Summary
Open globe øjenskader kan gå ubehandlet i flere dage i landdistrikterne eller militær-relevante scenarier, hvilket resulterer i blindhed. Terapi er nødvendig for at minimere tab af synet. Her beskriver vi en organkultur åben kloden skade model. Med denne model kan potentielle terapier til stabilisering af disse skader evalueres korrekt.
Abstract
Open globe skader har dårlige visuelle resultater, ofte resulterer i permanent tab af synet. Dette skyldes til dels en længere forsinkelse mellem skade og medicinsk intervention i landdistrikterne miljøer og militærmedicin applikationer, hvor oftalmologisk pleje ikke er let tilgængelige. Ubehandlede skader er modtagelige for infektion, efter at øjet har mistet sin vandtætte forsegling, samt tab af væv levedygtighed på grund af intraokulær hypotension. Therapeutics at midlertidigt forsegle åbne kloden skader, hvis korrekt udviklet, kan være i stand til at genoprette intraokulært tryk og forhindre infektion, indtil korrekt oftalmologisk pleje er mulig. For at lette produktudvikling, detaljeret her er brugen af en forreste segment organkultur open globe skade platform for sporing terapeutiske præstationer for mindst 72 timer efter skade. Porcine forreste segment væv kan opretholdes i specialdesignede organ kultur retter og holdes på fysiologisk intraokulært tryk. Punkteringsskader kan oprettes med et pneumatisk drevet system, der kan generere skadesstørrelser på op til 4,5 mm i diameter, svarende til militærrelevante skadesstørrelser. Tab af intraokulært tryk kan observeres i 72 timer efter skaden, der bekræfter korrekt skadeinduktion og tab af øjets vandtætte forsegling. Terapeutisk ydeevne kan spores ved påføring til øjet efter skade induktion og derefter spore intraokulært tryk i flere dage. Endvidere er den forreste segment skade model gælder for udbredte metoder til funktionelt og biologisk sporing forreste segment fysiologi, såsom vurdering af gennemsigtighed, okulær mekanik, hornhinde epitel sundhed, og væv levedygtighed. Samlet set er den metode, der er beskrevet her, et nødvendigt næste skridt i retning af at udvikle biomaterialebehandling til midlertidig forsegling af åbne globusskader, når oftalmisk pleje ikke er let tilgængelig.
Introduction
Skader på åben globus (OG) kan resultere i permanent synstab, når de ikke behandles eller i det mindste stabiliseres efter skade1. Forsinkelser er imidlertid fremherskende i fjerntliggende områder, hvor adgang til oftalmisk intervention ikke er let tilgængelig, f.eks. i landdistrikter eller på slagmarken i militære scenarier. Når behandlingen ikke er let tilgængelig, den nuværende standard for pleje er at beskytte øjet med en stiv skjold, indtil medicinsk intervention er mulig. I militærmedicin er denne forsinkelse i øjeblikket op til 24 timer, men det forventes at stige op til 72 timer i fremtidige kampoperationer i bymiljøer, hvor luftevakuering ikke er mulig2,3,4. Disse forsinkelser kan være endnu længere i civile anvendelser i landdistrikter, hvor adgangen til oftalmisk intervention er begrænset5,6. En ubehandlet OG-skade er meget modtagelig for infektion og tab af intraokulært tryk (IOP), fordi øjets vandtætte forsegling er kompromitteret7,8. Tab af IOP kan påvirke væv levedygtighed, hvilket gør enhver medicinsk intervention usandsynligt, at genoprette synet, hvis forsinkelsen mellem skade og terapeutisk er for lang9.
For at muliggøre udviklingen af let at anvende terapi til forsegling OG skader, indtil en oftalmologisk specialist kan nås, blev der tidligere udviklet en bænk og skadesmodel10,11. Med denne model blev højhastighedsskader skabt i hele porcine øjne, mens IOP blev fanget af tryktransducere. Therapeutics kan derefter anvendes til at vurdere deres evne til at forsegle OG skade site12. Men da denne model bruger hele porcine øjne, det kan kun vurdere øjeblikkelig terapeutisk ydeevne uden mulighed for at spore langsigtede resultater på tværs af de mulige 72 timer vindue, hvor den terapeutiske skal stabilisere skadestedet, indtil patienten når specialbehandling. Som følge heraf blev der udviklet og beskrevet en forreste segmentorgankultur (ASOC) OG skadesmodel i denne protokol som en platform til sporing af langsigtet terapeutisk ydeevne13.
ASOC er en meget anvendt teknik til vedligeholdelse af avaskulært væv i det forreste segment, såsom hornhinden, i flere uger efter enucleation14,15,16,17. Det forreste segment opretholdes under fysiologisk IOP ved at gennemtrænge væske ved fysiologiske strømningshastigheder og bevare det trabekulære meshwork udstrømningsområde, det væv, der er ansvarlig for reguleringen af IOP, under ASOC-opsætning18,19. ASOC-platformen kan opretholde væv fysiologisk, fremkalde en OG-skade ved hjælp af en pneumatisk drevet enhed, anvende en terapeutisk og spore skadestabilisering i mindst 72 timer efter skade13.
Her indeholder protokollen en trinvis metode til brug af ASOC-platformen. Først beskriver den, hvordan man opsætter og fabrikerer ASOC-platformen. Dernæst beskriver protokollen, hvordan man aseptisk dissekerer det forreste segment og opretholder det trabekulære meshwork, efterfulgt af opsætning af forreste segmentvæv i specialbyggede orgelkulturretter. Derefter beskriver det, hvordan man opretter åbne globe skader og anvender terapeutisk umiddelbart efter skade. Endelig giver protokollen et overblik over karakteriseringsparametre, der er mulige til brug med denne metode, der vurderer funktionelle, mekaniske og biologiske egenskaber i øjet, og hvor godt skaden blev stabiliseret. Samlet set giver denne model en tiltrængt platform til at fremskynde produktudvikling til stabilisering og behandling af åbne globe skader og forbedre den dårlige vision prognose efter skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før du udfører denne protokol, skal du være opmærksom på, at der er juridiske og etiske krav på plads for brug af dyr i forskning og uddannelse. Hvis levende dyr anvendes til kilden til okulært væv, skal du søge godkendelse af den lokale etiske eller juridiske myndighed (IACUC eller etisk komité osv.), inden de påbegyndes. Hvis der er nogen tvivl om at opnå godkendelse til brug af dyr, skal du ikke fortsætte. Vi har tidligere fastslået og rapporteret, at friske porcine øjne opnået og anvendes inden for 24 timer post mortem sammenlignet tættest på in vivo fysiologi og klarede sig godt for disse undersøgelser (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. Ingen levende dyr blev brugt i hele denne protokol, ved hjælp af en vævsleverandør til at opnå væv inden for 24 timer.
BEMÆRK: Før vævsopkomsten fremstilles organkulturretterne (tillægsprotokol 1), fastspændingsringe (tillægsprotokol 1), fadestande (tillægsprotokol 1),opsætning af tryktransducerdata (supplerende protokol 2) og punktermatisk punkteringsplatform (tillægsprotokol 3). Steriliser opvasken, værktøjerne og forsyningerne, og forbered arbejdsområderne. Det er nyttigt at have et ikke-sterilt område til at udføre grov dissektion på øjnene, da de normalt kommer med bindevæv fastgjort. Udfør disse første trin på en åben, ren arbejdsflade, og overfør derefter øjnene aseptisk ind i et BSC II-kabinet til mikro dissektion (kabinet # 1). Optimalt, BSC II kabinet udnyttet til mikro-dissektion er adskilt fra parabol samling BSC II kabinet (kabinet # 2) for at minimere luftstrømmen og maksimere arbejdsområde. Sæt mikro dissektionsskabet op med et dissekeringmikroskop og en måde at visualisere arbejdsfladen (kamera eller okularer, der stikker ud af kabinettet).
1. Sterilisering trin, forsyninger (se Tabel over materialer for flere detaljer), og opsætning
- Forbered og gassterilisere følgende elementer (1 sæt til hvert øje): ASOC skål, fastspændingsring, to fluidiske stik med O-ringe, to 18 G nål hubs, fire skruer, to længder af PE-100 slanger (længden af afstanden skal være lang nok til at strække sig fra fadet inde i inkubatoren til sprøjten pumpe og tryk transducer dataindsamling setup) to 18 G 90° bøjede nålenav, to 3-vejs ventiler.
- Forbered og autoklave følgende sæt.
- Forbered og autoklave mikro-dissektion instrument kit, der indeholder et par fine sammenkædninger, et par Vannas saks, et par medium tandede sammenkævne, et par store saks, vatpinde, og et barberblad eller skalpel.
- Forbered og autoklave samleinstrumentet, der indeholder et par medium tandede sammenk tvinger, et par kirurgiske sakse og en L-nøgle.
- Forbered og autoklave den daglige kit (mængde: en om dagen af kultur), der indeholder en L-nøgle til at stramme fastspænding ringe til retter hver dag efter behov.
- Autoklave fire 100 mL bægerglas til desinfektion og opbevaring af øjne og forreste segmenter.
- Autoklave punkteringsobjekterne.
- Saml følgende sterile genstande: Petriskål (1 skål/øje), gaze (1-2/øje), opvaskestativ, 20 mL sprøjter (1/øje), 10 mL sprøjter (1/øje), nylonsprøjtefiltre (1/øje).
- Forbered sterile medier: DMEM med 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicin, 1x Antibiotisk-Antimycotic (AA; ca. 30-40 mL komplet medier / øje).
- Forbered AA-PBS: PBS med 1x AA (~500 mL).
- Forbered den grove dissektionsværktøjspakke: Ren og tør stor kirurgisk saks og sammenkædning.
- Opsætning af det ikke-sterile dissektionsarbejdsområde: Saml forsyninger fra grov dissektionsværktøjspakke, inducerede porcineøjne nedsænket i PBS og på is, kirurgisk drapering, 100 mL bægerglas med PBS. Læg den kirurgiske drapering og elementer, der kræves for grov dissektion.
- Opsætning af det sterile dissektionsarbejdsområde: Saml forsyninger fra mikrodektionsinstrumentsæt, steril gaze, dissekeringmikroskop, betadinopløsning, steril PBS, sterile medier, fire steriliserede 100 mL-bægerglas, steril petriskål. Aseptisk overførsel til BSC II kabinet # 1. Sæt kabinettet op til visualisering af øjnene på dissekeringmikroskopet.
- Konfigurer ASOC-samlingsarbejdspladsen: Saml gassteriliserede kits (skålsæt og lågsæt), montageinstrumentsæt, sterile medier, skålstativer, sterile petriskåle, sterile sprøjter og sprøjtefiltre. Aseptisk overførsel til BSC II kabinet # 2. Sæt skabet op til parabolmontering.
- Når øjnene er stabiliseret og klar til punktering (72 timer efter opsætningen), overføres de aseptisk til et BSC II-kabinet. Konfigurer OG-induktionsarbejdsområdet: Pneumatisk drevet skadeinduktionsenhed (samling beskrevet i supplerende 3) og Lab Jack og cross-tracking skruestik til at holde ASOC-skålen.
2. Dissektion af væv
- Forbered svinvævet ved hjælp af ikke-steril dissektionsarbejdsplads.
- Procure induceret porcine øjne fra et lokalt slagteri, dyreforsøg, eller sælger. Hold øjnene på is nedsænket i PBS under levering og brug umiddelbart efter modtagelse.
- Skær det ekstraorbitale væv væk og trim bindehinden og lad kun hornheksle shell og synsnerven. Udfør dissektionen under ikke-sterile forhold med stor kirurgisk saks og sammenkædninger i en grov dissektionsværktøjspakke.
- Placer øjnene tilbage i frisk PBS på is, indtil alle øjne, der kræves for eksperimentel opsætning er blevet foreløbig / brutto dissekeret.
- Dyk øjnene ned i 10% betadinopløsning i 2 min i lukkede beholdere og overfør aseptisk til BSC II kabinet # 1. Udfør alle de efterfølgende værker under sterile forhold for at minimere forureninger under opsætningen.
- Sterilt dissekere forreste segmenter.
- Efter 2 min i betadinopløsning overføres øjnene til tre serielle vaske af steril AA-PBS for at fjerne overskydende betadinopløsning fra okulær overflade, samtidig med at det okulære vævs sterilitet opretholdes. Efter tre vasker, vedligeholde vævet i AA-PBS indtil videre brug.
- Forhåne øjet ved hjælp af et barberblad / skalpel og buet saks. Placer øjet på en AA-PBS-gennemblødt gaze og skabe et snit med et sterilt barberblad eller skalpel nær ækvator af øjet (60/40 split med 40 på den forreste side). Ved hjælp af buet kirurgisk saks, halvkugleformet øjet for at isolere det forreste øje (hornhinde halv).
BEMÆRK: Snittet omkring det forreste segment skal være kontinuerligt for at forhindre takkede, ru kanter i scleraen, der vil skabe væskelækager efter opsætning i orgelkulturen. - Brug mikroscissorer som en skovl til at skovle glasagtig humor fra det forreste segment. Fjern linsen fra det forreste segment ved hjælp af mikroscissorer. Lad de forreste segmenter i AA-PBS indtil yderligere dissektionstrin.
BEMÆRK: Alle de øjne, der vil blive dissekeret kan holdes på dette trin og en efter en taget gennem resten af dissektionsprocessen. - Med et dissekeringmikroskop skæres iris til irisrod gradvist, radialt indtil trabekulært meshwork (TM) er synligt. TM er et pigmenteret væv, der består af fibre, der omkranser ligegyldigt omkring hornhindeskallen. Omhyggelige nedskæringer i iris mod iris rod vil udsætte dybden af TM under vævet.
- Skær 360° rundt om iris i samme dybde som det første snit i vævet for at eksponere hele TM-regionen. Ryd op i eventuelle resterende resterende iris dækker TM som nødvendigt.
- Trim de ciliary krop rester posterior til TM, forlader kun et tyndt bånd af væv posterior til TM regionen (ca. 1 mm).
- Placer det dissekerede forreste segment (AS) i medier, indtil det er yderligere konfigureret i ASOC i BSC II kabinet nr. 2.
BEMÆRK: Alle øjne kan holdes på dette tidspunkt forud for ASOC-opsætningen, hvis en enkelt bruger udfører dissektion og organkulturskålssamling.
3. Opsætning af forreste segmenter i orgelkultur retter
- Placer en enkelt AS i en Petri parabol med AS omvendt (kop op). Brug en vatpind, våd i medierne og forsigtigt duppe i midten af hornhinden for at fjerne ethvert pigment. Brug sammentap til at holde øjet og den samme vatpind, tørre vatpind omkring sclera at fjerne ekstra pigment.
- Vend AS og sted på toppen af bunden del af fadet over den forhøjede region, centrering hornhinden over den forhøjede region i fadet. Placer fastspændingsringen oven på den nyoprettede AS.
- Placer fire skruer i de tilsvarende huller for at holde ringen på plads med AS under ringen. Skrune håndspændet forsigtigt med L-tasten.
BEMÆRK: Stramningstrinnet vil ske dagligt under hele eksperimentet, så målet med den indledende stramning her er at sikre, at medierne ikke lækker, samtidig med at man undgår at bryde fastspændingsringen. - Med et sterilt petriskålsæt skal du placere toppen over skålen og vende opsætningen. Fastgør retsstativet. Fastgør de fluidiske stik med O-ringe til gevindporte i bunden af fadet.
- Til et flydende stik skal du fastgøre en 18 G 90° bøjet nålnav, en slangelængde, en 18 G nålenav, et nylonsprøjtefilter, en trevejsventil og en 20 mL sprøjte fyldt med medier.
- Til det andet fluidiske stik skal du fastgøre en 18 G 90 ° grad bøjet nål hub, længden af slangen, en 18 G nål hub, en tre-vejs ventil, og tønde del af en steril 10 mL sprøjte (dette vil fungere som et reservoir til at fange væske og bobler fra ASOC).
- Med tre-vejs ventiler åbnet korrekt til sprøjterne, forsigtigt skubbe medier gennem systemet ved hjælp af fluidics stikport identificeret i trin 3,5 til at puste AS, fylde medier i slangen, og i sidste ende reservoiret.
BEMÆRK: Hvis mediet lækker ind i ASOC-fadet, er AS ikke fastgjort tæt nok med fastspændingsringen. - Fjern bobler ved forsigtigt at skubbe medierne ind i fadet og vende fadet for at skubbe boblerne og ind i reservoiret.
- Placer fadet og stå oprejst. Placer den nederste del af en petriskål under fødderne af stativet, pas på ikke at fange slangen.
4. Start forreste segment orgelkultur
- ASOC er nu klar til inkubation. Anbring ASOC-fadet i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2). Sørg for, at asoc-fadets højde i inkubatoren over tryktransducerne er kendt og gjort opmærksom på at beregne IOP nøjagtigt (tillægsprotokol 4).
- Ret slangelinjerne ud gennem bunden af 37 °C, 5% CO 2-inkubatordøren, så de ikke forstyrrer åbningen og lukningen af døren. 20 mL sprøjten fastgøres til sprøjtepumpen, der er indstillet til 2,5 μL/min.
- Placer slangen med beholderen ved tryktransducerinstrumentet. Tilslut side 3-vejs ventilen til tryktransduceropsætningen, mens PBS flyder gennem linjen for at undgå, at luftbobler kommer ind i slangelinjerne.
BEMÆRK: Tøm PBS fra reservoirerne, når systemet er sat op for at reducere sandsynligheden for reservoirforurening med mikrobiel vækst i organkulturens varighed. - Start IOP-dataindsamling ved først at sikre, at der findes et microSD-kort til lagring af datafiler. Derefter skal du tænde for opsætningen af tryktransducer for at starte dataindsamlingen.
BEMÆRK: Nærmere oplysninger om opsætning af tryktransducerdataindsamlingsenheden findes i supplerende protokol 2.
5. Daglig vedligeholdelse af ASOC
- Når ASOC har haft 24 timer til at ekvilibrere, skal du fjerne opvasken fra 37 °C, 5% CO 2-inkubatoren og placere dem i BSC II-kabinettet.
BEMÆRK: Ved erhvervelse af trykdata ligner disse tidsperioder pigge, da ASOC'erne fjernes fra inkubatoren (højdeændring) og justeres i kabinettet. - Kontroller, om der er lækager under hver skål på petripladen. Hvis det er til stede, skal du kontrollere, om der er stramme væsketilslutninger under fadet, og om nødvendigt stramme igen. Kontroller, om der er utætheder i fadtoppen ved hjælp af en steril L-nøgle til at stramme skruerne i spænderingen.
BEMÆRK: AS scleravævet komprimerer og reducerer tykkelsen med 24 timer, og fastspændingsringen skal strammes. - Aspirere medierne fra fadet godt.
BEMÆRK: Det trabekulære meshwork filtrerer væske fra det medie, der pumpes ind i ASOC. Derfor vil medierne være til stede i ASOC-fadet langs kanterne. - Gentag trin 3.7 og 3.8 for at fjerne eventuelle indespærrede luftbobler.
- Genopfyld sprøjter på sprøjtepumperne, sørg for, at sprøjtepumperne fungerer, og bekræft justeringen af ventiler for perfusion til ASOC. Send ASOC-fadet tilbage til 37 °C, 5 % CO 2-inkubatoren.
BEMÆRK: Optimalt skal disse trin udføres dagligt. Brugen af en 20 mL startvolumen af medier, ASOC-skålens brøndvolumen og en pumpehastighed på 2,5 μL/min bør dog være tilstrækkelig til at lade systemet køre i flere dage uforstyrret.
6. OG skade induktion med punktmatisk-drevne punktering enhed
BEMÆRK: Konstruktionen af punkteringen af punkturanordningen er beskrevet i tillægsprotokol 3. OG skader induceres efter IOP har stabiliseret sig, hvilket normalt sker efter 3 dage i kulturen. Acceptable IOP-værdier er 5-20 mmHg baseret på fysiologisk IOP, som kan bestemmes ved at evaluere IOP-datafilerne eller angive LED-indikatorer i trykmålingssystemet som beskrevet i supplerende protokol 2.
- Forbered BSC II kabinet til OG skade induktion som beskrevet i trin 1.10. Tilslut punkteringsplatformen til en trykluftledning. Fastgør det sterile punkteringsobjekt til chucken.
BEMÆRK: En luftkompressor kan bruges til at drive enheden, men tank trykluft eller indbyggede laboratorielinjer kan være tilstrækkeligt, hvis trykket er større end 50 psi. - Indstil trykregulatoren på punkteringsplatformen til 50 punkteringskraft for tilstrækkelig punkteringskraft på genstande med en diameter på op til 4,5 mm. Placer cross-tracking skruestikken på laboratoriestikket foran punkteringsplatformen for at holde ASOC-fadet under skades induktion.
- Fjern ASOC-opsætningen fra 37 °C, 5 % CO 2-inkubator, og placer den vinkelret på punkturplatformen (figur 2), når låget er fjernet, og læg det til side. Hold det forreste segment perfusing, men luk 3-vejs ventilporten til tryktransduceren for at forhindre overtrykskader på transduceren.
- Stempelarmen udvides til den maksimale afstand, og placer hornhindeudsen inden for 1 mm fra punkteringsobjektet. Træk stempelarmen tilbage, og bring det forreste segment 1 cm tættere på punkteringsobjektet.
BEMÆRK: Denne afstand er optimeret til højeffektiv skade induktion uden at ramme ASOC skålen. - Affyr punkteringsanordningen ved at tænde den og åbne magnetventilen med den anden kontakt på enheden. Hvis du vil trække enheden tilbage, skal du trykke på den anden kontakt igen for at fjerne punkteringsenheden fra øjet. Kontroller korrekt skade induktion ved visuel inspektion og medier lækker fra skade site.
- Fjern ASOC skål fra skruestikken; låget tilbage på skålsamlingen, og åbn den flydende linje for tryktransduceren. Anbring ASOC tilbage i 37 °C, 5 % CO 2-inkubatoren.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan terapeutisk anvendes på AS for at vurdere dens virkning for forsegling OG-skader.
7. Fjernelse af ASOC fra kulturen
BEMÆRK: Afhængigt af slutpunktsanalyse (se repræsentative resultater for mulige slutpunktsmetoder) skal AS forblive i ASOC-fadet oppustet, mens andre metoder kræver AS-væv isoleret fra kulturkammeret. Nedenstående metode beskriver, hvordan man tager AS ud af orgelkulturretterne og fjerner resten af opsætningen.
- Fjern ASOC-retterne fra 37 °C, 5 % CO 2-inkubatoren. Luk 3-vejs ventilen til sprøjten og reservoiret og afbryd slangen fra systemet. Kassér sprøjten, beholderen og filteret. Placer 3-vejs ventiler, slanger og nålenav i en separat beholder til vask og sterilisering.
- Afbryd nålenavene fra de flydende forbindelser i bunden af fadet. Unthread de fluidiske stik og o-ringe. Placer alle genstande i en beholder til vask og sterilisering.
- Fjern de fire skruer fra fastspændingsringen ved hjælp af L-tasten. Fjern forsigtigt fastspændingsringen.
- Brug sammentakkerne til at fjerne AS'en fra fadet og, afhængigt af slutpunktsanalyse og billede, placeres i fiksativt eller passende biofarligt affald.
8. Analyse af IOP-data
- Tilslut microSD-kortet til en computer for at fjerne den .txt fil, der indeholder data, fra den seneste eksperimentelle kørsel.
BEMÆRK: Filen er navngivet i den kode, der styrer mikrocontrolleren, og skal opdateres for hvert eksperiment (se supplerende protokol 2). - Importere dataene til et regneark.
- Organiser dataene i 12 kolonner: Tid (i min) og mV-signal for hver af 11 tryktransducerkanaler. De første ti kanaler svarer til ti ASOC eksperimentelle opsætninger. Det endelige transducersignal er, at en sensor, der er åben for luft som kontrolkanal, bekræfter, at mV-signalet ikke ændrede sig på grund af ændringer i indgangssignalet. Plot kontrol kanal versus tid til at bekræfte mV signal var konsekvent hele vejen igennem.
- Konverter mV-signalerne for ti kanaler til mmHg ved hjælp af hældnings-skæringspunktligninger, der genereres fra den indledende kalibrering af hver sensor (se supplerende protokol 4).
- Plot tid (konvertere til dage for at forenkle datafortolkning) versus hver af de ti kanaler til at bestemme, hvordan IOP svingede på tværs af eksperimentelle tidsforløb.
- Bestem gennemsnitlige IOP-værdier på nøglepunkter i dataene for lettere at sammenligne værdier mellem hver, og hvordan de ændres før og efter OG-skadeinduktion. Gennemsnitlig 2-3 timer data for hvert 24 timers interval for at bestemme IOP på hver dag i ASOC.
BEMÆRK: De repræsentative IOP-resultater er vist i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Billeder taget via Optisk Sammenhæng Tomografi (OKT) er vist for OG sårede øjne til at illustrere, hvordan en vellykket skade induktion ser ud. Figur 3 viser billeder til kontrol og OG skadet AS væv umiddelbart efter skade og 72 timer senere. Der vises to visninger: tværsnitsbilleder via skadesstedet og top-down-projektion (MIPs) for at visualisere billedets overfladeareal. Kontrol øjne viser ingen mærkbar forstyrrelse i hornhinden, mens klare skader kan være placeret, der krydser hele hornhinden efter OG skade. Fra MIPs er det tydeligt, at skader er uregelmæssige i form og størrelse, men skadestørrelsen falder over 72 timer. Tidligere har denne effekt vist sig at være signifikant for en række skadesstørrelser testet13.
Den primære dataudgang for OG-skadesmodellen, der er beskrevet i denne protokol, er intraokulært tryk i løbet af forsøgsopsætningen. Data registreres i millivoltenheder som en udgang fra hver tryktransducer, der kan omdannes til mmHg via kalibrering (supplerende protokol 4). Eksempel IOP-data vs. eksperimentelle tidsforløb er fastsat for øjne, der betragtes som acceptable, og andre, der ikke ville blive betragtet som brugbare (figur 4A). Fra trykspordata blev øjnene fastgjort til sensorer efter 24 timer i kultur, men IOP fortsætter med at svinge i løbet af de første 72 timer i kulturen. Fysiologisk IOP for AS væv i organkultur er ca 8-10 mmHg, så 2x og 1/2x rækkevidde blev besluttet som en port for brugbare IOP værdier efter værdier har stabiliseret (5-20 mmHg). Kun øjne, der var i dette interval ville være tilladt til brug med resten af protokollen. Fra tidligere eksperimenter havde vi en 90% succesrate, der blev opnået i ASOC-opsætningen for øjne, der stabiliserede sig i det krævede interval (Figur 4B).
Resultaterne for, hvordan IOP ændringer som følge af OG skade og terapeutisk intervention er også forudsat (Figur 4C, D). Efter og skadeinduktionen skal trykket falde betydeligt og forblive sådan, indtil vævet fjernes fra ASOC (Figur 4C). Hvis et øje efter skade induktion ikke falder i trykket, indikerer dette, at en vellykket skade ikke blev induceret, da IOP bør reduceres, hvis øjets vandtætte forsegling kompromitteres. Mindre skadesstørrelser kan dog selvhelbrede, hvilket kan resultere i, at IOP genoprettes. Hvis terapeutisk påføres øjet efter OG skade induktion, restaurering af IOP kan spores under ASOC. Dette koncept demonstreres med data, der viser et Dermabond klæbemiddel, der påføres 2,4 mm OG-skader (Figur 4D). Gennemsnitlige resultater for fem separate ASOC eksperimenter med og uden terapeutisk er vist, og det er tydeligt, at den terapeutiske er stigende IOP. Denne metode kan måle effekten af den terapeutiske for at genoprette IOP og spore, om dette tryk er genoprettet på tværs af nøglen 72 h post-OG skade.
Desuden kan ASOC-protokollen tilpasses til brug med en lang række tegniseringsslutpunkter for at opfylde slutbrugerens eksperimentelle krav. Under kultur, udstrømning medier forlader øjet kan indsamles på daglig eller endda timebasis, som kan udnyttes til sporing protein niveau ændringer forekommer under ASOC, efter OG skade induktion, eller efter terapeutisk anvendes. For eksempel er gelatine zymografi tidligere blevet udført for at opdage matrix metalloproteinase niveauer til at spore sårheling og væv remodeling20. Yderligere biologiske endepunkter er mulige efter fjernelse af væv fra kulturen via traditionelle immunohistokemimetoder til vurdering af vævs levedygtighed21,22, sporing af patofysiologiske ændringer i hornhinden23,24eller antistofbaseret farvning for ethvert protein af interesse25,26.
Funktionelle hornhinde målinger kan også fås fra øjnene opretholdes i ASOC. Hornhinde epitel integritet kan vurderes via en fluorescein øjenplet og billede erhvervelse ved hjælp af en blå lyskilde27,28. Efter fjernelse fra kultur, hornhindevæv kan vurderes for gennemsigtighed gennem simple billede erhvervelse13. Traditionel okulær billeddannelse kan også udføres for at vurdere vævsstruktur med eller uden terapeutisk indgriben. OCT billeder, som vist i figur 3, kan skabe tværsnitsbilleder gennem hornhinden og kan fanges ikke-invasivt, potentielt tillader billedindsamling samtidig opretholde væv i kulturen. Andre billeddannelsesmetoder såsom slidslampemikroskopi, ultralyd eller in vivokonfokal mikroskopi kan også tilpasses til at erhverve yderligere anatomiske oplysninger.
Endelig kan vurdering af de mekaniske egenskaber i det forreste segment opfanges for at forstå effekten af OG-skaden eller efterfølgende terapeutisk på det underliggende væv. Mens IOP dataindsamling alene fremhæver, hvordan integriteten af vandtæt forsegling af øjet er blevet kompromitteret, har vi tidligere vist, at yderligere test målinger kan måles for at drille ud yderligere mekaniske funktioner10,11. Okulær overholdelse, en klumpet mekanisk egenskab, der beskriver, hvordan intraokulært tryk ændrer sig på grund af inflation (ændring i volumen / ændring i trykket), kan måles med en sprøjtepumpe for at injicere pludselige små mængder væske i øjet og registrere den resulterende trykstigning med en tryktransducer. Højere overholdelse indikerer, at vævet er mindre stiv og kan bruges til at spore, hvordan terapeutiske materialeegenskaber adskiller sig fra det underliggende hornhindevæv. Lækagehastighed fra øjet eller en traditionel udstrømningsfacilitet kan måles og beregnes for at bestemme den præcise fluidiske strømningshastighed , der forlader øjet pr. trykenhed20,29. Endelig, med hensyn til terapeutisk testning, burst tryk kan måles for at bestemme det maksimale tryk øjet kan holde før den terapeutiske mangel. Dette kan bruges til at sammenligne ydeevne med uskadte øjne eller til at spore ændringer i ydeevnen med tid12,13.
Figur 1: Diagram over ASOC-opsætningen. Øjne holdes i specialbyggede orgelkulturretter og holdes på plads med en fastspændingsring. ASOC medier infunderes via sprøjtepumpe gennem ventil A og tilsluttes en tryktransducer, og efterfølgende dataindsamling med Valve B. Åbne porte i hver ventil fremhæves med blåt, mens gul angiver lukkede kanaler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over OG skade setup. (A) Pneumatiske drevet skade enhed setup. Fra venstre mod højre introduceres trykluft til enheden via en trykluftledning, der passerer gennem en regulator for at indstille trykket til 50 psi målt ved trykmåleren. To magnetventiler er forbundet med en lineær aktuator til direkte udvidelse/tilbagetrækning af borepatronen, der holder punkteringsobjektet. Skruestikket er placeret foran punkteringsanordningen for at holde øjet ved den relevante placering x, y, z. (B) Repræsentativ ASOC placeres foran skades induktionsanordningen. Yderligere oplysninger om anordningen og dens konstruktion er beskrevet i tillægsprotokol 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Optisk sammenhæng Tomografi Billeder af ASOC OG skade eksperimenter. Billeder vises for kontrol øjne (uskadt) og OG skadede øjne umiddelbart efter skade og 72 timer efter skade. Visninger vises som tværsnit gennem hornhinden (venstre side) og top-down maksimal intensitet projektion visninger af hornhinde overflade (højre side). Figuren er blevet tilpasset med tilladelse fra Snider et al.13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative IOP-resultater for ASOC-eksperimenter. (A) Rå IOP-data for de første 72 h af ASOC-opsætningen. Øjnene punkteres ved 72 timer, så de første 3 dage af data vurderes for at afgøre, om IOP stabiliserer sig i det acceptable IOP-interval (5-20 mmHg). Ud fra de repræsentative resultater falder tre af de fem øjne inden for det acceptable IOP-interval, mens man har IOP for høj, og man har IOP for lav (falder uden for den fremhævede gule region på plottet). (B) Stabiliseret IOP for n = 50 ASOC-opsætninger fra tidligere forsøg for at demonstrere den typiske succesrate med ASOC-metoden. (C) IOP for uskadte øjne sammenlignet med tre forskellige OG skade størrelser efter skade induktion for 72 timer. Tabet af IOP er tydeligt, uden tegn på bedring. (D) Skadede IOP-resultater sammenlignet med skader, der behandles med et Dermabond-klæbemiddel. Mens fejlprocenten er høj på grund af nogle øjne bliver forseglet og andre ikke, metoden kan spore ændringer til IOP i løbet af 72 timer periode efter skade. Figuren er blevet tilpasset med tilladelse fra Snider et al.13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende filer. Klik her for at downloade disse filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er kritiske trin med ASOC OG skade platform, der bør fremhæves for at forbedre sandsynligheden for succes, når du bruger metoden. For det første er det vigtigt, men udfordrende at bevare det traditionelle meshwork i det forreste segment dissektion, men udfordrende at gøre korrekt. Hvis TM afbrydes, vil øjet ikke opretholde fysiologisk pres og vil ikke opfylde kriterierne for forsøgsbrug. Det anbefales at øve dissektionsprocessen under normale forhold først i stedet for at indføre de ekstra aseptiske teknikudfordringer, indtil der opnås korrekte dissektioner. For det andet, når du indstiller øjnene i ASOC-retterne, er det bydende nødvendigt, at de er stramme nok til at forhindre væske i at lække, men løs nok til at forhindre beskadigelse af ASOC-retterne. Hvis øjet ikke er sikret stramt, væske vil lække ud fra øjet gennem ikke-fysiologiske midler resulterer i ringe eller ingen IOP. Den fastspændingsring, der holder øjet nede, er dog plastik og kan let brydes, hvis den er overtæt. Det er vigtigt at klemme øjnene ned over 2 dage, da det sclerale væv under ringen vil komprimere og løsne vævet i løbet af de første 24 timer. Det anbefales at stramme ringene lige indtil modstanden mod stramning mærkes på dag 1 og følge dette op ved at stramme op igen til lignende niveauer efter 24 timer i kultur for de bedste resultater.
For det tredje er det afgørende fuldt ud at forstå, hvor væskestrømmen er rettet mod alle tidspunkter, når du bruger denne model. Hver ASOC skål er forbundet til flere tre-vejs ventiler til direkte væskestrøm fra sprøjtepumpen eller 10 mL sprøjte reservoir og forbinde til tryk transducere. Forskellige forekomster af opsætningsprocessen kræver ventiler, der skal placeres på en sådan måde, at skylle luftbobler fra øjet eller for at beskytte tryktransducere fra overtryk. Der skal stadig udvises forsigtighed for at forstå, hvad der er åbent/tæt på alle tidspunkter forud for kritiske protokoltrin. Endelig er det afgørende, men let at miste steriliteten i hele ASOC OG-skadesprotokollen på tværs af flertrinsprocessen. Perfusion medier indeholder høje niveauer af antibiotika og antimycotics for at forhindre dette, og øjnene er nedsænket i betadin forud for at blive oprettet for at forhindre forureninger, men der er stadig kritiske skridt, hvor fejl er mest sandsynligt. Under den første opsætning i fadet skal du undgå kontakt med øjnene, mens du strammer fastspændingsringe på plads, og hold låg på opvasken til enhver tid, når de ikke er i brug. Et mere sandsynligt eksponeringstrin er i løbet af den daglige ASOC-vedligeholdelse. Det er vigtigt at gøre disse rutinemæssige trin i et biosikkerhedskab, selvom det ser ud til, at de hurtigt kan opnås uden at fjerne øjnene fra inkubatoren. Nøje at følge protokollen og opretholde god aseptisk teknik bør minimere forureningsrisici på tværs af de 6-dages ASOC-eksperimenter.
Samlet set er ASOC OG skadesplatformen unik fra andre metoder, der ser på åbne globeskader på grund af to nøglekriterier. For det første er skade induktion metode. Den anvendte højhastighedspneumatiske skadesanordning fremkalder skader med en høj kraftmængde. Dette giver mulighed for at fremkalde skader med genstande, der ikke er specielt skarpe eller med en lille diameter. Dette efterligner i højere grad skader, der er uregelmæssige i form; højhastighedssplinter skader som følge af eksplosive anordninger30,31. Den pneumatiske enhed kan nemt udstyres med uregelmæssige granatsplinter efterligne objekter til at skabe skader mere udfordrende at helbrede i forhold til tidligere metoder ved hjælp af lasere, nåle, eller skalpelblade til at skabe rene, præcise skade geometrier32,33,34. For det andet giver ASOC-metoden mulighed for at spore skadesfremskridt og terapeutisk ydeevne ud over indledende skadesinduktion. At kunne spore ud til 72 timer var ikke muligt i den tidligere udviklede bordplade OG skade platform10,11,12 og var motivationen bag udviklingen af denne protokol. Faktisk forblev celle levedygtigheden høj i hornhindedotelen i mindst 1 uge i ASOC13. ASOC er det eneste middel denne langsigtede karakterisering kan opnås uden at skifte til dyre in vivo eksperimenter.
De vigtigste applikationer til ASOC-platformen er dobbelt. For det første kan modellen bruges til yderligere at karakterisere åbne globe skader, især i betragtning af hvordan de ændrer sig med tiden. I den tidligere undersøgelse blev OG-skader karakteriseret på denne måde, og sårheling blev observeret over 72 timer efter skade13. Yderligere sporing af forskellige skadesstørrelser, former, steder i 72 timer eller endnu længere med hensyn til biologiske ændringer, der opstår, vil informere kritiske medicinske beslutninger, der skal træffes efter OG-skader. Visse skadesparametre kan give mulighed for selvhelbredende af hornhinden, eller andre parametre kan være mere alvorlige, hvis interventionen ikke anvendes inden for de første 24 timer. Disse oplysninger vil være uvurderlige for triaging patienter, når begrænsede medicinske forsyninger eller evakuering ressourcer er tilgængelige.
For det andet kan ASOC OG platformen bruges til at udvikle og teste produktudvikling. Til denne applikation kan orgelkulturplatformen udfylde en række roller. Under den indledende produktudvikling kan kortere tidsrammer testes med en række produktformuleringer for at bestemme, hvad der er mest effektivt. Orgelkultursystemet kan konfigureres til endnu større high-throughput til denne applikation med ekstra sprøjtepumper til at bevæge sig ud over de ti samtidige eksperimenter, der er mulige med systemet beskrevet her. For mere raffinerede produkter kan længere tidspunkter evalueres for at vurdere ydeevnen i 72 timer eller potentielt endnu længere. Endelig kan sårheling evaluering være mulig, når man vurderer biologisk aktive produkter, der permanent kan behandle OG skader i stedet for midlertidig stabilisering.
Der er dog begrænsninger med ASOC OG-platformen, der bør tages i betragtning. For det første, mens modellen giver mulighed for mere langsigtet vurdering af terapi, det mangler alle væv i øjet uden for hornhindegl shell, såsom iris og linse. Disse yderligere væv vil sandsynligvis blive påvirket af OG-skaden og kan spille en rolle i skadesprogressionen. På samme måde mangler et isoleret forreste segment immunresponselementer, der ville blive inkluderet, når man skiftede fra ASOC-modellen til efterfølgende dyreforsøg. Dernæst er modellen kun egnet til at skabe hornhinde OG skader og potentielt limbale OG skader. Scleral eller posterior OG skader kan ikke induceres med denne metode. Men mange af disse skade typer resulterer i skader på nethinden, hvilket gør enhver midlertidig stabilisering terapeutisk usandsynligt at forhindre tab af vision35,36. Endelig blev skader med modellen ud til 72 timer efter skade kun sporet. ASOC er blevet udnyttet i andre applikationer ud til 2 uger, så modellen kan sandsynligvis bruges til disse applikationer, men det er ikke blevet testet på nuværende tidspunkt37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. De synspunkter, der udtrykkes i denne artikel er de af forfatteren (r) og afspejler ikke den officielle politik eller holdning i den amerikanske hær Medical Department, Department of the Army, Department of Defense, eller den amerikanske regering.
Acknowledgments
Dette materiale er baseret på arbejde, der støttes af det amerikanske forsvarsministerium gennem en interagency aftale (# 19-1006-IM) med den midlertidige Hornhinde Reparation erhvervelse program (United States Army Medical Materiel Development Agency).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
- Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
- Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
- Riesberg, J., Powell, D., Loos, P.
- Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
- Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
- Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
- Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
- Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
- Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
- Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
- Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
- Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
- Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
- Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
- Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
- Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
- Ren, H., Wilson, G.
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
- Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
- Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
- Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
- Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
- Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
- Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
- Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
- Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
- Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
- Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
- Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
- Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
- Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
- Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
- Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
- Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).
