Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פלטפורמת תרבות איברים מגזריי חיצוני למעקב אחר פציעות גלובוס פתוח וביצועים טיפוליים

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62649
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

Summary

פציעות עיניים גלובוס פתוח עלולות ללכת מטופל במשך ימים מרובים בתרחישים כפריים או צבאיים רלוונטיים, וכתוצאה מכך עיוורון. טיפולים נדרשים כדי למזער את אובדן הראייה. כאן, אנו מפרטים מודל פציעה גלובוס פתוח תרבות איברים. עם מודל זה, טיפולים פוטנציאליים לייצוב פציעות אלה ניתן להעריך כראוי.

Abstract

לפציעות גלובוס פתוח יש תוצאות ראייתיות גרועות, ולעתים קרובות גורמות לאובדן ראייה קבוע. זאת, בין היתר, בשל עיכוב ממושך בין פציעה להתערבות רפואית בסביבות כפריות וביישומים לרפואה צבאית שבהם הטיפול ברופאים לא זמין. פציעות לא מטופלות רגישות לזיהום לאחר שהעין איבדה את החותם האטום במים שלה, כמו גם אובדן הכדאיות של הרקמה עקב תת לחץ דם תוך עיני. טיפולים לאטום באופן זמני פציעות גלובוס פתוח, אם מפותח כראוי, עשוי להיות מסוגל לשחזר את הלחץ התוך עיני ולמנוע זיהום עד טיפול עיניים נאות אפשרי. כדי להקל על פיתוח המוצר, מפורט כאן הוא השימוש של תרבות איברים פלח חיצוני פלטפורמת פגיעה גלובוס פתוח למעקב אחר ביצועים טיפוליים לפחות 72 שעות לאחר פציעה. רקמת מקטע חזירית ניתן לשמור על מנות תרבות איברים מעוצבות בהתאמה אישית ומוחזקת בלחץ תוך עיני פיזיולוגי. פציעות דקירה ניתן ליצור עם מערכת פנאומטית מסוגל לייצר גדלי פציעה עד 4.5 מ"מ קוטר, בדומה לגדלי פגיעה רלוונטיים לצבא. אובדן לחץ תוך עיני ניתן לראות עבור 72 שעות לאחר פציעה המאשר אינדוקציה פציעה נכונה ואובדן החותם אטום למים של העין. ביצועים טיפוליים ניתן לעקוב אחר ידי יישום לעין לאחר אינדוקציה פציעה ולאחר מכן מעקב אחר לחץ תוך עיני במשך מספר ימים. יתר על כן, מודל פגיעה במגזר קרום הלב החל על שיטות בשימוש נרחב עבור פיזיולוגיה מגזרי ריצה פונקציונלית וביולוגית, כגון הערכת שקיפות, מכניקת עיניים, בריאות אפיתל הקרנית, ואת הכדאיות רקמות. בסך הכל, השיטה המתוארת כאן היא צעד הכרחי לקראת פיתוח טיפולי ביו-חומרים לאיטום זמני של פציעות גלובוס פתוח כאשר טיפול עיניים אינו זמין.

Introduction

פציעות גלובוס פתוח (OG) עלולות לגרום לאובדן ראייה קבוע כאשר לא מטופלים או לפחות התייצבו בעקבותפציעה 1. עיכובים, לעומת זאת, נפוצים באזורים מרוחקים שבהם הגישה להתערבות עיניים אינה זמינה, כגון באזורים כפריים או בשדה הקרב בתרחישים צבאיים. כאשר הטיפול אינו זמין, הסטנדרט הנוכחי של טיפול הוא להגן על העין עם מגן נוקשה עד התערבות רפואית אפשרית. ברפואה הצבאית, עיכוב זה הוא כרגע עד 24 שעות, אבל זה צפוי להגדיל עד 72 שעות בפעולות לחימה עתידיות בסביבות עירוניות שבו פינוי אוויר אינו אפשרי2,3,4. עיכובים אלה יכולים להיות ארוכים עוד יותר ביישומים אזרחיים כפריים ומרוחקים שבהם הגישה להתערבות עיניים מוגבלת5,6. פגיעת OG לא מטופלת רגישה מאוד לזיהום ואובדן לחץ תוך עיני (IOP) בשל החותם האטום במים של העין שנפרץ7,8. אובדן IOP יכול להשפיע על הכדאיות של הרקמה, מה שהופך כל התערבות רפואית לא סביר לשחזר את הראייה אם העיכוב בין פציעה וטיפול הוא ארוך מדי9.

כדי לאפשר פיתוח של טיפולים קלים ליישום לאיטום פציעות OG עד שניתן להגיע למומחה עיניים, פותח בעבר מודל פגיעה OG benchtop10,11. עם מודל זה, פציעות במהירות גבוהה נוצרו בעיני חזירים שלמים בעוד IOP נתפס על ידי מתמרי לחץ. לאחר מכן ניתן ליישם טיפולים כדי להעריך את יכולתם לאטום את אתר הפציעהOG 12. עם זאת, כמו מודל זה משתמש בעיני חזיר מלא, זה יכול רק להעריך ביצועים טיפוליים מיידיים ללא דרך לעקוב אחר ביצועים לטווח ארוך על פני החלון האפשרי 72 שעות שבו הטיפול חייב לייצב את אתר הפציעה עד המטופל מגיע לטיפול מיוחד. כתוצאה מכך, פותח מודל פגיעה במגזרזרזר אחד (ASOC) OG ופורט בפרוטוקול זה כפלטפורמה למעקב אחר ביצועים טיפוליים ארוכי טווח13.

ASOC היא טכניקה בשימוש נרחב לשמירה על רקמת כלי דם של החלק הימני, כגון הקרנית, במשך שבועות מרובים לאחר enucleation14,15,16,17. המקטע החיצוני נשמר תחת IOP פיזיולוגי על ידי זלוף נוזלים בקצבי זרימה פיזיולוגיים ושמירה על אזור זרימת העבודה הטראבולרית, הרקמה האחראית על ויסות IOP, במהלך הגדרת ASOC18,19. פלטפורמת ASOC יכולה לשמור על רקמות פיזיולוגיות, לגרום לפגיעת OG באמצעות מכשיר המופעל על ידי פנאומטי, ליישם טיפול, ולעקוב אחר ייצוב פציעה לפחות 72 שעות לאחרפציעה 13.

כאן, הפרוטוקול מספק מתודולוגיה שלב אחר שלב לשימוש בפלטפורמת ASOC. ראשית הוא מפרט כיצד להגדיר ולזיוף את פלטפורמת ASOC. לאחר מכן, הפרוטוקול מפרט כיצד לנתח באופן אספטי את המקטע הימני ולשמור על רשת המיזוג הטראבקולרית, ואחריה הגדרת רקמת מקטעים ימנית במנות תרבות איברים שנבנו בהתאמה אישית. לאחר מכן, הוא מפרט כיצד ליצור פציעות גלובוס פתוח וליישם טיפולי מיד לאחר הפציעה. לבסוף, הפרוטוקול מספק סקירה על פרמטרי אפיון המאפשרים לשימוש בשיטה זו המעריכה תכונות תפקודיות, מכניות וביולוגיות של העין וכמה טוב הפגיעה התייצבה. בסך הכל, מודל זה מספק פלטפורמה נחוצה להאצת פיתוח המוצר לייצוב וטיפול בפציעות גלובוס פתוח ולשיפור הפרוגנוזה לקויה של הראייה בעקבות פציעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לפני ביצוע פרוטוקול זה, שים לב כי קיימות דרישות משפטיות ואתיות לשימוש בבעלי חיים במחקר ובהכשרה. אם בעלי חיים משמשים למקור של רקמת העין, בקש אישור על ידי הרשות האתית או המשפטית המקומית (IACUC או ועדת האתיקה וכו ') לפני תחילת. אם יש שאלה בקבלת אישור לשימוש בבעלי חיים, אל תמשיך. קבענו בעבר ודיווחנו כי עיני חזיר טריות שהושגו ושימשו בתוך 24 שעות לאחר המוות בהשוואה לפיזיולוגיה של ויוו והסתדרו היטב עבור מחקרים אלה (טכנולוגיות בעלי חיים, טיילר, TX, ארה"ב)10,13. לא נעשה שימוש בבעלי חיים לאורך פרוטוקול זה, באמצעות ספק רקמות כדי להשיג רקמה בתוך 24 שעות.

הערה: לפני הגעת הרקמה, לפברק את מנות תרבית האיברים(פרוטוקול משלים 1),טבעות הידוק(פרוטוקול משלים 1),דוכני צלחת(פרוטוקול משלים 1),הגדרת איסוף נתונים מתמר לחץ (פרוטוקול משלים 2),ופלטפורמת ניקוב פנאומטית(פרוטוקול משלים 3). מחטאים את הכלים, הכלים והאספקה ומכינים את אזורי העבודה. זה שימושי יש אזור לא סטרילי לבצע ניתוח ברוטו על העיניים, כפי שהם בדרך כלל מגיעים עם חיבור, רקמת מסלולית נוספת מחובר. בצע את השלבים הראשונים האלה על משטח עבודה פתוח ונקי, ולאחר מכן העבר את העיניים באופן הפוך לארון BSC II עבור מיקרו-ניתוח (ארון #1). באופן אופטימלי, ארון BSC II המשמש למיקרו-דיסקציה מופרד מארון הרכבת המנה BSC II (ארון #2) כדי למזער את זרימת האוויר ולמקסם את סביבת העבודה. הגדירו את ארון הניתוחים הזעירה עם מיקרוסקופ ניתוח ודרך לדמיין את משטח העבודה (מצלמה או שעונים בולטים מהארון).

1. שלבי עיקור, אספקה (ראו טבלת חומרים לפרטים נוספים) והגדרה

  1. הכן ועקר בגז את הפריטים הבאים (ערכה אחת לכל עין): צלחת ASOC, טבעת הידוק, שני מחברים נוזליים עם טבעות O, שתי רכזות מחט 18 גרם, ארבעה ברגים, שני אורכים של צינורות PE-100 (אורך המרחק צריך להיות ארוך מספיק כדי להאריך מהצלחת בתוך החממה למשאבת המזרק ומערך איסוף נתוני מתמר לחץ), שני רכזות מחט מכופפות 18 G 90°, שני שסתומים תלת-כיווניים.
  2. הכן וערוך אוטומטית את הערכות הבאות.
    1. הכן וחתוך אוטומטית את ערכת מכשירי המיקרו-ניתוח, המכילה זוג אחד של מלקחיים עדינים, זוג מספריים אחד של ואנס, זוג אחד של מלקחיים בעלי שיניים בינוניות, זוג מספריים גדולים, צמר גפן, וסכין גילוח או אזמל.
    2. הכן וכלול אוטומטית את ערכת כלי ההרכבה, המכילה זוג אחד של מלקחיים בעלי שיניים בינוניות, זוג מספריים כירורגיים אחד ומפתח L אחד.
    3. הכן וצמצם אוטומטית את הערכה היומית (כמות: אחד ליום של תרבות), המכילה מפתח L אחד להדק טבעות הידוק למנות בכל יום לפי הצורך.
    4. יש לאחסן אוטומטית ארבעה מכלי 100 מ"ל לחיטוי ולאחסון עיניים ומקטעים קהוריים.
    5. תציב אוטומטית את אובייקטי הנקב.
  3. לאסוף את הפריטים הסטריליים הבאים: צלחת פטרי (1 צלחת / עין), גזה (1-2 / עין), עמדת צלחת, 20 מזרקים מ"ל (1/עין), 10 מזרקים מ"ל (1/ עין), מסנני מזרק ניילון (1/ עין).
  4. הכן מדיה סטרילית: DMEM עם 4% FBS, 1x גלוטמקס, 1x גנטמיצין, 1x אנטישמיקוטי אנטישמי (AA; כ 30-40 מ"ל מדיה מלאה / עין).
  5. הכן AA-PBS: PBS עם AA 1x (~ 500 מ"ל).
  6. הכן את ערכת כלי הניתוח הגסה: מספריים כירורגיים גדולים ונקיים ומלקחיים.
  7. הגדר את סביבת העבודה של ניתוח לא סטרילי: אסוף אספקה מחבילת כלי ניתוח גולמית, עיני חזיר משודרגות שקועות ב- PBS ועל קרח, וילון כירורגי, 100 מ"ל עם PBS. לפרוס את הוילון הכירורגי ואת הפריטים הנדרשים לניתוח ברוטו.
  8. הגדר את סביבת העבודה הסטרילית של ביתור: אסוף אספקה מערכת מכשירים מיקרו-ניתוח, גזה סטרילית, מיקרוסקופ ניתוח, פתרון betadine, PBS סטרילי, מדיה סטרילית, ארבעה כוסות 100 מ"ל מעוקרות, צלחת פטרי סטרילית. העברה אספטית לארון BSC II #1. הגדר את הארון להדמיית עיניים על המיקרוסקופ הניתח.
  9. הקם את סביבת העבודה של הרכבה ASOC: אסוף ערכות מעוקרות בגז (ערכת כלים וערכת מכסה), ערכת כלי הרכבה, מדיה סטרילית, דוכני כלים, צלחות פטרי סטריליות, מזרקים סטריליים ומסנני מזרק. העברה אספטית לקבינט BSC II #2. תארגן את הארון להרכבה של כלים.
  10. כאשר העיניים מתייצבות ומוכנות לנקב (72 שעות לאחר ההתקנה), מעביר אותן באופן טפיטי לארון BSC II. הגדר את סביבת העבודה אינדוקציה פציעה OG: התקן אינדוקציה פציעה מופעל פניאומטי (הרכבה המפורטת בתוספת 3) ושקע מעבדה ומקסימום מעקב צולב להחזיק את צלחת ASOC.

2. ניתוח של רקמות

  1. הכן את רקמת החזיר באמצעות סביבת עבודה לא סטרילית של ניתוח.
    1. רכשו עיני חזיריות משורבות מבית מטבחיים מקומי, ממחקרים בבעלי חיים או מספק. שמור את העיניים על קרח שקוע PBS במהלך הלידה ולהשתמש מיד עם קבלת.
    2. חותכים את הרקמה החוץ-אורביטלית ומקצצים את הלחמית ומשאירים רק את קליפת הקורניאוסקלרלי ואת עצב הראייה. בצע את הניתוח בתנאים לא סטריליים עם מספריים כירורגיים גדולים ומלקחיים בערכת כלי ניתוח גולמית.
    3. מחזירים את העיניים ל-PBS טרי על הקרח עד שכל העיניים הנדרשות להתקנה ניסיונית נותחו ראשוניות/ברוטו.
    4. שקועים בעיניים בתמיסת betadine 10% למשך 2 דקות במיכלים סגורים ומעבירים באופן אספטי לארון BSC II #1. בצע את כל העבודות הבאות בתנאים סטריליים כדי למזער את הזיהומים במהלך ההתקנה.
  2. לנתח באופן סטרילי מקטעים קהוריים.
    1. לאחר 2 דקות בתמיסת betadine, להעביר את העיניים לשלוש שטיפות סדרתיות של AA-PBS סטרילי כדי להסיר תמיסת betadine עודף מפני השטח העין תוך שמירה על סטריליות של רקמת העין. לאחר שלוש שטיפות, לשמור על הרקמה ב- AA-PBS עד לשימוש נוסף.
    2. יש להחמיע את העין באמצעות סכין גילוח/אזמל ומספריים מעוקלות. מניחים את העין על גזה ספוגה AA-PBS וליצור חתך עם סכין גילוח סטרילי או אזמל ליד קו המשווה של העין (60/40 לפצל עם 40 בצד הצידה השמאלי). באמצעות מספריים כירורגיים מעוקלים, יש לבודד את העין האחורית (חצי הקרנית).
      הערה: החתך סביב המקטע החיצוני צריך להיות רציף כדי למנוע קצוות משוננים ומחוספסים בסקלרה שייצרו דליפות נוזלים לאחר ההתקנה בתרבות האיברים.
    3. השתמש מיקרו-cissors כ ואת חפירה כדי לגרוף הומור מצחילי מן הקטע החלקי. הסר את העדשה מהקטע החלק החלקי בחלקו החלקים הזעירים באמצעות מיקרו-רסיסים. השאר את המקטעים הימניים ב- AA-PBS עד לשלבי ניתוח נוספים.
      הערה: כל העיניים שינותחו יכולות להיות מוחזקות בשלב זה ואחת אחת נלקחות דרך שארית תהליך הניתוח.
    4. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, קיצצו את הקשתית לשורש הקשתית בהדרגה, רדיאלית עד שעבודת רשת trabecular (TM) גלויה. ה- TM היא רקמה פיגמנטית הכוללת סיבים המכוונים באופן היקפי סביב קליפת הקורניאו. חתכים זהירים לתוך הקשתית לכיוון שורש הקשתית יחשפו את עומק ה- TM מתחת לרקמה.
    5. חותכים 360° סביב הקשתית באותו עומק כמו החתך הראשוני לרקמה כדי לחשוף את כל אזור TM. נקו כל הקשתית שנותרה המכסה TM לפי הצורך.
    6. חותכים את שרידי הגוף הססיריים האחוריים ל- TM, ומשאירים רק רצועה דקה של רקמה אחורית לאזור TM (כ -1 מ"מ).
    7. מקם את המקטע החלקה החלקה של החלקה החלקה של החלקה המפורחת (AS) במדיה עד להתקנה נוספת ב- ASOC בארון BSC II #2.
      הערה: כל העיניים יכולות להיות מוחזקות בשלב זה לפני הגדרת ASOC אם משתמש יחיד מבצע ניתוח והרכבה צלחת תרבות איברים.

3. הקמת מקטעים קהוריים במנות תרבות איברים

  1. מניחים AS יחיד בצלחת פטרי עם AS הפוך (כוס למעלה). באמצעות צמר גפן, רטוב בתקשורת בעדינות טיפה במרכז הקרנית כדי להסיר כל פיגמנט. באמצעות מלקחיים כדי להחזיק את העין ואת אותה ספוגית, לנגב את צמר גפן סביב sclera כדי להסיר פיגמנט נוסף.
  2. הפוך את AS ומניחים על החלק התחתון של המנה מעל האזור המוגבה, מרכז הקרנית מעל האזור המוגבה בצלחת. הנח את טבעת הידוק על גבי AS החדש שהוצב.
  3. מניחים ארבעה ברגים לתוך החורים המתאימים כדי להחזיק את הטבעת במקום עם AS מתחת לטבעת. הדק בעדינות את הברגים בעזרת ה-L-key.
    הערה: שלב ההידוק יקרה מדי יום במהלך הניסוי, ולכן מטרת ההידוק הראשוני כאן היא להבטיח שהתקשורת לא תדלוף תוך הימנעות משבירת טבעת ההידוק.
  4. עם סט צלחת פטרי סטרילי, מניחים את החלק העליון מעל המנה והורידו את ההתקנה. חברו את דוכן הכלים. חבר את המחברים הנוזליים עם טבעות O ליציאות משורשלות בתחתית המנה.
  5. למחבר נוזלי אחד, חבר רכזת מחט כפופה של 18 G 90°, אורך צינורות, רכזת מחט 18 G, מסנן מזרק ניילון, שסתום משולש ומזרק 20 מ"ל מלא במדיה.
  6. למחבר הנוזלי השני, חבר רכזת מחט כפופה של 18 G 90 מעלות, אורך הצינורות, רכזת מחט 18 G, שסתום משולש, ואת חלק החבית של מזרק סטרילי 10 מ"ל (זה ישמש כמאגר לתפוס נוזלים ובועות מן ASOC).
  7. עם שסתומים משולשים הפתוחים כראוי למזרקים, דחפו בעדינות מדיה דרך המערכת באמצעות יציאת מחבר Fluidics שזוהתה בשלב 3.5 כדי לנפח את ה- AS, למלא מדיה בצינורות, ובסופו של דבר למאגר.
    הערה: אם התקשורת דולפת לתוך צלחת ASOC, AS אינו מאובטח מספיק בחוזקה עם טבעת הידוק.
  8. הסר בועות על ידי דוחף בעדינות מדיה לתוך המנה ולהפוך את המנה לדחוף את הבועות לתוך המאגר.
  9. מניחים את המנה ולעמוד זקוף. מניחים את החלק התחתון של צלחת פטרי מתחת לרגלי הדוכן, נזהרים לא לנהם את הצינורות.

4. התחלת תרבות איברים של מגזרי תחליפית

  1. ASOC הוא עכשיו מוכן לדגירה. מניחים את צלחת ASOC לתוך אינקובטור תרבית התא (37 °C (37 °C), 5% CO2). ודא את הגובה של צלחת ASOC באינקובטור מעל מתמרי הלחץ ידוע וחשב לחישוב IOP במדויק (פרוטוקול משלים 4).
  2. כוון את קווי הצינורות החוצה דרך החלק התחתון של 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור הדלת, כך שהם לא מפריעים הפתיחה והסגירה של הדלת. חבר את המזרק 20 מ"ל למשאבת המזרק להגדיר ב 2.5 μL / min.
  3. מקם את קו הצינורות עם המאגר במכשיר מתמר הלחץ. חבר את שסתום 3 כיווני הצד להגדרת מתמר הלחץ תוך הזרמת PBS דרך הקו כדי למנוע בועות אוויר נכנס קווי צינורות.
    הערה: רוקן את ה- PBS מהמאגרים לאחר הקמת המערכת כדי להפחית את הסבירות לזיהום מאגר עם צמיחה מיקרוביאלית למשך תרבית האיברים.
  4. הפעל איסוף נתוני IOP על-ידי הבטחת תחילה שכרטיס microSD קיים לשמירת קבצי נתונים. לאחר מכן, הפעל את הגדרת מתמר הלחץ כדי להתחיל באיסוף נתונים.
    הערה: פרטים להגדרת התקן איסוף הנתונים של מתמר הלחץ מסופקים בפרוטוקול משלים 2.

5. תחזוקה יומית של ASOC

  1. לאחר ASOC היה 24 שעות כדי שיווי משקל, להסיר את הכלים מן 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור ולהניח אותם לתוך ארון BSC II.
    הערה: ברכישת נתוני לחץ, תקופות זמן אלה נראות כמו קוצים כאשר ASOCs מוסרים מהאינקובטור (שינוי גובה) ומותאמים בארון.
  2. בדוק אם יש דליפות מתחת לכל מנה על צלחת הפטרי. אם יש, יש לבדוק אם יש קשרים נוזליים הדוקים מתחת לצלחת ולהדק מחדש במידת הצורך. בדוק אם יש דליפות בחלק העליון של המנה באמצעות מקש L סטרילי כדי להדק את הברגים בטבעת ההידוק.
    הערה: רקמת הסקלרה AS תדוחס ותפחית את העובי ב-24 שעות, ויהיה צורך להדק את טבעת ההידוק.
  3. שאפו היטב את התקשורת מהמנה.
    הערה: רשת המיזוג הטראבקולרית מסננת נוזלים מהמדיה הנישבת לתוך ה- ASOC. לכן, המדיה תהיה נוכחת בצלחת ASOC לאורך הקצוות.
  4. חזור על שלבים 3.7 ו- 3.8 כדי להסיר את כל בועות האוויר הלכודות.
  5. מילוי מזרקים על משאבות המזרק, להבטיח את משאבות המזרק פועלות, ולאשר את היישור של שסתומים עבור זלוף לתוך ASOC. מחזירים את מנת ASOC לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור.
    הערה: באופן אופטימלי, שלבים אלה צריכים להתבצע מדי יום. עם זאת, השימוש בנפח התחלתי של 20 מ"ל של מדיה, נפח צלחת ASOC היטב, וקצב משאבה של 2.5 μL / min צריך להיות מספיק כדי לאפשר למערכת לפעול במשך כמה ימים ללא הפרעה.

6. אינדוקציה לפציעת OG עם התקן ניקוב המופעל על ידי פנאומטיים

הערה: בניית התקן ניקוב פנאומטי מפורטת בפרוטוקול משלים 3. פציעות OG נגרמות לאחר IOP התייצב, אשר מתרחשת בדרך כלל לאחר 3 ימים בתרבות. ערכי IOP מקובלים הם 5-20 מ"מ כ"ג בהתבסס על IOP פיזיולוגי, אשר ניתן לקבוע על ידי הערכת קבצי הנתונים IOP או הגדרת מחווני LED במערכת מדידת הלחץ כמתואר בפרוטוקול משלים 2.

  1. הכן את ארון BSC II עבור אינדוקציה פציעה OG כמפורט בשלב 1.10. חבר את פלטפורמת הנקב לקו אוויר דחוס. חבר את חפץ הנקב הסטרילי לצ'אק.
    הערה: מדחס אוויר יכול לשמש להפעלת המכשיר, אבל אוויר דחוס טנק או קווי מעבדה מובנים יכול להספיק אם הלחץ גדול מ 50 פסאיי.
  2. הגדר את וסת הלחץ על פלטפורמת הדקירה ל-50 פסאיי לכוח דקירה נאות על עצמים בקוטר של עד 4.5 מ"מ. מקם את גוזמת המעקב הצולבת על שקע המעבדה מול פלטפורמת הנקב כדי להחזיק את צלחת ASOC במהלך אינדוקציה לפציעה.
  3. הסר את הגדרת ASOC מ- 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור, והצב במקשפי המעקב הצולבים בניצב לפלטפורמת הנקב(איור 2)לאחר הסרת המכסה והנחתו בצד. שמור על המקטע החיצוני זלוף אבל לסגור את יציאת שסתום 3 כיוונים כדי מתמר הלחץ כדי למנוע נזק לחץ יתר על המתמר.
  4. הרחיבו את זרוע הבוכנה למרחק המקסימלי שלה וממקמים את פסגת הקרנית בטווח של 1 מ"מ מחפץ הדקירה. יש לסגת מזרוע הבוכנה ולקרב את המקטע הימני 1 ס"מ לעצם הדקירה.
    הערה: מרחק זה עבר אופטימיזציה עבור אינדוקציה פציעה יעילות גבוהה מבלי להכות את צלחת ASOC.
  5. פטר את מכשיר הדקירה על ידי הפעלתו ופתיחת שסתום סולנואיד עם המתג השני במכשיר. כדי לבטל את ההתקן, לחץ שוב על המתג השני כדי להסיר את התקן הדקירה מהעין. לאמת פציעה נאותה אינדוקציה על ידי בדיקה חזותית ודליפת מדיה מאתר הפציעה.
  6. הסר צלחת ASOC מן המגוזף; מניחים את המכסה בחזרה על הרכבת המנה ופותחים את הקו הנוזלי אל מתמר הלחץ. מחזירים את ה-ASOC לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    הערה: בשלב זה, טיפול יכול להיות מיושם על AS כדי להעריך את יעילותו לאיטום פציעות OG.

7. הסרת ASOC מהתרבות

הערה: בהתאם לניתוח נקודות קצה (ראה תוצאות מייצגות עבור שיטות נקודת קצה אפשריות), AS צריך להישאר בצלחת ASOC מנופח בעוד שיטות אחרות דורשות רקמת AS מבודדת מתא התרבות. המתודולוגיה שלהלן מתארת כיצד להוציא את AS מהמנות של תרבות האיברים ולהסיר את שאר ההתקנה.

  1. הסר את מנות ASOC מן 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור. סגור את השסתום ה-3 למזרק ולמאגר ותנתק את הצינורות מהמערכת. השלך את המזרק, המאגר והמסנן. מניחים את השסתומים, הצינורות ורכזות המחט ה-30 במיכל נפרד לשטיפה וחיטוי.
  2. נתק את רכזות המחט מהחיבורים הנוזליים בתחתית המנה. בטל את המחברים הנוזליים וטבעות ה-O. מניחים את כל הפריטים במיכל לשטיפה וחיטוי.
  3. הסר את ארבעת הברגים מטבעת הידוק באמצעות L-key. הסר בזהירות את טבעת הידוק.
  4. באמצעות מלקחיים, להסיר את AS מן המנה, בהתאם לניתוח נקודות קצה ותמונה, למקם פסולת biohazard קבוע או מתאים.

8. ניתוח נתוני IOP

  1. חבר את כרטיס microSD למחשב כדי להסיר את קובץ .txt המכיל נתונים מההפעלה הניסיונית האחרונה.
    הערה: הקובץ נקרא בקוד השולט במיקרו-בקר ויש לעדכן אותו עבור כל ניסוי (ראה פרוטוקול משלים 2).
  2. יבא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
  3. ארגן את הנתונים ל- 12 עמודות: אות זמן (בדקה) ו- mV עבור כל אחד מ- 11 ערוצי מתמר לחץ. עשרת הערוצים הראשונים תואמים לעשרה מערכים ניסיוניים של ASOC. אות המתמר הסופי הוא עבור חיישן פתוח לאוויר כערוץ בקרה כדי לאשר אות mV לא השתנה עקב שינויים באות הקלט. ערוץ בקרת התוויה לעומת זמן לאישור אות MV היה עקבי לאורך כל הדרך.
  4. המר את אותות ה- mV עבור עשרה ערוצים ל- mmHg באמצעות משוואות יירוט שיפוע שנוצרו מהכיול הראשוני של כל חיישן (ראה פרוטוקול משלים 4).
  5. זמן התוויה (המר לימים כדי לפשט את פרשנות הנתונים) לעומת כל אחד מעשרת הערוצים כדי לקבוע כיצד ה- IOP התנודתי לאורך מסלול הזמן הניסיוני.
  6. קבע ערכי IOP ממוצעים בנקודות מפתח בנתונים כדי להשוות בקלות רבה יותר ערכים בין כל אחד מהם לבין האופן שבו הם משתנים לפני ואחרי אינדוקציה של פגיעה ב- OG. ממוצע 2-3 שעות של נתונים עבור כל מרווח זמן של 24 שעות כדי לקבוע IOP בכל יום של ASOC.
    הערה: תוצאות IOP מייצגות מוצגות באיור 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונות שצולמו באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) מוצגות לעיניים פצועות של OG כדי להמחיש כיצד נראית אינדוקציה מוצלחת של פציעה. איור 3 מציג תמונות לשליטה ורקמות AS פצועות של OG מיד לאחר הפציעה ו-72 שעות מאוחר יותר. מוצגות שתי תצוגות: תמונות חתך דרך אתר הפציעות והקרנת עוצמה מרבית מלמעלה למטה (MIPs) כדי לדמיין את שטח הפנים של התמונה. עיני בקרה מראות שאין הפרעה ניכרת בקרנית, בעוד פציעות ברורות ניתן לאתר כי לחצות את הקרנית כולה לאחר פציעת OG. מ- MIPs, ניכר כי פציעות אינן סדירות בצורתן ובגודלן, אך גודל הפציעה יורד מעל 72 שעות. בעבר, אפקט זה הוכיח להיות משמעותי עבור מספר גדלי פציעה נבדק13.

פלט הנתונים העיקרי עבור מודל הפציעה של OG המתואר בפרוטוקול זה הוא לחץ תוך עיני במהלך ההתקנה הניסיונית. הנתונים נרשמים ביחידות של מילבולטים כפלט מכל מתמר לחץ שניתן להמיר ל- mmHg באמצעות כיול (פרוטוקול משלים 4). נתוני IOP לדוגמה לעומת קורס הזמן הניסיוני מסופקים לעיניים הנחשבים מקובלים ואחרים שלא ייחשבו שמישים (איור 4A). מנתוני מעקב הלחץ, העיניים היו מחוברות לחיישנים לאחר 24 שעות בתרבות, אבל IOP ממשיך להשתנות מעל 72 השעות הראשונות בתרבות. IOP פיזיולוגי עבור רקמת AS בתרבות האיברים הוא כ 8-10 מ"מ כ"ג, כך 2x ו 1/2x טווח הוחלט על כשער לערכי IOP שמיש לאחר ערכים התייצבו (5-20 מ"מ כ"ג). רק עיניים שהיו בטווח הזה יהיו מותרות לשימוש עם שאר הפרוטוקול. מניסויים קודמים, היה לנו שיעור הצלחה של 90% שהושג במערך ASOC לייצוב עיניים בטווח הנדרש(איור 4B).

התוצאות של שינויי IOP עקב פגיעה ב-OG והתערבות טיפולית מסופקות גם הן (איור 4C,D). לאחר אינדוקציה פציעה OG, הלחץ צריך לרדת באופן משמעותי ולהישאר ככה עד הרקמה מוסרת ASOC (איור 4C). אם עין לאחר אינדוקציה פציעה אינה יורדת בלחץ, זה מצביע על כך פציעה מוצלחת לא נגרם כמו IOP צריך להיות מופחת אם חותם אטום למים של העין נפגע. עם זאת, גדלי פציעה קטנים יותר עשויים לרפא את עצמם, מה שעלול לגרום IOP להיות משוחזר. אם טיפול מוחל על העין לאחר אינדוקציה פציעה OG, שחזור של IOP ניתן לעקוב במהלך ASOC. תפיסה זו מודגמת בנתונים המראים דבק Dermabond להחיל על 2.4 מ"מ פציעות OG (איור 4D). תוצאות ממוצעות עבור חמישה ניסויי ASOC נפרדים עם ובלי טיפולי מוצגים וניכר הטיפולי מגביר IOP. שיטה זו יכולה למדוד את היעילות של הטיפול לשיקום IOP ולעקוב אם לחץ זה משוחזר על פני המפתח 72 h לאחר OG פציעה.

יתר על כן, פרוטוקול ASOC ניתן להתאמה לשימוש עם מגוון רחב של נקודות קצה אפיון כדי לענות על הדרישות הניסיוניות של משתמש הקצה. במהלך התרבות, מדיה זרימה עוזב את העין ניתן לאסוף על בסיס יומי או אפילו מדי שעה אשר ניתן להשתמש בו למעקב אחר שינויים ברמת החלבון המתרחשים במהלך ASOC, לאחר אינדוקציה פציעה OG, או לאחר טיפול מוחל. לדוגמה, זימוגרפיה ג'לטין בוצעה בעבר כדי לזהות מטריצה metalloproteinase רמות כדי לעקוב אחר ריפוי פצעים ושיפוץרקמות 20. נקודות קצה ביולוגיות נוספות אפשריות לאחר הסרת רקמות מתרבית באמצעות שיטות אימונוהיסטוכימיה מסורתיות להערכת הכדאיות שלהרקמה 21,22, מעקב אחר שינויים פתופיזיולוגיים בקרנית23,24, או כתמים מבוססי נוגדנים עבור כל חלבון של עניין25,26.

מדדי קרנית פונקציונליים ניתן להשיג גם מן העיניים נשמר ASOC. ניתן להעריך את שלמות האפיתל הקרנית באמצעות כתם עיניים פלואורסצין ורכישת תמונה באמצעות מקור אור כחול27,28. לאחר הסרה מתרבות, רקמת הקרנית ניתן להעריך לשקיפות באמצעות רכישת תמונה פשוטה13. הדמיה עינית מסורתית יכולה להתבצע גם כדי להעריך את מבנה הרקמה עם או בלי התערבות טיפולית. תמונות OCT, כפי שמוצג באיור 3, יכולות ליצור תמונות חתך דרך הקרנית וניתן ללכודן באופן לא פולשני, מה שעלול לאפשר איסוף תמונות תוך שמירה על רקמות בתרבית. שיטות הדמיה אחרות כגון מיקרוסקופיה של מנורת חריץ, אולטרסאונד, או מיקרוסקופיה קונפוקלית של ויוו יכולים להיות מותאמים גם לרכישת מידע אנטומי נוסף.

לבסוף, הערכה של תכונות מכניות של החלק החלק התחתון ניתן ללכוד כדי להבין את ההשפעה של פגיעת OG או טיפול לאחר מכן על הרקמה הבסיסית. בעוד שאיסוף נתוני IOP לבדו מדגיש כיצד שלמות האטם האטום במים של העין נפגעה, הראינו בעבר כי ניתן למדוד מדדי בדיקה נוספים כדי להקניט תכונות מכניות נוספות10,11. תאימות עינית, מאפיין מכני גושי המתאר כיצד שינויים בלחץ התוך עיני עקב האינפלציה (שינוי בנפח / שינוי בלחץ), ניתן למדוד עם משאבת מזרק כדי להזריק כמויות קטנות פתאומיות של נוזל לתוך העין ולתעד את עליית הלחץ המתקבלת עם מתמר לחץ. תאימות גבוהה יותר מצביעה על הרקמה היא פחות נוקשה וניתן להשתמש בה כדי לעקוב אחר איך תכונות חומר טיפולי שונים מרקמת הקרנית הבסיסית. קצב דליפה מהעין או מתקן זרימה מסורתי ניתן למדוד ולחשב כדי לקבוע את קצב הזרימה הנוזלי המדויק עוזב את העין ליחידת לחץ20,29. לבסוף, לגבי בדיקות טיפוליות, לחץ פרץ ניתן למדוד כדי לקבוע את הלחץ המרבי שהעין יכולה להחזיק לפני הכישלון הטיפולי. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי להשוות ביצועים לעיניים לא נפגעות או כדי לעקוב אחר שינויים בביצועים עם זמן12,13.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה של כיוונון ASOC. העיניים מוחזקות במנות תרבות איברים שנבנו בהתאמה אישית ומוחזקות במקום עם טבעת מהדקת. ASOC מדיה מושרשת באמצעות משאבת מזרק דרך שסתום A ומחובר מתמר לחץ, ורכישת נתונים הבאים עם שסתום B. יציאות פתוחות בכל שסתום מודגשות בכחול בעוד צהוב מציין ערוצים סגורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סקירה כללית של מערך הפציעות של OG. (A)הגדרת התקן פציעה המופעלת על-ידי פניאומטיים. משמאל לימין, אוויר דחוס מוצג למכשיר באמצעות קו אוויר דחוס, העובר דרך וסת כדי להגדיר לחץ על 50 פסאיי כפי שנמדד על ידי מד הלחץ. שני שסתומי סולנואיד מחוברים למפעיל ליניארי כדי לכוון הרחבה/נסיגה של צ'אק המקדחה שמחזיק את עצם הדקירה. Vise ממוקם מול התקן הנקב כדי להחזיק את העין במיקום x, Y, z המתאים. (B)נציג ASOC ממוקם מול מכשיר אינדוקציה פציעה. פרטים נוספים על המכשיר ובנייתו מפורטים בפרוטוקול המשלים 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של ניסויי פציעה של ASOC OG. תמונות מוצגות לעיניים שולטות (לא נפגעו) ועיניים פצועות OG מיד לאחר הפציעה ו 72 שעות לאחר פציעה. תצוגות מוצגות כחתך דרך הקרנית(צד שמאל)ותצוגות הקרנה בעוצמה מקסימלית מלמעלה למטה של פני הקרנית(צד ימין). הדמות הותאמה באישור סניידר ואח'13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות IOP מייצגות לניסויי ASOC. (A)נתוני IOP גולמיים עבור 72 השעות הראשונות של הגדרת ASOC. העיניים מנוקדות במהירות של 72 שעות ולכן 3 הימים הראשונים של הנתונים מוערכים כדי לקבוע אם IOP מתייצב בטווח IOP מקובל (5-20 מ"מ כ"ג). מהתוצאות הייצוגיות, שלוש מתוך חמש העיניים נופלות בטווח ה- IOP המקובל, בעוד שאחת מהן גבוהה מדי ואחת עם IOP נמוכה מדי (נופלת מחוץ לאזור הצהוב המודגש על המגרש). (B)IOP ייצוב עבור n = 50 הגדרות ASOC מניסויים קודמים כדי להדגים את שיעור ההצלחה הטיפוסי בשיטת ASOC. (C)IOP לעיניים לא נפגעות בהשוואה לשלושה גדלי פגיעה שונים של OG לאחר אינדוקציה לפציעה עבור 72 שעות. אובדן IOP ניכר, ללא סימני התאוששות. (D)תוצאות IOP פצועות בהשוואה לפציעות שטופלו בדבק דרמבונד. בעוד ששיעור השגיאות גבוה עקב עיניים מסוימות אטומות ואחרות לא, השיטה יכולה לעקוב אחר שינויים ב- IOP במהלך התקופה של 72 שעות לאחר הפציעה. הדמות הותאמה באישור סניידר ואח '13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קבצים משלימים. נא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם צעדים קריטיים עם פלטפורמת הפציעות ASOC OG שיש להדגיש כדי לשפר את הסבירות להצלחה בעת שימוש במתודולוגיה. ראשית, במהלך ניתוח המקטעים הראשונים, שמירה על רשת trabecular היא חיונית אך מאתגרת לעשות כראוי. אם TM הוא שיבש, העין לא תשמור על לחץ פיזיולוגי ולא תעמוד בקריטריוני הזכאות לשימוש ניסיוני. מומלץ לתרגל תחילה את תהליך הניתוח בתנאים רגילים במקום להציג תחילה אתגרי הטכניקה האספטית הנוספת עד לקבלת ניתוחים נאותים. שנית, כאשר הגדרת העיניים במנות ASOC, זה הכרחי כי הם הדוקים מספיק כדי למנוע נוזלים דולף אבל רופף מספיק כדי למנוע נזק מנות ASOC. אם העין אינה מאובטחת בחוזקה, נוזל ידלוף מהעין באמצעים לא פיזיולוגיים וכתוצאה מכך IOP קטן או ללא IOP. עם זאת, טבעת הידוק מחזיק את העין למטה הוא פלסטיק והוא יכול להיות שבור בקלות אם overtightened. זה חיוני כדי להדק את העיניים למטה במשך 2 ימים כמו רקמת scleral מתחת לטבעת יהיה לדחוס ולשחרר את הרקמה במהלך 24 השעות הראשונות. מומלץ להדק את הטבעות רק עד ההתנגדות להידוק מורגש ביום 1 ולעקוב אחר זה על ידי הידוק מחדש לרמות דומות לאחר 24 שעות בתרבות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

שלישית, חשוב להבין באופן מלא לאן זרימת הנוזלים מכוונת בכל עת בעת שימוש במודל זה. כל צלחת ASOC מחוברת שסתומים משולשים מרובים כדי לכוון את זרימת הנוזלים ממשאבת המזרק או מאגר מזרק 10 מ"ל ולהתחבר מתמרים לחץ. מקרים שונים של תהליך ההתקנה דורשים שסתומים להיות ממוקם באופן כזה כדי לשטוף בועות אוויר מהעין או כדי להגן על מתמרים לחץ מפני לחץ יתר. עדיין יש להזהר מה פתוח / סגור בכל עת לפני צעדי פרוטוקול קריטיים. לבסוף, שמירה על סטריליות לאורך פרוטוקול הפציעה של ASOC OG היא קריטית אך קלה לאבד אותה בתהליך הרב-שלבי ורב-יומי. מדיה זלוף מכיל רמות גבוהות של אנטיביוטיקה ותרופות אנטי ממיקוטיקה כדי למנוע את זה, והעיניים שקועות betadine לפני שהוקם כדי למנוע זיהומים, אבל יש עדיין צעדים קריטיים שבו טעויות הן הסבירות ביותר. במהלך ההתקנה הראשונית בצלחת, יש להימנע ממגע עם העיניים תוך הידוק טבעות הידוק במקום ולשמור את המכסים על הכלים בכל עת כאשר לא בשימוש. שלב חשיפה סביר יותר הוא במהלך תחזוקת ASOC היומיומית. חשוב לעשות את הצעדים השגרתיים האלה בארון בטיחות ביולוגית, גם אם נראה שהם יכולים להתבצע במהירות מבלי להסיר את העיניים מן האינקובטור. בזהירות בעקבות הפרוטוקול ושמירה על טכניקה אספטית טובה צריך למזער את סיכוני הזיהום על פני 6 ימים ניסויי ASOC.

בסך הכל, פלטפורמת הפציעות של ASOC OG ייחודית ממתודולוגיות אחרות הבוחנות פציעות בכדור פתוח בשל שני קריטריונים מרכזיים. הראשונה היא שיטת אינדוקציה פציעה. מכשיר הפציעה הפנאומטית במהירות גבוהה השתמש בפציעות עם כמות כוח גבוהה. זה מאפשר גרימת פציעות עם חפצים שאינם חדים במיוחד ולא עם קוטר קטן. זה מחקה מקרוב פציעות שאינן סדירות בצורתן; רסיסים במהירות גבוהה נפצעו כתוצאה ממטעני נפץ30,31. המכשיר הפנאומטי יכול בקלות להיות מצויד עם רסיסים בצורה לא סדירה מחקה אובייקטים כדי ליצור פציעות מאתגרות יותר לרפא בהשוואה לשיטות קודמות באמצעות לייזרים, מחטים, או להבי אזמל כדי ליצור גיאומטריות פציעה נקיות ומדויקות32,33,34. שנית, מתודולוגיית ASOC מאפשרת מעקב אחר התקדמות פציעה וביצועים טיפוליים מעבר לאינדוקציה ראשונית לפציעות. היכולת לעקוב אחר 72 שעות לא הייתה אפשרית בפלטפורמת הפציעות של OG שפותחה בעבר10,11,12 והייתה המוטיבציה מאחורי פיתוח פרוטוקול זה. למעשה, הכדאיות התא נשאר גבוה אנדותל הקרנית לפחות 1 שבוע ב ASOC13. ASOC הוא האמצעי היחיד לכך שניתן לבצע את האפיון ארוך הטווח הזה מבלי לעבור לניסויים יקרים ב- vivo.

היישומים העיקריים עבור פלטפורמת ASOC הם כפולים. ראשית, המודל יכול להיות מנוצל לאפיון נוסף של פציעות גלובוס פתוח, במיוחד בהתחשב באופן שבו הם משתנים עם הזמן. במחקר הקודם, פציעות OG אופיינו באופן זה וריפוי פצע נצפה מעל 72 שעות לאחרפציעה 13. מעקב נוסף אחר גדלי פציעות שונים, צורות, מיקומים עבור 72 שעות או אפילו יותר לגבי שינויים ביולוגיים המתרחשים יודיע החלטות רפואיות קריטיות שיש להתקבל בעקבות פציעות OG. פרמטרי פגיעה מסוימים עשויים לאפשר ריפוי עצמי על ידי הקרנית, או פרמטרים אחרים עשויים להיות חמורים יותר אם ההתערבות אינה מיושמת בתוך 24 השעות הראשונות. מידע זה יהיה יקר ערך עבור חולים טריוניים כאשר אספקה רפואית מוגבלת או משאבי פינוי זמינים.

שנית, פלטפורמת ASOC OG יכולה לשמש לפיתוח ובדיקת פיתוח מוצרים. עבור יישום זה, פלטפורמת תרבות האיברים יכולה למלא מספר תפקידים. במהלך פיתוח המוצר הראשוני, ניתן לבדוק מסגרות זמן קצרות יותר עם מגוון ניסוחים של מוצרים כדי לקבוע מה היעיל ביותר. מערכת תרבית האיברים יכולה להיות מוגדרת עבור תפוקה גבוהה עוד יותר עבור יישום זה עם משאבות מזרק נוספות לנוע מעבר עשרת ניסויים בו זמנית אפשרי עם המערכת המפורטת כאן. עבור מוצרים מעודנים יותר, ניתן להעריך נקודות זמן ארוכות יותר כדי להעריך את הביצועים עבור 72 שעות או אפילו יותר. לבסוף, הערכת ריפוי פצעים עשויה להיות אפשרית בעת הערכת מוצרים פעילים ביולוגית שעשויים לטפל באופן קבוע בפציעות OG ולא ייצוב זמני.

עם זאת, ישנן מגבלות עם פלטפורמת ASOC OG שיש לקחת בחשבון. ראשית, בעוד המודל מאפשר הערכה ארוכת טווח של טיפולית, חסרה לו כל רקמת העין מחוץ למעטפת הקרנית, כגון הקשתית והעדשה. רקמות נוספות אלה עשויות להיות מושפעות מפציעת OG ועשויות לשחק תפקיד בהתקדמות הפציעה. באופן דומה, פלח חיצוני מבודד חסר אלמנטים של תגובה חיסונית שייכללו בעת המעבר ממודל ASOC לניסויים בבעלי חיים הבאים. לאחר מכן, המודל מתאים רק ליצירת פציעות OG קרנית ופציעות OG לימביות פוטנציאליות. לא ניתן לגרום לפציעות OG סקלרליות או אחוריות בשיטה זו. עם זאת, רבים מסוגי פציעות אלה גורמים נזק ל רשתית, מה שהופך כל טיפול ייצוב זמני לא סביר למנוע אובדן ראייה35,36. לבסוף, עקבו אחר פציעות עם הדגם ל-72 שעות לאחר הפציעה. ASOC נוצל ביישומים אחרים עד שבועיים, כך שניתן להשתמש במודל ככל הנראה עבור יישומים אלה, אך הוא לא נבדק בשלב זה37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים. הדעות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות את המדיניות הרשמית או העמדה של המחלקה הרפואית של צבא ארה"ב, מחלקת הצבא, משרד ההגנה או ממשלת ארה"ב.

Acknowledgments

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי משרד ההגנה של ארצות הברית באמצעות הסכם בין-משרדי (#19-1006-IM) עם תוכנית הרכישה הזמנית לתיקון קרנית (הסוכנות לפיתוח מטריאל רפואי של צבא ארצות הברית).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector McMaster-Carr 51525K431
10-32 Socket cap screw, ½" McMaster-Carr 92196A269
10 mL syringe BD 302995
20 mL syringe BD 302830
Anti-Anti Gibco 15240-096
Ball-End L key McMaster-Carr 5020A25
Betadine Fisher Scientific NC1696484
BD Intramedic PE 160 Tubing Fisher Scientific 14-170-12E
Cotton swabs Puritan 25-8061WC
DMEM media ATCC 30-2002
FBS ATCC 30-2020
Fine forceps World Precision Instruments 15914
Gauze Covidien 8044
Gentamicin Gibco 15710-064
Glutamax Gibco 35050-061
High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID McMaster-Carr 5233T47
Large forceps World Precision Instruments 500365
Large surgical scissors World Precision Instruments 503261
Medium toothed forceps World Precision Instruments 501217
Nail (puncture object) McMaster-Carr 97808A503
Nylon syringe filters Fisher 09-719C
PBS Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm) Fisher FB0875713
Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock Fisher NC9593742
Razor blade Fisher 12-640
Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle McMaster-Carr 75165A81
Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle McMaster-Carr 75165A675
Sterile 100 mL beakers with lids VWR 15704-092
Vannas scissors World Precision Instruments WP5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
  2. Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
  3. Riesberg, J., Powell, D., Loos, P. The loss of the golden hour. Special Warfare. , 49-51 (2017).
  4. Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
  5. Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
  6. Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
  7. Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
  8. Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
  9. Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
  10. Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
  11. Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
  12. Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
  13. Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
  14. Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
  15. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
  16. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  17. Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
  18. Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
  19. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
  20. Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
  21. Ren, H., Wilson, G. Apoptosis in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).
  22. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
  23. Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
  24. Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
  25. Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
  26. Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
  27. Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
  28. Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
  29. Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
  30. Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
  31. Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
  32. Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
  33. Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
  34. Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
  35. Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
  36. Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
  37. Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
  38. Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
  39. Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 174
פלטפורמת תרבות איברים מגזריי חיצוני למעקב אחר פציעות גלובוס פתוח וביצועים טיפוליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boice, E. N., Snider, E. J. Anterior … More

Boice, E. N., Snider, E. J. Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance. J. Vis. Exp. (174), e62649, doi:10.3791/62649 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter