Summary
Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.
Abstract
O fracionamento de polissomos por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos sendo traduzidos por ribossomos e analisar fatores associados a polissomos. Embora os fabricantes automatizados de gradientes e os sistemas de fracionamento de gradientes sejam comumente usados com essa técnica, esses sistemas geralmente são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para laboratórios que têm recursos limitados ou não podem justificar a despesa devido à sua necessidade infrequente ou ocasional de executar esse método para suas pesquisas. Aqui, um protocolo é apresentado para gerar perfis de polissomo de forma reprodutível usando equipamentos padrão disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular sem instrumentos de fracionamento especializados. Além disso, uma comparação de perfis de polissomas gerados com e sem um sistema de fracionamento de gradiente é fornecida. Estratégias para otimizar e produzir perfis de polissomos reprodutíveis são discutidas. Saccharomyces cerevisiae é utilizado como organismo modelo neste protocolo. No entanto, este protocolo pode ser facilmente modificado e adaptado para gerar perfis de ribossomos para muitos organismos e tipos de células diferentes.
Introduction
Os ribossomos são complexos ribonucleoproteicos mega-Dalton que realizam o processo fundamental de tradução de mRNA em proteínas. Os ribossomos são responsáveis por realizar a síntese de todas as proteínas dentro de uma célula. Os ribossomos eucarióticos compreendem duas subunidades designadas como a pequena subunidade ribossomal (40S) e a grande subunidade ribossomal (60S) de acordo com seus coeficientes de sedimentação. O ribossomo totalmente montado é designado como o monossomo dos anos 80. Os polissomos são grupos de ribossomos envolvidos na tradução de uma única molécula de mRNA. O fracionamento de polissomas por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é um método poderoso usado para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos associados à tradução de ribossomos e analisar fatores associados a polissomos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Esta técnica é frequentemente usada para separar polissomos de ribossomos únicos, subunidades ribossomais e partículas de ribonucleoproteína mensageiras. Os perfis obtidos a partir do fracionamento podem fornecer informações valiosas sobre a atividade de tradução dos polissomos14 e o status de montagem dos ribossomos15,16,17.
A montagem do ribossomo é um processo muito complexo facilitado por um grupo de proteínas conhecido como fatores de montagem do ribossomo 18,19,20,21. Esses fatores desempenham uma ampla gama de funções durante a biogênese do ribossomo por meio de interações com muitas outras proteínas, incluindo ATPases, endo e exonucleases, GTPases, helicases de RNA e proteínas de ligação ao RNA22. O fracionamento de polissomos tem sido uma ferramenta poderosa usada para investigar o papel desses fatores na montagem de ribossomos. Por exemplo, esse método tem sido utilizado para demonstrar como mutações na polinucleotídeo quinase Grc3, um fator de processamento pré-rRNA, podem afetar negativamente o processo de montagem do ribossomo17,23. O perfil de polissomas também destacou e mostrou como os motivos conservados dentro da ATPase Rix7 são essenciais para a produção de ribossomos16.
O procedimento para o fracionamento de polissomos começa com a produção de lisados celulares solúveis a partir de células de interesse. O lisado contém RNA, subunidades ribossomais e polissomos, bem como outros componentes celulares solúveis. Um gradiente de sacarose contínuo e linear é feito dentro de um tubo ultracentrífugo. A fração solúvel do lisado celular é suavemente carregada no topo do tubo de gradiente de sacarose. O tubo de gradiente carregado é então submetido à centrifugação, que separa os componentes celulares por tamanho dentro do gradiente de sacarose pela força da gravidade. Os componentes maiores viajam mais para dentro do gradiente do que os componentes menores. A parte superior do gradiente abriga os componentes celulares menores e mais lentos, enquanto os componentes celulares maiores e mais rápidos são encontrados na parte inferior. Após a centrifugação, o conteúdo do tubo é coletado como frações. Este método efetivamente separa subunidades ribossomais, monossomos e polissomos. A densidade óptica de cada fração é então determinada medindo a absorvância espectral a um comprimento de onda de 254 nm. A plotagem da absorbância vs. número de frações produz um perfil polissômico.
Gradientes lineares de densidade de sacarose podem ser gerados utilizando um fabricante de gradientes. Após a centrifugação, os gradientes são frequentemente fracionados e as absorvâncias medidas usando um sistema automatizado de fracionamento de densidade 3,7,13,24,25. Embora esses sistemas funcionem muito bem para produzir perfis de polissomos, eles são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para alguns laboratórios. Aqui é apresentado um protocolo para gerar perfis de polissomas sem o uso desses instrumentos. Em vez disso, este protocolo utiliza equipamentos normalmente disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular.
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Protocol
1. Preparação de 7% - 47% de gradientes de sacarose
NOTA: O intervalo linear do gradiente de sacarose pode ser modificado para obter uma melhor separação, dependendo do tipo de célula utilizada. Este protocolo é otimizado para perfis polissômicos para S. cerevisiae.
- Preparar soluções-estoque de 7% e 47% de sacarose em tampão gradiente de sacarose (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 e 1 mM TDT). Filtrar esterilizar as soluções-mãe de sacarose através de um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C.
- Preparar 14 mL de soluções de sacarose a 17%, 27% e 37%, dispensando e misturando as soluções-estoque de sacarose a 7% e 47% da maneira descrita na Tabela 1.
- Coloque seis tubos de centrífuga de polipropileno (14 x 89 mm) em um rack de tubo de ensaio de visão completa. Garanta espaço suficiente entre os tubos para que as ações com um tubo não perturbem os outros.
- Ligue uma agulha longa a uma seringa de 3 ml. Para este protocolo, use uma agulha de 9 pol e 22 G com uma ponta contundente (Figura 1), mas qualquer agulha longa o suficiente para atingir o fundo do tubo de centrífuga será suficiente.
NOTA: Efectuar um enchimento e dispensação de ensaio para garantir que a seringa pode conter a solução de sacarose sem qualquer gotejamento antes de configurar os gradientes. - Adicionar 2 mL de sacarose a 7% ao fundo de cada tubo de centrífuga.
- Adicionar 2 ml de sacarose a 17% por baixo da solução a 7%, posicionando a ponta da agulha nas imediações do fundo do tubo e dispensando a solução lenta e cuidadosamente.
- Repita com 2 mL cada uma das soluções de sacarose a 27%, 37% e 47%. Certifique-se de que cada camada seja distinguível uma da outra por uma linha que marque a separação das densidades (Figura 2).
NOTA: Se os gradientes não forem utilizados no prazo de 48 horas, então, neste momento, antes da sua fixação num gradiente contínuo, congelar os tubos com soluções de sacarose em camadas em azoto líquido e conservar num congelador de -80 °C para armazenamento a longo prazo. - Armazenar gradientes a 4 °C durante a noite para permitir que os gradientes se instalem em uma porcentagem contínua e crescente de sacarose. Leva 8-12 h para que as soluções de sacarose em camadas se estabeleçam em um gradiente linear de sacarose. Os gradientes lineares são estáveis por até 48 h. O armazenamento durante a noite a 4 °C proporciona tempo suficiente para o descongelamento e a deposição num gradiente linear para a utilização de soluções de sacarose congeladas e em camadas. Use um densitômetro para avaliar a qualidade do gradiente.
NOTA: É fundamental armazenar os gradientes em um local estável onde eles não serão perturbados, pois quaisquer movimentos ou vibrações interromperão o gradiente.
2. Preparação de extratos de células de levedura
- Inocular a cepa de levedura de interesse em 50 mL de extrato de levedura peptona dextrose (YPD) e crescer durante a noite a 30 °C em uma incubadora agitada para a fase estacionária.
NOTA: A temperatura pode variar dependendo dos requisitos de cepa de levedura. - Transfira 10 mL de cultura de fase estacionária para 1 L de meio YPD fresco. Incubar as células com agitação vigorosa a 30 °C (ou outra temperatura adequada) até que a cultura atinja a fase de crescimento exponencial médio (OD600 = 0,4-0,6).
- Na fase de crescimento exponencial médio, adicionar cicloheximida à cultura a uma concentração final de 0,1 mg/mL. Incubar no gelo por 5 min.
- Colher as células por centrifugação a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C.
NOTA: Neste ponto, as células podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C. - Ressuspender as células em 700 μL refrigerados de tampão de extração de polissomas (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/mL de cicloheximida, 0,2 mg/mL de heparina). Adicione 100 unidades de inibidor de RNase e transfira-o para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Adicione ~400 μL de grânulos de vidro pré-resfriados com uma faixa de tamanho de 425-600 μm ao tubo de centrífuga. Interrompa as células de levedura por agitação vigorosa em um batedor de contas por 5 min.
- Clarificar o lisado por centrifugação a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Determinar a concentração do ARN no lisado clarificado medindo a absorvância a 260 nm com um espectrofotómetro ou utilizando um sistema de detecção de ARN baseado em fluorescência.
NOTA: Para medições de concentração de RNA muito precisas, use kits de detecção de RNA baseados em fluorescência. - Certifique-se de que a concentração de RNA é de 0,5-1 μg/μL. Se a concentração de RNA for muito baixa, reduza o volume de tampão de extração de polissomas usado para ressuspender as células em experimentos futuros.
NOTA: Carregue o lisado nos gradientes imediatamente após a lise e a quantificação do RNA. Se necessário, congelar rapidamente os lisados em azoto líquido e conservar a -80 °C durante alguns dias.
3. Centrifugação de gradientes
- Carregue cuidadosamente o lisado na parte superior dos gradientes. Coloque a ponta da pipeta contra a parede interna, na parte superior do tubo de polipropileno. Incline suavemente o tubo e distribua lentamente o lisado no topo do gradiente pingando contra a parede. Tome muito cuidado para não interromper ou perturbar o gradiente ao carregar o lisado.
NOTA: A quantidade de lisado carregado irá variar de acordo com o tipo de célula. O conteúdo do RNA também varia. Pode ser necessário realizar uma série de experimentos para determinar a quantidade de lisado necessária para gerar um perfil de polissomo ideal. Para leveduras, 300 μg de RNA é um bom ponto de partida para otimização. - Coloque suavemente os tubos nos baldes pré-resfriados de um rotor de balde oscilante.
NOTA: Cada tubo de centrífuga de polipropileno deve ter volumes iguais de gradiente e a quantidade de lisado carregada. Isso pode variar de tubo para tubo. Certifique-se de que a variação não cause um erro de desequilíbrio durante a ultracentrifugação. - Centrifugar os gradientes a 260,110 x g durante 150 min a 4 °C.
4. Fração e coleta de dados
- Remova cuidadosamente os tubos de centrífuga do rotor da caçamba oscilante e coloque-os em um suporte de tubo.
- Rotule as placas de 96 poços para armazenar as frações e pré-resfrie no gelo.
NOTA: Use uma placa de 96 poços adequada para um espectrofotômetro que tenha uma janela óptica de até 230 nm para determinações de ácido nucleico a 260 nm/280 nm. - Colete frações de 100 μL ou 200 μL a partir do topo do gradiente, inserindo cuidadosamente uma ponta de pipeta na parte superior do gradiente. Colete frações até que todo o gradiente seja alíquotado. O número de frações dependerá do volume total do gradiente.
Observação : colete as frações de uma maneira que não interrompa o restante do gradiente. Certifique-se de que todas as frações tenham volume igual. Além do fracionamento manual, outro método de baixo custo para o fracionamento é usar uma pequena bomba peristáltica. - Transfira cada fração para a placa de 96 poços para alcançar o fundo do tubo de centrífuga. Mantenha as frações coletadas no gelo em todos os momentos.
- Medir a absorvância de cada fracção a 254 nm com um espectrofotómetro. Use as soluções de sacarose a 7% e 47% como espaços em branco.
NOTA: Ao medir a absorbância de frações, tenha em mente que, para a maioria dos espectrômetros e colorímetros, a faixa de absorvância mais eficaz é de 0,1-1. Se as medições de absorbância estiverem fora do intervalo (≥1,0), as frações têm muito material. Dilua a amostra, recolha novamente os dados e, em seguida, tenha em conta o factor de diluição ao plotar o perfil. - Crie o perfil de polissomo plotando o número de frações versus a absorvência.
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Representative Results
Três perfis de polissomas representativos são mostrados na Figura 3. Todos os perfis são da mesma cepa de levedura. Um perfil típico de polissomas terá picos bem resolvidos para as subunidades ribossômicas dos anos 40, 60 e 80, bem como polissomos. A crista de cada subunidade ribossomal e o pico do polissomo serão aparentes em cada perfil (Figura 3). Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado na Figura 3A. Os gradientes de sacarose utilizados para gerar esse perfil foram preparados manualmente conforme descrito neste protocolo. Este perfil mostrado na Figura 3A foi produzido a partir de um perfil de absorbância contínua à medida que o gradiente de sacarose era deslocado de baixo para cima por uma solução de perseguição através de uma célula de fluxo detectora e coletado em frações. Como esses sistemas medem continuamente a absorvência, eles podem registrar mais de 1.500 pontos de dados. É impraticável gerar manualmente o mesmo número de pontos de dados. O volume de fração geralmente utilizado para perfis manuais é de 100-200 μL. Um volume de fração dentro dessa faixa produz um perfil com detalhes suficientes para a maioria das análises comparativas. Os resultados representativos obtidos a partir dos fracionamentos de 100 μL e 200 μL são mostrados na Figura 3B e na Figura 3C. Todos os três perfis apresentados utilizaram gradientes de sacarose preparados conforme descrito neste protocolo para comparar os dados produzidos. Para um exemplo de um perfil de polissomo que utiliza um fabricante de gradientes para preparar gradientes de sacarose em oposição à preparação manual descrita neste protocolo, um manuscrito recente de Chikashige et al. tem vários exemplos de perfis de gradiente gerados usando um fabricante automatizado de gradientes e sistema de fracionamento13.
| Concentração Final | mL de 7% Stock | mL de 47% Stock |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Tabela 1: Preparação de soluções de sacarose. Preparar 14 mL de soluções de sacarose a 17%, 27% e 37%, dispensando e misturando as soluções-estoque de sacarose a 7% e 47% nos volumes indicados.
Figura 1: Agulha e seringa montadas. Uma agulha de 9 pol., 22 G com ponta de ponto de agulha Hamilton de 3 polegadas ligada a uma seringa de 3 ml através de um mecanismo de bloqueio Luer. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A aparência final de 7%-47% de camadas de gradiente de sacarose. Soluções de sacarose de 7%, 17%, 27%, 37% e 47% em camadas sobre outra, conforme descrito no protocolo. As camadas de 17% e 37% tiveram coloração azul adicionada para ajudar a distinguir as camadas de uma fotografia; nenhuma coloração deve ser adicionada ao realizar um experimento real. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Perfis de polissoma. Todos os gradientes de sacarose utilizados para gerar esses perfis foram preparados utilizando-se o método descrito neste protocolo. (A) O perfil polissômico gerado por um sistema de fracionamento automatizado (Brandel Fractionator). (B) O perfil polissômico gerado pelo fracionamento manual de amostras de 200 μL descritas no protocolo atual. (C) O perfil polissômico gerado pelo fracionamento manual de amostras de 100 μL descritas no protocolo atual. Os picos de polissomos, 40S, 60S e 80S são indicados para cada perfil. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui um método para criar perfis de polissomas sem o uso de sistemas de fracionamento automatizados caros foi descrito. A vantagem desse método é que ele torna o perfil de polissomas acessível a laboratórios que não possuem sistemas de fracionamento automatizados. As principais desvantagens deste protocolo são o tedioso fracionamento manual e a sensibilidade reduzida em comparação com o sistema de fracionamento de densidade dedicado.
Este protocolo envolve a preparação cuidadosa de gradientes de sacarose com resolução suficiente para separar subunidades ribossomais, monossomos e polissomos. Ao preparar gradientes de sacarose, é fundamental não introduzir bolhas de ar ao carregar camadas de gradiente. As bolhas de ar sobem para o topo a partir da parte inferior e podem perturbar a linearidade do gradiente. Além disso, a parte externa da agulha deve ser limpa antes de cada uso, e o excesso de solução de sacarose deve ser retirado do lúmen para garantir a integridade de cada camada de gradiente. O armazenamento noturno de gradientes a 4 °C deve ser feito em câmara fria. As vibrações causadas por um compressor ligado e desligado em um refrigerador podem interromper o gradiente.
Outra parte crítica deste ensaio é o volume do gradiente e a concentração do RNA. Os tubos de centrífuga de 14 mm x 89 mm podem conter um volume de 12 mL, mas este é o volume máximo que pode ser acomodado por esses tubos e esse volume é tipicamente considerado como enchendo demais esses tubos. Um bom volume máximo de trabalho que não encha demais esses tubos é de 11,5 mL. O gradiente de sacarose em si tem um volume de 10 mL; portanto, o volume de tampão de extração de polissomas usado para ressuspender as células não deve exceder 1,5 mL. A quantidade de RNA necessária para gerar um bom perfil varia de acordo com o tipo de célula. Uma série de execuções iniciais devem ser realizadas para determinar qual quantidade de RNA gera um bom perfil de polissomos. Uma vez determinada essa quantidade, ela deve ser sempre utilizada com aquele tipo específico de célula para manter a reprodutibilidade e poder fazer análises comparativas. Além disso, para garantir que a mesma quantidade de RNA seja carregada a cada vez, o método usado para a quantificação de RNA deve ser sempre o mesmo. Se um espectrofotômetro é usado para quantificar o RNA, então ele deve ser usado em todos os momentos. Se um fluorômetro é utilizado, então ele deve ser usado em todos os momentos. Instrumentos e técnicas de quantificação variam amplamente em precisão e sensibilidade. A utilização de diferentes instrumentos ou técnicas para quantificar o experimento de RNA para o experimento não gerará resultados reprodutíveis.
Este método pode ser adaptado para obter informações importantes sobre o status da tradução de proteínas em uma célula. Como mencionado acima, a condição das próprias subunidades ribossomais dentro do processo de montagem pode ser determinada. A realização de experimentos na ausência de cicloheximida, que inibe o alongamento, possibilita a análise da taxa de escoamento, que indica se o alongamento está alterado ou não26. As frações individuais são uma valiosa fonte de material para experimentos e análises futuras. Por exemplo, as frações podem ser usadas em protocolos de blotting do norte ou oeste para identificar um RNA ou proteína específica associada a subpopulações ribossomais. Finalmente, o RNA pode ser extraído das frações e usado para identificar mRNAs ligados a ribossomos ativos por análise de microarray13,27 ou por análise de sequenciamento profundo em uma biblioteca de DNA gerada a partir do mRNA total 28.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Percy Tumbale e à Dra. Melissa Wells por sua leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Saúde dos EUA; Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos EUA (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
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