Summary
Les blessures oculaires du globe ouvert peuvent ne pas être traitées pendant plusieurs jours dans des scénarios ruraux ou militaires, entraînant la cécité. Des thérapies sont nécessaires pour minimiser la perte de vision. Ici, nous détaillons un modèle de lésion du globe ouvert de culture d’organes. Avec ce modèle, les traitements potentiels pour stabiliser ces blessures peuvent être correctement évalués.
Abstract
Les blessures du globe ouvert ont de mauvais résultats visuels, entraînant souvent une perte permanente de la vision. Cela est dû en partie à un délai prolongé entre la blessure et l’intervention médicale dans les environnements ruraux et les applications de la médecine militaire où les soins ophtalmiques ne sont pas facilement disponibles. Les blessures non traitées sont sensibles à l’infection après que l’œil a perdu son joint étanche, ainsi qu’à la perte de viabilité des tissus due à l’hypotension intraoculaire. Les thérapies pour sceller temporairement les blessures du globe ouvert, si elles sont correctement développées, peuvent être en mesure de rétablir la pression intraoculaire et de prévenir l’infection jusqu’à ce que des soins ophtalmiques appropriés soient possibles. Pour faciliter le développement de produits, voici l’utilisation d’une plate-forme de lésions à globe ouvert de culture d’organes du segment antérieur pour suivre les performances thérapeutiques pendant au moins 72 heures après la blessure. Le tissu du segment antérieur porcin peut être maintenu dans des boîtes de culture d’organes conçues sur mesure et maintenu à la pression intraoculaire physiologique. Les blessures par perforation peuvent être créées avec un système pneumatique capable de générer des tailles de blessures allant jusqu’à 4,5 mm de diamètre, similaires aux tailles de blessures liées à l’armée. La perte de pression intraoculaire peut être observée pendant 72 heures après la blessure, confirmant l’induction correcte de la blessure et la perte de l’étanchéité de l’œil. La performance thérapeutique peut être suivie par application à l’œil après l’induction de la blessure, puis en suivant la pression intraoculaire pendant plusieurs jours. De plus, le modèle de lésion du segment antérieur est applicable aux méthodes largement utilisées pour le suivi fonctionnel et biologique de la physiologie du segment antérieur, telles que l’évaluation de la transparence, de la mécanique oculaire, de la santé de l’épithélium cornéen et de la viabilité des tissus. Dans l’ensemble, la méthode décrite ici est une prochaine étape nécessaire vers le développement de biomatériaux thérapeutiques pour sceller temporairement les blessures du globe ouvert lorsque les soins ophtalmiques ne sont pas facilement disponibles.
Introduction
Les blessures à globe ouvert (OG) peuvent entraîner une perte permanente de la vision lorsqu’elles ne sont pas traitées ou au moins stabilisées après une blessure1. Les retards, cependant, sont fréquents dans les régions éloignées où l’accès à l’intervention ophtalmique n’est pas facilement disponible, comme dans les zones rurales ou sur le champ de bataille dans les scénarios militaires. Lorsque le traitement n’est pas facilement disponible, la norme de soins actuelle consiste à protéger l’œil avec un bouclier rigide jusqu’à ce qu’une intervention médicale soit possible. En médecine militaire, ce délai est actuellement jusqu’à 24 h, mais il devrait augmenter jusqu’à 72 h dans les futures opérations de combat en milieu urbain où l’évacuation aérienne n’est pas possible2,3,4. Ces délais peuvent être encore plus longs dans les applications civiles rurales et éloignées où l’accès à l’intervention ophtalmique est limité5,6. Une lésion OG non traitée est très sensible à l’infection et à la perte de pression intraoculaire (PIO) en raison de la compromission de l’étanchéité de l’œil7,8. La perte de la PIO peut avoir un impact sur la viabilité des tissus, ce qui rend toute intervention médicale peu susceptible de restaurer la vision si le délai entre la blessure et le traitement est trop long9.
Pour permettre le développement de thérapies faciles à appliquer pour sceller les blessures OG jusqu’à ce qu’un spécialiste ophtalmique puisse être contacté, un modèle de blessure OG de paillasse a été précédemment développé10,11. Avec ce modèle, des blessures à grande vitesse ont été créées dans des yeux porcins entiers tandis que la PIO a été capturée par des transducteurs de pression. Des produits thérapeutiques peuvent ensuite être appliqués pour évaluer leur capacité à sceller le site de la lésion OG12. Cependant, comme ce modèle utilise des yeux porcins entiers, il ne peut évaluer que la performance thérapeutique immédiate sans aucun moyen de suivre la performance à long terme à travers la fenêtre possible de 72 heures dans laquelle le thérapeutique doit stabiliser le site de la blessure jusqu’à ce que le patient atteigne des soins spécialisés. En conséquence, un modèle de lésion OG de culture d’organes du segment antérieur (ASOC) a été développé et détaillé dans ce protocole en tant que plate-forme de suivi des performances thérapeutiques à long terme13.
L’ASOC est une technique largement utilisée pour maintenir le tissu avasculaire du segment antérieur, comme la cornée, pendant plusieurs semaines après l’énucléation14,15,16,17. Le segment antérieur est maintenu sous IOP physiologique en perfusant du liquide à des débits physiologiques et en préservant la région d’écoulement du maillage trabéculaire, le tissu responsable de la régulation de la PIO, lors de la configuration ASOC18,19. La plate-forme ASOC peut maintenir les tissus physiologiquement, induire une blessure OG à l’aide d’un dispositif pneumatique, appliquer un traitement et suivre la stabilisation des blessures pendant au moins 72 heures après la blessure13.
Ici, le protocole fournit une méthodologie étape par étape pour l’utilisation de la plate-forme ASOC. Tout d’abord, il détaille comment configurer et fabriquer la plate-forme ASOC. Ensuite, le protocole détaille comment disséquer aseptiquement le segment antérieur et maintenir le maillage trabéculaire, suivi de la mise en place du tissu du segment antérieur dans des boîtes de culture d’organes construites sur mesure. Ensuite, il détaille comment créer des blessures à globe ouvert et appliquer un traitement immédiatement après la blessure. Enfin, le protocole donne un aperçu des paramètres de caractérisation qui peuvent être utilisés avec cette méthode qui évalue les propriétés fonctionnelles, mécaniques et biologiques de l’œil et la mesure dans laquelle la blessure a été stabilisée. Dans l’ensemble, ce modèle fournit une plate-forme indispensable pour accélérer le développement de produits permettant de stabiliser et de traiter les blessures du globe ouvert et d’améliorer le pronostic de la mauvaise vision après une blessure.
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Protocol
Avant d’effectuer ce protocole, sachez qu’il existe des exigences légales et éthiques pour l’utilisation des animaux dans la recherche et la formation. Si des animaux vivants sont utilisés pour la source de tissu oculaire, demandez l’approbation de l’autorité éthique ou légale locale (IACUC ou comité d’éthique, etc.) avant de commencer. S’il est question d’obtenir l’approbation pour l’utilisation d’animaux, ne continuez pas. Nous avons précédemment déterminé et rapporté que les yeux porcins frais obtenus et utilisés dans les 24 heures post-mortem se comparaient le plus près de la physiologie in vivo et s’en sortaient bien pour ces études (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. Aucun animal vivant n’a été utilisé tout au long de ce protocole, en utilisant un vendeur de tissus pour obtenir du tissu dans les 24 heures.
NOTE: Avant l’arrivée des tissus, fabriquer les boîtes de culture d’organes (Protocole additionnel 1), les anneaux de serrage (Protocole supplémentaire 1), les supports à vaisselle ( Protocole supplémentaire1), la configuration de la collecte de données du transducteur de pression (Protocole supplémentaire 2) et la plate-forme de ponction pneumatique (Protocole supplémentaire 3). Stérilisez la vaisselle, les outils et les fournitures et préparez les zones de travail. Il est utile d’avoir une zone non stérile pour effectuer une dissection grossière sur les yeux, car ils viennent généralement avec du tissu orbital supplémentaire conjonctif attaché. Exécutez ces premières étapes sur une surface de travail ouverte et propre, puis transférez les yeux de manière aseptique dans une armoire BSC II pour la micro-dissection (armoire #1). De manière optimale, l’armoire BSC II utilisée pour la micro-dissection est séparée de l’armoire BSC II de l’ensemble de plat (armoire n ° 2) pour minimiser le flux d’air et maximiser l’espace de travail. Installez l’armoire à micro-dissection avec un microscope à dissection et un moyen de visualiser la surface de travail (caméra ou oculaires dépassant de l’armoire).
1. Étapes de stérilisation, fournitures (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) et configuration
- Préparer et stériliser au gaz les éléments suivants (1 kit pour chaque œil) : plat ASOC, bague de serrage, deux connecteurs fluidiques avec joints toriques, deux moyeux d’aiguille de 18 G, quatre vis, deux longueurs de tube PE-100 (la longueur de distance doit être suffisamment longue pour s’étendre de la parabole à l’intérieur de l’incubateur à la pompe à seringue et à la configuration de collecte de données du transducteur de pression), deux moyeux d’aiguille pliés 18 G à 90°, deux vannes à 3 voies.
- Préparez et autoclavez les kits suivants.
- Préparez et autoclavez le kit d’instruments de micro-dissection, contenant une paire de pinces fines, une paire de ciseaux Vannas, une paire de pinces à dents moyennes, une paire de gros ciseaux, des cotons-tiges et une lame de rasoir ou un scalpel.
- Préparez et autoclavez le kit d’instruments d’assemblage, contenant une paire de pinces à dents moyennes, une paire de ciseaux chirurgicaux et une clé en L.
- Préparez et autoclavez le kit quotidien (quantité: un par jour de culture), contenant une clé en L pour serrer les anneaux de serrage à la vaisselle chaque jour au besoin.
- Autoclavez quatre béchers de 100 mL pour désinfecter et stocker les yeux et les segments antérieurs.
- Autoclavez les objets de perforation.
- Rassemblez les articles stériles suivants : boîte de Petri (1 plat/œil), gaze (1-2/œil), support à vaisselle, seringues de 20 mL (1/œil), seringues de 10 mL (1/œil), filtres à seringue en nylon (1/œil).
- Préparer un milieu stérile : DMEM avec 4 % de FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicine, 1x Antibiotique-Antimycotique (AA; environ 30-40 mL de milieu/œil complet).
- Préparez AA-PBS: PBS avec 1x AA (~ 500 mL).
- Préparez le pack d’outils de dissection grossière: nettoyez et séchez les gros ciseaux chirurgicaux et les pinces.
- Installez l’espace de travail de dissection non stérile : Rassemblez les fournitures du pack d’outils de dissection brute, des yeux porcins énucléés immergés dans du PBS et sur de la glace, un drap chirurgical, un bécher de 100 mL avec PBS. Armentez le drap chirurgical et les articles nécessaires à la dissection grossière.
- Configurer l’espace de travail de dissection stérile : Rassemblez des fournitures à partir d’un kit d’instruments de micro-dissection, d’une gaze stérile, d’un microscope à dissection, d’une solution de bétadine, d’un PBS stérile, d’un milieu stérile, de quatre béchers stérilisés de 100 mL, d’une boîte de Petri stérile. Transfert aseptique à l’armoire BSC II #1. Installez l’armoire pour visualiser les yeux sur le microscope à dissection.
- Configurez l’espace de travail d’assemblage ASOC : Rassemblez des kits stérilisés au gaz (kit de vaisselle et kit de couvercle), kit d’instruments d’assemblage, supports stériles, supports à vaisselle, boîtes de Petri stériles, seringues stériles et filtres à seringues. Transfert aseptique à l’armoire BSC II #2. Configurez l’armoire pour l’assemblage du plat.
- Lorsque les yeux sont stabilisés et prêts pour la ponction (72 h après la configuration), transférez-les aseptiquement dans une armoire BSC II. Configurez l’espace de travail d’induction des blessures OG: Dispositif d’induction de blessure à propulsion pneumatique (assemblage détaillé dans le supplément 3)et prise de laboratoire et vis de suivi croisé pour tenir la parabole ASOC.
2. Dissection de tissu
- Préparez le tissu porcin à l’aide d’un espace de travail de dissection non stérile.
- Procurez-vous des yeux porcins énucléés auprès d’un abattoir local, d’études animales ou d’un vendeur. Gardez les yeux sur la glace immergée dans le PBS pendant la livraison et utilisez-les immédiatement après réception.
- Coupez le tissu extraorbitaire et coupez la conjonctive en ne laissant que la coquille cornéosclérale et le nerf optique. Effectuez la dissection dans des conditions non stériles avec de gros ciseaux chirurgicaux et des pinces dans un ensemble d’outils de dissection grossière.
- Replacez les yeux dans un PBS frais sur la glace jusqu’à ce que tous les yeux nécessaires à la configuration expérimentale aient été disséqués de qualité préliminaire ou brute.
- Immergez les yeux dans une solution de bétadine à 10% pendant 2 min dans des récipients fermés et transférez aseptiquement dans l’armoire BSC II #1. Effectuer tous les travaux ultérieurs dans des conditions stériles afin de minimiser les contaminations lors de l’installation.
- Disséquer stérilement les segments antérieurs.
- Après 2 min dans une solution de bétadine, transférer les yeux dans trois lavages en série d’AA-PBS stérile pour éliminer l’excès de solution de bétadine de la surface oculaire tout en maintenant la stérilité du tissu oculaire. Après trois lavages, maintenez le tissu dans AA-PBS jusqu’à une utilisation ultérieure.
- Hémisectez l’œil à l’aide d’une lame de rasoir / scalpel et de ciseaux incurvés. Placez l’œil sur une gaze imbibée d’AA-PBS et créez une incision avec une lame de rasoir stérile ou un scalpel près de l’équateur de l’œil (60/40 divisé avec 40 sur la face antérieure). À l’aide de ciseaux chirurgicaux incurvés, hémisectez l’œil pour isoler l’œil antérieur (moitié cornéenne).
REMARQUE: La coupe autour du segment antérieur doit être continue pour éviter les bords déchiquetés et rugueux dans la sclérotique qui créeront des fuites de liquide après la mise en place dans la culture d’organes. - Utilisez des microcisseurs comme pelle pour extraire l’humeur vitrée du segment antérieur. Retirez la lentille du segment antérieur à l’aide de microcisseurs. Laissez les segments antérieurs dans AA-PBS jusqu’à d’autres étapes de dissection.
REMARQUE: Tous les yeux qui seront disséqués peuvent être tenus à cette étape et un par un pris à travers le reste du processus de dissection. - À l’l’effet d’un microscope à dissection, coupez progressivement l’iris en racine d’iris, radialement jusqu’à ce que le maillage trabéculaire (MT) soit visible. Le TM est un tissu pigmenté qui comprend des fibres circonférentiellement orientées autour de la coquille cornéosclérale. Des coupes minutieuses dans l’iris vers la racine de l’iris exposeront la profondeur de la MT sous le tissu.
- Coupez à 360° autour de l’iris à la même profondeur que la coupe initiale dans le tissu pour exposer toute la région de la MT. Nettoyez tout iris résiduel restant recouvrant LA MT au besoin.
- Couper les restes du corps ciliaire postérieur à la MT, en ne laissant qu’une fine bande de tissu postérieur à la région de la MT (environ 1 mm).
- Placez le segment antérieur disséqué (AS) dans le support jusqu’à la configuration ultérieure dans ASOC dans l’armoire BSC II #2.
REMARQUE: Tous les yeux peuvent être maintenus à ce stade avant la configuration ASOC si un seul utilisateur effectue une dissection et un assemblage de boîte de culture d’organes.
3. Mise en place de segments antérieurs dans les plats de culture d’organes
- Placez un seul AS dans une boîte de Petri avec AS inversé (tasse vers le haut). À l’aide d’un coton-tige, mouillez dans le média et tamponnez doucement au centre de la cornée pour enlever tout pigment. À l’aide d’une pince pour maintenir l’œil et le même écouvillon, essuyez le coton-tige autour de la sclérotique pour éliminer le pigment supplémentaire.
- Inverser l’AS et placer sur le dessus de la partie inférieure du plat sur la région surélevée, en centrant la cornée sur la région surélevée dans le plat. Placez la bague de serrage sur le dessus de l’AS nouvellement placé.
- Placez quatre vis dans les trous correspondants pour maintenir l’anneau en place avec l’AS sous l’anneau. Serrez doucement les vis à la main avec la touche L.
REMARQUE: L’étape de serrage se produira quotidiennement tout au long de l’expérience, de sorte que le but du serrage initial ici est de s’assurer que le support ne fuit pas tout en évitant de casser la bague de serrage. - Avec un ensemble de boîtes de Petri stériles, placez le dessus sur le plat et inversez la configuration. Fixez le support à vaisselle. Fixez les connecteurs fluidiques avec joints toriques aux orifices filetés situés au bas de la parabole.
- À un connecteur fluidique, fixez un moyeu d’aiguille plié de 18 G à 90 °, une longueur de tuyau, un moyeu d’aiguille de 18 G, un filtre à seringue en nylon, une valve à trois voies et une seringue de 20 mL remplie de média.
- Au deuxième connecteur fluidique, fixez un moyeu d’aiguille plié de 18 G à 90 °, une longueur de tuyau, un moyeu d’aiguille de 18 G, une vanne à trois voies et la partie barillet d’une seringue stérile de 10 mL (cela agira comme un réservoir pour attraper le liquide et les bulles de l’ASOC).
- Avec des vannes à trois voies ouvertes de manière appropriée sur les seringues, poussez doucement le média à travers le système à l’aide de l’aiifice de connecteur fluidique identifié à l’étape 3.5 pour gonfler l’AS, remplir le média dans le tube et, éventuellement, le réservoir.
REMARQUE: Si un média fuit dans la boîte ASOC, l’AS n’est pas suffisamment fixé avec la bague de serrage. - Enlevez les bulles en poussant doucement le média dans le plat et en inversant le plat pour pousser les bulles et dans le réservoir.
- Placez le plat et tenez-vous debout. Placez la partie inférieure d’une boîte de Pétri sous les pieds du support, en prenant soin de ne pas piéger le tube.
4. Début de la culture d’organes du segment antérieur
- ASOC est maintenant prêt pour l’incubation. Placer la boîte ASOC dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5% de CO2). S’assurer que la hauteur de la parabole ASOC dans l’incubateur au-dessus des transducteurs de pression est connue et prise en compte pour calculer avec précision laPIO (Protocole supplémentaire 4).
- Dirigez les conduites de tuyauterie par le bas de la porte de l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 afin qu’elles n’interfèrent pas avec l’ouverture et la fermeture de la porte. Fixez la seringue de 20 mL à la pompe à seringue réglée à 2,5 μL/min.
- Positionnez la tuyauterie avec le réservoir au niveau de l’instrument du transducteur de pression. Connectez la vanne latérale à 3 voies à la configuration du transducteur de pression tout en faisant circuler le PBS à travers la conduite pour éviter que des bulles d’air ne pénètrent dans les conduites de tuyauterie.
REMARQUE: Videz le PBS des réservoirs après la mise en place du système afin de réduire la probabilité de contamination du réservoir par la croissance microbienne pendant toute la durée de la culture d’organes. - Lancez la collecte de données IOP en vous assurant d’abord qu’une carte microSD est présente pour enregistrer les fichiers de données. Ensuite, activez la configuration du transducteur de pression pour commencer la collecte de données.
NOTE: Les détails de la configuration du dispositif de collecte de données du transducteur de pression sont fournis dans le Protocole additionnel 2.
5. Entretien quotidien de l’ASOC
- Une fois que l’ASOC a eu 24 heures pour s’équilibrer, retirez les plats de l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et placez-les dans l’armoire BSC II.
REMARQUE: Lors de l’acquisition de données de pression, ces périodes ressemblent à des pics lorsque les ASCC sont retirés de l’incubateur (changement de hauteur) et ajustés dans l’armoire. - Vérifiez les fuites sous chaque plat sur la plaque de Petri. Le cas échéant, vérifiez s’il y a des connexions fluidiques serrées sous la boîte et resserrez-les à nouveau si nécessaire. Vérifiez les fuites dans le dessus de la vaisselle à l’aide d’une clé en L stérile pour serrer les vis de la bague de serrage.
REMARQUE: Le tissu de la sclérotique AS se comprimera et réduira l’épaisseur de 24 h, et l’anneau de serrage devra être serré. - Aspirez bien les médias du plat.
REMARQUE: Le maillage trabéculaire filtre le fluide du média pompé dans l’ASOC. Par conséquent, les médias seront présents dans le plat ASOC le long des bords. - Répétez les étapes 3.7 et 3.8 pour éliminer les bulles d’air piégées.
- Rechargez les seringues sur les pompes à seringues, assurez-vous que les pompes à seringues fonctionnent et confirmez l’alignement des vannes de perfusion dans l’ASOC. Remettre la boîte ASOC dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2.
REMARQUE: De manière optimale, ces étapes doivent être effectuées quotidiennement. Cependant, l’utilisation d’un volume de départ de 20 mL de média, du volume du puits de la parabole ASOC et d’un débit de pompe de 2,5 μL/min devrait suffire à laisser le système fonctionner pendant plusieurs jours sans être dérangé.
6. Induction de blessure OG avec dispositif de ponction pneumatique
NOTE: La construction du dispositif de ponction pneumatique est détaillée dans le Protocole additionnel 3. Les lésions OG sont induites après la stabilisation de la PIO, ce qui se produit normalement après 3 jours en culture. Les valeurs de PIO acceptables sont de 5 à 20 mmHg sur la base de la PIO physiologique, qui peut être déterminée en évaluant les fichiers de données de la PIO ou en réglant des indicateurs LED dans le système de mesure de la pression comme décrit dans le Protocole additionnel 2.
- Préparez l’armoire BSC II pour l’induction des blessures OG comme détaillé à l’étape 1.10. Connectez la plate-forme de ponction à une conduite d’air comprimé. Fixez l’objet de ponction stérile au mandrin.
REMARQUE: Un compresseur d’air peut être utilisé pour alimenter l’appareil, mais l’air comprimé du réservoir ou les conduites de laboratoire intégrées peuvent suffire si la pression est supérieure à 50 psi. - Réglez le régulateur de pression sur la plate-forme de ponction à 50 psi pour une force de perforation adéquate sur les objets jusqu’à 4,5 mm de diamètre. Placez l’étau de suivi croisé sur le cric de laboratoire devant la plate-forme de ponction pour maintenir la parabole ASOC pendant l’induction de la blessure.
- Retirez la configuration ASOC de l’incubateur à 37 °C,5 % de CO 2 et placez-la dans l’étau de suivi croisé perpendiculairement à la plate-forme de ponction (Figure 2) après avoir retiré le couvercle et l’avoir mis de côté. Gardez le segment antérieur perfusé mais fermez l’ailette de vanne à 3 voies au transducteur de pression pour éviter que la surpressurisation ne soit endommagée par le transducteur.
- Étendez le bras du piston à sa distance maximale et positionnez l’apex de la cornée à moins de 1 mm de l’objet de ponction. Rétractez le bras du piston et rapprochez le segment antérieur de 1 cm de l’objet de ponction.
REMARQUE: Cette distance a été optimisée pour l’induction de blessures à haute efficacité sans heurter la parabole ASOC. - Allumez le dispositif de ponction en l’allumant et en ouvrant l’électrovanne avec le deuxième interrupteur de l’appareil. Pour rétracter l’appareil, appuyez à nouveau sur le deuxième interrupteur pour retirer le dispositif de ponction de l’œil. Vérifier l’induction correcte de la blessure par inspection visuelle et fuite de média du site de la blessure.
- Retirer le plat ASOC de l’étau; replacez le couvercle sur l’ensemble de la boîte et ouvrez la ligne fluidique jusqu’au transducteur de pression. Replacez l’ASOC dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
REMARQUE: À ce stade, le traitement peut être appliqué à la SA pour évaluer son efficacité pour sceller les blessures OG.
7. Retirer l’ASOC de la culture
REMARQUE : Selon l’analyse des paramètres (voir Résultats représentatifs pour les méthodes d’évaluation possibles), la SA doit rester gonflée dans la boîte ASOC, tandis que d’autres méthodes nécessitent l’isolement du tissu AS de la chambre de culture. La méthodologie ci-dessous décrit comment retirer AS des plats de culture d’organes et retirer le reste de la configuration.
- Retirez les plats ASOC de l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Fermez la vanne à 3 voies de la seringue et du réservoir et débranchez le tuyau du système. Jetez la seringue, le réservoir et le filtre. Placez les vannes à 3 voies, les tubes et les moyeux d’aiguille dans un récipient séparé pour le lavage et la stérilisation.
- Déconnectez les moyeux d’aiguille des connexions fluidiques au fond du plat. Déchaux les connecteurs fluidiques et les joints toriques. Placez tous les articles dans un récipient pour le lavage et la stérilisation.
- Retirez les quatre vis de la bague de serrage à l’aide de la touche L. Retirez soigneusement la bague de serrage.
- À l’aide de pinces, retirez l’AS de la boîte et, selon l’analyse des paramètres et l’image, placez-les dans des déchets fixateurs ou des déchets à risque biologique appropriés.
8. Analyse des données de la PIO
- Connectez la carte microSD à un ordinateur pour supprimer le fichier .txt contenant des données de l’exécution expérimentale la plus récente.
REMARQUE : Le fichier est nommé dans le code contrôlant le microcontrôleur et doit être mis à jour pour chaque expérience (voir Protocole supplémentaire 2). - Importez les données dans une feuille de calcul.
- Organisez les données en 12 colonnes : Temps (en min) et signal mV pour chacun des 11 canaux du transducteur de pression. Les dix premiers canaux correspondent à dix configurations expérimentales ASOC. Le signal final du transducteur est destiné à un capteur ouvert à l’air en tant que canal de commande pour confirmer que le signal mV n’a pas changé en raison de modifications du signal d’entrée. Tracer le canal de contrôle par rapport au temps pour confirmer que le signal mV était cohérent tout au long.
- Convertir les signaux mV de dix canaux en mmHg à l’aide d’équations d’interception de pente générées à partir de l’étalonnage initial de chaque capteur (voir protocole supplémentaire 4).
- Tracez le temps (convertir en jours pour simplifier l’interprétation des données) par rapport à chacun des dix canaux pour déterminer comment la PIO a fluctué tout au long du cours temporel expérimental.
- Déterminez les valeurs moyennes de la PIO aux points clés des données pour comparer plus facilement les valeurs entre chacune d’elles et la façon dont elles sont modifiées avant et après l’induction d’une blessure OG. Moyenne de 2 à 3 h de données pour chaque intervalle de 24 heures afin de déterminer la PIO à chaque jour d’ASOC.
REMARQUE : Les résultats représentatifs de la PIO sont illustrés à la figure 4.
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Representative Results
Des images capturées par tomographie par cohérence optique (OCT) sont montrées pour les yeux blessés OG afin d’illustrer à quoi ressemble une induction de blessure réussie. La figure 3 montre des images pour le contrôle et le tissu AS blessé OG immédiatement après la blessure et 72 h plus tard. Deux vues sont montrées : des images en coupe transversale à travers le site de la blessure et une projection d’intensité maximale (MIP) descendante pour visualiser la surface de l’image. Les yeux témoins ne montrent aucune perturbation notable dans la cornée, tandis que des blessures claires peuvent être localisées qui traversent toute la cornée après une blessure OG. D’après les MIP, il est évident que les blessures sont de forme et de taille irrégulières, mais la taille des blessures diminue en 72 h. Auparavant, cet effet s’est avéré significatif pour un certain nombre de tailles de blessures testées13.
La principale sortie de données pour le modèle de lésion OG décrit dans ce protocole est la pression intraoculaire au cours de la configuration expérimentale. Les données sont enregistrées en unités de millivolts sous forme de sortie de chaque transducteur de pression qui peut être convertie en mmHg par étalonnage (Protocole supplémentaire 4). Des exemples de données IOP par rapport au cours temporel expérimental sont fournis pour les yeux considérés comme acceptables et d’autres qui ne seraient pas considérés comme utilisables(Figure 4A). D’après les données de trace de pression, les yeux ont été fixés aux capteurs après 24 heures en culture, mais la PIO continue de fluctuer au cours des 72 premières heures en culture. La PIO physiologique pour le tissu AS en culture d’organes est d’environ 8-10 mmHg, de sorte que la plage 2x et 1/2x a été choisie comme porte pour les valeurs de PIO utilisables après stabilisation des valeurs (5-20 mmHg). Seuls les yeux qui se trouvaient dans cette plage seraient autorisés à être utilisés avec le reste du protocole. D’après des expériences antérieures, nous avons eu un taux de réussite de 90% qui a été atteint dans la configuration ASOC pour les yeux se stabilisant dans la plage requise (Figure 4B).
Les résultats sur la façon dont la PIO change en raison d’une lésion OG et d’une intervention thérapeutique sont également fournis (Figure 4C, D). Après l’induction de la blessure OG, la pression devrait chuter considérablement et rester ainsi jusqu’à ce que le tissu soit retiré de l’ASOC(Figure 4C). Si un œil après l’induction d’une blessure ne diminue pas en pression, cela indique qu’une blessure réussie n’a pas été induite car la PIO doit être réduite si l’étanchéité de l’œil est compromise. Cependant, des blessures de plus petite taille peuvent s’auto-guérir, ce qui pourrait entraîner le rétablissement de la PIO. Si le traitement est appliqué à l’œil après l’induction de la lésion OG, la restauration de la PIO peut être suivie pendant l’ASOC. Ce concept est démontré par des données montrant un adhésif Dermabond appliqué sur des blessures OG de 2,4 mm(Figure 4D). Les résultats moyens de cinq expériences ASOC distinctes avec et sans thérapeutique sont montrés et il est évident que la PIO thérapeutique augmente. Cette méthode peut mesurer l’efficacité du traitement pour restaurer la PIO et suivre si cette pression est rétablie tout au long de la blessure clé de 72 heures après l’OG.
De plus, le protocole ASOC est adaptable pour une utilisation avec un large éventail d’extrémités de caractérisation afin de répondre aux exigences expérimentales de l’utilisateur final. Pendant la culture, les milieux sortants quittant l’œil peuvent être collectés quotidiennement ou même toutes les heures, ce qui peut être utilisé pour suivre les changements de niveau de protéines survenant pendant l’ASOC, après l’induction d’une lésion OG ou après l’application thérapeutique. Par exemple, la zymographie à la gélatine a déjà été réalisée pour détecter les niveaux de métalloprotéinase matricielle afin de suivre la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus20. D’autres paramètres biologiques sont possibles après le retrait de tissu de la culture via des méthodes d’immunohistochimie traditionnelles pour évaluer la viabilité des tissus21,22, le suivi des modifications physiopathologiques de la cornée23,24, ou la coloration à base d’anticorps pour toute protéine d’intérêt25,26.
Des mesures cornéennes fonctionnelles peuvent également être obtenues à partir d’yeux maintenus dans ASOC. L’intégrité de l’épithélium cornéen peut être évaluée via une coloration oculaire à la fluorescéine et l’acquisition d’images à l’aide d’une source de lumière bleue27,28. Après le retrait de la culture, le tissu cornéen peut être évalué pour la transparence par simple acquisition d’image13. L’imagerie oculaire traditionnelle peut également être réalisée pour évaluer la structure tissulaire avec ou sans intervention thérapeutique. Les images OCT, comme le montre la figure 3,peuvent créer des images en coupe transversale à travers la cornée et peuvent être capturées de manière non invasive, ce qui permet potentiellement la collecte d’images tout en maintenant les tissus en culture. D’autres modalités d’imagerie telles que la microscopie à lampe à fente, l’échographie ou la microscopie confocale in vivo peuvent également être adaptées pour acquérir des informations anatomiques supplémentaires.
Enfin, l’évaluation des propriétés mécaniques du segment antérieur peut être capturée pour comprendre l’effet de la lésion OG ou thérapeutique ultérieure sur le tissu sous-jacent. Bien que la collecte de données IOP à elle seule souligne comment l’intégrité du joint étanche de l’œil a été compromise, nous avons déjà montré que des mesures de test supplémentaires peuvent être mesurées pour déterminer des caractéristiques mécaniques supplémentaires10,11. La conformité oculaire, une propriété mécanique a regroupée décrivant comment la pression intraoculaire change en raison du gonflage (changement de volume / changement de pression), peut être mesurée avec une pompe à seringue pour injecter de petits volumes soudains de liquide dans l’œil et enregistrer l’augmentation de pression résultante avec un transducteur de pression. Une conformité plus élevée indique que le tissu est moins rigide et peut être utilisé pour suivre comment les propriétés du matériau thérapeutique diffèrent du tissu cornéen sous-jacent. Le débit de fuite de l’œil ou d’une installation de sortie traditionnelle peut être mesuré et calculé pour déterminer le débit fluidique précis quittant l’œil par unité de pression20,29. Enfin, en ce qui concerne les tests thérapeutiques, la pression d’éclatement peut être mesurée pour déterminer la pression maximale que l’œil peut contenir avant l’échec thérapeutique. Cela peut être utilisé pour comparer les performances aux yeux non blessés ou pour suivre les changements de performance avec le temps12,13.
Figure 1: Schéma de la configuration ASOC. Les yeux sont maintenus dans des plats de culture d’orgues sur mesure et maintenus en place avec un anneau de serrage. Le support ASOC est infusé via une pompe à seringue à travers la vanne A et connecté à un transducteur de pression, puis l’acquisition de données avec la vanne B. Les orifices ouverts dans chaque vanne sont surlignés en bleu tandis que le jaune indique les canaux fermés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Vue d’ensemble de la configuration des blessures OG. (A) Configuration du dispositif de blessure pneumatique. De gauche à droite, l’air comprimé est introduit dans l’appareil via une conduite d’air comprimé, qui passe à travers un régulateur pour régler la pression à 50 psi telle que mesurée par le manomètre. Deux électrovannes sont reliées à un actionneur linéaire pour diriger l’expansion/rétraction du mandrin de forage qui maintient l’objet de ponction. Vise est positionné devant le dispositif de ponction pour maintenir l’œil au positionnement x, y, z approprié. (B) L’ASOC représentatif est placé devant le dispositif d’induction de la blessure. De plus amples détails sur le dispositif et sa construction sont détaillés dans le Protocole additionnel 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Images de tomographie par cohérence optique d’expériences de lésions ASOC OG. Des images sont montrées pour les yeux témoins (non blessés) et les yeux blessés OG immédiatement après la blessure et 72 heures après la blessure. Les vues sont présentées sous forme de coupes transversales à travers la cornée(côté gauche)et de projection d’intensité maximale descendante de la surface cornéenne(côté droit). La figure a été adaptée avec la permission de Snider et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Résultats représentatifs de la PIO pour les expériences ASOC. (A) Données brutes de la PIO pour les 72 premières heures de configuration de l’ASOC. Les yeux sont perforés à 72 h, de sorte que les 3 premiers jours de données sont évalués pour déterminer si la PIO se stabilise dans la plage de PIO acceptable (5-20 mmHg). D’après les résultats représentatifs, trois des cinq yeux se situent dans la plage de PIO acceptable, tandis que l’un a une PIO trop élevée et l’autre a une PIO trop faible (tombant en dehors de la région jaune surlignée sur la placette). (B) IOP stabilisé pour n = 50 configurations ASOC d’expériences précédentes pour démontrer le taux de réussite typique avec la méthode ASOC. (C) PIO pour les yeux non blessés par rapport à trois tailles de blessure OG différentes après l’induction de la blessure pendant 72 h. La perte de la PIO est évidente, sans aucun signe de rétablissement. (D) Résultats de la PIO blessée par rapport aux blessures traitées avec un adhésif Dermabond. Bien que le taux d’erreur soit élevé en raison du fait que certains yeux sont scellés et d’autres non, la méthode peut suivre les changements apportés à la PIO au cours de la période de 72 heures suivant la blessure. La figure a été adaptée avec la permission de Snider et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il y a des étapes critiques avec la plate-forme asoc OG sur les blessures qui devraient être mises en évidence pour améliorer les chances de succès lors de l’utilisation de la méthodologie. Tout d’abord, lors de la dissection du segment antérieur, la préservation du maillage trabéculaire est essentielle mais difficile à faire correctement. Si la MT est perturbée, l’œil ne maintiendra pas la pression physiologique et ne répondra pas aux critères d’admissibilité à une utilisation expérimentale. Il est recommandé de pratiquer d’abord le processus de dissection dans des conditions normales plutôt que d’introduire les défis techniques aseptiques supplémentaires jusqu’à ce que les dissections appropriées soient obtenues. Deuxièmement, lors de la mise en place des yeux dans les plats ASOC, il est impératif qu’ils soient suffisamment serrés pour empêcher le liquide de fuir, mais suffisamment lâches pour éviter d’endommager les plats ASOC. Si l’œil n’est pas bien fixé, le liquide s’écoulera de l’œil par des moyens non physiologiques, ce qui entraînera peu ou pas de PIO. Cependant, l’anneau de serrage qui maintient l’œil vers le bas est en plastique et peut être facilement cassé s’il est trop serré. Il est essentiel de serrer les yeux pendant 2 jours car le tissu scléral sous l’anneau comprimera et desserrera le tissu pendant les 24 premières heures. Il est recommandé de resserrer les anneaux jusqu’à ce que la résistance au resserrement se ressente le jour 1 et de le resserrer à nouveau à des niveaux similaires après 24 h en culture pour de meilleurs résultats.
Troisièmement, il est essentiel de bien comprendre où l’écoulement du fluide est dirigé à tout moment lors de l’utilisation de ce modèle. Chaque antenne ASOC est connectée à plusieurs vannes à trois voies pour diriger le flux de fluide de la pompe à seringue ou du réservoir de seringue de 10 mL et se connecter aux transducteurs de pression. Différents cas du processus d’installation nécessitent que les vannes soient positionnées de manière à évacuer les bulles d’air de l’œil ou à protéger les transducteurs de pression contre la surpression. Il faut quand même prendre soin de comprendre ce qui est ouvert/fermé en tout temps avant les étapes critiques du protocole. Enfin, le maintien de la stérilité tout au long du protocole de blessure ASOC OG est essentiel, mais facile à perdre tout au long du processus en plusieurs étapes et en plusieurs jours. Les milieux de perfusion contiennent des niveaux élevés d’antibiotiques et d’antimycotiques pour prévenir cela, et les yeux sont immergés dans la bétadine avant d’être mis en place pour prévenir les contaminations, mais il existe encore des étapes critiques où les erreurs sont les plus probables. Lors de la configuration initiale dans le plat, évitez le contact avec les yeux tout en resserrant les anneaux de serrage en place et gardez les couvercles sur la vaisselle en tout temps lorsqu’ils ne sont pas utilisés. Une étape d’exposition plus probable est pendant la maintenance quotidienne de l’ASOC. Il est important de faire ces étapes de routine dans une armoire de biosécurité, même s’il semble qu’elles puissent être accomplies rapidement sans retirer les yeux de l’incubateur. Le respect attentif du protocole et le maintien d’une bonne technique aseptique devraient minimiser les risques de contamination tout au long des expériences ASOC de 6 jours.
Dans l’ensemble, la plate-forme de blessures ASOC OG est unique par exemple par exemple par d’autres méthodologies examinant les blessures du globe ouvert en raison de deux critères clés. La première est la méthode d’induction des blessures. Le dispositif de blessure pneumatique à grande vitesse utilisé induit des blessures avec une quantité de force élevée. Cela permet d’induire des blessures avec des objets qui ne sont pas particulièrement tranchants ni de petit diamètre. Cela imite plus étroitement les blessures de forme irrégulière; des éclats d’obus à grande vitesse sont blessés par des engins explosifs30,31. Le dispositif pneumatique peut facilement être équipé d’éclats d’obus de forme irrégulière imitant des objets pour créer des blessures plus difficiles à guérir par rapport aux méthodes précédentes utilisant des lasers, des aiguilles ou des lames de scalpel pour créer des géométries de blessures propres et précises32,33,34. Deuxièmement, la méthodologie ASOC permet de suivre les progrès des blessures et les performances thérapeutiques au-delà de l’induction initiale des blessures. Être capable de suivre jusqu’à 72 h n’était pas possible dans la plate-forme de blessure OG de paillasse précédemment développée10,11,12 et était la motivation derrière le développement de ce protocole. En fait, la viabilité cellulaire est restée élevée dans l’endothélium cornéen pendant au moins 1 semaine dans ASOC13. ASOC est le seul moyen d’accomplir cette caractérisation à long terme sans passer à des expériences in vivo coûteuses.
Les principales applications de la plate-forme ASOC sont doubles. Tout d’abord, le modèle peut être utilisé pour caractériser davantage les blessures du globe ouvert, en particulier compte tenu de la façon dont elles changent avec le temps. Dans l’étude précédente, les blessures OG ont été caractérisées de cette manière et la cicatrisation des plaies a été observée sur 72 h après la blessure13. Un suivi plus approfondi des différentes tailles, formes et emplacements des blessures pendant 72 heures ou même plus en ce qui concerne les changements biologiques qui se produisent éclairera les décisions médicales critiques qui doivent être prises à la suite de blessures OG. Certains paramètres de blessure peuvent permettre l’auto-guérison par la cornée, ou d’autres paramètres peuvent être plus graves si l’intervention n’est pas appliquée dans les 24 premières heures. Cette information sera inestimable pour le triage des patients lorsque des fournitures médicales ou des ressources d’évacuation limitées sont disponibles.
Deuxièmement, la plate-forme ASOC OG peut être utilisée pour développer et tester le développement de produits. Pour cette application, la plateforme de culture d’organes peut remplir un certain nombre de rôles. Lors du développement initial du produit, des délais plus courts peuvent être testés avec une gamme de formulations de produits pour déterminer ce qui est le plus efficace. Le système de culture d’organes peut être configuré pour un débit encore plus élevé pour cette application avec des pompes à seringues supplémentaires pour aller au-delà des dix expériences simultanées possibles avec le système détaillé ici. Pour les produits plus raffinés, des points de temps plus longs peuvent être évalués pour évaluer les performances pendant 72 h ou potentiellement même plus longtemps. Enfin, l’évaluation de la cicatrisation des plaies peut être possible lors de l’évaluation de produits biologiquement actifs qui peuvent traiter de manière permanente les lésions OG plutôt que la stabilisation temporaire.
Cependant, il existe des limitations avec la plate-forme ASOC OG qui doivent être prises en considération. Tout d’abord, bien que le modèle permette une évaluation à plus long terme des traitements, il manque tous les tissus de l’œil à l’extérieur de la coquille cornéosclérale, tels que l’iris et le cristallin. Ces tissus supplémentaires sont susceptibles d’être influencés par la lésion OG et peuvent jouer un rôle dans la progression de la blessure. De même, il manque un segment antérieur isolé d’éléments de réponse immunitaire qui seraient inclus lors de la transition du modèle ASOC vers des tests ultérieurs sur les animaux. Ensuite, le modèle ne convient que pour créer des blessures OG cornéennes et potentiellement des lésions OG limbaires. Les lésions OG sclérales ou postérieures ne peuvent pas être induites avec cette méthode. Cependant, bon nombre de ces types de blessures entraînent des dommages à la rétine, ce qui rend toute stabilisation thérapeutique temporaire peu susceptible de prévenir la perte de vision35,36. Enfin, les blessures avec le modèle jusqu’à 72 h après la blessure n’ont été suivies que par le passé. ASOC a été utilisé dans d’autres applications jusqu’à 2 semaines, de sorte que le modèle peut probablement être utilisé pour ces applications, mais il n’a pas été testé pour le moment37,38,39.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent. Les opinions exprimées dans cet article sont celles du ou des auteurs et ne reflètent pas la politique ou la position officielle du département médical de l’armée américaine, du département de l’armée, du ministère de la Défense ou du gouvernement américain.
Acknowledgments
Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par le département de la Défense des États-Unis par le biais d’un accord inter-agences (# 19-1006-IM) avec le programme d’acquisition de réparation cornéenne temporaire (United States Army Medical Materiel Development Agency).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
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