Summary
Este protocolo demonstra um novo método para a aplicação de terapias genéticas a subpopulações de células em ratos neonatais em idades pós-natais de 5 a 10 dias, injetando um modificador quimiogenético anterógrado no córtex somatomotor e uma Cre recombinase retrógrada transportável na medula espinhal cervical.
Abstract
Enfrentar com sucesso os obstáculos que restringem a pesquisa em ratos neonatais é importante para estudar as diferenças nos resultados observados nas lesões da medula espinhal pediátrica (LME) em comparação com as ISCs adultas. Além disso, a introdução confiável de terapias nas células-alvo do sistema nervoso central (SNC) pode ser um desafio, e imprecisões podem comprometer a eficácia do estudo ou da terapia. Este protocolo combina a tecnologia de vetores virais com uma nova técnica cirúrgica para introduzir com precisão terapias genéticas em ratos neonatais no 5º dia pós-natal. Aqui, um vírus projetado para o transporte retrógrado (retroAAV2) de Cre é introduzido nos terminais axônicos dos neurônios corticoespinhais na medula espinhal, onde é posteriormente transportado para os corpos celulares. Um receptor projetista de orientação invertida (DIO) de dupla floxe exclusivamente ativado pelo vírus da droga (s) designer (DREADD) é então injetado no córtex somatomotor do cérebro. Esta técnica de dupla infecção promove a expressão dos DREADDs apenas nos neurônios do trato corticoespinhal (TSC) co-infectados. Assim, a co-injeção simultânea do córtex somatomotor e dos terminais CST cervical é um método válido para estudar a modulação quimiogenética da recuperação seguindo modelos de LM cervical em ratos neonatais.
Introduction
Embora a LM seja uma ocorrência relativamente rara na população pediátrica, é particularmente traumática e causa uma incapacidade permanente que requer imensa previsão logística. Além disso, uma maior proporção de LME pediátrica é classificada como cervical e completa em comparação com a população adulta 1,2. Uma característica das espécies de mamíferos é que os neonatos se recuperam notavelmente melhor da LM do que os adultos, o que oferece uma oportunidade para avaliar os mecanismos determinantes para a recuperação em populações mais jovens 3,4,5. Apesar disso, há menos estudos multimodais que abordam a pesquisa de recém-nascidos e roedores infantis, em parte devido à dificuldade adicional de direcionar com precisão populações selecionadas de neurônios nos marcos anatômicos muito mais apertados de animais mais jovens6. Este artigo enfoca a injeção direta de vetores adenoassociados ânterogrados e retrógrados altamente eficientes na medula espinhal de ratos para modular as principais vias motoras com a aplicação de DREADDs dependentes de Cre, expandindo o alcance de estudos de regeneração multimodal.
Os vetores virais são importantes ferramentas biológicas com uma amplitude de aplicações, incluindo a introdução de material genético para substituir genes-alvo, regular positivamente as proteínas de crescimento e traçar a paisagem anatômica do SNC 7,8,9. Muitos dos detalhes anatômicos das vias motoras espinhais têm sido estudados usando traçadores clássicos, ou seja, a amina dextrana biotinilada. Embora os traçadores tradicionais tenham sido fundamentais para a descoberta da neuroanatomia, eles não estão isentos de desvantagens: eles rotulam indiscriminadamente as vias, mesmo que corretamente injetados, e estudos descobriram que eles são absorvidos por axônios danificados10,11,12. Consequentemente, isso poderia levar a interpretações incorretas em estudos de regeneração, onde axônios cortados poderiam ser confundidos com fibras regeneradoras.
O método a seguir utiliza o sistema de vetores bivirais recentemente popularizado em estudos de modulação, com dois vetores virais diferentes em duas áreas separadas do mesmo neurônio13,14. O primeiro é um vetor que infecta localmente os corpos celulares dos neurônios de projeção. O outro é um vetor retrógrado sendo transportado dos terminais axônicos dos neurônios de projeção (Figura 1). O vetor retrógrado carrega Cre recombinase, e o vetor local incorpora a sequência de floxe duplo "Cre-On" na qual uma proteína fluorescente (mCherry) é codificada. O transgene nativo que expressa tanto hM3Dq quanto mCherry é invertido em relação ao promotor e é flanqueado por dois sítios LoxP (Figura 2). Assim, o mCherry só é expresso nos neurônios de projeção duplamente transduzidos onde a Cre recombinase induz um evento de recombinação entre os sítios LoxP, invertendo a orientação do transgene para o quadro de leitura apropriado e permitindo a expressão do DREADD e da proteína fluorescente. Uma vez que o transgene viral esteja na orientação correta, e quando aplicável, os DREADDs podem induzir transitoriamente a neuromodulação através de um ligante injetado separadamente, ou seja, clozapina-N-óxido. O protocolo foi projetado para autenticar pesquisas de neuromodulação induzíveis em neonatos, em que os DREADDS são injetados para modular os CSTs seletivamente. O sistema de dois vírus atua como uma apólice de seguro, garantindo que cada célula positiva para DREADD seja rastreável sob fluorescência com alta fidelidade para validar as injeções.
Este método também ajuda a preencher a lacuna na pesquisa neonatal. A LM pediátrica apresenta seus desafios, e pesquisas que analisem a regeneração, a brotação ou a plasticidade devem enfatizar as diferenças entre neonatos e adultos 3,15,16,17. Otimizando o procedimento cirúrgico e realizando estudos anatômicos prévios com coloração de Nissl, as coordenadas para as injeções cranianas e espinhais foram validadas. O objetivo era fornecer um método para injeções duplas em um rato neonatal com maior fidelidade e capacidade de sobrevivência.
Para o modelo atual, o vetor anterógrado foi injetado nos corpos celulares do córtex somatomotor utilizando o bregma como referência18,19. Em relação às injeções espinhais, o vetor retrógrado foi injetado nas lâminas V-VII, onde residem os terminais axônicos CST20,21. Existem muitas questões fundamentais subjacentes a como certos modelos de lesões afetam animais mais jovens de forma diferente e como a recuperação subsequente diverge de um animal mais velho. Este estudo demonstra um meio robusto de estudar lesões cervicais e a recuperabilidade da função dos membros anteriores em roedores neonatais. Em contrapartida, a maioria dos estudos anteriores abordou a locomoção da recuperação após lesões lombares ou torácicas 5,22,23,24. Ao emparelhar o vetor duplo-viral com a nova técnica de injeção descrita aqui, este protocolo ajuda a mitigar certos problemas (ou seja, a capacidade de sobrevivência) que podem atormentar as investigações de roedores neonatais. Este método é robusto, prático e versátil: pequenas variações na técnica permitirão atingir diferentes vias, ou seja, TSC ventral, TSC dorsal e vias dorsais ascendentes.
Para este sistema, um vírus de ação local (por exemplo, AAV2) é injetado na região dos corpos celulares neuronais de interesse. Um segundo vírus transportado retrógrado que controla a expressão do vírus local é injetado nos terminais axônicos para essa população neuronal. Assim, por definição, apenas os neurônios corticoespinhais são rotulados. O vírus retroAAV-Cre foi escolhido com um promotor de CMV constitutivamente ativo, pois o plasmídeo shuttle é usado para gerar vários sorotipos de AAV para expressão dependente de Cre em vários tipos de células. Para injeções corticais, o AAV2 foi escolhido com o transgene acionado pelo promotor de sinapsina-1 para limitar qualquer expressão aos neurônios. Como o sistema 2-viral depende mais da origem e término da população neuronal de interesse, vários promotores diferentes poderiam ser usados, se eles puderem impulsionar a expressão dos genes de interesse dentro da população neuronal de interesse. Por exemplo, o promotor neuronal excitatório, CamKII, poderia ser substituído pela sinapsina-1. Além do uso desses sorotipos de AAV, o transporte retrógrado para imaturos e, em muito menor grau, neurônios motores corticoespinhais adultos também pode ser alcançado usando o lentivírus transportável retrógrado alto (HiRet)25. Os lentivírus HiRet usam uma glicoproteína quimérica de raiva/VSV para direcionar a captação na sinapse para o transporte retrógrado. Combinado com um promotor Tet-On, este sistema 2-viral suporta a expressão induzível de forma retrógrada-dependente26,27.
Os vírus retrógrados inserem vetores no espaço sináptico de um neurônio-alvo, permitindo que ele seja absorvido pelo axônio dessa célula e transportado para o corpo celular. Embora os vetores lentivirais tenham tido anteriormente um tremendo sucesso, proporcionando expressão a longo prazo em estudos de terapia gênica, esse método girou em direção aos vetores virais adenoassociados por algumas razões simples26,28: o AAV é mais econômico, igualmente eficaz e apresenta menos carga logística, uma vez que possui uma designação de nível de biossegurança mais baixa 29,30,31,32 . Enquanto o AAV2, o sorotipo mais utilizado, demonstra transfecção robusta de axônios CST, futuros pesquisadores podem notar que o AAV1 oferece alguma versatilidade ao rotular transinapticamente, apresentando assim várias iterações possíveis em estudos futuros33. A adaptação final é codificar o vírus retrógrado com Cre-recombinase para que múltiplos vetores anterógrados possam ser introduzidos simultaneamente, reduzindo assim o desperdício desnecessário de vírus internos e maximizando a probabilidade de os DREADDs se expressarem na orientação correta.
Em última análise, este protocolo demonstra a injeção simultânea no córtex e na coluna cervical, visando especificamente os corpos celulares e os terminais axônicos do trato corticoespinhal, respectivamente. A transfecção de alta fidelidade é observada no córtex cerebral e na medula espinhal. Embora o protocolo descrito tenha sido aperfeiçoado para ratos Sprague Dawley com 5 dias de idade, é adequado para os dias pós-natais 4-10 com pequenos ajustes na anestesia e coordenadas estereotáxicas.
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Protocol
Todos os seguintes procedimentos cirúrgicos e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Temple University. O protocolo descrito é uma cirurgia de sobrevida, e os animais foram eventualmente eutanasiados por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico ao término de seus períodos.
1. Preparação pré-cirúrgica
- Preparar pelo menos duas agulhas de vidro puxadas para injeção viral usando pipetas capilares de vidro de 3,5 nL; uma agulha para o DREADD e uma agulha para o rCre. Como medida de precaução, prepare 4-5 agulhas no caso de quebrarem no intraoperatório.
- Usando microtesouras, corte 1-2 mm de excesso de vidro da agulha.
- Para cada agulha, posicione-a a 30°, use um chanfro de micropipeta para criar uma ponta com abertura de 30-40 μm e um ângulo chanfrado de 45°.
- Armazene as agulhas em uma placa de Petri coberta e, em seguida, esterilize-as colocando a placa de Petri em um exaustor de biossegurança sob luz UV por 15 min.
- Preparar os vírus necessários retirando um volume adequado do congelador a -80 °C antes do procedimento, tendo em conta que cada animal necessitará de 3 μL de cada vírus.
NOTA: Transporte e armazene o vírus no gelo quando não estiver em uso. Este protocolo foi desenvolvido utilizando AAV2-hM3Dq-mCherry e AAV2-retroCre para injetar 3 μL de cada vírus por animal. O plasmídeo DREADD, pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (ver Tabela de Materiais), foi utilizado para fazer o AAV2 anterógrado com um título viral de 1,54 × 1012 cópias do genoma (GC)/mL. O plasmídeo Cre, pAAV-CMV-scCre, foi utilizado para a confecção do AAV2 retrógrado com título viral de 4,27 × 1012 GC/mL. - Ligue o injetor à microbomba e coloque-o num micromanipulador com uma balança Vernier.
- Para ajudar a confirmar visualmente a presença ou ausência de vírus na agulha, carregue corante colorido, ou seja, óleo vermelho, na agulha. Evite bolhas na agulha.
- Insira a agulha de vidro no injetor, certificando-se de que a agulha se encaixa corretamente.
- Se disponível, repita todo o processo com uma bomba injetora separada para cada vírus. Se houver apenas uma bomba injetora disponível, prepare duas agulhas separadas e substitua a agulha usada quando for hora de trocar os vírus.
2. Anestesia e preparação do local cirúrgico
- Pese o animal em uma balança digital. Registre o peso pré-operatório para determinar o volume de anestésico necessário.
NOTA: Este protocolo constatou que a técnica anestésica mais confiável para garantir um plano anestésico satisfatório durante todo o tempo operatório é uma combinação de cetamina e hipotermia. A cetamina é insuficiente para garantir a anestesia por conta própria, e a suplementação com xilazina tem um limiar estreito antes de aumentar a mortalidade intraoperatória. A hipotermia por si só não é suficiente para cirurgias prolongadas (cirurgia dupla de coluna e cérebro provavelmente requer >1 h de anestesia constante). - Anestesiar o filhote injetando cetamina diluída (10 mg/mL) por via subcutânea entre as omoplatas, de modo que o animal receba uma dose de 100 mg/kg de cetamina; aguarde 5 min.
NOTA: Por exemplo, no 5º dia pós-natal, um filhote de rato pesa 10 g e recebe 0,1 mL da solução diluída de cetamina (10 mg/mL). - Coloque o filhote no gelo triturado por 6-8 min. Proteja-o contra congelamento, colocando o animal em uma luva de látex ou parafilme para evitar o contato direto com o gelo.
- Aperte o pé firmemente usando fórceps para confirmar um plano anestésico apropriado. Se ocorrer uma retirada reflexiva, deixe por mais 2 minutos no gelo antes de prosseguir.
- Aplicar amplamente antisséptico na cabeça do animal e área das costas usando gaze estéril embebida com uma solução de iodo a 5%. Em seguida, esterilize com gaze embebida em etanol a 70%. Aplique os toalhetes antissépticos três vezes cada, alternando entre iodo e etanol para embeber a gaze.
NOTA: Não há necessidade de cuidados com os olhos, pois os filhotes jovens só abrem os olhos aos 14 dias de idade. - Se um animal for receber cirurgia dupla (cérebro + coluna vertebral), forneça um bolo fisiológico normal antes da cirurgia (0,02 mL / g) por via subcutânea entre as omoplatas.
NOTA: se o animal se tornar responsivo durante a cirurgia e for necessária anestesia adicional, substitua o animal no gelo por 5 minutos.
3. Campo cirúrgico e preparação de instrumentos
- Autoclave as ferramentas cirúrgicas que incluem um suporte de bisturi, rongeurs, hemostáticos, pinça curva de ponto médio e afastadores
- Prepare o microscópio e instale o adaptador estereotáxico de rato neonatal para posicioná-lo firmemente dentro do suporte estereotáxico adulto.
- Realizar a cirurgia usando luvas esterilizadas. Abra um pacote de luvas cirúrgicas estéreis pré-embaladas e coloque o envoltório de luvas estéreis sobre a mesa, usando o invólucro como uma área adicional para colocar as ferramentas usadas.
NOTA: É importante seguir as boas práticas cirúrgicas e manter a esterilidade durante todo o procedimento. - Fixe uma lâmina de 11 no suporte do bisturi. Posicione solução salina estéril, sutura de catgut cromo 4.0, sutura de seda 4.0 e materiais para controlar o sangramento, por exemplo, gaze estéril, aplicadores estéreis com ponta de algodão e triângulos.
- Configure dois campos cirúrgicos conforme descrito acima, com um local designado para craniotomia e o outro local designado para laminectomia cervical.
- Recupere o animal e prenda-o no adaptador estereotáxico: como os neonatos são muito cartilaginosos, fixe-os suavemente, direcionando as barras auriculares amplamente para as articulações mandibulares. Uma vez estabilizado horizontalmente, introduza suavemente o bocal frontal.
NOTA: Uma regra de não ligação usada para fornecer uma área cirúrgica "plana" é fixar as barras auriculares na mesma altura e o bocal em aproximadamente 2-3 níveis mais baixos.
4. Realização da craniotomia e exposição do córtex somatomotor
- Identifique a área onde a incisão será feita pressionando a pinça na linha média na parte superior do couro cabeludo, sentindo a sutura sagital. Faça uma incisão de 1 cm ao longo do plano de sutura sagital, começando imediatamente acima da linha dos olhos. Mantenha a pele esticada para garantir uma incisão limpa, reta e precisa.
- Identifique o bregma (a convergência das suturas coronal e sagital) sondando suavemente a pinça ao longo da superfície do crânio e prestando muita atenção às linhas de sutura, bem como a qualquer recuo causado pela pinça que corre ao longo dos ossos parietais e frontais.
- Mantenha a abertura com a aplicação de ganchos ponderados no lado de interesse. Note que a injeção espinhal é feita no lado direito, a injeção craniana é no lado esquerdo.
- Limpe a aponeurose com uma combinação das pontas de algodão e microtesouras para maximizar a exposição do bregma para maior precisão. Certifique-se de que a sutura coronal esteja em visão clara o suficiente lateralmente para fornecer um modelo aproximado para injeções subsequentes.
- Usando a microtesoura, corte aproximadamente uma seção de 3 x 2 mm do osso frontal esquerdo do crânio imediatamente adjacente ao bregma.
NOTA: Uma vez que o retalho ósseo tenha sido cuidadosamente removido, deve haver uma janela clara com matéria cerebral exposta pronta para injeção. As linhas de sutura restantes no lado contralateral do cérebro atuarão como um guia visual para manter a precisão ao longo do eixo anteroposterior (AP). - Limpe quaisquer detritos, líquido cefalorraquidiano (LCR) e sangue com pontas de algodão.
NOTA: É normal que o sangue ou o LCR obscureçam ligeiramente a linha visual, por isso é aconselhável limpar a área com pontas de algodão regularmente.
Figura 3: Uma ilustração esquemática das coordenadas de injeção craniana (mm) em relação ao bregma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Carregar o vírus e posicionar o injetor
- Carregue o vírus no injetor pipetando ~5 μL em um pedaço de parafilme e posicione a agulha de modo que a ponta esteja descansando sobre a gota do vírus.
- Certifique-se de que o vírus extra é carregado no injetor para garantir a injeção suave. Por exemplo, ao injetar um total de 3 μL (1 μL para cada local de injeção), retire 4 μL do vírus a uma taxa de 250 nL/s usando a microbomba.
- Remova o excesso de vírus com uma limpeza de laboratório.
- Posicione o micromanipulador de modo que a escala de Vernier seja visível e posicione a agulha acima da sutura sagital.
- Abaixe a agulha para logo acima da área que representa o bregma (Figura 3) e anote as coordenadas AP e médio-lateral (ML).
- Dado que as injeções estarão no lado esquerdo, gere coordenadas alvo subtraindo 1, 1,5 e 2,0 mm (ML: -1,0, -1,5, -2,0) das coordenadas ML para bregma.
NOTA: A posição AP será de +0,5 mm do bregma para todas as três injeções. - Mova a agulha para a posição para a primeira injeção. AP: +0.5, ML: -1.0
- Abaixe a agulha para o cérebro exposto até que ele esteja recuando o córtex externo. Anote a altura da agulha e coloque-a na posição subtraindo 0,6 mm da altura da superfície do cérebro. Profundidade de injeção: superfície cortical -0,6 mm.
NOTA: É importante observar a profundidade da superfície para cada injeção, pois podem ocorrer pequenas interrupções no posicionamento do rato.
6. Injetar vírus no córtex somatomotor
- Uma vez que a agulha esteja no lugar, programe o injetor para injetar 1 μL a uma taxa de 250 nL / min.
- Uma vez que a injeção esteja concluída, deixe a agulha descansar no córtex por 3 min.
- Repita as injeções para as outras coordenadas: um total de 3 injeções ao longo do córtex em relação ao bregma, todas a uma profundidade de -0,6 mm: 1) AP: +0,5 mm, ML: -1,0 mm 2) AP: +0,5 mm, ML: -1,5 mm 3) AP: +0,5 mm, ML: -2,0 mm.
- Após a conclusão das injeções, consulte a secção 9 para sutura e transfira o animal para a outra mesa de operação para laminectomia cervical.
7. Criando uma janela espinhal para injeções precisas na medula espinhal
- Identifique o local da incisão usando os dedos para palpar a base do crânio. Na linha média, inicie a incisão 1-2 mm posterior à base do crânio usando uma lâmina #11 e estenda a incisão 1 cm posterior para expor o músculo superficial. Mantenha a pele tensa aplicando tensão com o polegar e o dedo indicador para garantir uma incisão limpa.
- Usando o ponto afiado da lâmina, faça suavemente uma série de cortes ao longo da linha média do músculo superficial para expor a cavidade espinhal e os músculos espinhais profundos. Use um par de pinças para abrir o músculo e visualizar a janela cirúrgica.
NOTA: O músculo superficial aparecerá rosa claro, enquanto os músculos espinhais profundos aparecerão um cinza-esbranquiçado claro. - Uma vez que os músculos espinhais profundos tenham sido expostos, insira afastadores na janela cirúrgica. Se necessário, use fórceps para agarrar a pele lateral e os músculos para esticá-los ao redor dos dentes dos afastadores. Retraia a janela cirúrgica para 7-8 mm de largura, permitindo uma visão desobstruída da coluna vertebral.
- Identifique a segunda vértebra cervical (C2 ou eixo) por seu proeminente processo espinhoso que se projeta dorsalmente e encapsulamento em um grande músculo em forma de cúpula. Use fórceps ou uma sonda contundente para sentir e identificar esse processo, pois este será o marco orientador.
NOTA: A vértebra C3 adjacente é frequentemente ligeiramente ocluída pelo grande músculo C2; portanto, a dissecção suave do músculo em C3 com fórceps ou um raspador ósseo ajuda a definir a vértebra e ajuda na contagem vertebral. - Usando a borda plana de um raspador de ossos, exponha as vértebras C3-C7 raspando suavemente o músculo espinhal profundo para os lados. Inicie a mediana e raspe lateralmente ao longo da direção paralela às lâminas vertebrais para garantir a exposição adequada, o que permitirá uma distinção clara das lâminas vertebrais. Controle qualquer sangramento com pontas de algodão.
- Usando um par de microtesouras, corte cuidadosamente as bordas laterais das lâminas cartilaginosas em C6 e C7. Use C2 como um guia ao contar os níveis vertebrais.
- Usando um par de pinças finas, remova cuidadosamente a porção dissecada da lâmina para expor a medula espinhal. Certifique-se de que a janela da coluna vertebral é grande o suficiente para acomodar o local de injeção desejado. Remova quaisquer partes afiadas ou irregulares do osso que possam perfurar a medula espinhal com microtesouras e pinças, conforme descrito acima.
- Coloque o animal no suporte craniano estereotáxico, conforme descrito na secção 3.6. Além disso, coloque um pedaço enrolado de gaze sob o tronco do animal para elevar seus quartos traseiros.
NOTA: A elevação dos quartos traseiros do animal levanta eficazmente o tórax da superfície do suporte para evitar que os movimentos respiratórios afectem a posição da agulha durante a injecção. - Antes de iniciar as injeções, limpe a janela espinhal de qualquer sangue ou líquido cefalorraquidiano aplicando suavemente pontas de algodão e triângulos de Sugi na área sem insultar a medula espinhal. Além disso, crie uma barreira ao redor do perímetro da janela para evitar a oclusão do local da injeção por sangramento contínuo ou vazamento de LCR. Para fazer isso, coloque um pequeno pedaço de algodão absorvível nas porções laterais da janela espinhal.
8. Injeções diretas na medula espinhal visando terminais axônicos
- Usando a ponta da agulha de injeção de vidro, aproxime-se da linha média da medula espinhal, identificando a artéria espinhal. No entanto, se a artéria espinhal estiver visivelmente fora do centro ou se desviar de alguma forma, aproxime-se da linha média usando a posição do processo espinhoso C2 e extrapolando-a pelo comprimento da coluna vertebral.
NOTA: Consulte a secção 5.1 para obter instruções sobre como carregar o vírus. - Uma vez identificada, situe a agulha logo posterior à lâmina C5 na linha média aproximada e use-a como ponto de referência. Em seguida, usando o micromanipulador, mova a agulha lateralmente para a direita em 0,3 mm. Abaixe a agulha até que ela apenas toque a superfície da medula espinhal; a partir desta profundidade, mergulhe a agulha 0,6 mm na medula espinhal. Se necessário, continue a mergulhar a agulha até que ela perfure a medula espinhal; em seguida, retraia ou abaixe a agulha até a profundidade apropriada.
- Injete 1 μL de retroAAV2-scCre a 250 nL/min. Após a injeção estar completa, aguarde 2 minutos para que o vírus se difunda na medula espinhal antes de retirar lentamente a agulha. Repita as injeções usando as mesmas coordenadas laterais e de profundidade em mais dois locais dentro da janela espinhal, um no ponto médio e o final logo anterior à lâmina T1.
9. Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios
- Retire o animal do suporte estereotáxico e retire os afastadores ou ganchos. Limpe a área da ferida com algumas gotas de solução salina normal estéril.
- Suture o couro cabeludo com 4,0 suturas de seda, duas ou 3 suturas no total.
- Ao suturar a abertura cervical, use 4,0 intestino crômico para recolocar firmemente as camadas musculares (2 suturas devem ser suficientes). Suture a abertura da pele cervical com seda 4.0 (4 suturas esperadas).
- Uma vez que o animal esteja fechado, aplique criteriosamente bandagem líquida nas suturas.
- Coloque o animal sob uma lâmpada de aquecimento e monitore-o de perto até que seja totalmente despertado. Uma vez que o animal esteja acordado, em movimento e seco, limpe suavemente as feridas com gaze estéril. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
- Devolva o animal à gaiola com sua mãe. Tome cuidado para evitar a negligência e a canibalização infantil da mãe em relação aos filhotes:
- Familiarizar os investigadores com a mãe em antecipação à cirurgia através de manuseio suave (5-10 min) duas vezes ao dia, começando uma semana antes da cirurgia.
- Devolva os filhotes à gaiola em casa juntos para limitar a interrupção para a mãe.
- Injete a mãe com acepromazina 1,5 mg/kg q12 h por via subcutânea no dia da cirurgia.
NOTA: O manejo da dor serve ao duplo propósito de proporcionar analgesia para os filhotes e incentivar o retorno precoce à atividade, promovendo assim a reintegração com a mãe. - Injetar buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea q8 h a partir da cirurgia por 3 dias no total (dias pós-operatórios 0, 1, 2).
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Representative Results
A injeção e o transporte bem-sucedidos do vetor viral devem resultar na transdução de neurônios unilaterais na medula espinhal e no córtex motor. A Figura 4 demonstra a marcação de neurônios CST da camada V no córtex motor de uma seção coronal cerebral expressando Cre-dependentes-DREADDs-mCherry co-injetados com uma injeção contralateral de rCre na coluna. Os cortes foram corados com anticorpo dsRed.
Figura 1: Uma ilustração demonstrando os métodos de injeção de dois virais usados neste protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustração dos construtos virais utilizados neste protocolo, juntamente com a orientação invertida de floxe duplo sendo corrigida pelo retroAAV2-scCRE. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Transdução de neurônios no córtex motor. (A) Ampliação da imunohistoquímica 5x. dsRed demonstrando expressão de mCherry em neurônios da camada V do córtex motor esquerdo do animal. Barra de escala = 500 μm.(B) Ampliação da imunohistoquímica 10x. dsRed demonstrando a expressão de mCherry em neurônios da camada V do córtex motor esquerdo do animal. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A modulação genética induzível da atividade cerebral com modificadores quimiogenéticos injetáveis é uma ferramenta poderosa no estudo dos vários mecanismos subjacentes à recuperação da LME. A precisão do direcionamento para os receptores acoplados à proteína G induzíveis (DREADDs) é ainda maior quando se considera que o traçado por fluorescência valida a precisão anatômica na histologia. Este artigo discute um método confiável para explorar se a inibição ou estimulação de vias neuronais selecionadas (com DREADDS excitatórios ou inibitórios) resulta ou não em regeneração ou brotação de axônios aumentada34,35. A injeção de um vetor retrógrado transportável na medula espinhal pode chamar a atenção para populações neuronais selecionadas, diretamente ou através de sua conexão sináptica, tornando este método uma excelente escolha para avaliar a resposta neurobiológica à lesão.
Como ilustrado, estudar a LM em modelos neonatais para elucidar quaisquer discrepâncias anteriormente desconhecidas entre populações pediátricas e populações adultas só serve para complicar ainda mais a pesquisa. Como tal, os desenhos de estudo são mais estreitos. O consenso na pesquisa neonatal é que os melhores resultados observados após a LM dependem do aumento da regeneração axonal e do aumento da brotação até por volta do dia pós-natal 7 em roedores 3,4,5,36. No entanto, essa plasticidade amplificada não é vista além do 10º dia pós-natal e dos platôs de recuperação até que represente também os modelos de lesão de roedores adultos37,38,40. Os mecanismos subjacentes para o aumento da plasticidade em neonatos são elusivos e permanecem debatidos, destacando a importância do desenvolvimento de modelos cirúrgicos facilmente replicados, sobrevivíveis e eficientes para facilitar a pesquisa focada em LM neonatal.
Por exemplo, alguns postularam que o nível desproporcional de brotação observado em animais mais jovens nega certos aspectos da recuperação funcional do insulto da TSC19. Em última análise, permanecem dúvidas se a recuperação espontânea é devida à regeneração orgânica ou simplesmente ao aumento da brotação de vias aberrantes que convenientemente contornam a lesão. O protocolo descrito é uma técnica relativamente simples e modular que pode ser usada para estudar a regeneração ou brotação do trato corticoespinhal através da inibição artificial ou estimulação de processos de recuperação com o advento de vetores induzíveis.
Os vírus utilizados neste estudo foram escolhidos para fornecer um modelo para pesquisas futuras que investigam a plausibilidade de influenciar a recuperação da LM em roedores mais jovens. Por design, o transgene que expressa mCherry só marcaria positivamente sob fluorescência se o DREADD (hM3Dq) estivesse se expressando simultaneamente, pois ambos estão presentes no mesmo transgene. Embora o protocolo atual não inclua avaliações comportamentais e fenotípicas, ele estabeleceu as bases para investigar com sucesso a atividade do DREADD em estudos futuros.
Os elementos mais críticos para injeções bem-sucedidas de vetores virais são conhecer a anatomia correta e garantir a difusão suficiente do vírus. Com relação à injeção do vetor anterógrado no córtex sensório-motor, existem inúmeros métodos descritos na literatura, incluindo três injeções nas proximidades do bregma a uma profundidade rasa (0,5-0,7 mm). Direcionar a área correta para a injeção retrógrada de um vetor na medula espinhal requer precisão e uma compreensão hábil da neurobiologia dos neurônios de interesse. A maioria dos terminais de TSC está localizada em lâminas V-VII em toda a substância cinzenta da medula espinhal, e a transfecção bem-sucedida pode exigir injeções em múltiplos níveis cervicais41. Por exemplo, os segmentos C4-C7 podem ser localizados com marcos distintos, preparando assim a janela cirúrgica para laminectomias de rotina e injeções subsequentes. Garantir a difusão adequada do material injetado depende das propriedades do vetor, do volume da injeção e da densidade do tecido neuronal.
Felizmente, o cérebro neonatal é muito receptivo à transfecção, pois a menor densidade permite uma disseminação mais rápida e disseminada do material injetado. O componente espinhal é mais complexo, com uma janela de injeção significativamente mais apertada. No entanto, o retroAAV é eficiente na transdução das sinapses alvo. É importante notar que o vetor retrógrado leva tempo para atingir o corpo celular e inverter o vetor DREADD na sequência correta, de modo que o tempo recomendado antes de realizar avaliações comportamentais ou estudos histológicos é ± 4 semanas a partir da data da injeção. Em resumo, o AAV retrógrado é apropriado, uma vez que possui várias vantagens imediatas, e dado que o sistema de duplo floxe apenas expressa fluorescentemente as populações neuronais alvo. Apesar da estreita janela operatória, a medula espinhal neonatal é igualmente receptiva à transfecção e demonstra expressão florida42.
A pesquisa pediátrica da medula espinhal é um nicho dentro de um campo que tem muitas barreiras para investigações em várias camadas. A cada nova iteração e avanço cirúrgico na metodologia, a pesquisa em si se torna mais fácil e, por sua vez, a probabilidade de descobrir resultados determinísticos aumenta. Injetar com precisão um vetor viral em uma via da medula espinhal é útil por uma série de razões investigativas, e expandir a tecnologia de vetores virais para incluir DREADDs é útil para melhorar ou atenuar seletivamente as proteínas-alvo. A esperança é que a precisão melhorada do sistema de injeção de duplo floxe emparelhado com o novo protocolo cirúrgico promova uma infinidade de objetivos de pesquisa semelhantes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma bolsa de estudos do Shriners Hospitals for Children SHC-84706.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blades | Roboz | RS-9801-11 | For use with the scalpel. |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic SC injection and fluid bolus |
| 4.0 silk suture | Ethicon | 771-683G | For skin closure |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation |
| Ketamine (Ketaset) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51600 | To hold the neonatal sterotaxic holder in place |
| Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor | 51615 | For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections | |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre plasmid | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361) | Bryan Roth’s lab through Addgene | DREADD plasmid | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
| Liquid bandage | NewSkin | 985838 | To apply along sutures following surgery and encourage wound healing |
| Wire Cage Lamp | ZooMed | LF10EC | To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally |
References
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000. Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).
- Bregman, B. S., Goldberger, M. E. Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats. Science. 217 (4559), 553-555 (1982).
- Castro, A. J. Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats. Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).
- Commissiong, J. W., Toffano, G. Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines. Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).
- Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats. Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).
- Kim, J., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo. The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Atasoy, D., Sternson, S. M. Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology. Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Reiner, A., et al. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Oguchi, M., et al. Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain. PloS One. 10 (7), 0132825 (2015).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat. The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).
- Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats. Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).
- Tillakaratne, N. J. K., et al. Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site. Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).
- Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats. Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).
- Gennaro, M., et al. Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system. Frontiers in Neural Circuits. 11, 47 (2017).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Paxinos, G. 2, Academic Press. New York. 294-309 (1985).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Takeoka, A., Arber, S. Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury. Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).
- Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury. Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).
- Ohne, H., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation. IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Sheikh, I. S., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487, 235-238 (2012).
- Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160 (2019).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yáñez-Muñoz, R. J., Moon, L. D. F. Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. Plos One. 9 (2), 87447 (2014).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).
- Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry. The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Roth, B. L.
- Hasegawa, A., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults. Behavioural Neurology. 2016, 1035473 (2016).
- Alstermark, B., Isa, T. Circuits for skilled reaching and grasping. Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).
- García-Alías, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries. Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion. Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).
- Ueno, M., et al. Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons. Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).
- Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
