Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man genererer en polysomprofil uden at bruge automatiserede gradientproducenter eller gradientfraktioneringssystemer.
Abstract
Polysomfraktionering ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at skabe ribosomprofiler, identificere specifikke mRNA'er, der oversættes af ribosomer, og analysere polysomassocierede faktorer. Mens automatiserede gradientproducenter og gradientfraktioneringssystemer ofte bruges med denne teknik, er disse systemer generelt dyre og kan være uoverkommelige for laboratorier, der har begrænsede ressourcer eller ikke kan retfærdiggøre udgiften på grund af deres sjældne eller lejlighedsvise behov for at udføre denne metode til deres forskning. Her præsenteres en protokol til reproducerbar generering af polysomprofiler ved hjælp af standardudstyr, der er tilgængeligt i de fleste molekylærbiologiske laboratorier uden specialiserede fraktioneringsinstrumenter. Desuden tilvejebringes en sammenligning af polysomprofiler genereret med og uden et gradientfraktioneringssystem. Strategier til optimering og produktion af reproducerbare polysomprofiler diskuteres. Saccharomyces cerevisiae anvendes som en modelorganisme i denne protokol. Denne protokol kan dog let ændres og tilpasses til at generere ribosomprofiler for mange forskellige organismer og celletyper.
Introduction
Ribosomer er mega-Dalton ribonukleoproteinkomplekser, der udfører den grundlæggende proces med at oversætte mRNA til proteiner. Ribosomer er ansvarlige for at udføre syntesen af alle proteiner i en celle. Eukaryote ribosomer omfatter to underenheder udpeget som den lille ribosomale underenhed (40S) og den store ribosomale underenhed (60S) i henhold til deres sedimentationskoefficienter. Det fuldt samlede ribosom betegnes som 80'ernes monosom. Polysomer er grupper af ribosomer, der beskæftiger sig med at oversætte et enkelt mRNA-molekyle. Polysomfraktionering ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering er en kraftfuld metode, der bruges til at skabe ribosomprofiler, identificere specifikke mRNA'er forbundet med oversættelse af ribosomer og analysere polysomassocierede faktorer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Denne teknik bruges ofte til at adskille polysomer fra enkelte ribosomer, ribosomale underenheder og messenger ribonukleoproteinpartikler. Profilerne opnået ved fraktionering kan give værdifuld information om oversættelsesaktiviteten af polysomer14 og samlingsstatus for ribosomerne15,16,17.
Ribosomsamling er en meget kompleks proces lettet af en gruppe proteiner kendt som ribosomsamlingsfaktorer 18,19,20,21. Disse faktorer udfører en bred vifte af funktioner under ribosombiogenese gennem interaktioner med mange andre proteiner, herunder ATPaser, endo- og exo-nukleaser, GTPaser, RNA-helicases og RNA-bindende proteiner22. Polysomfraktionering har været et kraftfuldt værktøj, der bruges til at undersøge disse faktorers rolle i ribosomsamling. For eksempel er denne metode blevet brugt til at demonstrere, hvordan mutationer i polynukleotidkinasen Grc3, en præ-rRNA-behandlingsfaktor, kan påvirke ribosomsamlingsprocessennegativt 17,23. Polysomprofilering har også fremhævet og vist, hvordan de bevarede motiver i ATPase Rix7 er afgørende for ribosomproduktionen16.
Proceduren for polysomfraktionering begynder med at fremstille opløselige cellelysater fra celler af interesse. Lysatet indeholder RNA, ribosomale underenheder og polysomer samt andre opløselige cellulære komponenter. En kontinuerlig, lineær saccharosegradient fremstilles i et ultracentrifugerør. Den opløselige fraktion af cellelysat lægges forsigtigt på toppen af saccharosegradientrøret. Det belastede gradientrør udsættes derefter for centrifugering, som adskiller de cellulære komponenter efter størrelse inden for saccharosegradienten ved tyngdekraften. De større komponenter bevæger sig længere ind i gradienten end de mindre komponenter. Toppen af gradienten huser de mindre, langsommere rejsende cellulære komponenter, mens de større, hurtigere rejsende cellulære komponenter findes i bunden. Efter centrifugering opsamles rørets indhold som fraktioner. Denne metode adskiller effektivt ribosomale underenheder, monosomer og polysomer. Den optiske tæthed af hver fraktion bestemmes derefter ved at måle spektralabsorbansen ved en bølgelængde på 254 nm. Plotning af absorbans vs. brøktal giver en polysomprofil.
Lineære saccharosetæthedsgradienter kan genereres ved hjælp af en gradientproducent. Efter centrifugering fraktioneres gradienter ofte, og absorbanser måles ved hjælp af et automatiseret densitetsfraktioneringssystem 3,7,13,24,25. Mens disse systemer fungerer meget godt til at producere polysomprofiler, er de dyre og kan være uoverkommelige for nogle laboratorier. Her præsenteres en protokol til generering af polysomprofiler uden brug af disse instrumenter. I stedet bruger denne protokol udstyr, der typisk er tilgængeligt i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af 7% - 47% saccharosegradienter
BEMÆRK: Det lineære område af saccharosegradienten kan ændres for at opnå bedre adskillelse afhængigt af den anvendte celletype. Denne protokol er optimeret til polysomprofiler til S. cerevisiae.
- Stamopløsninger af 7% og 47% saccharose i saccharosegradientbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT). Steriliserer saccharosestamopløsningerne filtreres gennem et filter på 0,22 μm, og de opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles 14 ml saccharoseopløsninger på 17%, 27% og 37% ved at dispensere og blande 7% og 47% saccharosestamopløsninger på den måde, der er beskrevet i tabel 1.
- Anbring seks polypropylencentrifugerør (14 x 89 mm) i et reagensglasstativ med fuld visning. Sørg for tilstrækkelig plads mellem rørene, så handlinger med et rør ikke forstyrrer de andre.
- Fastgør en lang nål til en 3 ml sprøjte. Til denne protokol skal du bruge en 9 tommer, 22 G nål med en stump spids (figur 1), men enhver nål, der er lang nok til at nå bunden af centrifugerøret, er tilstrækkelig.
BEMÆRK: Udfør en testfyldning og dispensation for at sikre, at sprøjten kan holde saccharoseopløsningen uden dryp, inden gradienterne sættes op. - Der tilsættes 2 ml af 7% saccharose til bunden af hvert centrifugerør.
- Der tilsættes 2 ml saccharose på 17 % under 7 %-opløsningen ved at placere kanylespidsen i umiddelbar nærhed af rørbunden og dispensere opløsningen langsomt og forsigtigt.
- Gentag med 2 ml hver af 27%, 37% og 47% saccharoseopløsninger. Sørg for, at hvert lag kan skelnes fra hinanden ved hjælp af en linje, der markerer adskillelsen af tætheder (figur 2).
BEMÆRK: Hvis gradienterne ikke skal bruges inden for 48 timer, skal du på dette tidspunkt, inden de aflejres i en kontinuerlig gradient, lynfryse rørene med lagdelte saccharoseopløsninger i flydende nitrogen og opbevares i en -80 ° C fryser til langtidsopbevaring. - Butiksgradienterne opbevares ved 4 °C natten over for at gøre det muligt for gradienterne at sætte sig til en kontinuerlig, stigende procentdel af saccharose. Det tager 8-12 timer for de lagdelte saccharoseopløsninger at sætte sig i en lineær saccharosegradient. Lineære gradienter er stabile i op til 48 timer. Opbevaring natten over ved 4 °C giver tilstrækkelig tid til optøning og bundfældning i en lineær gradient til anvendelse af frosne, lagdelte saccharoseopløsninger. Brug et densitometer til at vurdere gradientkvaliteten.
BEMÆRK: Det er vigtigt at opbevare gradienterne på et stabilt sted, hvor de ikke forstyrres, da eventuelle bevægelser eller vibrationer vil forstyrre gradienten.
2. Fremstilling af gærcelleekstrakter
- Poder gærstammen af interesse i 50 ml gærekstrakt pepton dextrose (YPD) medier og vokse natten over ved 30 ° C i en rystende inkubator til stationær fase.
BEMÆRK: Temperaturen kan variere afhængigt af gærbelastningskravene. - Overfør 10 ml stationær fasekultur til 1 liter friske YPD-medier. Inkubere cellerne med kraftig omrystning ved 30 °C (eller anden passende temperatur), indtil kulturen når den midterste eksponentielle vækstfase (OD600 = 0,4-0,6).
- Ved den midterste eksponentielle vækstfase tilsættes cycloheximid til kulturen i en endelig koncentration på 0,1 mg / ml. Inkuber på is i 5 min.
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 3.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan celler fryses og opbevares ved -80 °C. - Resuspenderer cellerne i kølet 700 μL polysomekstraktionsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/ml cycloheximid, 0,2 mg/ml heparin). Tilsæt 100 enheder RNase-hæmmer og overfør den til et 1,5 ml centrifugerør.
- Tilsæt ~400 μL forkølede glasperler med et størrelsesområde på 425-600 μm til centrifugerøret. Afbryd gærcellerne ved kraftig omrøring i en perlepisker i 5 min.
- Lysatet klargøres ved centrifugering ved 8.000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Koncentrationen af RNA'et i det klargjorte lysat bestemmes ved at måle absorbansen ved 260 nm med et spektrofotometer eller ved hjælp af et fluorescensbaseret RNA-detektionssystem.
BEMÆRK: For meget nøjagtige RNA-koncentrationsmålinger skal du bruge fluorescensbaserede RNA-detektionssæt. - Sørg for, at RNA-koncentrationen er 0,5-1 μg / μL. Hvis RNA-koncentrationen er for lav, reduceres mængden af polysomekstraktionsbuffer, der bruges til at resuspendere cellerne i fremtidige eksperimenter.
BEMÆRK: Læg lysatet på gradienterne umiddelbart efter lysis og RNA-kvantificering. Om nødvendigt nedfryses lysaterne i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C i et par dage.
3. Centrifugering af gradienter
- Læg forsigtigt lysatet på toppen af gradienterne. Placer pipettespidsen mod den indre væg øverst på polypropylenrøret. Veksl forsigtigt røret og dispenser langsomt lysatet på toppen af gradienten ved at drible mod væggen. Pas meget på ikke at forstyrre eller forstyrre gradienten, når du lægger lysat.
BEMÆRK: Mængden af indlæst lysat varierer pr. celletype. Indholdet af RNA'et vil også variere. Det kan være nødvendigt at udføre en række eksperimenter for at bestemme mængden af lysat, der er nødvendig for at generere en optimal polysomprofil. For gær er 300 μg RNA et godt udgangspunkt for optimering. - Placer forsigtigt rørene i de forkølede spande på en svingende spandrotor.
BEMÆRK: Hvert polypropylencentrifugerør skal have lige store mængder gradient og mængden af det lysat, der er belastet. Dette kan variere fra rør til rør. Sørg for, at variationen ikke forårsager en ubalancefejl under ultracentrifugering. - Centrifugering af hældningerne ved 260,110 x g i 150 minutter ved 4 °C.
4. Brøk- og dataindsamling
- Fjern forsigtigt centrifugerørene fra den svingende spandrotor og læg dem i en rørholder.
- Mærk pladerne med 96 brønde for at opbevare fraktionerne og forkøle på is.
BEMÆRK: Brug en 96-brøndplade, der er egnet til et spektrofotometer, der har et optisk vindue ned til 230 nm til bestemmelse af nukleinsyre ved 260 nm / 280 nm. - Der samles 100 μL eller 200 μL fraktioner startende fra toppen af gradienten ved forsigtigt at indsætte en pipetspids i toppen af gradienten. Saml fraktioner, indtil hele gradienten er aliciteret. Antallet af fraktioner afhænger af det samlede gradientvolumen.
BEMÆRK: Saml fraktionerne på en måde, der ikke forstyrrer resten af gradienten. Sørg for, at alle fraktioner har lige volumen. Ud over manuel fraktionering er en anden billig metode til fraktionering at bruge en lille peristaltisk pumpe. - Overfør hver brøkdel til 96-brøndspladen for at nå bunden af centrifugerøret. Hold altid de indsamlede fraktioner på isen.
- Absorbansen af hver fraktion måles ved 254 nm med et spektrofotometer. Brug 7% og 47% saccharoseopløsninger som emner.
BEMÆRK: Når du måler absorbansen af fraktioner, skal du huske på, at for de fleste spektrometre og kolorimetre er det mest effektive absorbansområde 0,1-1. Hvis absorbansmålingerne er uden for rækkevidde (≥1,0), har fraktionerne for meget materiale. Fortynd prøven, indsaml dataene, og redegør derefter for fortyndingsfaktoren, når profilen afbildes. - Opret polysomprofilen ved at plotte brøktallet versus absorbansen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre repræsentative polysomprofiler er vist i figur 3. Alle profiler er fra samme gærstamme. En typisk polysomprofil vil have velopløste toppe for 40S, 60S og 80S ribosomale underenheder samt polysomer. Kammen af hver ribosomal underenhed og polysomtop vil være tydelig på hver profil (figur 3). En repræsentativ profil fra et automatiseret densitetsfraktioneringssystem er vist i figur 3A. De saccharosegradienter, der blev anvendt til at generere denne profil, blev fremstillet manuelt som beskrevet i denne protokol. Denne profil vist i figur 3A blev fremstillet ud fra en kontinuerlig absorbansprofil, da saccharosegradienten blev forskudt nedefra og op af en jagtopløsning gennem en detektorstrømningscelle og opsamlet i fraktioner. Fordi disse systemer kontinuerligt måler absorbans, kan de registrere over 1.500 datapunkter. Det er upraktisk at manuelt generere det samme antal datapunkter. Brøkvolumenet, der generelt anvendes til manuelle profiler, er 100-200 μL. En brøkvolumen inden for dette interval giver en profil med detaljer nok til de fleste sammenlignende analyser. De repræsentative resultater fra både 100 μL og 200 μL fraktioneringer er vist i figur 3B og figur 3C. Alle tre profiler præsenterede anvendte saccharosegradienter udarbejdet som beskrevet i denne protokol for at sammenligne de leverede data. For et eksempel på en polysomprofil, der bruger en gradientproducent til at forberede saccharosegradienter i modsætning til den manuelle forberedelse, der er beskrevet i denne protokol, har et nyligt manuskript af Chikashige et al. flere eksempler på gradientprofiler genereret ved hjælp af en automatiseret gradientproducent og fraktioneringssystem13.
| Endelig koncentration | ml af 7% aktie | ml af 47% aktie |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Tabel 1: Fremstilling af saccharoseopløsninger. Der fremstilles 14 ml 17%, 27% og 37% saccharoseopløsninger ved at dispensere og blande 7% og 47% saccharosestamopløsninger i de angivne mængder.
Figur 1: Samlet nål og sprøjte. En 9 tommer, 22 G nål med Hamilton nålespids stil 3 spids fastgjort til en 3 ml sprøjte via en Luer låsemekanisme. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Det endelige udseende af 7% -47% saccharosegradientlag. 7%, 17%, 27%, 37% og 47% saccharoseopløsninger lagdelt oven på en anden som beskrevet i protokollen. Lagene på 17% og 37% havde blå farve tilføjet for at hjælpe med at skelne lagene til et fotografi; Der bør ikke tilføjes farvelægning, når du udfører et egentligt eksperiment. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Polysomprofiler. Alle saccharosegradienter, der blev anvendt til at generere disse profiler, blev fremstillet ved hjælp af den metode, der er beskrevet i denne protokol. (A) Polysomprofilen genereret af et automatiseret fraktioneringssystem (Brandel Fractionator). (B) Polysomprofilen genereret ved håndfraktionering af 200 μL prøver beskrevet i den nuværende protokol. (C) Den polysomprofil, der genereres ved håndfraktionering af 100 μL-prøver beskrevet i den nuværende protokol. Polysomer, 40S, 60S og 80S toppe er angivet for hver profil. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er en metode til at skabe polysomprofiler uden brug af dyre automatiserede fraktioneringssystemer blevet beskrevet. Fordelen ved denne metode er, at den gør polysomprofilering tilgængelig for laboratorier, der ikke har automatiserede fraktioneringssystemer. De største ulemper ved denne protokol er kedelig håndfraktionering og reduceret følsomhed sammenlignet med det dedikerede densitetsfraktioneringssystem.
Denne protokol indebærer omhyggelig forberedelse af saccharosegradienter med opløsning, der er tilstrækkelig til at adskille ribosomale underenheder, monosomer og polysomer. Ved fremstilling af saccharosegradienter er det afgørende ikke at indføre luftbobler under påfyldning af gradientlag. Luftbobler stiger til toppen fra bunden og kan forstyrre gradientens linearitet. Derudover skal ydersiden af nålen tørres af før hver brug, og overskydende saccharoseopløsning skal transporteres væk fra lumen for at sikre integriteten af hvert gradientlag. Opbevaring af stigninger ved 4 °C natten over skal ske i et kølerum. Vibrationer forårsaget af en kompressor, der tændes og slukkes i køleskab, kan forstyrre hældningen.
En anden kritisk del af dette assay er volumenet af gradienten og koncentrationen af RNA. Centrifugerørene på 14 mm x 89 mm kan rumme et volumen på 12 ml, men dette er det maksimale volumen, der kan rummes af disse rør, og dette volumen betragtes typisk som overfyldning af disse rør. Et godt maksimalt arbejdsvolumen, der ikke overfylder disse rør, er 11,5 ml. Selve saccharosegradienten har et volumen på 10 ml; derfor bør volumenet af polysomekstraktionsbuffer, der anvendes til at resuspendere celler, ikke overstige 1,5 ml. Mængden af RNA, der er nødvendig for at generere en god profil, varierer efter celletype. En række indledende kørsler skal udføres for at bestemme, hvilken mængde RNA der genererer en god polysomprofil. Når denne mængde er bestemt, skal den altid bruges med den specifikke celletype for at opretholde reproducerbarhed og for at kunne foretage sammenlignende analyse. For at sikre, at den samme mængde RNA indlæses hver gang, skal metoden, der anvendes til RNA-kvantificering, altid være den samme. Hvis et spektrofotometer bruges til at kvantificere RNA, skal det altid bruges. Hvis der anvendes et fluorometer, skal det altid bruges. Instrumenter og kvantificeringsteknikker varierer meget i både nøjagtighed og følsomhed. Brug af forskellige instrumenter eller teknikker til at kvantificere RNA-eksperiment til eksperiment vil ikke generere reproducerbare resultater.
Denne metode kan tilpasses for at opnå vigtige oplysninger om status for proteinoversættelse i en celle. Som nævnt ovenfor kan tilstanden af de ribosomale underenheder selv inden for samlingsprocessen bestemmes. Udførelse af eksperimenter i fravær af cycloheximid, som hæmmer forlængelse, muliggør afstrømningshastighedsanalyse, hvilket indikerer, om forlængelse ændres eller ej26. De enkelte fraktioner er en værdifuld kilde til materiale til videre eksperimenter og analyser. For eksempel kan fraktionerne bruges i nordlige eller vestlige blottingprotokoller til at identificere et specifikt RNA eller protein forbundet med ribosomale subpopulationer. Endelig kan RNA ekstraheres fra fraktionerne og bruges til at identificere mRNA'er bundet til aktive ribosomer ved mikroarrayanalyse13,27 eller ved dyb sekventeringsanalyse på et DNA-bibliotek genereret fra det samlede mRNA 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Percy Tumbale og Dr. Melissa Wells for deres kritiske læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af US National Institute of Health Intramural Research Program; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al.
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E.
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R.
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).
