Summary
Vi beskriver her etableringen og anvendelsen af en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (benævnt αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) musereporterlinje til omprogrammering af hjerte. Neonatale hjertefibroblaster (NCF'er) isoleret fra musestammen omdannes til inducerede kardiomyocytter (iCMs), hvilket giver mulighed for bekvem og effektiv evaluering af omprogrammeringseffektivitet og funktionel modning af iCMs via calcium (Ca2+) flux.
Abstract
Hjerte omprogrammering er blevet en potentielt lovende terapi til at reparere et beskadiget hjerte. Ved at indføre flere transskription faktorer, herunder Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblaster kan omprogrammeres til induceret kardiomyocytter (iCMs). Disse iCMs, når de genereres in situ i et infarkt hjerte, integrere elektrisk og mekanisk med det omgivende myokardie, hvilket fører til en reduktion i arstørrelse og en forbedring i hjertefunktionen. På grund af den relativt lave omprogrammering effektivitet, renhed og kvalitet af iCMs, karakterisering af iCMs er fortsat en udfordring. De aktuelt anvendte metoder på dette område, herunder flowcytometri, immunocytokemi og qPCR, fokuserer primært på hjertespecifikt gen- og proteinekspression, men ikke på den funktionelle modning af iCMs. Udløst af handling potentialer, åbningen af spænding-gated calcium kanaler i kardiomyocytter fører til en hurtig tilstrømning af calcium ind i cellen. Derfor er kvantificering af calciumtilstrømningen en lovende metode til at evaluere kardiomyocytfunktion. Her introducerer protokollen en metode til at evaluere iCM-funktionen ved calcium (Ca2+) flux. En αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme blev etableret ved at krydse Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (kaldet Myh6-Cre nedenfor) med Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (benævnt Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) mus. Neonatale hjertefibroblaster (NCF'er) fra P0-P2 neonatale mus blev isoleret og kultiveret in vitro, og en polycistronisk konstruktion af MGT blev introduceret til NCF'er, hvilket førte til deres omprogrammering til iCMs. Fordi kun med succes omprogrammeret iCMs vil udtrykke GCaMP3 reporter, den funktionelle modning af iMP'er kan visuelt vurderes af Ca2 + flux med fluorescens mikroskopi. Sammenlignet med ikke-omprogrammerede NCF'er viste NCF-iMP'er signifikant calciumtransient flux og spontan sammentrækning, svarende til CMs. Denne protokol beskriver i detaljer musen stamme etablering, isolation og udvælgelse af neonatale mus hjerter, NCF isolation, produktion af retrovirus til hjerte omprogrammering, iCM induktion, evaluering af iCM Ca2 + flux ved hjælp af vores reporter linje, og relaterede statistiske analyse og data præsentation. Det forventes, at de metoder, der er beskrevet her, vil give en værdifuld platform til at vurdere den funktionelle modning af iCMs til hjerte omprogrammeringsundersøgelser.
Introduction
Myokardieinfarkt (MI) er en alvorlig sygdom på verdensplan. Hjerte-kar-sygdomme (CVD'er) er den hyppigste dødsårsag på verdensplan og tegner sig for ca. 18,6 millioner dødsfald i 20191,2. Den samlede dødelighed af CVD'er er faldet i løbet af det sidste halve århundrede. Denne tendens er imidlertid blevet bremset eller endog vendt i nogle uudviklede lande1, hvilket kræver mere effektive behandlinger af CVD'er. Som en af de fatale manifestationer af CVD, MI tegner sig for omkring halvdelen af alle dødsfald tilskrives CVD'er i USA2. Under iskæmien, med blokering af kranspulsårer og begrænset forsyning af både næringsstoffer og ilt, myokardiet lider alvorlige metaboliske ændringer, forringer den systoliske funktion af kardiomyocytter (DM'er), og fører til CM death3. Talrige tilgange i hjerte-kar-forskning er blevet undersøgt for at reparere hjerteskade og genoprette funktionen af den skadede hjerte4. Direkte hjerte omprogrammering har vist sig som en lovende strategi for at reparere det beskadigede hjerte og genoprette sin funktion5,6. Ved at indføre Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblaster kan omprogrammeres til iCMs in vitro og in vivo, og disse iCMs kan reducere arområdet og forbedre hjertefunktionen7,8.
Selvom omprogrammering af hjertet er en lovende strategi for MI-behandling, er der stadig en række udfordringer. For det første er omprogrammeringseffektivitet, renhed og kvalitet ikke altid så høj som forventet. MGT-tilskyndelse kan kun opnå 8,4 % (cTnT+) eller 24,7 % (αMHC-GFP+) af de samlede CF'er, der skal omprogrammeres til iCMs in vitro7, eller op til 35 % in vivo8, hvilket begrænser anvendelsen heraf. Selv med flere faktorer induceret i systemet, såsom Hand29 eller Akt1/PKB10, er omprogrammeringseffektiviteten stadig næppe tilfredsstillende at blive brugt i kliniske omgivelser. Der er således behov for flere undersøgelser med fokus på at forbedre omprogrammeringseffektiviteten på dette område. For det andet er iMP'ernes elektriske integritet og sammentrækningskarakteristika vigtige for en effektiv forbedring af hjertefunktionen, men disse er udfordrende at evaluere. I øjeblikket er udbredte evalueringsmetoder på området, herunder flowcytometri, immunocytokemi og qPCR af nogle vigtige CMs-genersekspression, alle fokuseret på ligheden mellem iCMs og CMs, men ikke direkte relateret til de funktionelle egenskaber ved iCMs. Desuden har disse metoder relativt komplicerede procedurer og er tidskrævende. Mens omprogrammering undersøgelser normalt indebærer en screening af potentielle omprogrammering faktorer, der fremmer iCMs modning11, hjerte omprogrammering opfordrer til en hurtig og bekvem metode baseret på iCMs funktion.
CMs åbne spænding-gated calcium ion kanaler på cytomembrane i løbet af hver ordregivende cyklus, hvilket fører til en forbigående tilstrømning af calcium ion (Ca2 +) fra den intercellulære væske til cytoplasma at deltage i myofilament sammentrækning. En sådan Ca2 + tilstrømning og outflux cyklus er det grundlæggende træk ved myokardiesammentrækning og udgør den normale funktion af CMs12. Således kan en metode, der registrerer Ca2 + tilstrømning være en potentiel måde at måle funktionen af DM'er og CM-lignende celler, herunder iCMs. For iCMs giver en sådan metode desuden en anden måde at evaluere omprogrammeringseffektiviteten på.
Genetisk kodede calciumindikatorer (GEFI'er) er blevet udviklet og i vid udstrækning anvendt til at angive celleaktiviteter, især handlingspotentialer. Generelt består GEFI'er af et Ca2+- bindingsdomæne som calmodulin, og et fluorescerende domæne som GFP, og GCaMP3 er et med høj affinitets- og fluorescensintensitet. GCaMP3's fluorescensdomæne aktiveres, når den lokale calciumkoncentration ændres13. I dette papir, en mus stamme, der specifikt udtrykker en GCaMP3 reporter i Myh6 + celler er beskrevet. Ved at indføre MGT til de isolerede NCF'er fra nyfødte af denne stamme, kan omprogrammeringen overvåges af fluorescens, som med succes omprogrammeres iCMs vil udstille. En sådan musestamme og -metode vil give en værdifuld platform til at undersøge hjerte omprogrammering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer og praksis, der involverer dyr, blev godkendt af Institutional Animal Care &Use Committee på University of Michigan. Alle forsøgsprocedurer og -praksisser, der involverer cellekultur, skal udføres BSL2 Biological Safety Cabinet under sterile forhold. For de procedurer og praksis, der involverer virus, retningslinjen for korrekt bortskaffelse af transfected celler, pipette tips, og rør for at undgå risikoen for miljø-og sundhedsrisici blev fulgt.
1. Etablering af en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (benævnt Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) musestamme (figur 1)
- Forbered Tg(Myh6-cre)1Jmk/J mus stamme (Jackson lab lager 009074, benævnt Myh6-Cre) og Gt (ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze / J mus stamme (Jackson lab lager 014538, benævnt Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), henholdsvis.
- Race hver stamme op til 8 uger gammel for at opnå voksne Myh6-Cre og Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mus, henholdsvis.
- Krydsninger af de voksne Myh6-Cre og Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mus.
BEMÆRK: Opsætning af Myh6-Cre mand/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 kvinde eller omvendt. Der er ingen signifikant forskel mellem deres efterkommere. Typisk vil hunmus føde 8-10 hvalpe 19-21 dage efter krydsningen.
2. Isolation og udvælgelse af neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mus hjerter.
- Få P0-P2 hvalpe. Sørg for, at 8-10 hvalpe er til stede for at isolere 10 millioner NCF'er med denne protokol.
- Dybt bedøvet hvalpene ved hypotermi. Placer hvalpe i en latexhandske og fordyb op til halsen i knust is og vand (2 ° C - 3 ° C).
- Afsprit kort hvalpene med 75% ethanol.
- Ofre hvalpene ved halshugning med steril saks.
- Lav et vandret snit nær hjertet, klem hjertet, og isoler det derefter ved at adskille ved roden af aorta med en saks.
- Overhold hjertet slå under en fluorescens mikroskop. Sørg hjerter med Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotype viser Ca2 + flux angivet af GCaMP3 med hjertebanken. De andre genotyper viser ikke fluorescens (figur 2, video 1 og video 2).
3. Isolering af neonatale hjertefibroblaster (NCF'er)
BEMÆRK: For denne del blev protokol fra Dr. Li Qian's Lab14 vedtaget med mindre optimeringer, når det var relevant for denne undersøgelse.
- Efter isolering af αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hjerter, skære dem i fire stykker, der er løst forbundet. Vask dem i iskold DPBS i en 6 cm plade grundigt flere gange for at begrænse blodcelleforureningen i de isolerede celler.
- Overfør hjerterne til et 15 mL konisk rør.
- Fordøje hjerter med 8 mL varm 0,25% Trypsin-EDTA ved 37 °C i 10 min.
- Kassér trypsin supernatant og tilsæt 5 mL varm type-II kollagenase (0,5 mg/mL) i HBSS.
- Vortex blandingen grundigt, og inkuberes ved 37 °C i 5 min.
- Efter inkubationen hvirvler grundigt og lad det ufordøjede væv slå sig ned af tyngdekraften.
- Supernatanten opsamles i et 15 mL konisk rør med 5 mL koldt fibroblast (FB) medium (IMDM med 20% FBS og 1% penicillin/streptomycin).
- Gentag trin 3.4-3.7 for det ufordøjede væv 4-5 gange.
- Saml alt supernatanten sammen og filtrer supernatanten med en 40 μm si.
- Centrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C og kassér supernatanten.
- Brug cellerne igen i 10 mL magnetisk aktiveret cellesorteringsbuffer (MACS-buffer; 1x PBS med 2 mM EDTA og 0,5% BSA).
- Bestem det levedygtige cellenummer ved at prøve blå farvning.
- 10 μL celler ud fra 10 mL celleaffjedring i trin 3.11.
- Bland med 10 μL af 0,4% trypan blå opløsning og inkubere i 5 min ved stuetemperatur.
- Tilsæt blandingen til et hæmocytometer og bestemme det levedygtige cellenummer. De døde celler er plettet i blå, mens de levedygtige celler er unstained.
- Centrifugere cellerne ved 200 x g i 5 min ved 4 °C og kassér supernatanten.
- Brug cellerne igen med 10 μL thy1,2 mikroperler i 90 μL kølet MACS-buffer til mindre end 10 millioner levedygtige celler. Tilføj flere perler proportionalt, hvis der er mere end 10 millioner levedygtige celler. Pipette blandingen godt og inkuberes ved 4 °C i 30-60 min.
- Tilsæt 10 mL MACS buffer og bland godt.
- Centrifuge ved 200 x g i 5 min, kassér supernatanten.
- Gentag trin 3.15-3.16 én gang.
- Resuspend cellerne og perlerne med 2 mL MACS buffer.
- Sæt en MACS-separator op i emhætten. Indsæt en LS-kolonne i separatoren, og ekvilibrere kolonnen med 3 mL MACS-buffer.
- Når LS-kolonnen er ekvilibreret, skal du overføre cellerne gennem kolonnen.
- Vask LS-kolonnen med 2 mL MACS-buffer tre gange.
- Tag kolonnen af separatoren, eluter den med 2 mL MACS buffer tre gange, og saml derefter elutionen til et 50 mL rør.
- Centrifuge ved 200 x g i 5 min og kassér supernatanten.
- Brug cellerne igen med 5 mL FB-medier.
- Bestem cellenummeret med et hæmocytometer.
- Fortynd cellerne med FB medier og frø cellerne til retter eller plader som ønsket. Sørg for, at cellesåningstætheden er omkring 2-2,5 x 104 celler/cm2 (optimer tætheden baseret på individuelle eksperimenter). Sørg for, at de vedhæftede fibroblaster har en oval til rund form på den anden dag efter såning (figur 3).
4. Produktion af retroviruskodning af polycistronisk MGT-vektor til omprogrammering af hjerte
- Hold Plat-E med Plat-E-kulturmedier (DMEM suppleret med 10% FBS, 1 μg/mL puromycin og 10 μg/mL blasticidin) ved 37 °C med 5% CO2.
- På dag 1, split Plat-E til en 6-brønds plade på ca 4-5 x 105 celler / brøndtæthed.
- På dag 2 når Plat-E typisk 80% sammenløb. Overfør cellerne med følgende procedurer. Juster volumen og mængde af hvert element til stede her baseret på hver brønd i en 6-brønd plade.
- Fortynd 2 μg pMX-puro-MGT polycistronic retrovirus ekspression plasmidvektor (Addgene 111809) til 500 ng/μL med TE buffer.
- Transfektionsblandingen forberedes ved at blande 10 μL lipofectamin med 150 μL reduceret serummedie. Rør forsigtigt for at blande godt og inkubere ved stuetemperatur i 5 minutter. Vær forsigtig med at undgå bobler, når du rører.
- I mellemtiden forberede en plasmid blanding ved at blande plasmid med 150 μL af reduceret serum medium. Rør forsigtigt for at blande godt og inkubere ved stuetemperatur i 5 minutter. Vær forsigtig med at undgå bobler, når du rører.
- Bland forsigtigt de to blandinger og inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Løsningen kan virke overskyet.
- Tilsæt blandingen dråbe for dråbe til de celler, der skal overføres.
- Inkuber cellerne ved 37 °C natten over.
- På dag 3 skal du skifte mediet til et frisk komplet cellekulturmedie, der mangler puromycin og blasticidin.
- På dag 4, 48 timer efter transfektionen, opsamles supernatanten, der indeholder retrovirus, og opbevar den i 4 °C.
- På dag 5, 72 timer efter transfection, indsamle supernatant, der indeholder retrovirus.
- Filtrer både 48 timer og 72 h supernatant med et 0,45 μm filter, bundfald natten over ved 4 °C ved at tilsætte 1/5 volumen af 40% Poly (ethylenglycol) (PEG) opløsning for at lave en endelig koncentration på 8% PEG.
- Centrifuge ved 4.000 x g i 30 min for at udfælde virus.
BEMÆRK: PEG8000-virus danner små hvide nedbør. - Resuspend virus med iCM medium, der indeholder 8 μg/mL polybrene efter ønske. Brug retrovirus med det samme.
5. Omprogrammering NCF'er til iCMs med MGT kodning retrovirus infektion
- Vokse eller passage NCF'er før virusinfektion.
BEMÆRK: Normalt kan NCF passeres to gange. - På dag 0, frø NCF til tætheden omkring 1-2 x 104 celler / cm2 i FB medium.
- På dag 1 skal kulturmediet erstattes med et virusholdigt medium for hver brønd som ønsket. Brug virus fra en brønd Plat-E i en 6-brønd plade til at inficere to brønde i en 24-brønd plade. Titer virus til at bestemme den optimale virus koncentration.
BEMÆRK: Vira, der indeholder andre omprogrammeringsfaktorer af interesse, kan introduceres sammen med MGT retrovirus. - Inkuberes ved 37 °C natten over.
- På dag 2, 24 timer efter virusinfektionen, erstatte det virusholdige medium til et almindeligt iCM-medie.
- Hvis du vil overvåge GCaMP3-udtrykket, skal detplades under et omvendt fluorescensmikroskop. Under 10x på GFP-kanal skal du observere den milde basale GCaMP3 fluorescens af en del celler så tidligt som dag 5.
- Udskift mediet hver 2-3 dage under omprogrammeringen. Hvis det er nødvendigt, skal du foretage et positivt valg for MGT retrovirusinficerede celler ved at tilsætte 2 μg/mL puromycin til kulturmediet i 3 dage og opretholde det ved 1 μg/mL.
BEMÆRK: Indføre kemikalier af interesse (f.eks IGF-1, MM589, A83-01 og PTC-209, benævnt IMAP, som vi tidligere har rapporteret15) sammen med medium forandring. - Efter 14 dages infektion skal mediet udskiftes med B27-medium for yderligere at fremkalde iCM-modning.
6. Evaluering af iCM funktionel modning og omprogrammering effektivitet ved Ca2 + flux
BEMÆRK: Der tilsættes 1 μM isoproterenol til de celler, der om nødvendigt skal evalueres inden vurderingen.
- Vurder Ca2+- fluxen med et omvendt fluorescensmikroskop ved stuetemperatur.
- I GFP-kanalen skal du observere GCaMP3+-cellerne under 10x-målet. Sørg for, at det viser spontane celle slå i den lyse felt kanal.
- Vælg tilfældigt tre felter under 20x, og registrer Ca2+ -fluxen i iCM'erne i 3 min for hvert felt.
BEMÆRK: Her blev Ca2+ flux synkroniseret med spontane cellebanker (Figur 4, Figur 5 og Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8). - Kvantificer cellerne manuelt med Ca2+- flux.
7. Statistisk analyse og datapræsentation
- Analysere forskellene mellem grupper envejsanalyse af varians (ANOVA) og udføre Student-Newman-Keuls flere sammenligningstest.
BEMÆRK: Resultaterne er som gennemsnitlige ± S.E med p < 0,05 betragtes som statistisk signifikant. Hvert eksperiment blev udført mindst tre gange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle arbejdsgang til generering af Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme og genstrukturen af de transgene mus er vist i figur 1. Mens musestammen er etableret, blev hvalpenes hjerter isoleret og observeret under et omvendt fluorescensmikroskop for at bekræfte genotypen. Hjerter med korrekt genotype viser Ca2+ flux synkroniseret med slå, visualiseret som GCaMP3 fluorescens, mens der ikke blev observeret fluorescens i kontrolhjerter (Figur 2, Video 1 og Video 2). Isolerede NCF'er fastgøres til brønden inden for 2 timer og viser en oval til rund form 1 dag efter såningen (figur 3). Den funktionelle modenhed og omprogrammeringseffektiviteten af iPM'er blev evalueret af Ca2+ flux 14 dage efter MGT-introduktionen. De omprogrammerede celler kan vurderes under et fluorescensmikroskop for at måle Ca2+-fluxet. GCaMP3+ celler kunne findes i både IMAP- og MGT-grupper, mens IMAP-gruppen viser betydeligt flere GCaMP3+ celler og celler med Ca2+ svingninger tættere på normale CMs (Videos 3-8). Som vist i figur 4A vil en repræsentativ celle i IMAP-gruppen med Ca2+-svingning vise GCaMP3 fluorescensændring mellem maksimum (mellempanelet) og minimum (højre panel), og Ca2+-svingningen af sådanne celler ændres med jævne mellemrum (figur 4B). Efter indførelsen af IMAP var antallet af pryglklynger betydeligt højere end i kontrolgruppen, da antallet af GCaMP3+-celler med Ca2+-flux pr. højeffektfelt (HPF, 20x objektiv linse) blev øget i den IMAP-medium-behandlede gruppe (figur 5).
Figur 1: Generering Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme. Illustration af Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme generation og genstrukturen af de transgene mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ca2+ flux af det bankende hjerte. GCaMP3 fluorescens blev synkroniseret med hjertebanken i Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hjerter (øverste panel), mens der ikke blev observeret fluorescens i kontrolhjerter (underpanel). Skalalinje = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Isolerede NCF'er fastgjort til en 6-brønds plade. (A) NCF'er under laveffektfelt (LPF, 10x mål, skalalinje = 100 μm). (B) NCF'er under høj effektfelt (20x mål, skalalinje = 50 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ca2+ flux af omprogrammerede celler. (A) IMAP-behandlede NCF'er omprogrammeret til iCMs under GFP-kanal ved høj effektfelt (20x mål). Ca2+ flux af iMP'er blev visualiseret som GCaMP3 fluorescens, hvor celler med Ca2 + flux viser gentagne blinker mellem grundlæggende fluorescens (Ca2 + min, midterste panel) og lyse fluorescens (Ca2 + max, højre panel) synkroniseret med slå. (B) Ca2+ sporkurve for Ca2+ -svingninger+ celler i IMAP-gruppen. Skalastang = 50 μm. F/F0: relativ fluorescensintensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Figur 5: Evaluering af Ca2+ flux under IMAP-medium. Antal GCaMP3+-celler med Ca2+ flux pr. HPF 2, 3, 4 uger efter MGT-induktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Et bankende hjerte isoleret fra hvalpe med αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotype under scanning objektiv linse (4x mål) i GFP-kanalen. Hjertet er GCaMP3+ og blinker mellem grundlæggende fluorescens (Ca2+ min) og lys fluorescens (Ca2+ max) synkroniseret med slag. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Et bankende hjerte isoleret fra hvalpe med kontrol genotype under scanning objektiv linse i GFP-kanalen. Hjertet er GCaMP3- og viser ikke fluorescens blinkende synkroniseret med slå. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: iCMs i IMAP-gruppen under LPF i BF-kanalen (Bright Field). En celle med betydelige slå i midten af feltet kan ses. Både Video 3 og Video 4 fokuserer på det samme felt. Klik her for at downloade denne video.
Video 4: iCMs i IMAP-gruppen under LPF i GFP-kanalen. Flere celler med blinkende fluorescens, herunder den bankende celle set i BF-kanalen kan observeres. Både Video 3 og Video 4 fokuserer på det samme felt. Klik her for at downloade denne video.
Video 5: iCMs i IMAP-gruppen under HPF i BF-kanalen. Center for feltet video 3 og video 4 blev observeret under HPF. En celle med betydelige slå i midten af feltet kan observeres. Både Video 5 og Video 6 fokuserer på det samme felt. Klik her for at downloade denne video.
Video 6: iCMs i IMAP-gruppen under HPF i GFP-kanalen. Centerdelen af feltet Video 3 og Video 4 blev observeret under HPF. Flere celler med blinkende fluorescens, herunder den bankende celle set i BF-kanalen kan observeres. Både Video 5 og Video 6 fokuserer på det samme felt. Klik her for at downloade denne video.
Video 7: iCMs i MGT-gruppen under HPF i BF-kanalen. I modsætning til betydelige slå celler observeret i IMAP-gruppen, der er et par slå celler under BF kanal i MGT-gruppen, som har lavere omprogrammering effektivitet. Både Video 7 og Video 8 fokuserer på det samme felt. Klik her for at downloade denne video.
Video 8: iCMs i MGT-gruppen under HPF i GFP-kanalen. Flere celler med mild blinkende fluorescens kan observeres. Både Video 7 og Video 8 fokuserer på det samme felt. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evaluering af iCMs funktion er nødvendig for hjerte omprogrammering felt. I dette manuskript beskriver protokollen en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musestamme, der er blevet etableret, hvordan man bruger NCF'erne isoleret fra neonatale mus i denne stamme til omprogrammering til iMP'er og evaluering af iMP'er funktion ved Ca2+ flux. Dette er en de novo metode til at evaluere iCMs funktionelle modning.
Flere kritiske trin er vigtige for en vellykket omprogrammering og evaluering med denne metode. For det første skal NCF'er være frisklavede og sunde efter isolation. En hurtig procedure for hjerteisolation og skæring er afgørende. Vigtigst er det vigtigt at følge inkubationstiden for at undgå over-fordøjelse og reduktion i celle levedygtighed og tilstand. For det andet, blandt alle procedurer, virus infektion effektivitet ofte indfører stor variation i resultaterne. Virusinfektion effektivitet er stærkt påvirket af to faktorer. På den ene side skal virus titeren være konstant blandt forskellige forsøg, hvilket kræver konsistens i transfected plasmider mængde og lignende Plat-E celle tilstand og tæthed. Forskere efter denne protokol bør evaluere den optimale såning tæthed og tid før disse procedurer. Virusset bør straks anvendes for at undgå titerdæmpning på grund af virusfølsomhed over for fryse-optøningscyklusser. Derudover er det vigtigt at holde NCF'er i en sund tilstand og passende tæthed på infektionstidspunktet. Forskere bør være bekendt med de nationale centralbankers vækstkarakteristika. Selv omprogrammering af effektivitetsvariationen bør begrænses, kan hyppig overvågning være nyttig. Denne protokol kan nemt ændres for at co-inficere NCF'er med forskellige vira eller behandle dem med kemikalier af interesse. Således er det gældende som en universel metode til hjerte omprogrammering forskning. Udover punkter, der er nævnt her, omfatter almindelige problemer med denne metode lav fluorescens observeret efter omprogrammeringen. Dette kan skyldes flere årsager. For det første, infektionen kan ikke være så effektiv som ønsket, hvilket fører til en lav omprogrammering effektivitet og begrænser antallet af iCMs. For det andet kan det være nødvendigt at justere eksponeringstilstanden optimalt til observation af GCaMP3-fluorescens af iMP'er. Brug af neonatale kardiomyocytter isoleret fra de samme hvalpe som positiv kontrol vil bidrage til at identificere den potentielle årsag.
Ca2+ flux har været meget udbredt til at vurdere celleaktiviteter, herunder i neuronceller16, brystkirtlen17, fedtvæv18 osv. I denne undersøgelse blev Ca2+ flux brugt til at vurdere den funktionelle modning af iCMs. Tidligere er det blevet rapporteret, at Ca2 + flux kan måles ved specifikke kemikalier ved navn små molekyler calcium-følsomme farvestoffer, der kan bruges til at evaluere funktionen af omprogrammerede celler19. En sådan metode har dog flere begrænsninger: Det kemikalie, der introduceres til cellerne, kan have potentiel toksicitet og påvirke de cellulære processer, hvilket gør resultaterne mindre pålidelige end dem, der opnås med den metode, der præsenteres her. Desuden er farvningsprocessen kompliceret og tidskrævende, samtidig med at yderligere evalueringer af disse celler forhindres. Den metode, der præsenteres her, overvinder på den anden side disse begrænsninger. GCaMP3 er ikke-invasiv for cellerne, hvilket minimerer indflydelsen på celleaktiviteter og muliggør yderligere evaluering af cellerne. Da fluorescensen af iCMs kun afhænger af deres identitet, dvs Myh6 udtryk og lokale Ca2 + koncentration ændring, Ca2 + flux fluorescens af celler bliver synlige, så længe NCF'er er omprogrammeret, hvilket muliggør hyppig overvågning af omprogrammeringsprocessen uden en tidskrævende strategi. Mens Ca2+ flux let kan overvåges og registreres under et omvendt fluorescensmikroskop, kan den gentagne prygl og relaterede elektroniske aktivitet på tværs af cellemembranen, dvs. Ca2+ flux, yderligere kvantificeres yderligere20. Som vist i figur 4B kan en sådan kvantificering give flere oplysninger om modenheden af iPM'er og illustrere mere detaljerede strukturer af Ca2+ flux-ændringer under hjerte omprogrammering.
Denne metode har flere fordele. For det første observeres Ca2+ flux udelukkende i iPM'er. Fordi Myh6 er meget specifik for CMs, men ikke CFs, kun de vellykkede omprogrammerede celler vil udtrykke GCaMP3 reporter og blive fluorescerende. For det andet giver Ca2+ flux en måde at evaluere den funktionelle modning af iCMs ud over metoden til overvågning af ekspressionen af CM-specifikke gener. På grund af den relativt lange eksperimentelle procedure og variation, der er forbundet med dette, er funktionen af iPM'er ikke altid acceptabel for yderligere studier og potentiel klinisk brug. Mens CM-specifikke genekspression kun afslører en del af egenskaberne ved den omprogrammerede celle, Ca2 + flux giver et andet aspekt af hjerte omprogrammering felt til at evaluere den omprogrammerede cellekvalitet og effektivitet. Desuden er funktionel modning mere relateret til hjertefunktion, hvilket kan være en bedre indikator til at evaluere effektiviteten. Udbredte metoder på dette område omfatter flowcytometri, en teknik, der nødvendiggør trypsin fordøjelse af alle cellegrupper. Mens fordøjelsen kan påvirke cellefunktioner og egenskaber, det introducerer variation til systemet, faldende potentiale til at reproducere de observerede resultater og yderligere evaluering af disse celler. Sammenlignet med disse metoder har den transgene musestamme, der vises her, begrænset den potentielle indflydelse fra kemikalier eller eksperimentelle procedurer, der er nødvendige for evalueringen. Med disse fordele forenkler denne musestamme de evalueringsprocedurer, der er nødvendige for hjerteprogrammering, og forbedrer reproducerbarheden af resultater på dette område.
Der er dog nogle begrænsninger for denne undersøgelse. For det første er musestammen tidskrævende. Undersøgelser af musestammen fra kolleger på dette område hilses velkommen for at forkorte den tid, der er nødvendig for stammen etablering. For det andet involverer hjerte omprogrammering til iCMs med denne protokol flere faktorer og trin, som introducerer relativt høj variation til systemet. Færdigheder på dette område vil bidrage til at løse dette problem. Endelig, fordi GCaMP3 bliver fluorescerende kun under Ca2 + flux tilstand, den nuværende evalueringsmetode kan ikke direkte bruges til FACS som hjerte omprogrammering med Myh6-GFP stamme7. Men mens den nuværende stamme har flere og forskellige applikationer sammenlignet med Myh6-GFP stamme, sådan en ulejlighed kan overvindes.
Samlet set, som protokollen har beskrevet ovenfor, Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme og efter evaluering af iCMs modning giver en strategi til at overvåge hele processen med hjerte omprogrammering. Denne GCaMP3-medierede Ca2+ flux målestrategi kan udføres i levende celler uden at skade celle levedygtighed. Da GCaMP3 fluorescens er drevet af myokardiespecifikt genekspression, kan de erhvervede GCaMP3 fluorescerende data kvantificeres yderligere for at afsløre omprogrammeringseffektiviteten og iCMs-aktiviteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi sætter pris på Leo Gnatovskiys indsats for at redigere den engelske tekst til dette manuskript. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (NIH) i USA (1R01HL109054) tilskud til Dr. Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
