Summary
Açık küre göz yaralanmaları, kırsal veya askeri senaryolarda birden fazla gün boyunca tedavi edilmeyebilir ve bu da körlüğe neden olabilir. Görme kaybını en aza indirmek için terapötiklere ihtiyaç vardır. Burada, bir organ kültürü açık küre yaralanma modelini detaylandırıyoruz. Bu model ile, bu yaralanmaları stabilize etmek için potansiyel terapötikler uygun şekilde değerlendirilebilir.
Abstract
Açık küre yaralanmaları kötü görsel sonuçlara sahiptir ve genellikle kalıcı görme kaybına neden olabilir. Bu kısmen, kırsal ortamlarda yaralanma ve tıbbi müdahale ile oftalmik bakımın hazır olmadığı askeri tıp uygulamaları arasındaki uzun gecikmeden kaynaklanmaktadır. Tedavi edilmeyen yaralanmalar, göz su geçirmez mührünü kaybettikten sonra enfeksiyona ve göz içi hipotensiyona bağlı doku canlılığı kaybına karşı hassastır. Açık küre yaralanmalarını geçici olarak mühürlemek için terapötikler, uygun şekilde geliştirilirse, göz içi basıncını geri getirebilir ve uygun oftalmik bakım mümkün olana kadar enfeksiyonu önleyebilir. Ürün geliştirmeyi kolaylaştırmak için, burada ayrıntılı olarak, yaralanma sonrası en az 72 saat boyunca terapötik performansı izlemek için ön segment organ kültürü açık küre yaralanma platformunun kullanımı ayrıntılı olarak açıktır. Porcine ön segment dokusu özel tasarlanmış organ kültürü yemeklerinde tutulabilir ve fizyolojik göz içi basıncında tutulabilir. Delinme yaralanmaları, askeri yaralanma boyutlarına benzer şekilde 4,5 mm çapa kadar yaralanma boyutları üretebilen pnömatik güçte bir sistemle oluşturulabilir. Göz içi basıncı kaybı, uygun yaralanma indüksiyonunu ve gözün su geçirmez contasının kaybını doğrulayan 72 saat sonrası yaralanma için gözlenebilir. Terapötik performans, yaralanma indüksiyonu sonrası göze uygulama ve daha sonra göz içi basıncının birden fazla gün boyunca izlenmesi ile takip edilebilir. Ayrıca, ön segment yaralanması modeli, saydamlığı, oküler mekaniği, kornea epitel sağlığını ve doku canlılığını değerlendirmek gibi ön segment fizyolojisini fonksiyonel ve biyolojik olarak izlemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler için geçerlidir. Genel olarak, burada açıklanan yöntem, oftalmik bakım hazır olmadığında açık küre yaralanmalarını geçici olarak kapatmak için biyomalzeme terapötikleri geliştirmek için gerekli bir sonraki adımdır.
Introduction
Açık küre (OG) yaralanmaları tedavi edilmezse veya yaralanmadan sonra en azından stabilize edildiğinde kalıcı görme kaybına neden olabilir1. Ancak gecikmeler, kırsal alanlarda veya askeri senaryolarda savaş alanında olduğu gibi oftalmik müdahaleye erişimin hazır olmadığı uzak bölgelerde yaygındır. Tedavi hazır olmadığında, mevcut bakım standardı, tıbbi müdahale mümkün olana kadar gözü sert bir kalkanla korumaktır. Askeri tıpta, bu gecikme şu anda 24 saate kadardır, ancak hava tahliyenin mümkün olmadığı kentsel ortamlarda gelecekteki savaş operasyonlarında 72 h'ye kadar artması bekmektedir2,3,4. Oftalmik müdahaleye erişimin sınırlı olduğu kırsal, uzak sivil uygulamalarda bu gecikmeler daha da uzun olabilir5,6. Tedavi edilmemiş bir OG yaralanması, gözün su geçirmez mührü tehlikeye atıldığınız için enfeksiyona ve göz içi basıncı kaybına (Gİb) oldukça duyarlıdır7,8. Gİb kaybı doku canlılığını etkileyebilir, yaralanma ve terapötik arasındaki gecikme çok uzunsa, herhangi bir tıbbi müdahalenin görüşü geri getirme olasılığını düşük hale getirir9.
Bir oftalmik uzmana ulaşılana kadar OG yaralanmalarını kapatmak için uygulanması kolay terapötiklerin geliştirilmesini sağlamak için, daha önce10 , 11. Bu model ile tüm gözenekli gözlerde yüksek hızlı yaralanmalar oluşturulurken, Gİb basınç dönüştürücüler tarafından yakalandı. Terapötikler daha sonra OG yaralanma bölgesini mühürleme yeteneklerini değerlendirmek için uygulanabilir12. Bununla birlikte, bu model tüm gözenekli gözleri kullandığından, sadece hasta özel bakıma ulaşana kadar terapötik yaralanma bölgesini stabilize etmesi gereken olası 72 saat penceresinde daha uzun süreli performansı izlemenin bir yolu olmadan hemen terapötik performansı değerlendirebilir. Sonuç olarak, ön segment organ kültürü (ASOC) OG yaralanma modeli geliştirilmiş ve uzun süreli terapötik performansı izlemek için bir platform olarak bu protokoldedetaylandır 13.
ASOC, kornea gibi ön segmentin avasküler dokusunun, enükleasyon sonrası 14 , 15,16,17gibi birkaç hafta boyunca korunması için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Ön segment fizyolojik akış hızlarında sıvı perfüzyon ve TRABEKÜler meshwork çıkış bölgesi korunarak fizyolojik Gİb altında korunur, Gİb düzenleme sorumlu doku, ASOC kurulumu sırasında18,19. ASOC platformu doku fizyolojik olarak koruyabilir, pnömatik güçlendirilmiş bir cihaz kullanarak OG yaralanmasına neden olabilir, terapötik uygulayabilir ve yaralanma sonrası en az 72 saat boyunca yaralanma stabilizasyonunu izleyebilir13.
Burada, protokol ASOC platformunu kullanmak için adım adım bir metodoloji sağlar. İlk olarak, ASOC platformunun nasıl kurulayıp üretılacağını detaylandırıyor. Daha sonra, protokol ön segmentin nasıl aseptik olarak parçalanıp trabeküler mesh çalışmasının nasıl korunduğunu ve ardından özel yapım organ kültürü yemeklerinde ön segment dokusunun nasıl kurulduğunu detaylandırıyor. Daha sonra, açık küre yaralanmalarının nasıl oluşturulacağını ve yaralanmadan hemen sonra terapötik nasıl uygulanacağını detaylandırıyor. Son olarak, protokol, gözün fonksiyonel, mekanik ve biyolojik özelliklerini ve yaralanmanın ne kadar iyi stabilize edildiğini değerlendiren bu yöntemle kullanımı mümkün olan karakterizasyon parametrelerine genel bir bakış sağlar. Genel olarak, bu model açık küre yaralanmalarını stabilize etmek ve tedavi etmek için ürün geliştirmeyi hızlandırmak ve yaralanmadan sonra zayıf görme prognozunu iyileştirmek için çok ihtiyaç duyulan bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolü gerçekleştirmeden önce, hayvanların araştırma ve eğitimde kullanımı için yasal ve etik gerekliliklerin mevcut olduğunu unutmayın. Canlı hayvanlar oküler doku kaynağı için kullanılıyorsa, başlamadan önce yerel etik veya yasal otorite (IACUC veya Etik kurulu vb.) tarafından onay alın. Hayvanların kullanımı için onay alma konusunda herhangi bir soru varsa, devam etmeyin. Daha önce in vivo fizyolojiye en yakın 24 saat içinde elde edilen ve kullanılan taze gözenekli gözlerin in vivo fizyolojiye en yakın olduğunu ve bu çalışmalar için iyi uzak olduğunu belirledik ve bildirdik (Hayvan Teknolojileri, Tyler, TX, ABD)10,13. Bu protokol boyunca 24 saat içinde doku elde etmek için bir doku satıcısı kullanılarak canlı hayvan kullanılmamıştır.
NOT: Doku gelmeden önce organ kültürü yemeklerini (Tamamlayıcı Protokol 1), sıkma halkalarını (Tamamlayıcı Protokol 1),çanak standlarını (Tamamlayıcı Protokol 1), basınç dönüştürücü veri toplama kurulumunu (Tamamlayıcı Protokol 2) ve pnömatik delinme platformunu (Tamamlayıcı Protokol 3) imal edin. Bulaşıkları, aletleri ve malzemeleri sterilize edin ve çalışma alanlarını hazırlayın. Genellikle bağcı, ekstra yörünge dokusu ile birlikte geldikleri için gözlerde brüt diseksiyon yapmak için steril olmayan bir alana sahip olmak yararlıdır. Bu ilk adımları açık, temiz bir çalışma yüzeyinde uygulayın ve ardından gözleri mikro diseksiyon için bir BSC II kabinine aseptik olarak aktarın (dolap #1). En uygun şekilde, mikro diseksiyon için kullanılan BSC II kabini, hava akışını en aza indirmek ve çalışma alanını en üst düzeye çıkarmak için çanak montaj BSC II kabininden (kabin #2) ayrılır. Mikro diseksiyon kabinini bir diseksiyon mikroskobu ve çalışma yüzeyini görselleştirmenin bir yolu (kabinden çıkıntılı kamera veya göz merceği) ile ayarlayın.
1. Sterilizasyon adımları, sarf malzemeleri (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu'nu görün) ve kurulum
- Aşağıdaki öğeleri hazırlayın ve gaz sterilize edin (her göz için 1 kit): ASOC çanağı, sıkma halkası, O halkalı iki akışkan konektör, iki adet 18 G iğne göbeği, dört vida, iki uzunlukta PE-100 boru (mesafe uzunluğu, inkübatörün içindeki çanaktan şırınga pompasına ve basınç dönüştürücü veri toplama kurulumuna kadar uzanacak kadar uzun olmalıdır), iki adet 18 G 90° bükülmüş iğne göbeği, iki adet 3'lü vana.
- Aşağıdaki kitleri hazırlayın ve otoklav yapın.
- Bir çift ince forseps, bir çift Vannas makası, bir çift orta dişli forseps, bir çift büyük makas, pamuklu çubuk ve bir jilet veya neşter içeren mikro diseksiyon aleti kitini hazırlayın ve otoklavlayın.
- Bir çift orta dişli forseps, bir çift cerrahi makas ve bir L-anahtar içeren montaj aleti kitini hazırlayın ve otoklavlayın.
- Gerektiğinde her gün bulaşıklara sıkma halkalarını sıkmak için bir L tuşu içeren günlük kiti (miktar: kültür günde bir adet) hazırlayın ve otoklavleyin.
- Gözleri ve ön segmentleri dezenfekte etmek ve depolamak için dört 100 mL beheri otoklavlav edin.
- Delinme nesnelerini otomatik olarak örtün.
- Aşağıdaki steril eşyaları toplayın: Petri kabı (1 tabak/göz), gazlı bez (1-2/göz), çanak standı, 20 mL şırıng (1/göz), 10 mL şırıng (1/göz), naylon şırıng filtreleri (1/göz).
- Steril ortam hazırlayın: %4 FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamisin, 1x Antibiyotik-Antimikotik (AA; yaklaşık 30-40 mL komple ortam/göz) ile DMEM.
- AA-PBS: 1x AA (~500 mL) ile PBS hazırlayın.
- Brüt diseksiyon takım paketini hazırlayın: büyük cerrahi makas ve toparlayıp temizleyin.
- Steril olmayan diseksiyon çalışma alanını kurun: Brüt diseksiyon takım paketinden, PBS'ye batırılmış enüklet gözenekli gözlerden ve buzda, cerrahi perdeden, PBS'li 100 mL beherden malzeme toplayın. Brüt diseksiyon için gerekli cerrahi örtü ve öğeleri düzenlemek.
- Steril diseksiyon çalışma alanını kurun: Mikro diseksiyon aleti kiti, steril gazlı bez, diseksiyon mikroskobu, betadin çözeltisi, steril PBS, steril ortam, dört sterilize edilmiş 100 mL beher, steril Petri kabından malzeme toplayın. BSC II kabine #1'e aseptik olarak aktarın. Diseksiyon mikroskopunda gözleri görselleştirmek için kabini kurun.
- ASOC montaj çalışma alanını kurun: Gaz sterilize edilmiş kitleri (bulaşık kiti ve kapak kiti), montaj aleti kiti, steril ortam, bulaşık standları, steril Petri tabakları, steril şırıngarlar ve şırıngar filtreleri toplayın. BSC II kabinesine aseptik olarak aktarın #2. Dolabı bulaşık montajı için ayarlayın.
- Gözler stabilize edildiğinde ve delinmeye hazır olduğunda (kurulum sonrası 72 saat), bunları bir BSC II kabinine aseptik olarak aktarın. OG yaralanma indüksiyon çalışma alanını kurun: Pnömatik güçlendirilmiş yaralanma indüksiyon cihazı (Ek 3'teayrıntılı montaj) ve Lab Jack ve ASOC çanağı tutmak için çapraz izleme mengenesi.
2. Dokunun diseksiyonu
- Steril olmayan diseksiyon çalışma alanını kullanarak porcine dokusunu hazırlayın.
- Yerel bir a sittoirden, hayvan çalışmalarından veya satıcıdan enükle edilmiş porcine gözler temin edin. Teslimat sırasında PBS'ye batırılmış buzda gözleri koruyun ve aldıktan hemen sonra kullanın.
- Ekstraorbital dokuyu kesin ve konjonktivayı sadece korneoskleral kabuk ve optik sinir bırakarak kesin. Steril olmayan koşullarda, büyük bir diseksiyon takım paketinde büyük cerrahi makas ve asalarla diseksiyonu gerçekleştirin.
- Deneysel kurulum için gerekli tüm gözler ön/brüt diseksiyon yapılana kadar gözleri buz üzerinde taze PBS'ye geri yerleştirin.
- Gözleri kapalı kaplarda 2 dakika boyunca% 10 betadin çözeltisine batırın ve BSC II kabinine aseptik olarak aktarın #1. Kurulum sırasında kontaminasyonları en aza indirmek için sonraki tüm çalışmaları steril koşullarda gerçekleştirin.
- Ön segmentleri steril olarak parçalara ayırır.
- Betadin çözeltisinde 2 dakika sonra, göz dokusunun sterilitesini korurken fazla betadin çözeltisini oküler yüzeyden çıkarmak için gözleri steril AA-PBS'nin üç seri yıkamasına aktarın. Üç yıkamadan sonra, bir sonraki kullanıma kadar dokuyu AA-PBS'de tutun.
- Jilet/neşter ve kavisli makas kullanarak gözü şaşır. Gözü AA-PBS'ye batırılmış bir gazlı bezin üzerine yerleştirin ve gözün ekvatorunun yanında steril bir jilet veya neşterle bir kesi oluşturun (ön tarafta 40 ile 60/40 bölün). Kavisli cerrahi makas kullanarak, ön gözü izole etmek için gözü yarı yarıya (kornea yarısı).
NOT: Organ kültüründe kurulumdan sonra sıvı sızıntısı yaratacak skleradaki pürüzlü, pürüzlü kenarları önlemek için ön segmentin etrafındaki kesimin sürekli olması gerekir. - Ön segmentten vitreus mizahı kepçek için kürek olarak mikroscisörler kullanın. Lensi mikrosirsörler kullanarak ön segmentten çıkarın. Ön segmentleri, daha fazla diseksiyon adımına kadar AA-PBS'de bırakın.
NOT: Diseksiyon yapılacak tüm gözler bu adımda tutulabilir ve diseksiyon işleminin geri kalanı boyunca tek tek alınabilir. - Diseksiyon mikroskobu ile, iris kökünü trabeküler meshwork (TM) görünene kadar kademeli olarak, radyal olarak kesin. TM, korneoskleral kabuğun etrafında çevreye yönlendirilmiş liflerden oluşan pigmentli bir dokudur. İris köküne doğru irise dikkatli kesikler, doku altındaki TM'nin derinliğini ortaya çıkaracaktır.
- Tüm TM bölgesini açığa çıkarmak için dokuya ilk kesimle aynı derinlikte iris etrafında 360 ° kesin. TM'yi kaplayan kalan irisleri gerektiği gibi temizleyin.
- Silier gövde kalıntılarını TM'ye arka olarak kırpın ve TM bölgesine sadece ince bir doku arka bandı bırakın (yaklaşık 1 mm).
- BSC II kabin #2'deki ASOC'de daha fazla kurulum olana kadar, parçalanmış ön segmenti (AS) ortama yerleştirin.
NOT: Tek bir kullanıcı diseksiyon ve organ kültürü çanak montajı yapıyorsa, ASOC kurulumu öncesinde tüm gözler bu noktada tutulabilir.
3. Organ kültürü yemeklerinde ön segmentlerin kurulması
- As ters (fincan yukarı) ile bir Petri kabına tek bir AS yerleştirin. Bir pamuklu çubuk kullanarak, medyada ıslak ve herhangi bir pigmenti çıkarmak için korneanın ortasına hafifçe dab. Gözü ve aynı bezi tutmak için tokmaklar kullanarak, ekstra pigmenti çıkarmak için skleranın etrafındaki pamuklu çubuğu silin.
- AS'yi ters çevirin ve korneayı çanaktaki yükseltilmiş bölgenin üzerine ortalayarak yemeğin alt kısmının üzerine yerleştirin. Sıkma halkasını yeni yerleştirilen AS'nin üzerine yerleştirin.
- Halkayı halkanın altında AS ile yerinde tutmak için ilgili deliklere dört vida yerleştirin. Vidaları L tuşu ile hafifçe sıkın.
NOT: Sıkma adımı deney boyunca her gün gerçekleşecektir, bu nedenle buradaki ilk sıkmanın amacı, sıkıştırma halkasını kırmaktan kaçınırken ortamın sızmamasını sağlamaktır. - Steril bir Petri kabı seti ile üst mekanı kabın üzerine yerleştirin ve kurulumu ters çevirin. Çanak standını takın. O halkalı akışkan konektörleri çanağın altındaki dişli bağlantı noktalarına takın.
- Bir akışkan konektöre, 18 G 90° bükülmüş bir iğne göbeği, bir boru uzunluğu, 18 G iğne göbeği, naylon şırınga filtresi, üç yönlü valf ve medya ile dolu 20 mL şırınga takın.
- İkinci akışkan konektöre, 18 G 90° derece bükülmüş bir iğne göbeği, boru uzunluğu, 18 G iğne göbeği, üç yönlü bir valf ve steril bir 10 mL şırınganın namlu kısmını takın (bu, ASOC'den sıvı ve kabarcıkları yakalamak için bir rezervuar görevi görecektir).
- Şırındlara uygun şekilde açılan üç yönlü vanalarla, AS'yi şişirmek, borudaki medyayı doldurmak ve sonunda rezervuarı doldurmak için 3,5 adımda tanımlanan akışkan konektör bağlantı noktasını kullanarak ortamı sisteme hafifçe itin.
NOT: Asoc kabına medya sızarsa, AS sıkma halkası ile yeterince sıkı bir şekilde sabitlenir. - Ortamı yavaşça yemeğe iterek ve kabarcıkları dışarı ve rezervuara itmek için tabağı ters çevirerek kabarcıkları çıkarın.
- Tabağı yerleştirin ve dik durun. Petri kabının alt kısmını standın ayaklarının altına yerleştirin, boruyu kaplamamaya dikkat edin.
4. Ön segment organ kültürünün başlatılması
- ASOC artık kuluçka için hazır. ASOC çanasını hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin (37 °C, %5 CO2). AKÜ'nün yüksekliğini, basınç dönüştürücülerinin üzerindeki inkübatörde, Gİb'i doğru hesaplamak için bilindiğinden ve hesaba katıldığından emin olun (Tamamlayıcı Protokol 4).
- Boru hatlarını 37 °C, %5 CO2 inkübatör kapısının altından dışarı doğru yönlendirin, böylece kapının açılıp kapanmasına engel olmazlar. 20 mL şırınnayı 2,5 μL/dk'da ayarlanan şırınna pompasına takın.
- Boru hattını basınç dönüştürücü cihazına rezervuarla yerleştirin. Boru hatlarına giren hava kabarcıklarını önlemek için PBS'yi çizgiden geçirirken yan 3 yönlü vanayı basınç dönüştürücü kurulumuna bağlayın.
NOT: Organ kültürü süresince mikrobiyal büyüme ile rezervuar kirlenmesi olasılığını azaltmak için sistem kurulduktan sonra PBS'yi rezervuarlardan boşaltın. - Önce veri dosyalarını kaydetmek için bir microSD kartın bulunduğuna emin olarak Gİb veri toplamayı başlatın. Ardından, veri toplamaya başlamak için basınç dönüştürücü kurulumunu açın.
NOT: Basınç dönüştürücü veri toplama cihazının kurulmasına ilişkin ayrıntılar Ek Protokol 2 'de verilmiştir.
5. ASOC'nin günlük bakımı
- ASOC'nin dengeyi sağlamak için 24 saat geçirdikten sonra, bulaşıkları 37 °C, % 5 CO2 inkübatöründen çıkarın ve BSC II kabinine yerleştirin.
NOT: Basınç verisi alımında, ASOC'ler inkübatörden çıkarıldığından (yükseklik değişimi) ve kabinde ayarlandığından bu zaman aralıkları ani artışlar gibi görünür. - Petri plakasındaki her kabın altında sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Varsa, kabın altında sıkı akışkan bağlantılar olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse yeniden sıkın. Sıkma halkasındaki vidaları sıkmak için steril bir L tuşu kullanarak bulaşık üst kısmındaki sızıntıları kontrol edin.
NOT: AS sklera dokusu kalınlığı 24 saat sıkıştırır ve azaltır ve sıkma halkasının sıkılması gerekir. - Medyayı tabak kuyusundan epire edin.
NOT: Trabeküler meshwork, ASOC'ye pompalanan ortamdan sıvıyı filtreliyor. Bu nedenle, kenarlar boyunca ASOC çanasında medya mevcut olacaktır. - Sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için 3.7 ve 3.8 adımlarını yineleyin.
- Şırınna pompalarındaki şırınnaları yeniden doldurun, şırınna pompalarının çalıştığından emin olun ve perfüzyon için vanaların ASOC'ye hizalamasını onaylayın. ASOC çanasını 37 °C, %5 CO2 inkübatörüne geri verin.
NOT: En iyi şekilde, bu adımlar günlük olarak gerçekleştirilmelidir. Bununla birlikte, 20 mL başlangıç ortamı hacmi, ASOC çanak kuyusu hacmi ve 2,5 μL / dk pompa oranı, sistemin birkaç gün boyunca bozulmadan çalışmasına izin vermek için yeterli olmalıdır.
6. Pnömatik güçlendirilmiş delinme cihazı ile OG yaralanma indüksiyonu
NOT: Pnömatik delinme cihazının yapımı Ek Protokol 3 'te ayrıntılı olarak yer unun. OG yaralanmaları, normalde kültürde 3 gün sonra ortaya çıkan Gİb stabilize edildikten sonra indüklenir. Kabul edilebilir Gİb değerleri, IOP veri dosyalarının değerlendirilmesi veya Basınç ölçüm sisteminde LED göstergelerinin ayarlanması ile belirlenebilen fizyolojik Gİb tabanlı 5-20 mmHg'dir Ek Protokol 2.
- BSC II kabinini, 1.10. Delinme platformunu basınçlı hava hattına bağlayın. Steril delinme nesnesini aynaya takın.
NOT: Cihaza güç sağlamak için bir hava kompresörü kullanılabilir, ancak basınç 50 psi'den büyükse tank basınçlı hava veya dahili laboratuvar hatları yeterli olabilir. - Çapı 4,5 mm'ye kadar olan nesneler üzerinde yeterli delinme kuvveti için delinme platformundaki basınç regülatörünü 50 psi'ye ayarlayın. Yaralanma indüksiyonu sırasında ASOC çanasını tutmak için çapraz izleme mengenesini laboratuvar jakının önüne delinme platformunun önüne yerleştirin.
- ASOC kurulumunu 37 °C'den,%5 CO 2 inkübatöründen çıkarın ve kapağı çıkarıp bir kenara yerleştirdikten sonra delinme platformuna(Şekil 2)dik çapraz izleme mengenesine yerleştirin. Ön segmenti perfüzyonda tutun, ancak dönüştürücünün aşırı basınç hasarını önlemek için 3 yönlü valf portunu basınç dönüştürücüye kapatın.
- Piston kolunu maksimum mesafesine kadar uzatın ve kornea tepesini delinme nesnesinin 1 mm'sine yerleştirin. Piston kolunu geri çek ve ön segmenti delinme nesnesine 1 cm yaklaştırın.
NOT: Bu mesafe, ASOC çanaktan çarpmadan yüksek verimli yaralanma indüksiyonu için optimize edilmiştir. - Delinme cihazını açarak ve cihazın ikinci anahtarıyla solenoid vanayı açarak ateşleyin. Cihazı geri çekmek için, ikinci düğmeye tekrar basarak delinme cihazını gözden çıkarın. Yaralanma bölgesinden sızan görsel inceleme ve ortam ile uygun yaralanma indüksiyonunu doğrulayın.
- ASOC kabını mengeneden çıkarın; kapağı tekrar bulaşık tertibatına yerleştirin ve akışkan hattı basınç dönüştürücüye açın. ASOC'yi tekrar 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
NOT: Bu noktada, OG yaralanmalarının sızdırmazlık etkinliğini değerlendirmek için AS'ye terapötik uygulanabilir.
7. ASOC'nin kültürden çıkarılması
NOT: Uç nokta analizine bağlı olarak (olası uç nokta yöntemleri için Temsili Sonuçlar'a bakın), AS'nin ASOC kabında şişirilmiş olarak kalması gerekirken, diğer yöntemler kültür odasından izole edilmiş AS dokusu gerektirir. Aşağıdaki metodoloji, AS'nin organ kültürü yemeklerinden nasıl çıkarılacağını ve kurulumun geri kalanının nasıl kaldırılacağını açıklar.
- ASOC yemeklerini 37 °C, %5 CO2 inkübatöründen çıkarın. Şırınd ve hazneye giden 3 yönlü vanayı kapatın ve boruyu sistemden çıkarın. Şırınd, rezervuar ve filtreyi atın. 3 yönlü vanaları, boruları ve iğne göbeklerini yıkamak ve sterilize etmek için ayrı bir kaba yerleştirin.
- İğne göbeklerini kabın altındaki akışkan bağlantılardan ayırın. Akışkan konektörleri ve o-halkaları okuma. Tüm eşyaları yıkamak ve sterilize etmek için bir kaba yerleştirin.
- L tuşunu kullanarak dört vidayı sıkıştırma halkasından çıkarın. Sıkma halkasını dikkatlice çıkarın.
- As'ı eşak kullanarak, AS'yi çanaktan çıkarın ve uç nokta analizine ve görüntüye bağlı olarak, sabitleyici veya uygun biyolojik tehlike atıklarına yerleştirin.
8. Gİb veri analizi
- En son deneysel çalıştırmadan veri içeren .txt dosyasını kaldırmak için microSD kartı bir bilgisayara bağlayın.
NOT: Dosya mikrodenetleyiciyi denetleyen kodda adlandırılır ve her deneme için güncelleştirilmelidir (bkz. Tamamlayıcı Protokol 2). - Verileri elektronik tabloya alın.
- Verileri 12 sütun halinde düzenleyin: 11 basınç dönüştürücü kanalının her biri için zaman (en az) ve mV sinyali. İlk on kanal on ASOC deneysel kurulumuna karşılık gelir. Son dönüştürücü sinyali, giriş sinyalindeki değişiklikler nedeniyle mV sinyalinin değişmediğini onaylamak için kontrol kanalı olarak havaya açık bir sensör içindir. MV sinyalinin boyunca tutarlı olduğunu onaylamak için zamana karşı kontrol kanallarını çizin.
- Her sensörün ilk kalibrasyonundan oluşturulan eğim kesme denklemlerini kullanarak on kanal için mV sinyallerini mmHg'ye dönüştürün (bkz. Tamamlayıcı Protokol 4).
- Gİb'in deneysel zaman kursunda nasıl dalgalandığını belirlemek için on kanalın her birine karşı zamanı çizin (veri yorumlamayı basitleştirmek için günlere dönüştürün).
- OG yaralanma indüksiyonu öncesi ve sonrası değerleri her biri ile nasıl değiştirildikleri arasında daha kolay karşılaştırmak için verilerdeki önemli noktalarda ortalama Gİb değerlerini belirleyin. ASOC'nin her gününde Gİb'i belirlemek için her 24 saat aralığı için ortalama 2-3 h veri.
NOT: Temsili Gİb sonuçları Şekil 4'te gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optik Koherens Tomografi (OCT) ile çekilen görüntüler, başarılı bir yaralanma indüksiyonun nasıl göründüğünü göstermek için OG yaralı gözleri için gösterilir. Şekil 3, yaralanmadan hemen sonra ve 72 saat sonra kontrol ve OG yaralı AS dokusu için görüntüler göstermektedir. İki görünüm gösterilir: yaralanma bölgesinden kesitsel görüntüler ve görüntünün yüzey alanını görselleştirmek için yukarıdan aşağıya maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP'ler). Kontrol gözleri korneada gözle görülür bir bozulma göstermezken, OG yaralanmasından sonra tüm korneayı geçen net yaralanmalar bulunabilir. MIP'lerden, yaralanmaların şekil ve boyutta düzensiz olduğu açıktır, ancak yaralanma boyutu 72 saatin üzerinde azalır. Daha önce, bu etkinin test edilen bir dizi yaralanma boyutu için önemli olduğu gösterilmiştir13.
Bu protokolde açıklanan OG yaralanma modeli için birincil veri çıkışı, deneysel kurulum boyunca göz içi basıncıdır. Veriler, kalibrasyon yoluyla mmHg'ye dönüştürülebilen her basınç dönüştürücüsünden bir çıkış olarak milivolt birimlerinde kaydedilir(Tamamlayıcı Protokol 4). Kabul edilebilir kabul edilen gözler ve kullanılabilir sayılmayacak diğerleri için örnek Gİb verileri ve deneysel zaman kursu sağlanır (Şekil 4A). Basınç izi verilerinden, gözler kültürde 24 saat sonra sensörlere tutturuldu, ancak Gİb kültürde ilk 72 saat boyunca dalgalanmaya devam ediyor. Organ kültüründe AS dokusu için fizyolojik Gİb yaklaşık 8-10 mmHg'dir, bu nedenle değerler stabilize edildikten sonra kullanılabilir Gİb değerleri için bir kapı olarak 2x ve 1/2x aralığına karar verilmiştir (5-20 mmHg). Yalnızca bu aralıktaki gözlerin protokolün geri kalanıyla kullanılmasına izin verilecekti. Önceki deneylerden, gerekli aralıkta stabilize gözler için ASOC kurulumunda elde edilen% 90 başarı oranına sahiptik (Şekil 4B).
OG yaralanması ve terapötik müdahaleye bağlı Gİb'in nasıl değiştiğine dair sonuçlar da verilmiştir (Şekil 4C,D). OG yaralanma indüksiyonundan sonra, doku ASOC'den çıkarılana kadar basınç önemli ölçüde düşmeli ve bu şekilde kalmalıdır (Şekil 4C). Yaralanma indüksiyonu sonrası bir göz basınçta azalmazsa, bu, gözün su geçirmez mührü tehlikeye girerse Gİb'in azaltılması gerektiği için başarılı bir yaralanmanın indüklenmediğini gösterir. Bununla birlikte, daha küçük yaralanma boyutları kendi kendine iyileşebilir ve bu da Gİb'in geri yüklenmesine neden olabilir. OG yaralanma indüksiyonu sonrası göze terapötik uygulanırsa, ASOC sırasında Gİb'in restorasyonu takip edilebilir. Bu kavram, 2,4 mm OG yaralanmalarına uygulanan bir Dermabond yapıştırıcısını gösteren verilerle gösterilmiştir (Şekil 4D). Terapötik ve terapötik olmayan beş ayrı ASOC deneyi için ortalama sonuçlar gösterilmiştir ve terapötik Gİb'i artırdığı açıktır. Bu yöntem, Gİb'i geri yüklemek için terapötik etkinliğine ölçülebilir ve bu basıncın OG sonrası 72 saat boyunca geri yüklenip yüklenmediğini izleyebilir.
Ayrıca, ASOC protokolü, son kullanıcının deneysel gereksinimlerini karşılamak için çok çeşitli karakterizasyon uç noktalarıyla kullanılmak üzere uyarlanabilir. Kültür sırasında, gözden ayrılan çıkış ortamı günlük hatta saatlik olarak toplanabilir ve bu da ASOC sırasında, OG yaralanma indüksiyonu sırasında veya terapötik uygulandıktan sonra meydana gelen protein seviyesi değişikliklerini izlemek için kullanılabilir. Örneğin, jelatin zymografi daha önce yara iyileşmesi ve doku tadilatı20izlemek için matris metalloproteinaz seviyelerini tespit etmek için gerçeklenmiştir. Doku canlılığını değerlendirmek için geleneksel immünofiztokimya yöntemleri ile kültürün dokusu çıkarıldıktan sonra daha fazla biyolojik uç nokta mümkündür21,22, kornea23,24'tekipatofizyolojik değişiklikleri izlemek veya herhangi bir ilgi proteini için antikor bazlı boyama25,26.
Fonksiyonel kornea ölçümleri ASOC'de tutulan gözlerden de elde edilebilir. Kornea epitel bütünlüğü, mavi ışık kaynağı kullanılarak floresan göz lekesi ve görüntü alımı ile değerlendirilebilir27,28. Kültürden çıkarıldıktan sonra, kornea dokusu basit görüntü alımı ile şeffaflık için değerlendirilebilir13. Geleneksel oküler görüntüleme, terapötik müdahale ile veya terapötik müdahale olmadan doku yapısını değerlendirmek için de yapılabilir. OCT görüntüleri, Şekil 3'tegösterildiği gibi, kornea boyunca kesitsel görüntüler oluşturabilir ve kültürde doku korurken görüntü toplanmasına izin vererek invaziv olmayan bir şekilde yakalanabilir. Yarık lambalı mikroskopi, ultrason veya in vivo konfokal mikroskopi gibi diğer görüntüleme yöntemleri de daha fazla anatomik bilgi edinmek için uyarlanabilir.
Son olarak, ÖN segmentin mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi, OG yaralanmasının veya daha sonra tedavinin alttaki doku üzerindeki etkisini anlamak için yakalanabilir. Gİb veri toplama tek başına gözün su geçirmez mührün bütünlüğünün nasıl tehlikeye atıldığını vurgularken, daha önce ek mekanik özelliklerin10 , 11. Enflasyona bağlı olarak göz içi basıncının nasıl değiştiğini açıklayan topaklanmış mekanik bir özellik olan oküler uyum (hacimdeki değişiklik/basınçtaki değişim), göze ani küçük hacimlerde sıvı enjekte etmek ve ortaya çıkan basınç artışını bir basınç dönüştürücü ile kaydetmek için bir şırınna pompası ile ölçülebilir. Daha yüksek uyum, dokunun daha az sert olduğunu ve terapötik malzeme özelliklerinin alttaki kornea dokusundan nasıl farklı olduğunu izlemek için kullanılabileceğini gösterir. Gözden veya geleneksel bir çıkış tesisinden sızıntı oranı ölçülebilir ve basınç birimi başına gözü terk eden hassas akışkan akışkan akış hızını belirlemek için hesaplanabilir20,29. Son olarak, terapötik testlerle ilgili olarak, gözün terapötik arızadan önce tutabileceği maksimum basıncı belirlemek için patlama basıncı ölçülebilir. Bu, performansı yaralanmamış gözlerle karşılaştırmak veya performanstaki değişiklikleri zaman12,13ile izlemek için kullanılabilir.
Şekil 1: ASOC kurulumunun şeması. Gözler özel yapım organ kültürü yemeklerinde tutulur ve bir sıkma halkası ile yerinde tutulur. ASOC ortamı, A Valfi üzerinden şırınna pompası aracılığıyla aşılanır ve bir basınç dönüştürücüye bağlanır ve daha sonra Valve B ile veri alımı her valfteki açık bağlantı noktaları mavi renkte vurgulanırken sarı kapalı kanalları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: OG yaralanma kurulumuna genel bakış. (A) Pnömatik güçlendirilmiş yaralanma cihazı kurulumu. Soldan sağa, basınç göstergesi ile ölçülen basıncı 50 psi olarak ayarlamak için bir regülatörden geçen basınçlı hava hattı aracılığıyla cihaza basınçlı hava sokulur. Delinme nesnesini tutan matkap aynasının doğrudan genişlemesi/geri çekilmesi için doğrusal bir aktüatöre iki solenoid valf bağlanır. Vise, gözü uygun x, y, z konumlandırmasında tutmak için delinme cihazının önüne yerleştirilmiştir. (B) Temsilci ASOC yaralanma indüksiyon cihazının önüne yerleştirilir. Cihazın ve yapımının daha fazla ayrıntısı Ek Protokol 3'te ayrıntılı olarak yer sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ASOC OG yaralanma deneylerinin Optik Tutarlılık Tomografi görüntüleri. Kontrol gözleri (yaralanmamış) ve OG yaralı gözler için görüntüler yaralanma sonrası hemen ve yaralanma sonrası 72 saat gösterilir. Görünümler korneadan(sol taraf)kesitler ve kornea yüzeyinin(sağ taraf)yukarıdan aşağıya maksimum yoğunluk projeksiyon görünümleri olarak gösterilir. Şekil, Snider ve ark.13'tenizin alınarak uyarlanmıştır.
Şekil 4: ASOC denemeleri için temsili Gİb sonuçları. (A) ASOC kurulumunun ilk 72 h'si için ham Gİb verileri. Gözler 72 saatte delinir, bu nedenle ilk 3 günlük veriler Gİb'in kabul edilebilir Gİb aralığında (5-20 mmHg) stabilize olup olmadığını belirlemek için değerlendirilir. Temsili sonuçlardan, beş gözün üçü kabul edilebilir Gİb aralığına girerken, biri Gİb'i çok yüksek ve biri Gİb çok düşük (arsadaki vurgulanan sarı bölgenin dışına düşüyor). (B) ASOC yöntemiyle tipik başarı oranını göstermek için önceki denemelerden n = 50 ASOC kurulumu için stabilize Gİb. (C) Yaralanmayan gözler için Gİb, 72 saat boyunca yaralanma indüksiyonu sonrası üç farklı OG yaralanma boyutuna kıyasla. Gİb'in kaybı belirgindir, iyileşme belirtisi yoktur. (D) Dermabond yapıştırıcı ile tedavi edilen yaralanmalara kıyasla yaralı Gİb sonuçları. Bazı gözlerin mühürlü olması ve diğerlerinin mühürlenmemesi nedeniyle hata oranı yüksek olsa da, yöntem yaralanma sonrası 72 saat boyunca Gİb'de yapılan değişiklikleri izleyebilir. Şekil, Snider ve ark.13'tenizin alınarak uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosyalar. Bu dosyaları indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ASOC OG yaralanma platformunda, metodolojiyi kullanırken başarı olasılığını artırmak için vurgulanması gereken kritik adımlar vardır. İlk olarak, ön segment diseksiyonu sırasında, trabeküler meshwork'ü korumak esastır, ancak doğru şekilde yapılması zordur. TM bozulursa, göz fizyolojik basıncı korumaz ve deneysel kullanım için uygunluk kriterlerini karşılamaz. Uygun diseksiyonlar elde edilene kadar ek aseptik teknik zorluklarının ortaya konması yerine, diseksiyon işleminin normal koşullarda uygulanması önerilir. İkincisi, ASOC yemeklerinde gözleri ayarlarken, sıvının sızmasını önleyecek kadar sıkı ancak ASOC yemeklerine zarar vermesini önleyecek kadar gevşek olmaları zorunludur. Göz sıkıca sabitlenmezse, fizyolojik olmayan yollarla gözden sıvı sızar ve bu da Gİb'in çok az veya hiç olmamasına neden olur. Bununla birlikte, gözü aşağıda tutan sıkma halkası plastiktir ve aşırı iyileştirilmişse kolayca kırılabilir. Halkanın altındaki skleral doku ilk 24 saat boyunca dokuyu sıkıştıracağı ve gevşeteceği için gözleri 2 gün boyunca kıskaçlamak önemlidir. 1. günde sıkılaşmaya karşı direnç hissedilene kadar halkaların sıktırınız ve en iyi sonuçlar için kültürde 24 saat sonra benzer seviyelere yeniden sıkılarak bunu takip etmeniz önerilir.
Üçüncü olarak, bu modeli kullanırken sıvı akışının her zaman nereye yönlendirildiğini tam olarak anlamak önemlidir. Her ASOC çanağı, şırınna pompasından veya 10 mL şırınd rezervuarından sıvı akışını yönlendirmek ve basınç dönüştürücülerine bağlanmak için birden fazla üç yönlü valflere bağlanır. Kurulum işleminin farklı örnekleri, vanaların gözdeki hava kabarcıklarını temizlemek veya basınç dönüştürücülerini aşırı basınçtan korumak için bu şekilde konumlandırılmasını gerektirir. Kritik protokol adımlarını atarak her zaman neyin açık/kapalı olduğunu anlamaya özen göstermelisiniz. Son olarak, ASOC OG yaralanma protokolü boyunca steriliteyi korumak çok adımlı, çok günlük süreç boyunca kritiktir, ancak kaybedilir. Perfüzyon ortamı bunu önlemek için yüksek düzeyde antibiyotik ve antimykotik içerir ve kontaminasyonları önlemek için kurutmalardan önce gözler betadin içine batırılır, ancak hataların büyük olasılıkla olduğu kritik adımlar hala vardır. Çanaktaki ilk kurulum sırasında, sıkma halkalarını yerinde sıkarken gözlerle temastan kaçının ve kullanılmadığında her zaman bulaşıkların kapağını tutun. Daha olası bir maruz kalma adımı, günlük ASOC bakımı sırasındadır. Gözleri inkübatörden çıkarmadan hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilecek gibi görünse bile, bu rutin adımları bir biyogüvenlik kabininde yapmak önemlidir. Protokolü dikkatle takip etmek ve iyi aseptik tekniği korumak, 6 günlük ASOC deneylerinde kontaminasyon risklerini en aza indirmelidir.
Genel olarak, ASOC OG yaralanma platformu, iki temel kriter nedeniyle açık küre yaralanmalarına bakan diğer metodolojilerden benzersizdir. Birincisi yaralanma indüksiyon yöntemidir. Kullanılan yüksek hızlı pnömatik yaralanma cihazı, yüksek kuvvet miktarına sahip yaralanmalara neden olan yaralanmalara neden oldu. Bu, özellikle keskin olmayan veya küçük çaplı nesnelerle yaralanmaların teşvikini sağlar. Bu, şekil olarak düzensiz olan yaralanmaları daha yakından taklit eder; patlayıcı cihazlardan kaynaklanan yüksek hızlı şarapnel yaralanmaları30,31. Pnömatik cihaz, temiz, hassas yaralanma geometrileri oluşturmak için lazerler, iğneler veya neşter bıçakları kullanarak önceki yöntemlere kıyasla iyileşmesi daha zor yaralanmalar oluşturmak için düzensiz şekilli şarapnel taklit nesneleri ile kolayca donatılabilir32,33,34. İkinci olarak, ASOC metodolojisi, ilk yaralanma indüksiyonu dışında yaralanma ilerlemesini ve terapötik performansı izlemeye izin verir. Daha önce geliştirilen benchtop OG yaralanma platformu10 , 11,12'de72 h'ye kadar takip edebilmek mümkün değildi ve bu protokolü geliştirmenin arkasındaki motivasyondu. Aslında, hücre canlılığı ASOC13'teen az 1 hafta kornea endotelinde yüksek kaldı. ASOC, bu uzun vadeli karakterizasyonun maliyetli in vivo deneylere geçiş yapmadan gerçekleştirilebilmesinin tek yoludur.
ASOC platformu için ana uygulamalar iki katlıdır. İlk olarak, model, özellikle zamanla nasıl değiştikleri göz önüne alındığında, açık küre yaralanmalarını daha fazla karakterize etmek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada OG yaralanmaları bu şekilde karakterize edilmiş ve yaralanma13'ütakiben 72 saat üzerinde yara iyileşmesi gözlenmiştir. Meydana gelen biyolojik değişikliklerle ilgili olarak farklı yaralanma boyutlarını, şekillerini, konumlarını 72 saat veya daha uzun süre takip etmek, OG yaralanmalarından sonra alınması gereken kritik tıbbi kararları bildirecektir. Bazı yaralanma parametreleri kornea tarafından kendi kendini iyileştirmeye izin verebilir veya müdahale ilk 24 saat içinde uygulanmazsa diğer parametreler daha şiddetli olabilir. Bu bilgiler, sınırlı tıbbi malzemeler veya tahliye kaynakları mevcut olduğunda hastaları değerlendirmek için paha biçilmez olacaktır.
İkinci olarak, ASOC OG platformu ürün geliştirmeyi geliştirmek ve test etmek için kullanılabilir. Bu uygulama için organ kültürü platformu bir dizi rolü doldurabilir. İlk ürün geliştirme sırasında, neyin en etkili olduğunu belirlemek için bir dizi ürün formülasyonu ile daha kısa zaman dilimleri test edilebilir. Organ kültürü sistemi, burada ayrıntılı olarak açıklanan sistemle mümkün olan on eşzamanlı deneyin ötesine geçmek için ek şırınga pompaları ile bu uygulama için daha da yüksek verim için yapılandırılabilir. Daha rafine ürünler için, performansı 72 saat veya potansiyel olarak daha uzun süre değerlendirmek için daha uzun zaman noktaları değerlendirilebilir. Son olarak, geçici stabilizasyon yerine OG yaralanmalarını kalıcı olarak tedavi edebilecek biyolojik olarak aktif ürünler değerlendirilirken yara iyileşmesi değerlendirmesi yapılabilir.
Ancak ASOC OG platformu ile dikkat edilmesi gereken sınırlamalar bulunmaktadır. İlk olarak, model terapötiklerin daha uzun süreli değerlendirilmesine izin verirken, gözün iris ve lens gibi korneoskleral kabuğun dışındaki tüm dokusunu eksiktir. Bu ek dokuların OG yaralanmasından etkilenmesi muhtemeldir ve yaralanma ilerlemesinde rol oynayabilir. Benzer şekilde, izole edilmiş bir ön segment, ASOC modelinden sonraki hayvan testlerine geçerken dahil edilecek immün yanıt elemanlarını eksiktir. Daha sonra, model sadece kornea OG yaralanmaları ve potansiyel olarak limbal OG yaralanmaları oluşturmak için uygundur. Skleral veya arka OG yaralanmaları bu yöntemle indüklenemez. Bununla birlikte, bu yaralanma türlerinin çoğu retinanın hasar görmesine neden olarak, herhangi bir geçici stabilizasyonu terapötik olarak görme kaybını önlemek için olası değildir35,36. Son olarak, model 72 h'ye kadar olan yaralanmalar sadece takip edildi. ASOC, 2 haftaya kadar diğer uygulamalarda kullanılmıştır, bu nedenle model muhtemelen bu uygulamalar için kullanılabilir, ancak şu anda test edilmiştir37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir. Bu makalede ifade edilen görüşler yazar(lar)ın görüşleridir ve ABD Ordusu Tıp Departmanı, Ordu Bakanlığı, Savunma Bakanlığı veya ABD Hükümeti'nin resmi politikasını veya konumunu yansıtmamaktadır.
Acknowledgments
Bu materyal, Geçici Kornea Onarım satın alma programı (Amerika Birleşik Devletleri Ordusu Tıbbi Materiel Geliştirme Ajansı) ile kurumlar arası bir anlaşma (#19-1006-IM) aracılığıyla Amerika Birleşik Devletleri Savunma Bakanlığı tarafından desteklenen çalışmalara dayanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
- Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
- Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
- Riesberg, J., Powell, D., Loos, P.
- Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
- Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
- Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
- Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
- Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
- Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
- Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
- Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
- Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
- Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
- Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
- Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
- Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
- Ren, H., Wilson, G.
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
- Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
- Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
- Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
- Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
- Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
- Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
- Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
- Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
- Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
- Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
- Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
- Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
- Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
- Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
- Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
- Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).
