Summary
Ögonskador i öppen jordglob kan gå obehandlade i flera dagar i landsbygds- eller militärrelevanta scenarier, vilket resulterar i blindhet. Terapier behövs för att minimera synförlust. Här beskriver vi en organkultur open globe skademodell. Med denna modell kan potentiella terapier för stabilisering av dessa skador utvärderas ordentligt.
Abstract
Öppna globen skador har dåliga visuella resultat, ofta resulterar i permanent förlust av vision. Detta beror delvis på en förlängd försening mellan skador och medicinska insatser i landsbygdsmiljöer och militära medicinapplikationer där oftalmisk vård inte är lätt tillgänglig. Obehandlade skador är mottagliga för infektion efter att ögat har förlorat sin vattentäta tätning, liksom förlust av vävnadens livskraft på grund av intraokulär hypotoni. Terapier för att tillfälligt försegla öppna globe skador, om korrekt utvecklats, kan återställa intraokulärt tryck och förhindra infektion tills korrekt oftalmisk vård är möjlig. För att underlätta produktutveckling, detaljerad här är användningen av en främre segment organkultur öppen jordglob skada plattform för att spåra terapeutiska prestanda för minst 72 h efter skada. Svin främre segment vävnad kan upprätthållas i specialdesignade organ kultur rätter och hålls vid fysiologiskt intraokulärt tryck. Punkteringsskador kan skapas med ett pneumatiskt system som kan generera skadestorlekar upp till 4,5 mm i diameter, liknande militärrelevanta skadestorlekar. Förlust av intraokulärt tryck kan observeras för 72 h efter skada bekräftar korrekt skada induktion och förlust av ögats vattentäta tätning. Terapeutiska prestanda kan spåras genom applicering på ögat efter skada induktion och sedan spåra intraokulärt tryck i flera dagar. Vidare är den främre segmentets skademodell tillämplig på allmänt använda metoder för funktionell och biologisk spårning av fysiologi inom det främre segmentet, såsom bedömning av transparens, okulär mekanik, hornhinnans epitelhälsa och vävnadsaktivitet. Sammantaget är metoden som beskrivs här ett nödvändigt nästa steg mot att utveckla biomaterialterapier för att tillfälligt försegla öppna jordglobskador när oftalmisk vård inte är lätt tillgänglig.
Introduction
Öppna jordglobsskador (OG) kan leda till permanent synförlust när de inte behandlas eller åtminstone stabiliseras efter skada1. Förseningar är dock vanliga i avlägsna områden där det inte är lätt att få tillgång till oftalmiska ingripanden, till exempel på landsbygden eller på slagfältet i militära scenarier. När behandlingen inte är lättillgänglig är den nuvarande vårdstandarden att skydda ögat med en styv sköld tills medicinsk intervention är möjlig. Inom militärmedicinen är denna försening för närvarande upp till 24 timmar, men den förväntas öka upp till 72 h i framtida stridsoperationer i stadsmiljöer där luftevakuering inte ärmöjlig 2,3,4. Dessa förseningar kan vara ännu längre i lantliga, avlägsna civila applikationer där tillgången till oftalmisk intervention är begränsad5,6. En obehandlad OG-skada är mycket mottaglig för infektion och förlust av intraokulärt tryck (IOP) på grund av att den vattentäta tätningen i ögat äventyras7,8. Förlust av IOP kan påverka vävnadens livskraft, vilket gör det osannolikt att någon medicinsk intervention återställer synen om förseningen mellan skada och terapeutisk är för lång9.
För att möjliggöra utveckling av lättanvända terapier för tätning av OG-skador tills en oftalmisk specialist kan nås, utvecklades en bänktop OG-skademodelltidigare 10,11. Med denna modell skapades höghastighetsskador i hela svinögon medan IOP fångades av tryckgivare. Therapeutics kan sedan appliceras för att bedöma deras förmåga att försegla OG skada plats12. Men eftersom denna modell använder hela svin ögon, Det kan bara bedöma omedelbar terapeutisk prestanda utan möjlighet att spåra långsiktiga prestanda över det möjliga 72 h fönstret där den terapeutiska måste stabilisera skadestället tills patienten når specialvård. Som ett resultat utvecklades en främre segment organ kultur (ASOC) OG skada modell och beskrivs i detta protokoll som en plattform för att spåra långsiktiga terapeutiska prestanda13.
ASOC är en allmänt använd teknik för att upprätthålla avaskulär vävnad i det främre segmentet, såsom hornhinnan, i flera veckor efter enucleation14,15,16,17. Det främre segmentet upprätthålls under fysiologisk IOP genom att perfusera vätska vid fysiologiskaflödeshastigheteroch bevara den trabekulära meshwork utflödesregionen, vävnaden som ansvarar för att reglera IOP, under ASOC-inställning 18,19. ASOC-plattformen kan upprätthålla vävnad fysiologiskt, inducera en OG-skada med hjälp av en pneumatisk driven enhet, tillämpa en terapeutisk och spårskadastabilisering i minst 72 h efter skada13.
Här ger protokollet en steg-för-steg-metodik för att använda ASOC-plattformen. Först beskriver den hur man ställer in och tillverkar ASOC-plattformen. Därefter beskriver protokollet hur man aseptiskt dissekerar det främre segmentet och upprätthåller trabekulär meshwork, följt av att ställa in främre segmentvävnad i specialbyggda organkulturrätter. Sedan beskriver det hur man skapar öppna globe-skador och applicerar terapeutiska omedelbart efter skada. Slutligen ger protokollet en översikt över karakteriseringsparametrar som är möjliga att använda med denna metod som bedömer funktionella, mekaniska och biologiska egenskaper hos ögat och hur väl skadan stabiliserades. Sammantaget ger denna modell en välbehövlig plattform för att påskynda produktutvecklingen för att stabilisera och behandla öppna jordglobskador och förbättra prognosen för dålig syn efter skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Innan du utför detta protokoll bör du vara medveten om att det finns rättsliga och etiska krav för användning av djur i forskning och utbildning. Om levande djur används för källan till okulär vävnad, sök godkännande av den lokala etiska eller rättsliga myndigheten (IACUC eller etikkommittén osv.) innan du börjar. Om det är fråga om att få godkännande för användning av djur, fortsätt inte. Vi har tidigare fastställt och rapporterat att färska svin ögon erhålls och används inom 24 h post-mortem jämfört närmast in vivo fysiologi och klarade sig bra för dessa studier (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. Inga levande djur användes under hela detta protokoll, med hjälp av en vävnadsleverantör för att få vävnad inom 24 timmar.
OBS: Innan vävnaden anländer, tillverka organkulturrätterna(tilläggsprotokoll 1),klämringar(tilläggsprotokoll 1),diskställ(tilläggsprotokoll 1),inställningar för insamling av tryckgivaresdata(tilläggsprotokoll 2)och pneumatisk punkteringsplattform(tilläggsprotokoll 3). Sterilisera disken, verktygen och förnödenheterna och förbered arbetsområdena. Det är användbart att ha ett icke-sterilt område för att utföra grov dissekering på ögonen, eftersom de vanligtvis kommer med bindväv fäst. Utför dessa första steg på en öppen, ren arbetsyta och överför sedan ögonen aseptiskt till ett BSC II-skåp för mikrodesektion (skåp #1). Optimalt separeras BSC II-skåpet som används för mikroav dissekering från diskenheten BSC II-skåpet (skåp #2) för att minimera luftflödet och maximera arbetsytan. Ställ in mikrodesektionsskåpet med ett dissekerande mikroskop och ett sätt att visualisera arbetsytan (kamera eller okular som sticker ut från skåpet).
1. Steriliseringssteg, förnödenheter (se Materialförteckning för mer information) och installation
- Förbered och gassterilisera följande föremål (1 sats för varje öga): ASOC-skål, klämring, två fluidiska kontakter med O-ringar, två 18 G nålnav, fyra skruvar, två längder av PE-100-slangar (avståndslängden bör vara tillräckligt lång för att sträcka sig från skålen inuti inkubatorn till sprutpumpen och insamlingsinställningen för tryckgivare). två 18 G 90° böjda nålnav, två 3-vägsventiler.
- Förbered och spara automatiskt följande satser.
- Förbered och autoklavera mikrodissekeringsinstrumentsatsen, som innehåller ett par fina tångar, ett par Vannas-saxar, ett par medeltandade tångar, ett par stora saxar, bomullspinne och ett rakblad eller skalpell.
- Förbered och autoklavera monteringsinstrumentsatsen, som innehåller ett par medeltandade tångar, en par kirurgiska saxar och en L-nyckel.
- Förbered och autoklavera det dagliga kitet (mängd: en per kulturdag), som innehåller en L-nyckel för att dra åt klämringarna till disken varje dag efter behov.
- Autoklav fyra 100 ml bägare för desinfektion och förvaring av ögon och främre segment.
- Klavera punkteringsobjekten automatiskt.
- Samla följande sterila föremål: Petriskål (1 maträtt/öga), gasväv (1-2/öga), diskställ, 20 ml sprutor (1/öga), 10 ml sprutor (1/öga), nylonsprutafilter (1/öga).
- Förbered sterila medier: DMEM med 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicin, 1x Antibiotikum-Antimycotic (AA; cirka 30-40 mL komplett media/öga).
- Förbered AA-PBS: PBS med 1x AA (~500 ml).
- Förbered den grova dissekeringsverktygsförpackningen: rengör och torka stora kirurgiska saxar och tångar.
- Ställ in den icke-sterila dissekeringsarbetsytan: Samla in förnödenheter från grov dissekeringsverktygsförpackning, enucleated svinögon nedsänkta i PBS och på is, kirurgiskt draperi, 100 mL bägare med PBS. Lägg ut det kirurgiska draperiet och föremål som krävs för grov dissekering.
- Ställ in den sterila dissekeringsarbetsytan: Samla in förnödenheter från mikrodissektionsinstrumentsats, steril gasväv, dissekerande mikroskop, betadinlösning, steril PBS, sterila medier, fyra steriliserade 100 ml bägare, steril Petri-skål. Aseptiskt överföra till BSC II skåp #1. Ställ in skåpet för att visualisera ögonen på det dissekerande mikroskopet.
- Ställ in ASOC-monteringsarbetsytan: Samla gassteriliserade satser (disksats och locksats), monteringsinstrumentsats, sterila medier, diskställ, sterila petriskålar, sterila sprutor och sprutfilter. Aseptiskt överföra till BSC II skåp #2. Ställ in skåpet för diskenhet.
- När ögonen är stabiliserade och redo för punktering (72 h efter installationen), överför de aseptiskt till ett BSC II-skåp. Ställ in OG-skadeinduktionsarbetsytan: Pneumatisk driven skadeinduktionsenhet (montering enligt tillägg 3)och Lab Jack och korsspårningsvisir för att hålla ASOC-skålen.
2. Dissekering av vävnad
- Förbered svinvävnaden med hjälp av icke-steril dissekeringsarbetsyta.
- Skaffa enucleated svin ögon från ett lokalt slakteri, djurstudier eller leverantör. Håll ögonen på isen nedsänkta i PBS under leverans och använd omedelbart efter mottagandet.
- Skär bort den extraorbitala vävnaden och trimma bindhinnan och lämna endast hornhinnans skal och optisk nerv. Utför dissekeringen under icke-sterila förhållanden med stor kirurgisk sax och tång i en grov dissekeringsverktygsförpackning.
- Placera ögonen tillbaka i färsk PBS på is tills alla ögon som krävs för experimentell installation har varit preliminära / grova dissekerade.
- Dränk ögonen i 10% betadinlösning i 2 min i slutna behållare och överför aseptiskt till BSC II skåp #1. Utför alla efterföljande arbeten under sterila förhållanden för att minimera kontaminering under installationen.
- Sterilt dissekera främre segment.
- Efter 2 min i betadinlösning, överför ögonen till tre seriella tvättar av steril AA-PBS för att ta bort överskott av betadinlösning från okulärytan samtidigt som okulärvävnadens sterilitet bibehålls. Efter tre tvättar, håll vävnaden i AA-PBS tills vidare användning.
- Hemisect ögat med ett rakblad / skalpell och böjd sax. Placera ögat på en AA-PBS-blöt gasväv och skapa ett snitt med ett sterilt rakblad eller skalpell nära ögats ekvator (60/40 split med 40 på den främre sidan). Använd böjd kirurgisk sax, hemisect ögat för att isolera det främre ögat (hornhinnans halva).
OBS: Snittet runt det främre segmentet måste vara kontinuerligt för att förhindra ojämna, grova kanter i skleran som skapar vätskeläckor efter installation i organkulturen. - Använd mikroscissorer som spade för att skopa glasaktig humor från det främre segmentet. Ta bort objektivet från det främre segmentet med hjälp av mikroscissorer. Lämna de främre segmenten i AA-PBS tills ytterligare dissekeringssteg.
OBS: Alla ögon som kommer att dissekeras kan hållas i detta steg och en efter en tas genom resten av dissekeringsprocessen. - Med ett dissekerande mikroskop, skär tillbaka iris till irisrot gradvis, radiellt tills trabekulär meshwork (TM) är synligt. TM är en pigmenterad vävnad som består av fibrer omkretsorienterade runt hornhinnans skal. Noggranna skär i iris mot irisroten kommer att exponera djupet av TM under vävnaden.
- Skär 360° runt irisen på samma djup som det första snittet i vävnaden för att exponera hela TM-regionen. Rengör eventuell kvarvarande iris som täcker TM efter behov.
- Trimma ciliary kroppsresterna bakre till TM, lämnar endast ett tunt band av vävnad posterior till TM regionen (ca 1 mm).
- Placera det dissekerade främre segmentet (AS) i media tills ytterligare inställningar i ASOC i BSC II skåp #2.
OBS: Alla ögon kan hållas vid denna tidpunkt före ASOC-installationen om en enda användare utför dissekering och organkultur dish assembly.
3. Ställa in främre segment i orgelkulturrätter
- Placera en enda AS i en Petri-skål med AS inverterad (kopp upp). Använd en bomullspinne, blöt i media och doppa försiktigt i mitten av hornhinnan för att ta bort pigment. Använd tång för att hålla ögat och samma bomullspinne, torka bomullspinnen runt sclera för att ta bort extra pigment.
- Invertera AS och placera ovanpå bottendelen av skålen över den upphöjda regionen, centrera hornhinnan över den upphöjda regionen i skålen. Placera fastspänningsringen ovanpå det nyplacerade AS.Place the clamping ring top of the newly placed AS.
- Placera fyra skruvar i motsvarande hål för att hålla ringen på plats med AS under ringen. Dra försiktigt åt skruvarna med L-knappen för hand.
OBS: Åtdragningssteget kommer att ske dagligen under hela experimentet, så målet med den första åtdragningen här är att säkerställa att media inte läcker samtidigt som man undviker att bryta klämringen. - Med ett sterilt Petri-diskset placerar du toppen över skålen och inverterar installationen. Fäst diskstativet. Fäst de fluidiska kontakterna med O-ringar på gängade portar på botten av skålen.
- Fäst ett 18 G 90° böjt nålnav, en slanglängd, ett 18 G nålnav, ett nylonsprutafilter, en trevägsventil och en 20 ml spruta fylld med media.
- Fäst ett 18 G 90° graders böjt nålnav, slanglängd, ett 18 G nålnav, en trevägsventil och fatdelen av en steril 10 ml spruta (detta fungerar som en reservoar för att fånga vätska och bubblor från ASOC).
- Med trevägsventiler öppna på lämpligt sätt mot sprutorna, tryck försiktigt media genom systemet med hjälp av fluidikkontaktporten som identifieras i steg 3.5 för att blåsa upp AS, fylla media i slangen och så småningom behållaren.
OBS: Om media läcker in i ASOC-skålen är AS inte tillräckligt ordentligt fastsatt med klämringen. - Ta bort bubblor genom att försiktigt trycka in media i skålen och vända skålen för att trycka ut bubblorna och in i behållaren.
- Placera skålen och stå upprätt. Placera den nedre delen av en Petri-skål under stativens fötter, var försiktig så att du inte omstycker slangen.
4. Starta organkultur inom det främre segmentet
- ASOC är nu redo för inkubation. Placera ASOC-skålen i cellkulturinkubatorn (37 °C, 5 % CO2). Se till att asoc-skålens höjd i inkubatorn ovanför tryckgivare är känd och redovisad för att beräkna IOP exakt(tilläggsprotokoll 4).
- Rikta ut slangledningarna genom botten av 37 °C, 5 % CO 2-inkubatordörr så att de inte stör dörrens öppning och stängning. Fäst sprutan på 20 ml på sprutpumpen på 2,5 μL/min.
- Placera slangledningen med behållaren vid tryckgivareinstrumentet. Anslut sidoventilen till tryckgivarens inställning samtidigt som växeln flödar genom linjen för att undvika att luftbubblor kommer in i rörledningarna.
OBS: Töm PBS från reservoarerna efter att systemet har ställts in för att minska sannolikheten för reservoarförorening med mikrobiell tillväxt under organkulturens varaktighet. - Initiera IOP-datainsamling genom att först se till att det finns ett microSD-kort för att spara datafiler. Aktivera sedan tryckgivarens inställning för att påbörja datainsamlingen.
ANM.: Närmare uppgifter om hur tryckgivares datainsamlingsenhet ska konfigureras finns i tilläggsprotokoll 2.
5. Dagligt underhåll av ASOC
- När ASOC har haft 24 timmar att balansera, ta bort disken från 37 °C, 5% CO2 inkubator och placera dem i BSC II skåpet.
OBS: Vid tryckdatainsamling ser dessa tidsperioder ut som spikar när ASOC tas bort från inkubatorn (höjdförändring) och justeras i skåpet. - Kontrollera om det finns läckor under varje skål på Petri-plattan. Om det finns, kontrollera om det finns täta flytande anslutningar under skålen och dra åt vid behov igen. Kontrollera om det finns läckage i diskskivan med hjälp av en steril L-nyckel för att dra åt skruvarna i klämringen.
OBS: AS skleravävnad komprimeras och minskar tjockleken med 24 timmar, och klämringen måste dras åt. - Aspirera media från skålen väl.
OBS: Trabekulärt nät är att filtrera vätska från det medium som pumpas in i ASOC. Därför kommer media att finnas i ASOC-skålen längs kanterna. - Upprepa steg 3.7 och 3.8 för att ta bort eventuella instängda luftbubblor.
- Fyll på sprutorna på sprutpumparna, se till att sprutpumparna fungerar och bekräfta att ventilerna är i linje med perfusionen till ASOC. Sätt tillbaka ASOC-skålen på 37 °C, 5 % CO2-inkubator.
OBS: Optimalt bör dessa steg utföras dagligen. Användningen av en startvolym på 20 ml av media, ASOC-skålens brunnsvolym och en pumphastighet på 2,5 μL/min bör dock vara tillräcklig för att systemet ska kunna köras i flera dagar ostört.
6. Induktion av OG-skador med pneumatisk drivna punkteringsanordning
OBS: Konstruktion av den pneumatiska punkteringsanordningen beskrivs i tilläggsprotokoll 3. OG-skador induceras efter att IOP har stabiliserats, vilket normalt inträffar efter 3 dagar i kultur. Godtagbara IOP-värden är 5-20 mmHg baserade på fysiologisk IOP, vilket kan bestämmas genom att utvärdera IOP-datafilerna eller ställa in LED-indikatorer i tryckmätningssystemet enligt beskrivningen i tilläggsprotokoll 2.
- Förbered BSC II-skåpet för OG-induktion av skador enligt steg 1.10. Anslut punkteringsplattformen till en tryckluftsledning. Fäst det sterila punkteringsobjektet på chucken.
OBS: En luftkompressor kan användas för att driva enheten, men tanktryckluft eller inbyggda laboratorieledningar kan räcka om trycket är större än 50 psi. - Ställ in tryckregulatorn på punkteringsplattformen på 50 psi för tillräcklig punkteringskraft på föremål upp till 4,5 mm i diameter. Placera korsspårningsvisiret på labbuttaget framför punkteringsplattformen för att hålla ASOC-skålen under induktion av skador.
- Ta bort ASOC-inställningen från 37 °C, 5 % CO2-inkubator och placera den vinkelrätt mot punkteringsplattformen ( figur2) efter att locket har avlägsnats och ställts åt sidan. Håll det främre segmentet genomspänd men stäng av 3-vägsventilporten till tryckgivaren för att förhindra övertrycksskador på givaren.
- Förläng kolvarmen till maximalt avstånd och placera hornhinnans spets inom 1 mm från punkteringsobjektet. Dra tillbaka kolvarmen och för det främre segmentet 1 cm närmare punkteringsobjektet.
OBS: Detta avstånd har optimerats för högeffektiv induktion av skador utan att träffa ASOC-skålen. - Tänd punkteringsanordningen genom att slå på den och öppna magnetventilen med den andra strömbrytaren på enheten. För att dra tillbaka enheten, tryck på den andra strömbrytaren igen för att ta bort punkteringsanordningen från ögat. Kontrollera att det finns ordentligt induktion av skador genom visuell inspektion och att media läcker ut från skadeplatsen.
- Ta bort ASOC-skålen från visen; placera locket på diskenheten igen och öppna den flytande linjen mot tryckgivaren. Placera ASOC tillbaka i 37 °C, 5 % CO2-inkubator.
OBS: Vid denna tidpunkt kan terapeutiskt appliceras på AS för att bedöma dess effekt för tätning av OG-skador.
7. Ta bort ASOC från kulturen
OBS: Beroende på endpointanalys (se representativa resultat för möjliga endpointmetoder) måste AS-avdelningen stanna kvar i ASOC-skålen uppblåst medan andra metoder kräver AS-vävnad isolerad från kulturkammaren. Nedanstående metodik beskriver hur man tar AS ur orgelkulturerna och tar bort resten av installationen.
- Ta bort ASOC-diskarna från 37 °C, 5 % CO2-inkubatorn. Stäng 3-vägsventilen till sprutan och behållaren och koppla bort slangen från systemet. Kassera sprutan, behållaren och filtret. Placera 3-vägsventilerna, slangarna och nålnaven i en separat behållare för tvättning och sterilisering.
- Koppla bort nålnaven från de fluidiska anslutningarna på botten av skålen. Ta bort de flytande kontakterna och o-ringarna. Placera alla föremål i en behållare för tvätt och sterilisering.
- Ta bort de fyra skruvarna från klämringen med L-knappen. Ta försiktigt bort klämringen.
- Använd tång, ta bort as från skålen och, beroende på slutpunktsanalys och bild, placera i fixativt eller lämpligt biologiskt avfall.
8. IOP-dataanalys
- Anslut microSD-kortet till en dator för att ta bort .txt filen som innehåller data från den senaste experimentella körningen.
OBS: Filen namnges i koden som styr mikrokontrollern och bör uppdateras för varje experiment (se tilläggsprotokoll 2). - Importera data till ett kalkylblad.
- Organisera data i 12 kolumner: Tid (i min) och mV-signal för var och en av 11 tryckgivares kanaler. De första tio kanalerna motsvarar tio ASOC-experimentella inställningar. Den slutliga givarens signal är att en sensor är öppen för luft som en styrkanal för att bekräfta att mV-signalen inte ändrades på grund av förändringar i ingångssignalen. Plot kontroll kanal kontra tid för att bekräfta mV signal var konsekvent hela tiden.
- Omvandla mV-signalerna för tio kanaler till mmHg med hjälp av ekvationer för lutningsavlyssning som genereras från den första kalibreringen av varje sensor (se tilläggsprotokoll 4).
- Plottid (konvertera till dagar för att förenkla datatolkning) jämfört med var och en av de tio kanalerna för att avgöra hur IOP fluktuerade över den experimentella tidskursen.
- Bestäm genomsnittliga IOP-värden vid viktiga punkter i data för att lättare jämföra värden mellan var och en och hur de ändras före och efter OG-skadeinduktion. Genomsnittlig 2-3 h data för varje 24 h intervall för att bestämma IOP vid varje dag i ASOC.
OBS: Representativa IOP-resultat visas i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilder tagna via Optical Coherence Tomography (OCT) visas för OG-skadade ögon för att illustrera hur en framgångsrik skada induktion ser ut. Figur 3 visar bilder för kontroll och OG-skadad AS-vävnad omedelbart efter skada och 72 timmar senare. Två vyer visas: tvärsnittsbilder genom skadeplatsen och uppifrån och ned maximal intensitetsprojektion (MIPs) för att visualisera bildens yta. Kontroll ögon visar inga märkbara störningar i hornhinnan, medan tydliga skador kan lokaliseras som korsar hela hornhinnan efter OG skada. Från MIPs är det uppenbart att skador är oregelbundna i form och storlek, men skadestorleken minskar över 72 h. Tidigare har denna effekt visat sig vara signifikant för ett antal skadestorlekar som testats13.
Den primära datautgången för OG-skademodellen som beskrivs i detta protokoll är intraokulärt tryck under den experimentella installationen. Data registreras i millimeterenheter som en utgång från varje tryckgivare som kan omvandlas till mmHg via kalibrering(tilläggsprotokoll 4). Exempel på IOP-data jämfört med den experimentella tidskursen ges för ögon som anses godtagbara och andra som inte skulle anses användbara (figur 4A). Från tryckspårningsdata var ögonen fästa vid sensorer efter 24 h i kultur, men IOP fortsätter att fluktuera under de första 72 h i kultur. Fysiologisk IOP för AS-vävnad i organkulturen är cirka 8-10 mmHg, så 2x och 1/2x intervall bestämdes som en grind för användbara IOP-värden efter att värdena har stabiliserats (5-20 mmHg). Endast ögon som fanns i det intervallet skulle vara tillåtna att använda med resten av protokollet. Från tidigare experiment hade vi en 90% framgångsgrad som uppnåddes i ASOC-installation för ögon som stabiliserades i det önskade intervallet (Figur 4B).
Resultaten för hur IOP förändras på grund av OG-skada och terapeutisk intervention tillhandahålls också (figur 4C,D). Efter OG-induktion av OG-skador bör trycket sjunka avsevärt och förbli så tills vävnaden avlägsnas från ASOC (Figur 4C). Om ett öga efter skada induktion inte minskar i tryck, indikerar detta att en framgångsrik skada inte inducerades eftersom IOP bör minskas om den vattentäta tätningen i ögat äventyras. Mindre skadestorlekar kan dock självläka, vilket kan leda till att IOP återställs. Om terapeutiska appliceras på ögat efter OG skada induktion, återställande av IOP kan spåras under ASOC. Detta koncept demonstreras med data som visar ett Dermabond-lim som appliceras på 2,4 mm OG-skador(figur 4D). Genomsnittliga resultat för fem separata ASOC experiment med och utan terapeutisk visas och det är uppenbart att terapeutiska ökar IOP. Denna metod kan mäta effekten av den terapeutiska för att återställa IOP och spåra om det trycket återställs över nyckeln 72 h post-OG skada.
Vidare är ASOC-protokollet anpassningsbart för användning med ett brett spektrum av karakteriseringsslutpunkter för att uppfylla slutanvändarens experimentella krav. Under kulturen kan utflödesmedier som lämnar ögat samlas in dagligen eller till och med varje timme och som kan användas för att spåra proteinnivåförändringar som inträffar under ASOC, efter OG-skada induktion eller efter terapeutisk tillämpas. Till exempel har gelatin zymografi tidigare utförts för att upptäcka matrismetalloproteinasnivåer för att spåra sårläkning och vävnadsrenovering20. Ytterligare biologiska effektmått är möjliga efter att ha avlägsnat vävnad från kulturen via traditionella immunohistokemiska metoder för att bedöma vävnadens livskraft21,22, spåra patofysiologiska förändringar ihornhinnan 23,24eller antikroppsbaserad färgning för något protein av intresse25,26.
Funktionella hornhinnans mätvärden kan också erhållas från ögon som upprätthålls i ASOC. Hornhinnans epitel integritet kan bedömas via en fluorescein ögonfläck och bildförvärv med hjälp av en blå ljuskälla27,28. Efter borttagning från kultur kan hornhinnans vävnad bedömas för transparens genom enkelt bildförvärv13. Traditionell okulär avbildning kan också utföras för att bedöma vävnadsstrukturen med eller utan terapeutisk intervention. OCT-bilder, som visas i figur 3, kan skapa tvärsnittsbilder genom hornhinnan och kan fångas icke-invasivt, vilket potentiellt möjliggör bildsamling samtidigt som vävnaden bevaras i kulturen. Andra bildframställningsmetoder såsom slits-lampmikroskopi, ultraljud eller in vivo confocal mikroskopi kan också anpassas för att förvärva ytterligare anatomisk information.
Slutligen kan bedömning av mekaniska egenskaper hos det främre segmentet fångas för att förstå effekten av OG-skadan eller efterföljande terapeutisk på den underliggande vävnaden. Medan IOP-datainsamling ensam belyser hur integriteten hos ögats vattentäta tätning har äventyrats, har vi tidigare visat att ytterligare testmått kan mätas för att reta ut ytterligare mekaniska funktioner10,11. Okulär överensstämmelse, en klumpad mekanisk egenskap som beskriver hur intraokulärt tryck förändras på grund av inflation (volymförändring/tryckförändring), kan mätas med en sprutpump för att injicera plötsliga små volymer vätska i ögat och registrera den resulterande tryckökningen med en tryckgivare. Högre överensstämmelse indikerar att vävnaden är mindre styv och kan användas för att spåra hur terapeutiska materialegenskaper skiljer sig från den underliggande hornhinnans vävnad. Läckagehastighet från ögat eller en traditionell utflödesanläggning kan mätas och beräknas för att bestämma det exakta flytande flödet som lämnar ögat per tryckenhet20,29. Slutligen, när det gäller terapeutisk testning, kan burst tryck mätas för att bestämma det maximala trycket ögat kan hålla före den terapeutiska svikten. Detta kan användas för att jämföra prestanda med oskadda ögon eller för att spåra prestandaförändringar med tid12,13.
Bild 1: Diagram över ASOC-installationen. Ögonen hålls i specialbyggda orgelkulturfat och hålls på plats med en klämring. ASOC-media infunderas via sprutpump genom ventil A och ansluts till en tryckgivare, och efterföljande datainsamling med Valve B. Öppna portar i varje ventil markeras i blått medan gult indikerar slutna kanaler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Översikt över OG-skadeinställningen. Från vänster till höger introduceras tryckluft till enheten via en tryckluftsledning, som passerar genom en regulator för att ställa in trycket på 50 psi mätt med tryckmätaren. Två magnetventiler ansluts till ett linjärt ställdon för direkt expansion/upprullning av borrchucken som håller punkteringsobjektet. Vise är placerad framför punkteringsanordningen för att hålla ögat vid lämplig x, y, z positionering. B)Representativ ASOC placeras framför skadeinduktionsanordningen. Närmare uppgifter om anordningen och dess konstruktion beskrivs i tilläggsprotokoll 3. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Optisk koherenstomografi Bilder av ASOC OG-skadeexperiment. Bilder visas för kontroll ögon (oskadda) och OG skadade ögon omedelbart efter skada och 72 h efter skada. Vyer visas som tvärsnitt genom hornhinnan(vänster sida)och övre delen av maximal intensitet projektionsvyer av hornhinnans yta(höger sida). Siffran har anpassats med tillstånd från Snider et al.13.
Figur 4: Representativa IOP-resultat för ASOC-experiment. (A) Raw IOP-data för de första 72 h av ASOC-installationen. Ögonen punkteras vid 72 h så de första 3 dagarnas data bedöms för att avgöra om IOP stabiliseras i det acceptabla IOP-intervallet (5-20 mmHg). Från de representativa resultaten faller tre av de fem ögonen inom det acceptabla IOP-intervallet, medan en har IOP för högt och en har IOP för lågt (faller utanför den markerade gula regionen på tomten). (B) Stabiliserad IOP för n = 50 ASOC-inställningar från tidigare experiment för att visa den typiska framgångsgraden med ASOC-metoden. (C) IOP för oskadda ögon jämfört med tre olika OG-skadestorlekar efter skadeinduktion i 72 timmar. Förlusten av IOP är uppenbar, utan tecken på återhämtning. (D) Skadade IOP-resultat jämfört med skador som behandlats med ett Dermabond-lim. Även om felfrekvensen är hög på grund av att vissa ögon förseglas och andra inte, kan metoden spåra ändringar i IOP under 72 h-perioden efter skadan. Siffran har anpassats med tillstånd från Snider et al.13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner dessa filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns kritiska steg med ASOC OG skadeplattform som bör lyftas fram för att förbättra sannolikheten för framgång när du använder metoden. För det första, under den främre segment dissekeringen, är bevarandet av trabekulär meshwork viktigt men utmanande att göra korrekt. Om TM störs kommer ögat inte att upprätthålla fysiologiskt tryck och uppfyller inte behörighetskriterierna för experimentell användning. Det rekommenderas att öva dissekeringsprocessen under normala förhållanden först snarare än att införa ytterligare aseptiska teknikutmaningar tills rätt dissekeringar erhålls. För det andra, när du ställer ögonen i ASOC-disken är det absolut nödvändigt att de är tillräckligt snäva för att förhindra att vätska läcker men tillräckligt lös för att förhindra att ASOC-disken skadas. Om ögat inte är ordentligt fastsatt kommer vätska att läcka ut från ögat genom icke-fysiologiska medel som resulterar i liten eller ingen IOP. Klämringen som håller ner ögat är dock plastig och kan lätt brytas om den är övertätad. Det är viktigt att spänna fast ögonen under 2 dagar eftersom den sklerala vävnaden under ringen komprimerar och lossar vävnaden under de första 24 h. Det rekommenderas att dra åt ringarna bara tills motstånd mot åtdragning känns på dag 1 och följa upp detta genom att dra åt liknande nivåer igen efter 24 h i kultur för bästa resultat.
För det tredje är det viktigt att fullt ut förstå var vätskeflödet riktas hela tiden när du använder denna modell. Varje ASOC-skål är ansluten till flera trevägsventiler för att rikta vätskeflödet från sprutpumpen eller 10 ml sprutbehållare och ansluts till tryckgivare. Olika instanser av installationsprocessen kräver att ventiler placeras på ett sådant sätt att luftbubblor spolas från ögat eller att tryckgivare skyddas från övertryck. Man bör fortfarande vara noga med att förstå vad som är öppet/nära hela tiden före kritiska protokollsteg. Slutligen är det viktigt men lätt att förlora under hela ASOC OG-skadeprotokollet genom flerstegsprocessen. Perfusion media innehåller höga nivåer av antibiotika och antimykotika för att förhindra detta, och ögonen är nedsänkta i betadin innan de sätts upp för att förhindra föroreningar, men det finns fortfarande kritiska steg där misstag är mest sannolika. Undvik kontakt med ögonen under den första installationen i skålen samtidigt som du drar åt klämringarna på plats och håll alltid locken på disken när de inte används. Ett mer sannolikt exponeringssteg är under det dagliga ASOC-underhållet. Det är viktigt att göra dessa rutinsteg i ett biosäkerhetsskåp, även om det verkar som om de snabbt kan uppnås utan att ta bort ögonen från inkubatorn. Att noggrant följa protokollet och upprätthålla god aseptisk teknik bör minimera föroreningsriskerna under de 6-dagars ASOC-experimenten.
Sammantaget är ASOC OG skadeplattform unik från andra metoder som tittar på öppna globen skador på grund av två viktiga kriterier. Först är skadeinduktionsmetoden. Höghastighets pneumatiska skadeanordningen som används inducerar skador med en hög kraftmängd. Detta gör det möjligt att inducera skador med föremål som inte är särskilt skarpa eller med en liten diameter. Detta efterliknar närmare skador som är oregelbundna i form; Splitterskador i hög hastighet till följd av sprängladdningar30,31. Den pneumatiska enheten kan enkelt utrustas med oregelbundna splitter som efterliknar föremål för att skapa skador som är mer utmanande att läka jämfört med tidigare metoder med hjälp av lasrar, nålar eller skalpellblad för att skapa rena, exakta skadegeometrier32,33,34. För det andra möjliggör ASOC-metoden spårning av skadeframsteg och terapeutiska prestanda utöver initial skadeinduktion. Att kunna spåra ut till 72 h var inte möjligt i den tidigare utvecklade bänkskivan OG skadeplattform10,11,12 ochvar motivationen bakom att utveckla detta protokoll. Faktum är att cellens livskraft förblev hög i hornhinnans endotel i minst 1 vecka i ASOC13. ASOC är det enda sättet att uppnå denna långsiktiga karakterisering utan att övergå till kostsamma in vivo-experiment.
De viktigaste applikationerna för ASOC-plattformen är tvåfaldiga. För det första kan modellen användas för att ytterligare karakterisera öppna globe-skador, särskilt med tanke på hur de förändras med tiden. I den tidigare studien karakteriserades OG skador på detta sätt och sårläkning observerades över 72 h efter skada13. Ytterligare spårning av olika skadestorlekar, former, platser i 72 timmar eller ännu längre när det gäller biologiska förändringar som inträffar kommer att informera kritiska medicinska beslut som måste fattas efter OG-skador. Vissa skadeparametrar kan möjliggöra självläkning av hornhinnan, eller andra parametrar kan vara allvarligare om ingreppet inte appliceras inom de första 24 h. Denna information kommer att vara ovärderlig för triaging patienter när begränsade medicinska förnödenheter eller evakuering resurser finns tillgängliga.
För det andra kan ASOC OG-plattformen användas för att utveckla och testa produktutveckling. För denna applikation kan organkulturplattformen fylla ett antal roller. Under den inledande produktutvecklingen kan kortare tidsramar testas med en rad produktformuleringar för att avgöra vad som är mest effektivt. Organkultursystemet kan konfigureras för ännu större hög genomströmning för denna applikation med ytterligare sprutpumpar för att gå utöver de tio samtidiga experiment som är möjliga med systemet detaljerat här. För mer raffinerade produkter kan längre tidspunkter utvärderas för att bedöma prestanda för 72 h eller potentiellt ännu längre. Slutligen kan sårläkningsutvärdering vara möjlig vid utvärdering av biologiskt aktiva produkter som permanent kan behandla OG-skador snarare än tillfällig stabilisering.
Det finns dock begränsningar med ASOC OG-plattformen som bör beaktas. För det första, medan modellen möjliggör långsiktig bedömning av terapier, saknar den all vävnad i ögat utanför hornhinnanskleralskal, såsom iris och lins. Dessa ytterligare vävnader kommer sannolikt att påverkas av OG-skadan och kan spela en roll i skadeprogression. På samma sätt saknar ett isolerat främre segment immunsvarselement som skulle inkluderas vid övergång från ASOC-modellen till efterföljande djurförsök. Därefter är modellen endast lämplig för att skapa hornhinnans OG-skador och potentiellt limbala OG-skador. Scleral eller bakre OG skador kan inte induceras med denna metod. Många av dessa skadetyper resulterar dock i skador på näthinnan, vilket gör någon tillfällig stabilisering terapeutisk osannolikt att förhindra förlust av syn35,36. Slutligen spårades skador med modellen ut till 72 h efter skada endast. ASOC har använts i andra applikationer ut till 2 veckor, så modellen kan sannolikt användas för dessa applikationer, men det har inte testats förnärvarande 37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen. De åsikter som uttrycks i denna artikel är författarens och återspeglar inte den officiella policyn eller positionen för US Army Medical Department, Department of the Army, Department of Defense eller DEN AMERIKANSKA regeringen.
Acknowledgments
Detta material är baserat på arbete som stöds av USA: s försvarsdepartement genom ett interagency-avtal (#19-1006-IM) med det tillfälliga förvärvsprogrammet för cornealreparation (United States Army Medical Materiel Development Agency).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
- Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
- Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
- Riesberg, J., Powell, D., Loos, P.
- Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
- Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
- Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
- Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
- Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
- Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
- Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
- Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
- Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
- Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
- Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
- Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
- Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
- Ren, H., Wilson, G.
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
- Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
- Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
- Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
- Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
- Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
- Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
- Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
- Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
- Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
- Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
- Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
- Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
- Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
- Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
- Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
- Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).
