Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Published: June 1, 2021 doi: 10.3791/62680
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

Abstract

פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי ליצור פרופילים של ריבוזומים, לזהות mRNA ספציפיים המתורגמים על ידי ריבוזומים, ולנתח גורמים הקשורים לפוליזום. בעוד שיצרני שיפועים אוטומטיים ומערכות פיצול הדרגתיות משמשים בדרך כלל בטכניקה זו, מערכות אלה הן בדרך כלל יקרות ויכולות להיות יקרות עבור מעבדות שיש להן משאבים מוגבלים או שאינן יכולות להצדיק את ההוצאה בשל הצורך הנדיר או המזדמן שלהן לבצע שיטה זו עבור המחקר שלהן. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילי פוליזום באמצעות ציוד סטנדרטי הזמין ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית ללא מכשירי פיצול מיוחדים. יתר על כן, ניתנת השוואה של פרופילי פוליזום שנוצרו עם ובלי מערכת פיצול הדרגתית. נדונו אסטרטגיות למיטוב וייצור פרופילי פוליזום הניתנים לשחזור. Saccharomyces cerevisiae משמש כאורגניזם מודל בפרוטוקול זה. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להשתנות בקלות ולהתאים ליצירת פרופילי ריבוזום עבור אורגניזמים וסוגי תאים רבים ושונים.

Introduction

ריבוזומים הם קומפלקסים מגה-דלטון ריבונוקלאופרוטאין המבצעים את התהליך הבסיסי של תרגום mRNA לחלבונים. ריבוזומים אחראים על ביצוע הסינתזה של כל החלבונים בתוך התא. ריבוזומים אאוקריוטים מורכבים משתי תת-יחידות המוגדרות כתת-יחידה ריבוזומלית קטנה (40S) ותת-יחידה ריבוזומלית גדולה (60S) על פי מקדמי המשקעים שלהן. הריבוזום המורכב במלואו מוגדר כמונוזום 80S. פוליזומים הם קבוצות של ריבוזומים העוסקים בתרגום מולקולת mRNA יחידה. פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז היא שיטה רבת עוצמה המשמשת ליצירת פרופילי ריבוזום, זיהוי mRNA ספציפיים הקשורים לתרגום ריבוזומים וניתוח גורמים הקשורים לפוליזום 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות להפרדת פוליסומים מריבוזומים בודדים, תת-יחידות ריבוזומליות וחלקיקי ריבונוקלאופרוטאין שליחים. הפרופילים המתקבלים מהפיצול יכולים לספק מידע רב ערך לגבי פעילות התרגום של פוליזומים14 ומצב ההרכבה של הריבוזומים15,16,17.

הרכבת ריבוזום היא תהליך מורכב מאוד המתאפשר על ידי קבוצה של חלבונים הידועים כגורמי הרכבה ריבוזום 18,19,20,21. גורמים אלה מבצעים מגוון רחב של פונקציות במהלך ביוגנזה של ריבוזום באמצעות אינטראקציות עם חלבונים רבים אחרים, כולל ATPases, אנדו ואקסו-נוקלזים, GTPases, RNA helicases וחלבונים קושרי RNA22. פיצול פוליזום היה כלי רב עוצמה המשמש לחקר תפקידם של גורמים אלה בהרכבת ריבוזום. לדוגמה, שיטה זו שימשה כדי להדגים כיצד מוטציות בפולינוקלאוטיד קינאז Grc3, גורם עיבוד קדם-rRNA, יכולות להשפיע לרעה על תהליך הרכבת הריבוזום17,23. פרופיל פוליזום גם הדגיש והראה כיצד המוטיבים המשומרים בתוך ATPase Rix7 חיוניים לייצור ריבוזום16.

ההליך לפיצול פוליזום מתחיל ביצירת תאים מסיסים מתאי עניין. הליזאט מכיל RNA, תת-יחידות ריבוזומליות ופוליזומים, כמו גם רכיבים תאיים מסיסים אחרים. שיפוע סוכרוז רציף וליניארי נוצר בתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה. החלק המסיס של ליזאט התא נטען בעדינות על החלק העליון של צינור גרדיאנט סוכרוז. לאחר מכן, צינור השיפוע הטעון נתון לצנטריפוגה, המפרידה בין הרכיבים התאיים לפי גודלם בתוך שיפוע הסוכרוז בכוח הכבידה. הרכיבים הגדולים יותר נעים רחוק יותר לתוך השיפוע מאשר הרכיבים הקטנים יותר. החלק העליון של השיפוע מכיל את הרכיבים התאיים הקטנים והאיטיים יותר, ואילו הרכיבים הסלולריים הגדולים והמהירים יותר נמצאים בתחתית. לאחר צנטריפוגה, התוכן של הצינור נאספים כשברים. שיטה זו מפרידה ביעילות בין תת-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליסומים. הצפיפות האופטית של כל שבר נקבעת לאחר מכן על ידי מדידת הבליעה הספקטרלית באורך גל של 254 ננומטר. התוויית ספיגה לעומת מספר שבר מניבה פרופיל פוליזום.

ניתן ליצור מעברי צבע ליניאריים של צפיפות סוכרוז באמצעות יצירת מעבר צבע. לאחר צנטריפוגה, שיפועים מופרדים לעתים קרובות, וסופגות נמדדות באמצעות מערכת פיצול צפיפות אוטומטית 3,7,13,24,25. בעוד שמערכות אלה פועלות היטב כדי לייצר פרופילים פוליזומיים, הן יקרות ועלולות להיות יקרות עבור מעבדות מסוימות. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש בכלים אלה. במקום זאת, פרוטוקול זה משתמש בציוד הזמין בדרך כלל ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת שיפועים של 7% - 47% סוכרוז

הערה: ניתן לשנות את הטווח הליניארי של מעבר הצבע סוכרוז כדי להשיג הפרדה טובה יותר בהתאם לסוג התא שבו נעשה שימוש. פרוטוקול זה מותאם לפרופילי פוליזום עבור S. cerevisiae.

  1. הכן פתרונות מלאי של 7% ו-47% סוכרוז במאגר הדרגתי של סוכרוז (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 ו-1 mM DTT). המסנן מעקר את תמיסות מלאי הסוכרוז באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ומאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן 14 מ"ל של 17%, 27% ו-37% פתרונות סוכרוז על-ידי חלוקה וערבוב של פתרונות מלאי של 7% ו-47% סוכרוז באופן המתואר בטבלה 1.
  3. הנח שש שפופרות צנטריפוגות פוליפרופילן (14 x 89 מ"מ) במדף מבחנות לצפייה מלאה. ודא מספיק רווח בין הצינורות כך שפעולות עם צינור אחד לא יפריעו לאחרים.
  4. הצמידו מחט ארוכה למזרק 3 מ"ל. עבור פרוטוקול זה, השתמש במחט בגודל 9 אינץ', 22 G עם קצה קהה (איור 1), אך כל מחט ארוכה מספיק כדי להגיע לתחתית צינור הצנטריפוגה תספיק.
    הערה: יש לבצע בדיקה של מילוי וחלוקה כדי לוודא שהמזרק יכול להכיל את תמיסת הסוכרוז ללא טפטוף לפני הגדרת מעברי הצבע.
  5. הוסף 2 מ"ל של 7% סוכרוז לתחתית כל צינור צנטריפוגה.
  6. הוסף 2 מ"ל של 17% סוכרוז מתחת לתמיסת 7% על ידי מיקום קצה המחט בסביבה הקרובה של תחתית הצינור וחלוקת התמיסה לאט ובזהירות.
  7. חזרו על הפעולה עם 2 מ"ל כל אחד מתמיסות הסוכרוז של 27%, 37% ו-47%. ודאו שכל שכבה ניתנת להבחנה ביניהן באמצעות קו המסמן את הפרדת הצפיפויות (איור 2).
    הערה: אם לא מתכוונים להשתמש בשיפוע תוך 48 שעות, בשלב זה, לפני התיישבותם לשיפוע רציף, הקפיא את הצינורות עם תמיסות סוכרוז שכבתיות בחנקן נוזלי ואחסן במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
  8. יש לאחסן מעברי צבע בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי לאפשר למעברי צבע לשקוע באחוז רציף והולך של סוכרוז. לוקח 8-12 שעות עד שתמיסות הסוכרוז השכבתיות מתמקמות בשיפוע סוכרוז ליניארי. מעברי צבע ליניאריים יציבים עד 48 שעות. אחסון לילה בטמפרטורה של 4°C מספק מספיק זמן להפשרה והתיישבות לתוך שיפוע ליניארי לשימוש בתמיסות סוכרוז קפואות ושכבתיות. השתמש במד צפיפות כדי להעריך את איכות מעבר הצבע.
    הערה: חיוני לאחסן את מעברי הצבע במקום יציב שבו הם לא יופרעו, מכיוון שכל תנועה או רטט ישבשו את השיפוע.

2. הכנת תמציות תאי שמרים

  1. לחסן את זן השמרים המעניין לתוך 50 מ"ל של תמצית שמרים פפטון דקסטרוז (YPD) מדיה ולגדול בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד לשלב נייח.
    הערה: הטמפרטורה עשויה להשתנות בהתאם לדרישות זן השמרים.
  2. העבר 10 מ"ל של תרבית פאזה נייחת לתוך 1 ליטר של מדיית YPD טרייה. דגירה של התאים עם רעידות נמרצות ב 30 מעלות צלזיוס (או טמפרטורה מתאימה אחרת) עד התרבית מגיעה לשלב הצמיחה האמצעי-מעריכי (OD600 = 0.4-0.6).
  3. בשלב הגדילה האמצעי-אקספוננציאלי, יש להוסיף ציקלוהקסימיד לתרבית בריכוז סופי של 0.1 מ"ג/מ"ל. דגירה על קרח במשך 5 דקות.
  4. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשלב זה, ניתן להקפיא תאים ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 °C.
  5. החזירו את התאים למאגר מיצוי פוליזום מצונן של 700 μL (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0.1 mg/mL של ציקלוהקסימיד, 0.2 מ"ג/מ"ל של הפרין). הוסף 100 יחידות של מעכב RNase והעבר אותו לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  6. הוסף ~ 400 μL של חרוזי זכוכית מקוררים מראש עם טווח גודל של 425-600 מיקרומטר לצינור הצנטריפוגה. משבשים את תאי השמרים על ידי תסיסה נמרצת במקציף חרוזים למשך 5 דקות.
  7. להבהיר את ליזאט על ידי צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. קבע את ריכוז הרנ"א בליזאט המובהר על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר או באמצעות מערכת גילוי RNA מבוססת פלואורסצנציה.
    הערה: למדידות מדויקות מאוד של ריכוז RNA, השתמש בערכות זיהוי RNA מבוססות פלואורסצנציה.
  9. ודא כי ריכוז RNA הוא 0.5-1 מיקרוגרם / μL. אם ריכוז הרנ"א נמוך מדי, הפחיתו את נפח מאגר מיצוי הפוליסום המשמש להחייאת התאים בניסויים עתידיים.
    הערה: טען את הליזאט על מעברי הצבע מיד לאחר כמות הליזיס והרנ"א. במידת הצורך, פלאש להקפיא את הליזטים בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.

3. צנטריפוגה של שיפועים

  1. טען בזהירות את הליזאט על החלק העליון של מעברי הצבע. מניחים את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי, בחלק העליון של צינור הפוליפרופילן. זווית עדינה את הצינור ופזרו באיטיות את הליזאט על החלק העליון של השיפוע על ידי טפטוף על הקיר. היזהר מאוד לא לשבש או להפריע לשיפוע בעת טעינת הליזאט.
    הערה: כמות הליזאט שנטען משתנה בהתאם לסוג התא. התוכן של RNA יהיה גם להשתנות. ייתכן שיהיה צורך לבצע מספר ניסויים כדי לקבוע את כמות הליזאט הדרושה ליצירת פרופיל פוליזום אופטימלי. עבור שמרים, 300 מיקרוגרם של RNA היא נקודת התחלה טובה לאופטימיזציה.
  2. מניחים בעדינות את הצינורות בדליים המצוננים מראש של רוטור דלי מתנדנד.
    הערה: כל צינור צנטריפוגה מפוליפרופילן צריך להיות בעל נפחים שווים של שיפוע וכמות הליזאט הטעונה. זה יכול להשתנות מצינור לצינור. ודא כי השונות אינה גורמת לשגיאה בחוסר איזון במהלך ultracentrifugation.
  3. צנטריפוגה שיפועים ב 260,110 x גרם במשך 150 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.

4. שברים ואיסוף נתונים

  1. הסר בזהירות את צינורות הצנטריפוגה מרוטור הדלי המתנדנד והנח אותם במחזיק צינורות.
  2. תייג את לוחות 96 הבארות כדי לאחסן את השברים ולצנן מראש על קרח.
    הערה: השתמש בלוח 96 בארות המתאים לספקטרופוטומטר בעל חלון אופטי עד 230 ננומטר לקביעת חומצות גרעין ב-260 ננומטר/280 ננומטר.
  3. אסוף שברים של 100 μL או 200 μL החל מראש השיפוע על ידי הכנסה קפדנית של קצה פיפט לחלק העליון של מעבר הצבע. אסוף שברים עד שכל מעבר הצבע הוא aliquoted. מספר השברים יהיה תלוי בנפח ההדרגתי הכולל.
    הערה: אסוף את השברים באופן שאינו משבש את שאר מעבר הצבע. ודא שלכל השברים יש נפח שווה. בנוסף לפיצול ידני, שיטה נוספת בעלות נמוכה לפיצול היא להשתמש במשאבה פריסטלטית קטנה.
  4. מעבירים כל חלק לצלחת 96 הבאר כדי להגיע לתחתית צינור הצנטריפוגה. שמור את השברים שנאספו על הקרח בכל עת.
  5. מדוד את הספיגה של כל שבר ב-254 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש בתמיסות 7% ו- 47% סוכרוז כריקים.
    הערה: בעת מדידת ספיגת שברים, זכור כי עבור רוב הספקטרומטרים ומדי הצבע, טווח הספיגה היעיל ביותר הוא 0.1-1. אם מדידות הספיגה נמצאות מחוץ לטווח (≥1.0), לשברים יש יותר מדי חומר. לדלל את המדגם, לזכור את הנתונים, ולאחר מכן לקחת בחשבון את גורם הדילול בעת התוויית הפרופיל.
  6. צור את פרופיל הפוליזום על-ידי התוויית מספר השבר לעומת הספיגה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלושה פרופילים פוליזום מייצגים מוצגים באיור 3. כל הפרופילים הם מאותו זן שמרים. פרופיל פוליזום טיפוסי יהיה בעל פסגות פתורות היטב עבור תת-יחידות ריבוזומליות של 40S, 60S ו-80S, כמו גם פוליזומים. הפסגה של כל תת-יחידה ריבוזומלית ופסגה פוליזומית תיראה בכל פרופיל (איור 3). פרופיל מייצג ממערכת אוטומטית של פיצול צפיפות מוצג באיור 3A. שיפועי הסוכרוז ששימשו ליצירת פרופיל זה הוכנו ביד כמתואר בפרוטוקול זה. פרופיל זה המוצג באיור 3A הופק מפרופיל ספיגה רציף כאשר שיפוע הסוכרוז נעקר מלמטה למעלה על-ידי תמיסת מרדף דרך תא זרימת גלאי ונאסף בשברים. מכיוון שמערכות אלה מודדות באופן רציף את הקליטה, הן יכולות להקליט יותר מ-1,500 נקודות נתונים. זה לא מעשי ליצור באופן ידני את אותו מספר של נקודות נתונים. נפח השבר המשמש בדרך כלל לפרופילים ידניים הוא 100-200 μL. נפח שבר בטווח זה מניב פרופיל עם מספיק פרטים עבור רוב הניתוחים ההשוואתיים. התוצאות המייצגות המתקבלות הן מ-100 μL והן מ-200 μL מוצגות באיור 3B ובאיור 3C. כל שלושת הפרופילים שהוצגו השתמשו בגרדיאנטים של סוכרוז שהוכנו כמתואר בפרוטוקול זה כדי להשוות את הנתונים שהופקו. לדוגמה של פרופיל פוליזום המשתמש ביצרן שיפועים להכנת שיפועים של סוכרוז, בניגוד להכנה הידנית המתוארת בפרוטוקול זה, בכתב יד עדכני של Chikashige et al. יש מספר דוגמאות לפרופילי שיפוע שנוצרו באמצעות יצרן שיפועים אוטומטי ומערכת פיצול13.

ריכוז סופי מ"ל של 7% מניות מ"ל של 47% מניות
7% 14 0
17% 10.5 3.5
27% 7 7
37% 3.5 10.5
47% 0 14

טבלה 1: הכנת תמיסות סוכרוז. הכן 14 מ"ל של 17%, 27% ו-37% פתרונות סוכרוז על ידי חלוקה וערבוב של פתרונות מלאי סוכרוז של 7% ו-47% בכמויות שצוינו.

Figure 1
איור 1: מחט ומזרק מורכבים. מחט 9 אינץ ', 22 G עם נקודת מחט המילטון בסגנון 3 קצה מחובר מזרק 3 מ"ל באמצעות מנגנון נעילה Luer. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: המראה הסופי של 7%-47% שכבות הדרגתיות של סוכרוז. 7%, 17%, 27%, 37% ו-47% תמיסות סוכרוז מונחות על גבי זו כמתואר בפרוטוקול. לשכבות של 17% ו-37% נוספו צבעים כחולים כדי לסייע בהבחנה בין השכבות לתצלום; אין להוסיף צביעה בעת ביצוע ניסוי בפועל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פרופילים פוליזומים. כל מעברי הצבע של סוכרוז המשמשים ליצירת פרופילים אלה הוכנו בשיטה המתוארת בפרוטוקול זה. (A) פרופיל הפוליזום שנוצר על ידי מערכת פיצול אוטומטית (Brandel Fractionator). (B) פרופיל הפוליזום שנוצר על ידי חלוקה ידנית של 200 דגימות μL המתוארות בפרוטוקול הנוכחי. (C) פרופיל הפוליזום שנוצר על ידי חלוקה ידנית של 100 דגימות μL המתוארות בפרוטוקול הנוכחי. פוליזומים, פסגות 40S, 60S ו- 80S מסומנות עבור כל פרופיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן תוארה שיטה ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש במערכות פיצול אוטומטיות יקרות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מנגישה פרופיל פוליזום למעבדות שאין להן מערכות פיצול אוטומטיות. החסרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם פיצול ידיים מייגע ורגישות מופחתת בהשוואה למערכת פיצול הצפיפות הייעודית.

פרוטוקול זה כרוך בהכנה קפדנית של מעברי צבע סוכרוז ברזולוציה מספקת להפרדת תת-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליסומים. בעת הכנת שיפועי סוכרוז, חשוב מאוד לא להכניס בועות אוויר בזמן טעינת שכבות הדרגתיות. בועות אוויר עולות למעלה מלמטה ויכולות לשבש את הלינאריות של השיפוע. בנוסף, יש לנגב את החלק החיצוני של המחט לפני כל שימוש, ותמיסת סוכרוז עודפת צריכה להיות מרושעת מהלומן כדי להבטיח את שלמותה של כל שכבת מעבר צבע. אחסון לילה של שיפועים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס חייב להיעשות בחדר קר. הרעידות הנגרמות על ידי מדחס שנדלק ומכבה במקרר יכולות לשבש את השיפוע.

חלק קריטי נוסף בבדיקה זו הוא נפח השיפוע וריכוז הרנ"א. צינורות הצנטריפוגה בגודל 14 מ"מ x 89 מ"מ יכולים להכיל נפח של 12 מ"ל, אך זהו הנפח המרבי שניתן להכיל על ידי צינורות אלה ונפח זה נחשב בדרך כלל כמילוי יתר של צינורות אלה. נפח עבודה מקסימלי טוב שאינו ממלא צינורות אלה הוא 11.5 מ"ל. שיפוע סוכרוז עצמו יש נפח של 10 מ"ל; לכן, נפח של מאגר מיצוי פוליזום המשמש להחייאת תאים לא יעלה על 1.5 מ"ל. כמות הרנ"א הדרושה ליצירת פרופיל טוב תשתנה בהתאם לסוג התא. יש לבצע מספר ריצות ראשוניות כדי לקבוע איזו כמות של RNA מייצרת פרופיל פוליזום טוב. לאחר סכום זה נקבע, זה תמיד צריך לשמש עם סוג התא הספציפי כדי לשמור על שכפול כדי להיות מסוגל לעשות ניתוח השוואתי. כמו כן, כדי להבטיח שאותה כמות של RNA נטענת בכל פעם, השיטה המשמשת לכמות RNA חייבת להיות תמיד זהה. אם ספקטרופוטומטר משמש לכמות RNA, אז זה צריך לשמש בכל עת. אם נעשה שימוש בפלואורומטר, יש להשתמש בו בכל עת. מכשירים וטכניקות כמותיות משתנים מאוד הן ברמת הדיוק והן ברמת הרגישות. שימוש במכשירים או טכניקות שונות כדי לכמת ניסוי RNA לניסוי לא יניב תוצאות הניתנות לשחזור.

שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לקבל מידע חשוב על מצב תרגום חלבונים בתא. כאמור, ניתן לקבוע את מצבן של יחידות המשנה הריבוזומליות עצמן בתוך תהליך ההרכבה. ביצוע ניסויים בהיעדר ציקלוהקסימיד, המעכב התארכה, מאפשר ניתוח קצב ריצה, המציין אם ההתארכות השתנתה או לא26. השברים הבודדים הם מקור חשוב של חומר לניסויים וניתוחים נוספים. לדוגמה, ניתן להשתמש בשברים בפרוטוקולי כתמים צפוניים או מערביים כדי לזהות רנ"א או חלבון ספציפיים הקשורים לתת-אוכלוסיות ריבוזומליות. לבסוף, ניתן לחלץ רנ"א מהשברים ולהשתמש בו כדי לזהות mRNA הקשורים לריבוזומים פעילים על ידי ניתוח מיקרו-מערך13,27 או על ידי ניתוח ריצוף עמוק על ספריית דנ"א שנוצרה מסך ה-mRNA 28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר פרסי טומבלה ולד"ר מליסה וולס על קריאתם הביקורתית של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארה"ב לבריאות תוכנית מחקר תוך-מוחית; המכון הלאומי של ארה"ב למדעי בריאות הסביבה (NIEHS; ZIA ES103247 ל- R.E.S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic Fractionator Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader BMG Labtech
Cycloheximide Sigma Aldrich C7698
Dithiothreitol Invitrogen 15508-013
Glass Beads, acid washed Sigma Aldrich G8772 425–600 μm
Heparin Sigma Aldrich H4784
Magnesium Chloride, 1 M KD Medical CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub Hamilton Company 7748-08 custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes Beckman Coulter 331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack Fisher Scientific 14-810-54A
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32855
RNAse Inhibitor Applied Biosystems N8080119
Sucrose Sigma Aldrich S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg Beckman Coulter 331336
Syringe, 3 mL Coviden 888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4 KD Medical RGF-3340
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
UV-Star Microplate, 96 wells Greiner Bio-One 655801

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
  2. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).
  3. Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
  4. Liang, S., et al. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).
  5. Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
  6. Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).
  7. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  8. Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
  9. Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).
  10. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
  11. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
  12. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
  13. Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
  14. Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
  15. Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
  16. Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
  17. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
  18. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  19. Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
  20. Bassler, J., Hurt, E. Eukaryotic ribosome assembly. Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).
  21. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
  22. Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
  23. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).
  24. Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
  25. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).
  26. Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
  27. Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
  28. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).

Tags

ביוכימיה גיליון 172
פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sobhany, M., Stanley, R. E. Polysome … More

Sobhany, M., Stanley, R. E. Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems. J. Vis. Exp. (172), e62680, doi:10.3791/62680 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter