考えられます。第一に、感染は望ましいほど効果的ではなく、低いリプログラミング効率をもたらし、iCMの数を制限する。第二に、iCMのGCaMP3蛍光の観察のために、暴露状態を最適に調整する必要がある。同じ子犬から分離された新生児心筋細胞を肯定的なコントロールとして使用することは、潜在的な理由を特定するのに役立ちます。
Ca2+フラックスは、ニューロン細胞16、乳腺17、脂肪組織18などにおいて細胞活動を評価するために広く用いられている。本研究では、Ca2+フラックスを使用してiCMの機能的成熟を評価した。これまで、Ca2+フラックスは、再プログラム化されたCells19の機能を評価するために使用できる低分子カルシウム感受性色素と名付けられた特定の化学物質によって測定できることが報告されている。しかし、このような方法には、いくつかの制限があります:細胞に導入された化学物質は、潜在的な毒性を有し、細胞プロセスに影響を与える可能性があり、結果はここで提示された方法で得られたものよりも信頼性が低くなります。また、染色プロセスは複雑で時間がかかる一方で、これらの細胞のさらなる評価を防ぎます。一方、ここで示す方法は、これらの制限を克服します。GCaMP3は細胞にとって非侵襲性であり、細胞活動への影響を最小限に抑え、細胞のさらなる評価を可能にする。iCMの蛍光は、そのアイデンティティ、すなわちMyh6発現および局所Ca2+濃度変化のみに依存するため、NcFが再プログラムされている限り、細胞のCa2+フラックス蛍光が見えるようになり、時間のかかる戦略なしにリプログラミングプロセスを頻繁にモニタリングすることができます。Ca2+フラックスは反転蛍光顕微鏡下で容易に監視・記録できるが、細胞膜を横切る繰り返しの叩きおよび関連する電子活動、すなわちCa2+フラックスは、更に一時的に定量できる20。図4Bに示すように、このような定量化は、iCMの成熟度に関するより多くの情報を提供し、心臓リプログラミング中のCa2+フラックス変化のより詳細な構造を示すことができる。
この方法には、いくつかの利点があります。まず、Ca2+ フラックスはiCMで排他的に観察されます。Myh6はCMに非常に特異的であり、CFには特異的ではないので、正常に再プログラムされた細胞だけがGCaMP3レポーターを発現し、蛍光になります。第2に、Ca2+ フラックスは、CM特異的遺伝子の発現をモニタリングする方法以外にも、iCMの機能的成熟を評価する方法を提供する。比較的長い実験手順とこれに関連するバリエーションのために、iCMの機能は、さらなる研究と潜在的な臨床使用のために常に受け入れられるとは限りません。CM特異的遺伝子発現は再プログラムされた細胞の特性の一部を明らかにするだけですが、Ca2+ フラックスは、再プログラムされた細胞の品質と効率を評価するために心臓リプログラミング分野の別の側面を提供します。さらに、機能的成熟は心臓機能に関連し、効率を評価するためのより良い指標となり得る。この分野で広く用いられている方法としては、フローサイトメトリー、全ての細胞群のトリプシン消化を必要とする手法が挙げられる。消化は細胞の機能や特性に影響を与える可能性がありますが、システムにばらつきをもたらし、観察された結果を再現する可能性を低下させ、それらの細胞をさらに評価します。これらの方法と比較して、ここで示すトランスジェニックマウス株は、評価に必要な化学物質または実験手順からの潜在的な影響を制限している。これらの利点を使用して、このマウス株は心臓リプログラミングに必要な評価手順を簡素化し、この分野での結果の再現性を高めます。
しかし、この研究にはいくつか制限があります。まず、マウスひずみの確立には時間がかかります。この分野の同僚からのマウス株の問い合わせは、ひずみの確立に必要な時間を短縮するために歓迎されます。第二に、このプロトコルを用いたiCMへの心臓リプログラミングには、複数の要因とステップが含まれ、システムに比較的高い変動を導入する。この分野の能力は、この問題を克服するのに役立ちます。最後に、GCaMP3はCa2+ フラックス条件下でのみ蛍光性を有するため、現在の評価方法は、Myh6-GFP株7による心臓リプログラミングとしてFACSに直接使用することはできません。しかし、現在の株はMyh6-GFP株と比較してより多くの異なる用途を有するが、そのような不便を克服することができる。
全体的に、プロトコルが上記したように、Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株およびiCM成熟の評価は、心臓リプログラミングの全プロセスを監視する戦略を提供する。このGCaMP3媒介Ca2+ フラックス測定戦略は、細胞の生存率を損なうことなく生細胞で行うことができます。GCaMP3蛍光は心筋特異的な遺伝子発現によって駆動されるため、取得したGCaMP3蛍光データをさらに定量化して、リプログラミング効率およびiCM活性を明らかにすることができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この原稿の英語のテキストを編集するレオ・グナトフスキーの努力に感謝します。図 1 は、BioRender.com で作成されています。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)によって支援されました (1R01HL109054) 王博士への助成金.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
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