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Neuroscience

संयुक्त मस्तिष्क और रीढ़ की सर्जरी का उपयोग करके डबल-वायरल वेक्टर के साथ नवजात चूहों में कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट को लक्षित करना

Published: June 30, 2021 doi: 10.3791/62698
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Shriners Hospitals Pediatric Research Center, Lewis Katz School of Medicine, Temple University

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर 5-10 दिनों की उम्र में नवजात चूहों में कोशिकाओं की उप-आबादी के लिए जीन थेरेपी लागू करने के लिए एक नई विधि प्रदर्शित करता है, जिसमें सोमाटोमोटर कॉर्टेक्स में एक एंटेरोग्रेड केमोजेनेटिक संशोधक और ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में प्रतिगामी रूप से परिवहन योग्य क्रे रिकोम्बिनेस इंजेक्ट किया जाता है।

Abstract

वयस्क एससीआई की तुलना में बाल चिकित्सा रीढ़ की हड्डी की चोटों (एससीआई) में देखे गए परिणामों में अंतर का अध्ययन करने के लिए नवजात चूहों पर अनुसंधान को बाधित करने वाली बाधाओं से सफलतापूर्वक निपटना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की लक्षित कोशिकाओं में विश्वसनीय रूप से उपचार पेश करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और अशुद्धियां अध्ययन या चिकित्सा की प्रभावकारिता से समझौता कर सकती हैं। यह प्रोटोकॉल वायरल वेक्टर तकनीक को एक नई शल्य चिकित्सा तकनीक के साथ जोड़ता है ताकि प्रसवोत्तर दिन 5 पर नवजात चूहों में जीन थेरेपी को सही ढंग से पेश किया जा सके। यहां, सीआरई के प्रतिगामी परिवहन (रेट्रोएएवी 2) के लिए इंजीनियर किए गए वायरस को रीढ़ की हड्डी में कॉर्टिकोस्पाइनल न्यूरॉन्स के अक्षतंतु टर्मिनलों पर पेश किया जाता है, जहां इसे बाद में कोशिका निकायों में ले जाया जाता है। डिजाइनर ड्रग (ओं) (डीआरईडीडी) वायरस द्वारा विशेष रूप से सक्रिय एक डबल-फ्लोक्स्ड इनवर्टेड ओरिएंटेशन (डीआईओ) डिजाइनर रिसेप्टर को तब मस्तिष्क के सोमाटोमोटर कॉर्टेक्स में इंजेक्ट किया जाता है। यह डबल-संक्रमण तकनीक केवल सह-संक्रमित कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट (सीएसटी) न्यूरॉन्स में ड्रेड्स की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देती है। इस प्रकार, नवजात चूहों में ग्रीवा एससीआई मॉडल के बाद वसूली के केमोजेनेटिक मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए सोमाटोमोटर कॉर्टेक्स और ग्रीवा सीएसटी टर्मिनलों का एक साथ सह-इंजेक्शन एक वैध तरीका है।

Introduction

जबकि एससीआई बाल चिकित्सा आबादी में एक अपेक्षाकृत दुर्लभ घटना है, यह विशेष रूप से दर्दनाक है और एक स्थायी विकलांगता का कारण बनता है जिसके लिए अत्यधिक तार्किक दूरदर्शिता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, बाल चिकित्सा एससीआई के एक उच्च अनुपात को वयस्क आबादी 1,2 की तुलना में गर्भाशय ग्रीवा और पूर्ण के रूप में वर्गीकृत किया गया है। स्तनधारी प्रजातियों में एक पहचान यह है कि नवजात शिशु वयस्कों की तुलना में एससीआई से विशेष रूप से बेहतर तरीके से ठीक होते हैं, और यह युवा आबादी 3,4,5 में वसूली के लिए ड्राइविंग तंत्र का आकलन करने का अवसर प्रदान करता है। इसके बावजूद, नवजात शिशु और शिशु कृंतक अनुसंधान से निपटने के लिए कम बहुआयामी अध्ययन हैं, आंशिक रूप सेयुवा जानवरों के बहुत तंग शारीरिक स्थलों में न्यूरॉन्स की चुनिंदा आबादी को सटीक रूप से लक्षित करने की अतिरिक्त कठिनाई के कारण। यह लेख चूहे की रीढ़ की हड्डी में अत्यधिक कुशल एंटेरोग्रेड और प्रतिगामी एडेनो-संबद्ध वैक्टर के प्रत्यक्ष इंजेक्शन पर केंद्रित है ताकि क्रे-डिपेंडेंट-ड्रेड्स के आवेदन के साथ प्रमुख मोटर मार्गों को संशोधित किया जा सके, जिससे मल्टीमॉडल पुनर्जनन अध्ययनों की पहुंच का विस्तार हो सके।

वायरल वैक्टर अनुप्रयोगों की चौड़ाई के साथ महत्वपूर्ण जैविक उपकरण हैं, जिसमें लक्ष्य जीन के विकल्प के लिए आनुवंशिक सामग्री की शुरूआत, विकास प्रोटीन को विनियमित करना और सीएनएस 7,8,9 के शारीरिक परिदृश्य का पता लगाना शामिल है। रीढ़ की हड्डी के मोटर मार्गों के कई शारीरिक विवरणों का अध्ययन शास्त्रीय ट्रेसर का उपयोग करके किया गया है, यानी, बायोटिनिलेटेड डेक्सट्रान अमाइन। जबकि पारंपरिक ट्रेसर न्यूरोएनाटॉमी का पता लगाने में सहायक रहे हैं, वे अपने नुकसान के बिना नहीं हैं: वे सही ढंग से इंजेक्शन दिए जाने पर भी मार्गों को अंधाधुंध लेबल करते हैं, और अध्ययनों में पाया गया है कि उन्हें क्षतिग्रस्त अक्षतंतु 10,11,12 द्वारा लिया जाता है। नतीजतन, इससे पुनर्जनन अध्ययनों में गलत व्याख्या हो सकती है जहां कटे हुए अक्षतंतु को फाइबर को पुनर्जीवित करने के लिए गलत समझा जा सकता है।

निम्नलिखित विधि हाल ही में मॉड्यूलेशन अध्ययनों में लोकप्रिय दो-वायरल वेक्टर प्रणाली का उपयोग करती है, जिसमें एक ही न्यूरॉन13,14 के दो अलग-अलग क्षेत्रों में दो अलग-अलग वायरल वैक्टर होते हैं। पहला एक वेक्टर है जो स्थानीय रूप से प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स के सेल निकायों को संक्रमित करता है। दूसरा एक प्रतिगामी वेक्टर है जिसे प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स (चित्रा 1) के अक्षतंतु टर्मिनलों से ले जाया जा रहा है। प्रतिगामी वेक्टर क्रे रिकोम्बिनेस को वहन करता है, और स्थानीय वेक्टर में "क्रे-ऑन" डबल-फ्लोक्स्ड अनुक्रम शामिल होता है जिसमें एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमचेरी) एन्कोड किया जाता है। hM3Dq और mCherry दोनों को व्यक्त करने वाला देशी ट्रांसजीन प्रमोटर के सापेक्ष उल्टा है और दो LoxP साइटों (चित्रा 2) से घिरा हुआ है। इस प्रकार, एमचेरी को केवल दोगुना ट्रांसड्यूस्ड प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है जहां क्रे रिकोम्बिनेस लॉक्सपी साइटों के बीच एक पुनर्संयोजन घटना को प्रेरित करता है, ट्रांसजीन के अभिविन्यास को उचित रीडिंग फ्रेम में फ्लिप करता है और डीईडीडी और फ्लोरोसेंट प्रोटीन दोनों की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। एक बार वायरल ट्रांसजीन सही अभिविन्यास में होता है, और जब लागू होता है, तो डीआरईडीडी एक अलग इंजेक्शन लिगैंड, यानी, क्लोज़ापाइन-एन-ऑक्साइड के माध्यम से न्यूरोमॉड्यूलेशन को क्षणिक रूप से प्रेरित कर सकता है। प्रोटोकॉल को नवजात शिशुओं में इंड्यूसेबल न्यूरोमॉड्यूलेशन अनुसंधान को प्रमाणित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जिसमें डीआरईडीडीएस को सीएसटी को चुनिंदा रूप से संशोधित करने के लिए इंजेक्ट किया जाता है। दो-वायरल प्रणाली एक बीमा पॉलिसी के रूप में कार्य करती है, यह सुनिश्चित करती है कि इंजेक्शन को मान्य करने के लिए उच्च निष्ठा के साथ प्रतिदीप्ति के तहत प्रत्येक डीआरईडीडी-पॉजिटिव सेल का पता लगाया जा सकता है।

यह विधि नवजात अनुसंधान में अंतर को पाटने में भी मदद करती है। बाल चिकित्सा एससीआई अपनी चुनौतियों को प्रस्तुत करता है, और पुनर्जनन, अंकुरण, या प्लास्टिसिटी का विश्लेषण करने वाले अनुसंधान को नवजात शिशुओं और वयस्कों के बीच अंतर पर जोर देना चाहिए 3,15,16,17। शल्य चिकित्सा प्रक्रिया को अनुकूलित करके और निस्ल स्टेनिंग के साथ पूर्व शारीरिक अध्ययन करके, कपाल और रीढ़ की हड्डी के इंजेक्शन दोनों के लिए निर्देशांक मान्य किए गए थे। इसका उद्देश्य बढ़ी हुई निष्ठा और उत्तरजीविता के साथ एक नवजात चूहे में दोहरे इंजेक्शन के लिए एक विधि प्रदान करना था।

वर्तमान मॉडल के लिए, एंटेरोग्रेड वेक्टर को संदर्भ18,19 के रूप में ब्रेग्मा का उपयोग करके सोमाटोमोटर कॉर्टेक्स के सेल निकायों में इंजेक्ट किया गया था। रीढ़ की हड्डी के इंजेक्शन के संदर्भ में, प्रतिगामी वेक्टर को लैमिनेट वी-VII में इंजेक्ट किया गया था, जहां सीएसटी एक्सॉन टर्मिनल20,21 रहते हैं। अंतर्निहित कई मौलिक प्रश्न हैं कि कैसे कुछ घाव मॉडल युवा जानवरों को अलग तरह से प्रभावित करते हैं, और बाद में वसूली एक पुराने जानवर से कैसे भिन्न होती है। यह अध्ययन गर्भाशय ग्रीवा की चोटों और नवजात कृन्तकों में फोरलिम्ब फ़ंक्शन की वसूली का अध्ययन करने का एक मजबूत साधन प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, पिछले अध्ययनों के बहुमत ने काठ या वक्ष की चोटों 5,22,23,24 के बाद वसूली हरकत को संबोधित किया है। यहां वर्णित नई इंजेक्शन तकनीक के साथ डबल-वायरल वेक्टर को जोड़कर, यह प्रोटोकॉल कुछ मुद्दों (यानी, उत्तरजीविता) को कम करने में मदद करता है जो नवजात कृंतक जांच को पीड़ित कर सकते हैं। यह विधि मजबूत, व्यावहारिक और बहुमुखी है: तकनीक में मामूली बदलाव विभिन्न मार्गों को लक्षित करने की अनुमति देगा, यानी, वेंट्रल सीएसटी, पृष्ठीय सीएसटी, और आरोही पृष्ठीय मार्ग।

इस प्रणाली के लिए, एक स्थानीय रूप से अभिनय वायरस (जैसे, एएवी 2) को रुचि के न्यूरोनल सेल निकायों के क्षेत्र में इंजेक्ट किया जाता है। एक दूसरा प्रतिगामी परिवहन वायरस जो स्थानीय वायरस की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, उसे उस न्यूरोनल आबादी के लिए अक्षतंतु टर्मिनलों पर इंजेक्ट किया जाता है। इस प्रकार, परिभाषा के अनुसार, केवल कॉर्टिकोस्पाइनल न्यूरॉन्स को लेबल किया जाता है। रेट्रोएएवी-सीआरई वायरस को संवैधानिक रूप से सक्रिय सीएमवी प्रमोटर के साथ चुना गया था क्योंकि शटल प्लास्मिड का उपयोग कई सेल प्रकारों में सीआरई-निर्भर अभिव्यक्ति के लिए कई एएवी सीरोटाइप उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। कॉर्टिकल इंजेक्शन के लिए, एएवी 2 को न्यूरॉन्स तक किसी भी अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए सिनैप्सिन -1 प्रोमोटर द्वारा संचालित ट्रांसजीन के साथ चुना गया था। क्योंकि 2-वायरल प्रणाली रुचि की न्यूरोनल आबादी की उत्पत्ति और समाप्ति पर अधिक निर्भर करती है, कई अलग-अलग प्रमोटरों का उपयोग किया जा सकता है, अगर वे रुचि की न्यूरोनल आबादी के भीतर रुचि के जीन की अभिव्यक्ति को चला सकते हैं। उदाहरण के लिए, उत्तेजक न्यूरोनल प्रमोटर, कैमकेआईआई, को सिनैप्सिन -1 के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इन एएवी सीरोटाइप के उपयोग के अलावा, अपरिपक्व में प्रतिगामी परिवहन, और बहुत कम हद तक, वयस्क कॉर्टिकोस्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स को उच्च प्रतिगामी परिवहन योग्य लेंटिवायरस (हाईरेट) 25 का उपयोग करके भी प्राप्त किया जा सकता है। HiRet lentivirus प्रतिगामी परिवहन के लिए सिनैप्स पर अपटेक को लक्षित करने के लिए एक चिमेरिक रेबीज / वीएसवी ग्लाइकोप्रोटीन का उपयोग करते हैं। टेट-ऑन प्रमोटर के साथ संयुक्त, यह 2-वायरल सिस्टम प्रतिगामी-निर्भर फैशन26,27 में इंड्यूसेबल अभिव्यक्ति का समर्थन करता है।

प्रतिगामी वायरस एक लक्ष्य न्यूरॉन के सिनैप्टिक स्पेस में वैक्टर डालते हैं, जिससे इसे उस सेल के अक्षतंतु द्वारा लिया जा सकता है और सेल बॉडी में ले जाया जा सकता है। जबकि लेंटिवायरल वैक्टर को पहले जबरदस्त सफलता मिली है, जीन थेरेपी अध्ययनों में दीर्घकालिक अभिव्यक्ति प्रदान करते हुए, यह विधि कुछ सरल कारणों से एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर की ओर बढ़ती है26,28: एएवी अधिक किफायती है, समान रूप से प्रभावी है, और एक तार्किक बोझ को कम प्रस्तुत करता है, यह देखते हुए कि इसमें कम जैव सुरक्षा स्तर पदनाम 29,30,31,32 है . जबकि एएवी 2, सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला सीरोटाइप, सीएसटी अक्षतंतु के मजबूत अभिकर्मक को प्रदर्शित करता है, भविष्य के शोधकर्ता ध्यान दे सकते हैं कि एएवी 1 कुछ बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है क्योंकि यह ट्रांससिनेप्टिक रूप से लेबल करता है, इस प्रकार भविष्य के अध्ययनों में कई संभावित पुनरावृत्तियों को सामने रखताहै। अंतिम अनुकूलन क्रे-रिकोम्बिनेस के साथ प्रतिगामी वायरस को एन्कोड करना है ताकि कई एंटेरोग्रेड वैक्टर को एक साथ पेश किया जा सके, जिससे अनावश्यक इन-हाउस वायरस अपशिष्ट को कम किया जा सके और सही अभिविन्यास में व्यक्त किए गए डीआरईडीएस की संभावना को अधिकतम किया जा सके।

अंततः, यह प्रोटोकॉल कॉर्टेक्स और ग्रीवा रीढ़ में एक साथ इंजेक्शन प्रदर्शित करता है, विशेष रूप से सेल निकायों और कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट के एक्सॉन टर्मिनलों को लक्षित करता है। सेरेब्रल कॉर्टेक्स और रीढ़ की हड्डी में उच्च निष्ठा अभिकर्मक देखा जाता है। जबकि वर्णित प्रोटोकॉल 5 दिन की उम्र के स्प्रैग डॉवले चूहों के लिए परिपूर्ण था, यह संज्ञाहरण और स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक के मामूली समायोजन के साथ प्रसवोत्तर दिनों 4-10 के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

निम्नलिखित सभी शल्य चिकित्सा और पशु देखभाल प्रक्रियाओं को मंदिर विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। वर्णित प्रोटोकॉल एक उत्तरजीविता सर्जरी है, और जानवरों को अंततः उनके समय बिंदुओं के पूरा होने पर 100 मिलीग्राम / किग्रा सोडियम पेंटोबार्बिटल के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी।

1. पूर्व शल्य चिकित्सा तैयारी

  1. 3.5 एनएल ग्लास केशिका पिपेट का उपयोग करके वायरल इंजेक्शन के लिए कम से कम दो खींची गई ग्लास सुइयों को तैयार करें; एक सुई ड्रेड के लिए और एक सुई आरसीआरई के लिए। एहतियात के तौर पर, इंट्राऑपरेटिव रूप से टूटने की स्थिति में 4-5 सुइयां तैयार करें।
  2. माइक्रोसिसर का उपयोग करके, सुई से 1-2 मिमी अतिरिक्त ग्लास काट दें।
  3. प्रत्येक सुई के लिए, इसे 30 ° पर रखें, 30-40 μm अपर्चर और 45 ° बेवेल्ड कोण के साथ एक टिप बनाने के लिए एक माइक्रोपिपेट बेवेलर का उपयोग करें।
  4. सुइयों को एक कवर पेट्री डिश में स्टोर करें और फिर पेट्री डिश को 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत जैव सुरक्षा हुड में रखकर उन्हें निष्फल करें।
  5. प्रक्रिया से पहले -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एक उपयुक्त मात्रा निकालकर आवश्यक वायरस तैयार करें, यह ध्यान में रखते हुए कि प्रत्येक जानवर को प्रत्येक वायरस के 3 μL की आवश्यकता होगी।
    नोट: उपयोग में नहीं होने पर बर्फ पर वायरस को परिवहन और स्टोर करें। इस प्रोटोकॉल को एएवी 2-एचएम 3 डीक्यू-एमचेरी और एएवी 2-रेट्रोक्रे का उपयोग करके प्रति जानवर प्रत्येक वायरस के 3 μL को इंजेक्ट करने के लिए विकसित किया गया था। ड्रेड प्लास्मिड, पीएएवी-एचसिन-डीआईओ-एचएम 3 डीक्यू-एमचेरी ( सामग्री की तालिका देखें), का उपयोग 1.54 × 10 12 जीनोम प्रतियों (जीसी)/एमएल के वायरल टिटर के साथ एंटेरोग्रेड एएवी2 बनाने के लिए किया गया था। क्रे प्लास्मिड, पीएएवी-सीएमवी-एससीसीआरई का उपयोग 4.27 × 10 12 जीसी / एमएल के वायरल टिटर के साथ प्रतिगामी एएवी2 बनाने के लिए किया गया था।
  6. इंजेक्टर को माइक्रोपंप में प्लग करें और इसे वर्नियर स्केल के साथ माइक्रोमैनिपुलेटर में रखें।
  7. सुई में वायरस की उपस्थिति या अनुपस्थिति की नेत्रहीन पुष्टि करने में मदद करने के लिए, सुई में रंगीन डाई, यानी लाल तेल लोड करें। सुई में बुलबुले से बचें।
  8. इंजेक्टर में कांच की सुई डालें, यह सुनिश्चित करें कि सुई सही ढंग से फिट बैठती है।
  9. यदि उपलब्ध हो, तो प्रत्येक वायरस के लिए एक अलग इंजेक्शन पंप के साथ पूरी प्रक्रिया को दोहराएं। यदि केवल एक इंजेक्शन पंप उपलब्ध है, तो दो अलग-अलग सुइयां तैयार करें और वायरस को स्वैप करने का समय होने पर इस्तेमाल की गई सुई को बदलें।

2. संज्ञाहरण और सर्जिकल साइट की तैयारी

  1. जानवर को डिजिटल पैमाने पर तौलें। आवश्यक एनेस्थेटिक की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रीऑपरेटिव वजन रिकॉर्ड करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में पाया गया कि ऑपरेटिव समय में एक संतोषजनक एनेस्थेटिक विमान सुनिश्चित करने के लिए सबसे विश्वसनीय एनेस्थेटिक तकनीक केटामाइन और हाइपोथर्मिया का संयोजन है। केटामाइन अपने आप में संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए अपर्याप्त है, और इसे ज़ाइलाज़िन के साथ पूरक करने से इंट्राऑपरेटिव मृत्यु दर बढ़ने से पहले एक संकीर्ण सीमा होती है। हाइपोथर्मिया अपने आप में लंबे समय तक सर्जरी के लिए पर्याप्त नहीं है (दोहरी रीढ़ और मस्तिष्क सर्जरी के लिए >1 घंटे स्थिर संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है)।
  2. कंधे के ब्लेड के बीच पतला केटामाइन (10 मिलीग्राम / एमएल) को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करके पिल्ला को एनेस्थेटाइज करें ताकि जानवर को केटामाइन की 100 मिलीग्राम / किग्रा खुराक प्राप्त हो; 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, प्रसवोत्तर दिन 5 में, एक चूहे के पिल्ले का वजन 10 ग्राम होता है और पतला केटामाइन समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) का 0.1 एमएल प्राप्त होता है।
  3. पिल्ला को 6-8 मिनट के लिए कुचल बर्फ पर रखें। बर्फ के सीधे संपर्क से बचने के लिए जानवर को लेटेक्स दस्ताने या पैराफिल्म में रखकर इसे फ्रॉस्टबाइट से बचाएं।
  4. एक उपयुक्त एनेस्थेटिक विमान की पुष्टि करने के लिए बल का उपयोग करके पैर को मजबूती से पिंच करें। यदि रिफ्लेक्सिव वापसी होती है, तो आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर अतिरिक्त 2 मिनट के लिए छोड़ दें।
  5. मोटे तौर पर 5% आयोडीन समाधान के साथ भिगोए गए बाँझ धुंध का उपयोग करके जानवर के सिर और पीछे के क्षेत्र में एंटीसेप्टिक लागू करें। फिर, 70% इथेनॉल में भिगोए गए धुंध के साथ निष्फल करें। धुंध को भिगोने के लिए आयोडीन और इथेनॉल के बीच बारी-बारी से एंटीसेप्टिक वाइप्स को तीन बार लागू करें।
    नोट: आंखों की देखभाल की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि युवा पिल्ले केवल 14 दिनों की उम्र में अपनी आंखें खोलते हैं।
  6. यदि किसी जानवर को दोहरी सर्जरी (मस्तिष्क + रीढ़) प्राप्त करनी है, तो कंधे के ब्लेड के बीच चमड़े के नीचे सर्जरी (0.02 एमएल / जी) से पहले एक सामान्य खारा बोलस प्रदान करें।
    नोट: यदि जानवर सर्जरी के दौरान उत्तरदायी हो जाता है और आगे संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है, तो जानवर को 5 मिनट के लिए बर्फ पर बदलें।

3. सर्जिकल क्षेत्र और उपकरण तैयार करना

  1. सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें जिसमें एक स्केलपेल धारक, रोंगेर, हेमोस्टैट्स, मध्यम बिंदु घुमावदार बल और रिट्रैक्टर्स शामिल हैं
  2. माइक्रोस्कोप तैयार करें और नवजात चूहे स्टीरियोटैक्सिक एडाप्टर को वयस्क स्टीरियोटैक्सिक धारक के भीतर मजबूती से रखने के लिए स्थापित करें।
  3. निष्फल दस्ताने का उपयोग करके सर्जरी का संचालन करें। प्रीपैकेज्ड बाँझ सर्जिकल दस्ताने का एक पैक खोलें और उपयोग किए गए उपकरणों को रखने के लिए रैपर को अतिरिक्त क्षेत्र के रूप में उपयोग करते हुए, मेज पर बाँझ दस्ताने लपेटें।
    नोट: अच्छी शल्य चिकित्सा अभ्यास का पालन करना और पूरी प्रक्रिया में बाँझपन बनाए रखना महत्वपूर्ण है।
  4. स्केलपेल धारक में एक 11- ब्लेड सुरक्षित करें। बाँझ खारा, 4.0 क्रोमिक कैटगट सीवन, 4.0 रेशम सीवन, और रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लिए सामग्री, जैसे, बाँझ धुंध, बाँझ कपास-टिम्प्ड एप्लिकेटर, और त्रिकोण।
  5. ऊपर वर्णित दो सर्जिकल क्षेत्र स्थापित करें, जिसमें एक साइट क्रानियोटॉमी के लिए सौंपी गई है और दूसरी साइट ग्रीवा लैमिनेक्टॉमी के लिए सौंपी गई है।
  6. जानवर को पुनः प्राप्त करें और इसे स्टीरियोटैक्सिक एडाप्टर में सुरक्षित करें: चूंकि नवजात शिशु बहुत कार्टिलाजिनस होते हैं, इसलिए ईयरबार को मोटे तौर पर मैंडिबुलर जोड़ों की ओर निर्देशित करके उन्हें धीरे से ठीक करें। एक बार क्षैतिज रूप से स्थिर होने के बाद, धीरे से सामने के मुखपत्र का परिचय दें।
    नोट: "फ्लैट" सर्जिकल क्षेत्र प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक गैर-बाध्यकारी नियम इयरबार को एक ही ऊंचाई पर और मुखपत्र को लगभग 2-3 स्तर कम पर ठीक करना है।

4. क्रैनियोटॉमी करना और सोमाटोमोटर कॉर्टेक्स को उजागर करना

  1. उस क्षेत्र की पहचान करें जहां खोपड़ी के शीर्ष पर मध्य रेखा में बल को दबाकर चीरा लगाया जाएगा, जो सीवन के लिए महसूस करता है। आईलाइन के ठीक ऊपर से शुरू करके, सीवन प्लेन के साथ 1 सेमी चीरा लगाएं। एक साफ, सीधे और सटीक चीरा सुनिश्चित करने के लिए त्वचा को तना हुआ पकड़ें।
  2. खोपड़ी की सतह के साथ बल की धीरे से जांच करके और सीवन लाइनों के साथ-साथ पार्श्विका और ललाट हड्डियों के साथ चलने वाले बल के कारण होने वाले किसी भी इंडेंटेशन पर पूरा ध्यान देकर ब्रेग्मा (कोरोनल और कोरोनल सीवन का अभिसरण) की पहचान करें।
  3. ब्याज के पक्ष में भारित हुक के आवेदन के साथ उद्घाटन बनाए रखें। ध्यान दें कि रीढ़ की हड्डी का इंजेक्शन दाईं ओर बनाया गया है, कपाल इंजेक्शन बाईं ओर है।
  4. बढ़ी हुई सटीकता के लिए ब्रेग्मा के जोखिम को अधिकतम करने के लिए कपास युक्तियों और माइक्रोसिसर के संयोजन के साथ एपोन्यूरोसिस को साफ करें। सुनिश्चित करें कि कोरोनल सीवन स्पष्ट रूप से स्पष्ट रूप से दिखाई दे ताकि बाद के इंजेक्शन के लिए एक मोटा टेम्पलेट प्रदान किया जा सके।
  5. माइक्रोसिसर का उपयोग करके, ब्रेग्मा से सटे बाएं ललाट खोपड़ी की हड्डी के लगभग 3 x 2 मिमी खंड को काट दें।
    नोट: एक बार हड्डी के फ्लैप को सावधानीपूर्वक हटा दिया गया है, इंजेक्शन के लिए तैयार उजागर मस्तिष्क पदार्थ के साथ एक स्पष्ट खिड़की होनी चाहिए। मस्तिष्क के विपरीत पक्ष पर शेष सीवन रेखाएं पूर्ववर्ती-पश्चवर्ती (एपी) अक्ष के साथ सटीकता बनाए रखने के लिए एक दृश्य मार्गदर्शिका के रूप में कार्य करेंगी।
  6. कपास युक्तियों के साथ किसी भी मलबे, मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), और रक्त को साफ करें।
    नोट: रक्त या सीएसएफ के लिए दृश्य रेखा को थोड़ा अस्पष्ट करना सामान्य है, इसलिए नियमित रूप से कपास युक्तियों के साथ क्षेत्र को साफ करने की सलाह दी जाती है।
    Figure 3

चित्र 3: ब्रेग्मा के सापेक्ष कपाल इंजेक्शन निर्देशांक (mm) का एक योजनाबद्ध चित्रण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

5. वायरस लोड करना और इंजेक्टर को पोजिशन करना

  1. पैराफिल्म के एक टुकड़े पर ~ 5 μL पाइप करके इंजेक्टर में वायरस लोड करें, और सुई को इस तरह रखें कि टिप वायरस की बूंद के ऊपर आराम कर रही है।
  2. सुनिश्चित करें कि चिकनी इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्टर में अतिरिक्त वायरस लोड किया गया है। उदाहरण के लिए, कुल 3 μL (प्रत्येक इंजेक्शन साइट के लिए 1 μL) इंजेक्ट करते समय, माइक्रोपंप का उपयोग करके 250 nL / s की दर से वायरस के 4 μL को वापस लें।
  3. प्रयोगशाला पोंछे के साथ अतिरिक्त वायरस को हटा दें।
  4. माइक्रोमैनिपुलेटर को रखें ताकि वर्नियर स्केल दिखाई दे, और सुई को सीवन के ऊपर रखें।
  5. सुई को ब्रेग्मा (चित्रा 3) का प्रतिनिधित्व करने वाले क्षेत्र के ठीक ऊपर तक कम करें, और एपी और मेडियल-लेटरल (एमएल) निर्देशांक को नोट करें।
  6. यह देखते हुए कि इंजेक्शन बाईं ओर होंगे, ब्रेग्मा के लिए एमएल निर्देशांक से 1, 1.5 और 2.0 मिमी (एमएल: -1.0, -1.5, -2.0) घटाकर लक्ष्य निर्देशांक उत्पन्न करें।
    नोट: एपी की स्थिति सभी तीन इंजेक्शन के लिए ब्रेग्मा से +0.5 मिमी होगी।
  7. पहले इंजेक्शन के लिए सुई को स्थिति में ले जाएं। एपी: +0.5, एमएल: -1.0
  8. सुई को उजागर मस्तिष्क तक कम करें जब तक कि यह बाहरी कॉर्टेक्स को प्रभावित न करे। सुई की ऊंचाई को नोट करें और मस्तिष्क की सतह की ऊंचाई से 0.6 मिमी घटाकर सुई को स्थिति में लाएं। इंजेक्शन की गहराई: कॉर्टिकल सतह -0.6 मिमी।
    नोट: प्रत्येक इंजेक्शन के लिए सतह की गहराई पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है क्योंकि चूहे की स्थिति में मामूली व्यवधान हो सकता है।

6. सोमाटोमोटर कॉर्टेक्स में वायरस इंजेक्ट करना

  1. एक बार सुई लगने के बाद, इंजेक्टर को 250 nL / min की दर से 1 μL इंजेक्ट करने के लिए प्रोग्राम करें।
  2. एक बार इंजेक्शन पूरा हो जाने के बाद, सुई को 3 मिनट के लिए कॉर्टेक्स में आराम करने दें।
  3. अन्य निर्देशांक के लिए इंजेक्शन दोहराएं: ब्रेग्मा के संबंध में कॉर्टेक्स के साथ कुल 3 इंजेक्शन, सभी -0.6 मिमी की गहराई पर: 1) एपी: +0.5 मिमी, एमएल: -1.0 मिमी 2) एपी: +0.5 मिमी, एमएल: -1.5 मिमी 3) एपी: +0.5 मिमी, एमएल: -2.0 मिमी।
  4. इंजेक्शन के पूरा होने के बाद, सीवन के लिए अनुभाग 9 देखें, और ग्रीवा लैमिनेक्टॉमी के लिए जानवर को अन्य ऑपरेटिंग टेबल पर स्थानांतरित करें।

7. सटीक रीढ़ की हड्डी इंजेक्शन के लिए रीढ़ की हड्डी की खिड़की बनाना

  1. खोपड़ी के आधार को समतल करने के लिए उंगलियों का उपयोग करके चीरा साइट की पहचान करें। मध्य रेखा पर, # 11 ब्लेड का उपयोग करके खोपड़ी के आधार पर 1-2 मिमी पीछे चीरा शुरू करें और सतही मांसपेशियों को उजागर करने के लिए चीरा को 1 सेमी पीछे की ओर बढ़ाएं। एक साफ चीरा सुनिश्चित करने के लिए अंगूठे और तर्जनी उंगली के साथ तनाव लगाकर त्वचा को तना हुआ रखें।
  2. ब्लेड के तेज बिंदु का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी की गुहा और गहरी रीढ़ की हड्डी की मांसपेशियों को उजागर करने के लिए सतही मांसपेशियों की मध्य रेखा के साथ धीरे से कटौती की एक श्रृंखला बनाएं। मांसपेशियों को खोलने और सर्जिकल विंडो की कल्पना करने के लिए बल की एक जोड़ी का उपयोग करें।
    नोट: सतही मांसपेशी हल्के गुलाबी दिखाई देगी, जबकि गहरी रीढ़ की हड्डी की मांसपेशियां हल्की सफेद-ग्रे दिखाई देंगी।
  3. एक बार गहरी रीढ़ की हड्डी की मांसपेशियों को उजागर करने के बाद, सर्जिकल विंडो में रिट्रैक्टर्स डालें। यदि आवश्यक हो, तो पार्श्व त्वचा और मांसपेशियों को पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें ताकि उन्हें वापस लेने वालों के दांतों के चारों ओर फैलाया जा सके। सर्जिकल विंडो को चौड़ाई में 7-8 मिमी तक वापस लें, जिससे रीढ़ की हड्डी का एक अबाधित दृश्य हो सके।
  4. दूसरे ग्रीवा (सी 2 या अक्ष) कशेरुक को इसकी प्रमुख घुमावदार प्रक्रिया द्वारा पहचानें जो एक बड़े गुंबद के आकार की मांसपेशियों में पृष्ठीय और एनकैप्सुलेशन को प्रोजेक्ट करता है। इस प्रक्रिया को महसूस करने और पहचानने के लिए बल या कुंद जांच का उपयोग करें, क्योंकि यह मार्गदर्शक मील का पत्थर होगा।
    नोट: आसन्न सी 3 कशेरुक अक्सर बड़ी सी 2 मांसपेशियों द्वारा थोड़ा संकुचित होता है; इसलिए, सी 3 पर मांसपेशियों का कोमल विच्छेदन बल या हड्डी स्क्रैपर के साथ कशेरुक को परिभाषित करने और कशेरुक गणना में सहायता करने में मदद करता है।
  5. एक हड्डी स्क्रैपर के सपाट किनारे का उपयोग करके, सी 3-सी 7 कशेरुकाओं को धीरे से गहरी रीढ़ की हड्डी को किनारों पर खुरचकर उजागर करें। उचित जोखिम सुनिश्चित करने के लिए कशेरुक लैमिना के समानांतर दिशा के साथ औसत दर्जे की शुरुआत करें और पार्श्व रूप से खुरचें, जो कशेरुक लैमिनेट के स्पष्ट अंतर की अनुमति देगा। कॉटन टिप्स से किसी भी ब्लीडिंग को कंट्रोल करें।
  6. माइक्रोसिसर की एक जोड़ी का उपयोग करके, सी 6 और सी 7 पर कार्टिलाजिनस लैमिनेट के पार्श्व किनारों को सावधानीपूर्वक काटें। कशेरुक स्तरों की गणना करते समय एक गाइड के रूप में सी 2 का उपयोग करें।
  7. बारीक बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी को उजागर करने के लिए लैमिना के विच्छेदित हिस्से को सावधानीपूर्वक हटा दें। सुनिश्चित करें कि रीढ़ की हड्डी की खिड़की वांछित इंजेक्शन साइट को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बड़ी है। हड्डी के किसी भी तेज या झुके हुए हिस्सों को हटा दें जो रीढ़ की हड्डी को माइक्रोसिसर और फोर्सप्स के साथ पंचर कर सकते हैं जैसा कि ऊपर वर्णित है।
  8. धारा 3.6 में वर्णित स्टीरियोटैक्सिक कपाल धारक में जानवर को सेट करें। इसके अलावा, जानवर के ट्रंक के नीचे धुंध का एक लुढ़का हुआ टुकड़ा रखें ताकि इसके पिछले हिस्से को ऊपर उठाया जा सके।
    नोट: इंजेक्शन के दौरान सुई की स्थिति को प्रभावित करने से श्वसन आंदोलनों को रोकने के लिए जानवर के पिछले हिस्से की ऊंचाई प्रभावी रूप से धारक की सतह से वक्ष को उठाती है।
  9. इंजेक्शन शुरू करने से पहले, रीढ़ की हड्डी का अपमान किए बिना क्षेत्र में धीरे से कपास युक्तियों और सुगी त्रिकोण ों को लागू करके किसी भी रक्त या मस्तिष्कमेरु द्रव की रीढ़ की हड्डी की खिड़की को साफ करें। इसके अलावा, निरंतर रक्तस्राव या सीएसएफ रिसाव द्वारा इंजेक्शन साइट के रोड़ा को रोकने के लिए खिड़की की परिधि के चारों ओर एक बाधा बनाएं। ऐसा करने के लिए, रीढ़ की हड्डी की खिड़की के पार्श्व भागों में अवशोषित कपास का एक छोटा टुकड़ा रखें।

8. अक्षतंतु टर्मिनलों को लक्षित करने वाली रीढ़ की हड्डी में प्रत्यक्ष इंजेक्शन

  1. ग्लास इंजेक्शन सुई की नोक का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी की धमनी की पहचान करके रीढ़ की हड्डी की मध्य रेखा का अनुमान लगाएं। हालांकि, यदि रीढ़ की हड्डी की धमनी किसी भी तरह से केंद्र से बाहर है या विचलित होती है, तो सी 2 स्पिनस प्रक्रिया की स्थिति का उपयोग करके और रीढ़ की लंबाई को कम करके मध्य रेखा का अनुमान लगाएं।
    नोट: वायरस लोड करने के निर्देशों के लिए अनुभाग 5.1 देखें।
  2. एक बार पहचान लेने के बाद, सुई को अनुमानित मध्य रेखा पर सी 5 लैमिना के ठीक पीछे रखें और इसे संदर्भ बिंदु के रूप में उपयोग करें। फिर, माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके, सुई को 0.3 मिमी से दाईं ओर ले जाएं। सुई को तब तक कम करें जब तक कि यह रीढ़ की हड्डी की सतह को न छू ले; इस गहराई से, सुई को रीढ़ की हड्डी में 0.6 मिमी डुबोएं। यदि आवश्यक हो, तो सुई को तब तक डुबोना जारी रखें जब तक कि यह रीढ़ की हड्डी को पंक्चर न कर दे; फिर, सुई को उचित गहराई तक वापस लें या कम करें।
  3. 250 nL/min पर रेट्रोAAV2-scCre के 1 μL इंजेक्ट करें। इंजेक्शन पूरा होने के बाद, धीरे-धीरे सुई को वापस लेने से पहले वायरस को रीढ़ की हड्डी में फैलाने के लिए 2 मिनट प्रतीक्षा करें। रीढ़ की हड्डी की खिड़की के भीतर दो और साइटों पर एक ही पार्श्व और गहराई निर्देशांक का उपयोग करके इंजेक्शन को दोहराएं, एक मध्य बिंदु पर और अंतिम टी 1 लैमिना के ठीक पहले।

9. घाव बंद करना और पोस्टऑपरेटिव देखभाल

  1. जानवर को स्टीरियोटैक्सिक धारक से हटा दें और रिट्रैक्टर्स या हुक को बाहर निकालें। बाँझ सामान्य खारा की कुछ बूंदों के साथ घाव क्षेत्र को साफ करें।
  2. खोपड़ी को 4.0 रेशम सीवन, कुल मिलाकर दो या 3 सीवन के साथ सीवन करें।
  3. ग्रीवा खोलने के दौरान, मांसपेशियों की परतों को कसकर फिर से जोड़ने के लिए 4.0 क्रोमिक आंत का उपयोग करें (2 सीवन पर्याप्त होना चाहिए)। 4.0 रेशम (4 सीवन अपेक्षित) के साथ गर्भाशय ग्रीवा की त्वचा को खोलने की सीवन।
  4. एक बार जब जानवर बंद हो जाता है, तो विवेकपूर्ण रूप से सीवन पर तरल पट्टी लागू करें।
  5. जानवर को एक हीटिंग लैंप के नीचे रखें और पूरी तरह से फिर से जागृत होने तक इसकी बारीकी से निगरानी करें। एक बार जब जानवर जाग जाता है, चलता है, और सूख जाता है, तो धीरे से बाँझ धुंध के साथ घावों को साफ करें। जानवर को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
  6. जानवर को उसकी मां के साथ घर पर वापस कर दें। पिल्ले की ओर मां से उपेक्षा और शिशु नरभक्षण को रोकने के लिए ध्यान रखें:
    1. सर्जरी से एक सप्ताह पहले शुरू होने वाले दिन में दो बार सौम्य हैंडलिंग (5-10 मिनट) के माध्यम से सर्जरी की प्रत्याशा में मां के साथ जांचकर्ताओं को परिचित करें।
    2. मां के लिए व्यवधान को सीमित करने के लिए पिल्लों को एक साथ होमकेज में वापस करें।
    3. सर्जरी के दिन मां को 1.5 मिलीग्राम / किग्रा क्यू 12 घंटे के साथ एसेप्रोमाज़िन इंजेक्ट करें।
      नोट: दर्द प्रबंधन पिल्ले के लिए एनाल्जेसिया प्रदान करने और गतिविधि में पहले वापसी को प्रोत्साहित करने के दोहरे उद्देश्य को पूरा करता है, इस प्रकार मां के साथ पुन: एकीकरण को बढ़ावा देता है।
    4. सर्जरी के बाद कुल 3 दिनों (पोस्टऑपरेटिव दिन 0, 1, 2) के लिए शुरू होने वाले ब्यूप्रेनोर्फिन 0.05 मिलीग्राम / किग्रा को क्यू 8 घंटे इंजेक्ट करें।

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Representative Results

वायरल वेक्टर के सफल इंजेक्शन और परिवहन के परिणामस्वरूप रीढ़ की हड्डी और मोटर कॉर्टेक्स में एकतरफा न्यूरॉन्स का पारगमन होना चाहिए। चित्रा 4 मस्तिष्क कोरोनल सेक्शन के मोटर कॉर्टेक्स में लेयर वी सीएसटी न्यूरॉन्स की लेबलिंग को दर्शाता है जो क्रे-डिपेंडेंट-ड्रेड्स-एमचेरी को आरसीआरई के विपरीत रीढ़ इंजेक्शन के साथ सह-इंजेक्शन व्यक्त करता है। अनुभागों को डीएसरेड एंटीबॉडी से दाग दिया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले दो-वायरल इंजेक्शन विधियों को प्रदर्शित करने वाला एक चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले वायरल संरचनाओं का चित्रण, रेट्रोएएवी 2-एससीसीआरई द्वारा सही किए जा रहे डबल-फ्लोक्स्ड उल्टे अभिविन्यास के साथ। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: मोटर कॉर्टेक्स में न्यूरॉन्स का पारगमन। (ए) 5x का आवर्धन। dsRed इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जानवर के बाएं मोटर कॉर्टेक्स की परत V न्यूरॉन्स में एमचेरी अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करता है। स्केल बार = 500 μm.(B) 10x का आवर्धन dsRed इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जानवर के बाएं मोटर कॉर्टेक्स की परत V न्यूरॉन्स में एमचेरी अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करता है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इंजेक्टेबल केमोजेनेटिक संशोधक के साथ मस्तिष्क गतिविधि का इंड्यूसेबल जेनेटिक मॉड्यूलेशन एससीआई से वसूली को रेखांकित करने वाले विभिन्न तंत्रों का अध्ययन करने में एक शक्तिशाली उपकरण है। इंड्यूसेबल जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (डीआरईडीडी) के लिए लक्ष्यीकरण की सटीकता तब और बढ़ जाती है जब यह विचार किया जाता है कि फ्लोरेसेंस ट्रेसिंग हिस्टोलॉजी में शारीरिक परिशुद्धता को मान्य करता है। यह पेपर यह पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय विधि पर चर्चा करता है कि चुनिंदा न्यूरोनल मार्गों (या तो उत्तेजक या निरोधात्मक ड्रेड्स के साथ) को बाधित या उत्तेजित करने से एक्सॉन पुनर्जनन याअंकुरित 34,35 में वृद्धि होती है या नहीं। रीढ़ की हड्डी में प्रतिगामी रूप से परिवहन योग्य वेक्टर का इंजेक्शन चुनिंदा न्यूरोनल आबादी पर ध्यान आकर्षित कर सकता है, या तो सीधे या उनके सिनैप्टिक कनेक्शन के माध्यम से, इस विधि को चोट के लिए न्यूरोबायोलॉजिकल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प बनाता है।

जैसा कि दिखाया गया है, बाल चिकित्सा आबादी और वयस्क आबादी के बीच किसी भी पहले अज्ञात विसंगतियों को स्पष्ट करने के लिए नवजात मॉडल में एससीआई का अध्ययन केवल अनुसंधान को और जटिल बनाने का कार्य करता है। इस प्रकार, अध्ययन डिजाइन संकरे हैं। नवजात अनुसंधान में आम सहमति यह है कि एससीआई के बाद देखे गए बेहतर परिणाम 3,4,5,36 कृन्तकों में प्रसवोत्तर दिन 7 तक बढ़े हुए अक्षीय पुनर्जनन और अंकुरण में वृद्धि पर निर्भर करते हैं। हालांकि, यह प्रवर्धित प्लास्टिसिटी प्रसवोत्तर दिन 10 और रिकवरी पठार से परे नहीं देखी जाती है जब तक कि यह वयस्क कृंतक चोट मॉडल का प्रतिनिधित्व नहीं करताहै। नवजात शिशुओं में बढ़ी हुई प्लास्टिसिटी के लिए अंतर्निहित तंत्र मायावी हैं और बहस जारी है, जो नवजात एससीआई पर केंद्रित अनुसंधान की सुविधा के लिए आसानी से दोहराए जाने वाले, उत्तरजीविता और कुशल सर्जिकल मॉडल विकसित करने के महत्व पर प्रकाश डालते हैं।

उदाहरण के लिए, कुछ ने माना है कि युवा जानवरों में देखा गया अंकुरण का अनुपातहीन स्तर सीएसटी अपमान19 से कार्यात्मक वसूली के कुछ पहलुओं को नकारता है। अंततः, सवाल बने रहते हैं कि क्या सहज वसूली कार्बनिक पुनर्जनन के कारण होती है या बस असामान्य मार्गों के अंकुरण में वृद्धि होती है जो आसानी से घाव को बाईपास करते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत सरल और मॉड्यूलर तकनीक है जिसका उपयोग कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट पुनर्जनन या इंड्यूसेबल वैक्टर के आगमन के साथ कृत्रिम अवरोध या पुनर्प्राप्ति प्रक्रियाओं की उत्तेजना के माध्यम से अंकुरित होने का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

इस अध्ययन में उपयोग किए गए वायरस को युवा कृन्तकों में एससीआई से वसूली को प्रभावित करने की व्यवहार्यता की जांच के लिए भविष्य के शोध के लिए एक खाका प्रदान करने के लिए चुना गया था। डिजाइन के अनुसार, एमचेरी को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेन केवल फ्लोरेसेंस के तहत सकारात्मक रूप से लेबल करेंगे यदि ड्रेड (एचएम 3 डी क्यू) एक साथ व्यक्त कर रहे थे, क्योंकि वे दोनों एक ही ट्रांसजेन पर मौजूद हैं। जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल में व्यवहार और फेनोटाइपिक आकलन शामिल नहीं हैं, इसने भविष्य के अध्ययनों में डीआरईडीडी गतिविधि की सफलतापूर्वक जांच के लिए आधार तैयार किया है।

वायरल वैक्टर के सफल इंजेक्शन के लिए सबसे महत्वपूर्ण तत्व सही शरीर रचना विज्ञान को जानना और वायरस के पर्याप्त प्रसार को सुनिश्चित करना है। सेंसरिमोटर कॉर्टेक्स में एंटेरोग्रेड वेक्टर को इंजेक्ट करने के संबंध में, साहित्य में वर्णित कई तरीके हैं, जिनमें उथले गहराई (0.5-0.7 मिमी) पर ब्रेग्मा के आसपास के क्षेत्र में तीन इंजेक्शन शामिल हैं। रीढ़ की हड्डी में वेक्टर के प्रतिगामी इंजेक्शन के लिए सही क्षेत्र को लक्षित करने के लिए सटीकता और रुचि के न्यूरॉन्स के न्यूरोबायोलॉजी की चतुर समझ की आवश्यकता होती है। अधिकांश सीएसटी टर्मिनलों को रीढ़ की हड्डी के ग्रे पदार्थ में लैमिनेट वी -VII के लिए स्थानीयकृत किया जाता है, और सफल अभिकर्मक को कईग्रीवा स्तरों पर इंजेक्शन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, सेगमेंट सी 4-सी 7 को अलग-अलग स्थलों के साथ स्थित किया जा सकता है, इस प्रकार नियमित लैमिनेक्टोमी और बाद के इंजेक्शन के लिए सर्जिकल विंडो को भड़काया जा सकता है। इंजेक्शन सामग्री का पर्याप्त प्रसार सुनिश्चित करना वेक्टर के गुणों, इंजेक्शन की मात्रा और न्यूरोनल ऊतक के घनत्व पर निर्भर है।

सौभाग्य से, नवजात मस्तिष्क अभिकर्मक के लिए बहुत ग्रहणशील है क्योंकि कम घनत्व इंजेक्शन सामग्री के अधिक तेजी से और प्रसारित प्रसार की अनुमति देता है। रीढ़ की हड्डी का घटक अधिक जटिल है, जिसमें काफी सख्त इंजेक्शन खिड़की है। फिर भी, रेट्रोएएवी लक्ष्य सिनैप्स को ट्रांसड्यूस करने में कुशल है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिगामी वेक्टर को कोशिका शरीर तक पहुंचने और डीईडीडी वेक्टर को सही अनुक्रम में फ्लिप करने में समय लगता है, इसलिए व्यवहार आकलन या हिस्टोलॉजिकल अध्ययन करने से पहले अनुशंसित समय इंजेक्शन की तारीख से 4 सप्ताह ± है। सारांश में, प्रतिगामी एएवी उपयुक्त है, यह देखते हुए कि इसके कई तत्काल फायदे हैं, और यह देखते हुए कि डबल-फ्लोक्स्ड सिस्टम केवल फ्लोरोसेंटली लक्ष्य न्यूरोनल आबादी को व्यक्त करता है। संकीर्ण ऑपरेटिव विंडो के बावजूद, नवजात रीढ़ की हड्डी अभिकर्मक के लिए समान रूप से ग्रहणशील है और फ्लोरिड अभिव्यक्ति42 को प्रदर्शित करती है।

बाल चिकित्सा रीढ़ की हड्डी अनुसंधान एक क्षेत्र के भीतर एक आला है जिसमें बहुस्तरीय जांच के लिए कई बाधाएं हैं। कार्यप्रणाली में प्रत्येक नई पुनरावृत्ति और शल्य चिकित्सा सफलता के साथ, अनुसंधान स्वयं आसान हो जाता है, और बदले में, नियतात्मक परिणामों को उजागर करने की संभावना बढ़ जाती है। रीढ़ की हड्डी के मार्ग में एक वायरल वेक्टर को सटीक रूप से इंजेक्ट करना कई जांच कारणों से उपयोगी है, और वायरल वेक्टर तकनीक का विस्तार करके डीआरईडीडी को शामिल करना चुनिंदा लक्ष्य प्रोटीन को बढ़ाने या कम करने के लिए उपयोगी है। आशा है कि नए सर्जिकल प्रोटोकॉल के साथ जोड़े गए डबल-फ्लोक्स्ड इंजेक्शन सिस्टम से बेहतर सटीकता समान अनुसंधान लक्ष्यों की भीड़ को बढ़ावा देगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को बच्चों के लिए श्रीनर्स हॉस्पिटल्स एसएचसी -84706 से फैलोशिप अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 scalpel blades Roboz RS-9801-11 For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades Roboz RS-9801-10 For use with the scalpel.
1 mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309659 For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture Ethicon 771-683G For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture DemeTECH NN374-16 To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler World Precision Instruments 32416 Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution Purdue Products L.P. L01020-08 For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol N/A N/A For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset) Zoetis 240048 For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer CellPoint 5-1450 To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale Okaus REV.005 For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment World Precision Instruments MF34G-5 For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes World Precision Instruments 4878 For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats Roboz RS-7231 For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps Roboz RS-5136 For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale Kanetec N/A For precise targeting during surgery.
Microscissors Roboz RS-5621 For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument Stoelting 51600 To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor 51615 For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular Leitz Wetzlar N/A Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments 62403 To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector World Precision Instruments 500150 To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller Narishige PC-100 To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre Wu lab  Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361) Bryan Roth’s lab through Addgene DREADD plasmid
Parafilm Bemis PM-996 To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton, Dickinson and Company 305122 For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps Roboz RS-5152 For griping spinous processes.
Red Oil N/A N/A To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors Roboz RS-6510 To hold open the surgical wound.
Rongeurs Roboz RS-8300 To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle Roboz RS-9843 To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors Roboz RS-5980 For general use in surgery.
Staple Removing Forceps Kent Scientific INS750347 To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth Phenix Research Products BP-989 To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators Puritan 806-WC To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze Covidien 2146 To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline Baxter Healthcare Corporation 281324 For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves N/A N/A For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad N/A N/A For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope N/A N/A For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler Kent Scientific INS750546 To apply the staples.
Water Convection Warming Pad Baxter Healthcare Corporation L1K018 For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks N/A N/A To hold open the surgical wound.
Liquid bandage NewSkin 985838 To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp ZooMed LF10EC To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 172 न्यूरोसाइंस सर्वाइकल स्पाइन की चोट नवजात शिशु अक्षतंतु पुनर्जनन अंकुरण जीन थेरेपी डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर ड्रग्स (डीआरईडीडी) द्वारा सक्रिय
संयुक्त मस्तिष्क और रीढ़ की सर्जरी का उपयोग करके डबल-वायरल वेक्टर के साथ नवजात चूहों में कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट को लक्षित करना
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Smit, R. D., Campion III, T. J., Stingel, R. L., Shah, P. H., Chen, J., Smith, G. M. Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery. J. Vis. Exp. (172), e62698, doi:10.3791/62698 (2021).

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