Evaluering af motorisk svækkelse i C. elegans Modeller af Amyotrofisk Lateral Sklerose

Summary

Denne protokol beskriver to følsomme assays til kræsning blandt mild, moderat, og svær motorisk svækkelse i C. elegans modeller af amyotrofisk lateral sklerose, med generelle nytte for C. elegans stammer, med ændret motilitet.

Abstract

Den neurodegenerative sygdom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) har progressivt tab af motoriske neuroner ledsaget af muskelsvaghed og motorisk svækkelse, der forværres med tiden. Mens der er gjort betydelige fremskridt med hensyn til at bestemme genetiske drivkræfter for ALS for en delmængde af patienter, har de fleste tilfælde en ukendt ætiologi. Endvidere er de mekanismer, der ligger til grund for motor neuron dysfunktion og degeneration ikke godt forstået; derfor er der et vedvarende behov for at udvikle og karakterisere repræsentative modeller for at studere disse processer. Caenorhabditis elegans kan tilpasse deres bevægelse til de fysiske begrænsninger i deres omgivelser, med to primære bevægelse paradigmer undersøgt i et laboratorium miljø-kravle på en fast overflade og svømning i væske. Disse repræsenterer et komplekst samspil mellem sensation, motoriske neuroner og muskler. C. elegans modeller af ALS kan udvise svækkelse i en eller begge af disse bevægelse paradigmer. Denne protokol beskriver to følsomme analyser til evaluering af motilitet i C. elegans: en optimeret radial bevægelsesanalyse, der måler krybe på en fast overflade og en automatiseret metode til sporing og analyse af svømning i væske (prygl). Ud over karakterisering af baseline motorisk svækkelse af ALS-modeller, disse analyser kan opdage undertrykkelse eller forbedring af fænotyper fra genetiske eller små molekyle interventioner. Således har disse metoder nytte til at studere ALS-modeller og enhver C. elegans stamme, der udviser ændret motilitet.

Introduction

Amyotrofisk Lateral Sklerose (ALS) er en invaliderende, aldringsrelateret neurodegenerativ sygdom med en særlig indvirkning på motoriske neuroner. Sygdommen har tab af motoriske neuroner i hjernen og rygmarven og progressiv motorisk svækkelse. Dette resulterer i større funktionelt handicap og for tidlig død, typisk inden for 3-5 år efter ^diagnose1. Mutationer i mindst 38 gener kan forårsage ALS; De fleste patienter med ALS akkumulerer dog allestedsnærværende indeslutninger af proteinet TDP-43 som deres primære patologi i neuroner og gliaceller2,3,4. Der er udviklet en række dyremodeller til undersøgelse af de underliggende mekanismer, der forårsager eller bidrager til ALS in vivo (revideret ⁱ⁵). I C. elegans omfatter disse modeller genetiske tab-af-funktion mutationer i homolog af ALS-forårsager gener eller transgen udtryk for menneskelige ALS gener. Der er mange fordele ved modellering ALS i C. elegans. C. elegans er et let kantbart dyr med et differentieret nervesystem, velkarakteriseret adfærdsparadigmer og betydelig genetisk hyldest til ^mennesker6,7. Mange værktøjer findes til at arbejde med C. elegans, herunder robust genom redigering kapaciteter, in vivo fluorescerende reportere af neurodegeneration, RNAi screening paradigmer, tractable genetik, og etablerede adfærdsmæssige og fænotypiske assays. C. elegans modeller af ALS rekapitulere aspekter af menneskers sygdom, herunder ophobning af uopløseligt protein, neurodegeneration, og tidlig ^død8,9. Desuden, motorisk dysfunktion byder forstyrrelse af både kravle og svømning adfærd er til stede i mange C. elegans ALS modeller.

Denne protokol beskriver to metoder til at karakterisere C. elegans motorfænotyper: radial bevægelse assay til evaluering kravle på en fast overflade og vurdering af svømning i væske (prygl) ved hjælp af WormLab automatiseret sporing og analyse. Disse følsomme metoder til karakterisering af motoriske underskud tillader sammenligninger af sværhedsgrad og tilbyder værktøjer til måling undertrykkelse og forbedringer af motorfænotyper. Den radiale bevægelse assay kvantificerer forskelle i kravle motilitet (sinusformet bevægelse på en solid overflade) blandt populationer af orme. Denne analyse udnytter C. elegans naturlige unstimulerede udforskning adfærd ved at placere orme i et enkelt sted på en plade og markerer deres endelige placering efter en given ^periode10. Alternativt, svømning i flydende (prygl) assays tælle kroppen bøjninger af de enkelte orme over en bestemt periode. Den manuelle optælling af kroppen bøjer ved det menneskelige øje er tidskrævende og udviser typisk betydelig variation mellem forsøgspersonerne. Brugen af computerassisteret automatiseret sporing og analyse kan eliminere meget af denne variation. Ud over karakterisering af baseline motorisk svækkelse af ALS-modeller, både radial bevægelse og svømning assays kan opdage graduering af forskellige locomotoriske fænotyper fra genetiske eller små molekyle interventioner. Disse metoder har nytte til at studere ALS-modeller og enhver C. elegans stamme, der udviser ændret motilitet.

Protocol

1. Radial bevægelse assay

1. Forbered petriskåle med en diameter på 100 mm eller 150 mm, der er ca. halvt fyldt med nematodevækstmedier (NGM) og sået med en ensartet græsplæne med OP50-bakterier, der dækker hele agarens overflade.
2. Vend NGM-analysepladerne på hovedet, og mærk bunden med en identifikator for C. elegans-stammerne , der skal analyseres, 2 plader pr. stamme (figur 1A).
3. Lav en lille prik med markøren i midten af den omvendte plade (Figur 1A).
4. Mens du arbejder med en dissekering mikroskop, overføre 15-20 iscenesat ^matchede11 orme til midten af analysen plade direkte over midten prik (synlig gennem NGM) ved hjælp af en platin-wire pick (Figur 1B).
   BEMÆRK: Prøv at overføre alle ormene på samme tid eller så hurtigt som muligt.
   1. Indstil en timer i 30 minutter efter orme er placeret i midten af pladen. Læg låget tilbage på pladen og sæt det til side (Figur 1C).
5. Fortsæt med at overføre orme, indtil alle stammer er på de udpegede assay plader, hvilket gør en note på omtrent, hvor lang tid det tager at overføre mellem plader (mål for ~ 1 minut mellem plader). Opbevar alle plader i samme rækkefølge, som de blev sat op.
6. Efter 30 min begynder du at score den første plade.
   1. Fjern låget og placer pladen med forsiden nedad under dissekeringmikroskopet, således at den mærkede bagsiden af pladen vender op, og NGM-agaren er mellem synslinjen og ormene. Pladen vil være på hovedet fra den normale brug.
   2. Juster mikroskopfokus, indtil orme er synlige gennem agaren.
   3. Ved hjælp af en anden farvet filtpen fra midtpunktet skal du sætte en lille prik på placeringen af hver orm - følg ormens spor gennem bakterieplænen for at finde de mest distale dyr.
   4. Kontroller kanten af pladen, da nogle orme kan ende der. Du skal også tælle og registrere antallet af orme i den midterste punktpunktspunkt (Figur 1D).
7. Fortsæt mærkning alle assay plader i orden, således at alle plader har 30 minutters aktivitet tid, være omhyggelig med at tage højde for den tid, det tog at oprette pladen. Udfør derefter manuelle eller digitale målinger som beskrevet i trin 1.8 eller 1.9.
8. Udfør manuelle målinger ved hjælp af en lineal.
   1. Brug en lineal til at måle afstanden fra midtpunktet til de endelige placeringsmarkeringer for hver orm og registrere afstanden i mm. For at holde styr på fremskridt under scoringen skal du mærke det første scorede point med en lille markeringslinje.
   2. Registrer længdedata for hver prik fortløbende ved at rotere pladen med uret (figur 1E).
9. Udføre digital måling ved hjælp af en scanner og ImageJ.
   1. Scan bagsiden af analysepladen ved siden af en lineal ved hjælp af en flatbedscanner (tal mod scanningsoverfladen) (figur 2A).
   2. Åbn det scannede pladebillede i ImageJ eller et lignende program.
      BEMÆRK: ImageJ er en gratis Java-baseret billedbehandling software hostet af NIH.
   3. Klik på straight-line tool og derefter tegne en linje, der forbinder 1 cm og 2 cm punkter på det scannede billede af linealen (Figur 2B).
      BEMÆRK: Hvis du holder Shift-computernøglen nede , tvinges linjen til nærmeste 45°-vinkel.
   4. Gå til menuen Analyser, og brug den til at angive skalaen (Analyser | Sæt skala) (figur 2C).
   5. Angiv den kendte afstand (10) og Længdeenheder (mm) i de relevante bokse, juster ikke afstanden i pixelnummer. Markér Global for at anvende den samme skala på alle billeder, der analyseres i hver ImageJ-session. Ellers skal du indstille skalaen for hvert billede ved åbning (figur 2D). Klik på OK.
      BEMÆRK: Trin 1.9.2-1.9.5 udføres for at indstille måleskalaen. Målinger for dette billede relaterer nu automatisk længden af linjer til den definerede pixel: længderelation. Billeder, der scannes ved 300 dpi, har en omtrentlig relation på 11,8 pixel pr. mm.
   6. Brug penselværktøjet til at markere lige over det første punkt, der skal scores.
      BEMÆRK: Dette er en visuel indikator for den første orm, der blev scoret.
   7. Brug lige linjeværktøjet til at tegne en linje fra midtpunktet til det første ormdatapunkt.
   8. Klik på M-tasten på tastaturet for at måle afstanden. Du kan også navigere til menuen Analyser og vælge Mål (Analyser | foranstaltning). I begge tilfælde vises målingen i et nyt vindue. dette vindue indsamler alle målinger pr. billede.
   9. Hold midtpunktet konstant, flyt slutningen af linjen, der rører ved det første ormpunkt, til det næste ormepunkt, bevæger sig med uret , og klik på M-tasten for at måle.
   10. Fortsæt med at måle hvert punkt på urets måde, indtil alle point er scoret.
   11. Kopier og Indsæt længdemålingsdata i et regneark for at gemme dem. Gentag derefter processen for hvert scannet pladebillede.
       BEMÆRK: Trin 1.9.6 - 1.9.11 måler ormens forskydningsværdier (figur 2E-F).
10. Udfør statistisk analyse.
    1. Kombiner replikker i et enkelt eksperiment, så det samlede antal scorede er mellem 30-40 orme.
    2. Udfør uafhængige eksperimentelle replikeringer på forskellige dage og med uafhængige populationer af orme for at ende med 3 uafhængige eksperimentelle replikeringer.
    3. Analyser data ved hjælp af passende statistiske analyser såsom Student's t-test for 2 stammer eller 1-vejs ANOVA for tre eller flere stammer.

2. Computer-analyseret svømning assay

BEMÆRK: Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner til det kommercielt tilgængelige WormLab-hardware- og softwaresystem (se Materialetabel). Arbejdsprocessen kan dog anvendes på andre computeranalyseret svømning assay systemer.

1. Opsætning og optagelse af videoer.
2. Hæv afskærmningen på billedhardwaren (figur 3), og kontroller, at kamerahøjden er indstillet til den forventede placering.
   BEMÆRK: Den optimale højde til optagelse af orme på en 35 mm plade er sådan, at den tredje fra den nederste gevindskruebore er synlig under det justerbare kameramonteringsbeslag, men der ses ikke yderligere monteringshul over skrueboret (ca. 30,5 cm over scenen) (Figur 3C). Dette vil resultere i et opsamlingsforhold på 11,43 μm/pixel. Overvej at tilføje en "korrekt højde" indikator, så dette er lettere at bekræfte, før du begynder analysen. Se protokoltrin 2.18 for at tage højdejusteringer.
3. Åbn den tilknyttede software (supplerende figur 1A).
4. Klik på ikonet Videooptagelse (film med en trekant, der peger til højre i midten) for at åbne et nyt videooptagelsesvindue . Kameraet vil være i Live View, men displayet vil være sort (supplerende figur 1B).
5. Tryk ned på lysdæmperknappen, og drej den med uret for at justere lyset.
   BEMÆRK: Lysdæmperknappen er på billedsystemets stadium i nærheden af den lyse feltlyskilde. Video Capture live view-skærmen skifter fra sort til oplyst.
6. Tilbage i vinduet Videooptagelse skal du klikke på fanen Indstillinger , justere på følgende måde: Videotilstand: 2456 x 2052_Mono8, Billedhastighed: 14, Output: monokrom, Eksponering: 0,00300 s, Gain: 1 dB , Gamma: 1, Roter 180 (check on).
7. Gå tilbage til fanen Hent . Vælg optagelsesmappen (supplerende figur 1B).
   BEMÆRK: Det er her, alle optagelser og projektfiler gemmes. Opret entydige mapper til individuelle eksperimenter for at holde data organiseret.
8. Tildel et filnavn ved at indtaste det i tekstboksen Filpræfiks .
   BEMÆRK: Softwaren vil automatisk tilføje et progressivt tal til slutningen af præfikset i formatet "0001". Det er tilrådeligt at have en konsekvent navngivning ordning for de filer, såsom: "YYYYMMDD_treatmentName_rep #_".
9. Angiv andre hentningsindstillinger på følgende måde: Buffer: 128 billeder (standard), Varighed (check on): 00 h:01min:00 s. Ignorer eller slå andre indstillinger fra under denne fane.
10. Placer analysepladen, låget op, på enhedens scene, og centrer den på videooptagelsesskærmen . låget.
    BEMÆRK: Forbered analyseplader på forhånd. Hver plade består af en 35 mm Petriskål ca. halvt fuld af useedet (ingen bakterieplæne) NGM.
11. Brug en mikropipette til at vaske scenen ^{synkroniseret11} orme i 1 ML af M9 på analysen plade - sigte efter omkring 50 orme (Figur 3D). Hvirvl forsigtigt pladen for at bringe dyrene til centrum eller bruge en mikropipette til at tilføje et par dråber M9 til separate dyr (Figur 3E). Indstil en timer til 60 s for at tillade orme at akklimatere til svømning.
    BEMÆRK: Pladen vil ikke være 100% synlig på skærmen. Dyr spores ikke nøjagtigt, mens de overlapper hinanden.
12. Mens timeren tæller ned, skal du manuelt justere kameraets fokus ved at dreje fokusringen på kameraets linsekrop, mens du ser displayet (Figur 3F). Det er muligt at zoome ind på ormene ved hjælp af en rullehjulsmus, der giver mulighed for mere præcis fokusering.
13. Når du har indstillet fokus, skal du justere lysknappen, så skærmen er så lys som muligt uden overeksponering (vises som røde pixels på displayet).
14. Efter 60'erne skal du trykke på knappen Optag .
    BEMÆRK: Videoen går fra Live View til Optagelse, og en timer vil være synlig. Når optagelsen er fuldført, vender videooptagelsesvisningen tilbage til Live View (supplerende figur 1B).
15. Fjern pladen efter optagelse og sæt den næste plade op. Omdøb præfikset efter behov. Vask orme i analysen plade, inkubere i 60 s, og registrere hver behandling.
16. Når du har fuldført alle optagelser til et eksperiment, skal du lukke alle åbne videofaner og slukke for lyskilden ved at trykke på lysdæmperknappen.
17. Luk vinduet Videooptagelse ved at klikke på den røde x-knap i vinduets øverste højre hjørne. Alternativt kan du lukke hele softwarepakken og genåbne.
18. Forbered videoer til sporing.
19. Vælg den første knap i denne menu, Importer billedsekvens, i menuen Arbejdsproces, og find og dobbeltklik på en video. Videoen åbnes i det midterste vindue (supplerende figur 2A).
    BEMÆRK: Standardvisningen for softwaren er menuen På siden Workflow . Du kan også få adgang til denne menu via rullemenuen Vis øverst under Vis [Vis | Arbejdsproces]. Menuen Arbejdsproces indeholder flere visningsindstillinger. Sporvisningen er passende på dette tidspunkt i protokollen. Hvis knappen Angiv sekvensoplysninger ikke er synlig i menuen, er dette ikke den korrekte visning. Først skal du se nederst i menuen og kontrollere, at fanen Arbejdsproces er aktiv, og kontroller næste gang, at sporvisningen er aktiv, ved at klikke på ikonet Spor . Hvor menuerne vises i vinduet, afhænger af skærmstørrelsen og placeringen af andre åbne menuer. Menuer kan flyttes ved at trække og slippe, ændre størrelsen og lukkes. De fleste menuer kan også åbnes via rullemenuen Vis .
20. Vælg Angiv sekvensoplysninger (supplerende figur 2B) i menuen Arbejdsproces. Markér navngivningsskemaet i det nye menuvindue, tilføj noter, og valider metadata.
21. Kontroller, at skaleringen er indstillet korrekt. Skala: 11,43 μm/pixel og Mål vil automatisk fylde som 1000 μm er 87 pixels. Hvis kamerahøjden er blevet justeret anderledes end foreskrevet her, skal du følge vejledningen i denne menu for at opdatere skalaen. Klik på knappen Gem .
22. Vælg Juster billede i menuen Arbejdsproces, og en ny pop op-menu med navnet Billedjusteringer åbnes (supplerende figur 2C). Vælg Mørke orme på lys baggrund (lyst felt).
23. Juster yderligere indstillinger. Anbefalede indstillinger for billedbehandling er som følger: Baggrundsudjævning: 10, Gaussisk udjævning: 5, Fyld huller: 2, Lille objektfilter: 0, og spring integral derivativesegmentering over.
24. Juster tærskelniveauet , så dyrene er helt fyldt med grønt, men stadig adskilt fra baggrunden. Klik på Anvend.
    BEMÆRK: Det er tilladt at hente nogle objekter, der ikke er orme.
25. Vælg Find og spor (supplerende figur 2D) i menuen Arbejdsproces.
    BEMÆRK: Der vises en menu på siden af videoen med tre faner: Registrering, sporing og reparation. Markøren ligner en pegefinger, når den vises over videoskærmen. Du kan også klikke på ikonet Vælg (markørpil) i ikonmenuen øverst til venstre i softwaren.
    1. Brug værktøjet til fingervælger til at vælge 3-7 orme, og klik på knappen Find orme under fanen Registrering .
       BEMÆRK: Dette valg hjælper softwaren med nøjagtigt at identificere orme for givne forhold og skal gøres for hver video. Efter et par sekunder vil de fleste orme blive fremhævet med grønt og have et tal i gult. Orme, der rører eller krølles sammen, vil sandsynligvis ikke blive fremhævet. Programmet vil dog sandsynligvis finde dem under sporing. Der er mulighed for at justere registreringsparametrene. Standardindstillingerne fungerer dog godt under de fleste forhold. Hvis der foretages justeringer af registreringsparametrene, skal du sørge for at være konsistent mellem prøver og replikeringer.
26. Gå stadig i vinduet Find og spor, og flyt til fanen Sporing (supplerende figur 2E). Fjern markeringen af Spor orme i kanten af billedet i kontrollen Sporingsparametre Brug tilbageskridt.
27. Indstil Max sporede hypotese til 5. Indstil sporingstilstanden til svømning.
    BEMÆRK: Indstillingen Max-sporet hypotese justerer, hvor mange potentielle ormspor en enkelt sporet orm har lov til at have, og giver programmet et vist spillerum i, hvordan man præcist sporer en enkelt orm uden at miste overblikket over den. 5 er en god ramme for svømning.
28. Flyt til sektionen Avancerede indstillinger , og angiv følgende: Rammeorme kan berøre grænsen: 50, Rammeorme kan overlappe hinanden: 500, Positionstolerance: 0,50, Figurtolerance: 0,50. Gem disse indstillinger, og installer dem til alle videoer i et eksperiment (og videre) ved at gemme dem som en konfiguration.
    BEMÆRK: Sporfiltrering anbefales ikke og kan nemt gøres efterbehandling, lad være slukket.
29. Gå til Konfigurationsstyring (tandhjulsikon) i menuen øverst til venstre. Når der klikkes på det, åbnes menuen i Konfigurationsstyring . Klik derefter på ikonet Gem (gear +), giv denne konfiguration et navn og en beskrivelse, og klik derefter på knappen OK .
    1. Hvis du vil have adgang til denne konfiguration i fremtiden, skal du åbne menuen Konfiguration , vælge den ønskede konfiguration og klikke på ikonet Indlæs (gear pil op). Tilføj derefter sekvensoplysninger, eventuelt finjustere tærskelniveauet, og vælg orme til registrering. Alle andre indstillinger vil være ens.
30. Klik på Gem projekt i menuen Arbejdsproces, kontroller lagringsplaceringen, og tilføj et projektfilnavn (det hjælper med kontinuiteten at matche projektfilnavnet med videonavnet). Luk videoen.
    BEMÆRK: Disse projekter gemmes med .wpr-filtypen.
31. Gentag for alle videoer: Importer billedsekvens (2.18), Indlæs gemt konfiguration (2.28.1), juster tærsklen (2.23), angiv sekvensoplysninger (2.19), find orme (2.24.1), gem projektet (2.29), luk video.
32. Spor videoer
    1. Hvis du vil spore projektfilerne, skal du gå til menuen Arbejdsproces og klikke på ikonet Batch (mappe, der indeholder ormesider) (Supplerende figur 2F).
       BEMÆRK: Panelet Batchbehandling vises (supplerende figur 2G). Nogle gange er det skjult, men kan tilgås nederst i menuen Batcharbejdsgang . vinduet skal muligvis udvides for at se det.
    2. Klik på knappen Tilføj under sektionen Filvalg i menuen Batchbehandling . Naviger til , og vælg alle de projektfiler (.wpr), der skal behandles, skal du klikke på Åbn.
       BEMÆRK: Menuen Batchbehandling udfyldes med den valgte filsti, en statusindikator og en grå statuslinje for hver fil.
    3. Klik på ikonet Knappen Start (afspil). Bemærk den grønne statusindikator for den første fil. Tillad, at alle filerne behandles. Når alle filerne læses som færdige (grøn), kan softwaren lukkes (supplerende figur 2G).
    4. Hvis en projektfil sidder fast, kan du overveje at køre den hængte fil af sig selv, dette løser normalt problemet. Hvis dette ikke løser problemet, skal du åbne projektfilen, slette de markerede orme (menuen Find og spor ) og vælge fra et nyt uddannelsessæt igen. Derefter genbehandles projektfilen.
33. Reparation af spor (anbefales)
    BEMÆRK: Reparation af spor kan øge nøjagtigheden af sporene. Almindelige rettelser kombinerer spor, der klart tilhører den samme orm, som det menneskelige øje ser som, sletter spor, der ikke er nøjagtige eller ikke fanger rigtige ormdata, og opdeler spor, der er forvansket, fordi orme rører (fjern den dårlige sektion og kombiner spor fra før og efter den dårlige sektion, hvis det er praktisk).
    1. Åbn softwaren, og åbn en projektfil [Fil | Åbent projekt] af interesse. Klik på Åbn , og klik på ja for at bruge denne fil. Vent på, at det tidsmæssige filter indlæses. Den behandlede video vil være på skærmen; orme vil blive fremhævet med grønt og skitseret med gult. Brug videoafspilleren til at skrubbe videoen igennem eller afspilles.
    2. Vælg Find og spor (supplerende figur 2D) i menuen Arbejdsproces. Skift til fanen Reparer. Aktiver vælgermarkøren ved at klikke på ikonet Vælgerværktøj (markørpil). Skrub gennem videoen, find og vælg et ormspor, og brug derefter reparationsmenuen til at oprette den ønskede ændring.
       BEMÆRK: For strategisk at løse de fleste problemer hurtigt, zoom ind på en sådan, at omkring 1/^6th af pladen er synlig, skal du starte med området omkring spor # 1. Skrubbe hurtigt gennem videokontrollen for orme, der på mystisk vis vises ud af ingenting, spor, hvor tallene ændrer sig, eller orme støder ind i hinanden og redigerer, når der opstår problemer. Følg orme i numerisk rækkefølge fra startpositionen. Skrub frem og tilbage for at følge hver orm efter behov, indtil hele pladen er repareret. Vær opmærksom på pladens kanter; ofte vises falske orme i skyggerne af pladekanter.
34. Dataanalyse
    1. Vælg Analyser data (supplerende figur 3A) i menuen Arbejdsproces.
       BEMÆRK: Der vises et nyt vindue med navnet Dataanalyse og plotning (supplerende figur 3B). Dette vindue har mange måder at vurdere og få vist bevægelsesdata for en bestemt projektfils ormpopulation. De fleste af disse analyser giver mulighed for at vælge specifikke, flere eller alle orme fra en given video, der gør det muligt at plotte sporoplysninger på forskellige måder.
    2. Hvis du vil analysere antallet af sving, skal du gå til Sporoversigt [Position &hastighed | Sporoversigt] (supplerende figur 3C). Brug knappen Eksporter nederst til højre til at eksportere data i et regnearkslæsbart format (.csv), vælg en sti til den ønskede placering af regnearket, herunder omdøbe det til noget mindeværdigt. Standardindstillingerne er et godt valg (supplerende figur 3D).
    3. Indsæt disse data samt alle andre relevante projektdatasæt i en konsolideret regnearksprojektmappe (supplerende figur 3E).
    4. Brug Svingoptælling og Sporvarighed til at beregne sving pr. minut for hvert spor ved hjælp af regnearksfunktioner (=sving/sporvarighed * 60), eller brug en anden metrikværdi som ønsket (supplerende figur 3F).
       BEMÆRK: Vender per minut fanger meget lignende oplysninger som en manuel prygl assay, som er en meget anvendt metrisk aktivitet i væske, men der er mange muligheder, og det er meget muligt, at en anden måling kan identificere andre interessante data for en given behandling eller sammenligning.
    5. Hvis det ønskes, skal du screene for ormstørrelse, spore varighed og/eller andre valgte metrikværdier ved hjælp af betingede formateringsværktøjer til at fremhæve spor til fjernelse, hvis de kan forvirres. Opretholde ensartet databehandling mellem behandlinger og replikerer.
    6. Analyser data ved hjælp af relevante statistiske analyser såsom Student's t-test for 2 stammer, eller 1-vejs ANOVA for 3 eller flere stammer. Udfør uafhængige eksperimentelle replikeringer på forskellige dage og med uafhængige populationer af orme i mindst 3 uafhængige eksperimentelle replikeringer.

Representative Results

Både radial bevægelse og svømning assays tilbyder følsom påvisning af motilitet værdiforringelse (Figur 4 og figur 5). For at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for patologisk TDP-43 i ALS, er der udviklet C. elegans-modeller , der udtrykker vilde eller ALS-mutante mennesker TDP-43 pan-neuronally. Disse dyr udviser molekylære og cellulære egenskaber, der minder om ALS, herunder motorisk ^dysfunktion9. Vigtigere, de udviser moderat motilitet svækkelse med udtryk for vilde-type menneskelige TDP-43 og mere alvorlige motilitet værdiforringelse hos dyr, der udtrykker ALS-mutant TDP-43 ved hjælp af både radial bevægelse og svømning assays. Nogle mutant eller transgene dyr vil have større svækkelse i crawling end svømning, eller vice versa. Ved hjælp af to forskellige motilitet assays, et klarere billede af fænotypiske forskelle mellem stammer opnås.

Radial bevægelse
Når de placeres på en seedet agarplade, udforsker C. elegans deres omgivelser, herunder søger grænserne for deres fødekilde. Radial bevægelse assays er en måde at drage fordel af denne adfærd som en metrik for fysisk kondition. Ved at analysere lokomotorisk adfærd (kravle på en solid overflade) på en kontrolleret og kvantificerbar måde, tilbyder den radiale lokomotoriske analyse et enkelt og effektivt værktøj til vurdering af sværhedsgraden af motoriske underskud og andre motorrelaterede fænotyper. Radiale bevægelsesanalyser registrerer forskelle i motilitet i moderat eller alvorligt svækkede ALS-modelorme og giver en baseline til at sammenligne graduering af motilitetsfænotyper eller ændringer i motilitet med alderen (figur 6). Denne strategi kan anvendes til at kvantificere den gennemsøgningsadfærd, der har ændret bevægelse fra vildtype (N2) eller kontrolorme. Denne metode er dog muligvis ikke et godt valg til at vurdere dyr, der ikke er i stand til at kravle normalt, såsom rullemutanter eller dyr, der er lammede. Typisk vil vilde orme udgøre en gennemsnitlig forskydning mellem 200-300 μm/min, når de hæves og testes ved 20 °C. Eksempeldataene i figur 4 viser forventede resultater, der sammenligner N2, to forskellige transgene stammer, der udtrykker vilde mennesker TDP-43 med en mild fænotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller stærkere fænotype [TDP-43(WT-moderat), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], en transgen stamme, der udtrykker mutant human TDP-43 med en alvorlig fænotype [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]) og en transgen stamme, der udtrykker et andet neurodegenerativt sygdomsrelateret protein, human tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De to stammer, der udtrykker vild-type TDP-43 har forskellige grader af svækkelse som detekteret af radial bevægelse. TDP-43 (WT-lav) er ikke væsentligt forskellig fra N2, mens TDP-43 (WT-høj) udviser klare forskelle i motilitet. TDP-43(M337V) og tau (WT) stammer har mere alvorlige funktionsnedsættelser i motilitet.

Svømning assay
C. elegans engagere sig i stereotype svømning (prygl) bevægelse, når nedsænket i væske. Umiddelbart efter nedsænkning begynder orme at bøje hoved og hale mod hinanden med en bøjningsvinkel på ca. 45 °, hvor vinkelknudepunktet er midtpunktet af ormen. Orme skiftevis bøjning i ventrale og dorsale retninger. En thrash, målt ved softwaren, repræsenterer bevægelsen af at gå fra lige til en kropsbøjningsvinkel på 20 ° eller derover, uanset retningsbestemthed (vinkeltærskel kan justeres efter behandling inden for analyse- og plotningsvinduet [Workflow | Analyser | Kropsform | Bøjning vinkel | Midtpunkt | Amplitude Threshold: # grader]. Svømning assay beskrevet her bruger automatiseret computer-baseret sporing og analyse til at give upartisk scoring af svømning aktivitet. Det forventes, at vilde orme (N2) i gennemsnit vil være mellem 150-200 thrashes pr. minut, når de hæves og registreres ved 20 °C. Eksempeldataene i figur 5 viser forventede resultater, der sammenligner N2, to forskellige transgene stammer, der udtrykker vilde mennesker TDP-43 med en mild fænotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller stærkere fænotype [TDP-43(WT-moderat), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], og en transgen stamme, der udtrykker et andet neurodegenerativt sygdomsrelateret protein, human tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Den transgene stamme, der udtrykker ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] ikke prygl i væske, og det er derfor angivet på grafen som ND (ingen data). Denne analyse kan diskriminere forskellige fænotyper end radial bevægelse assay vist i figur 4. I radial bevægelsesanalysen (figur 4) var TDP-43(WT-lav) f.eks. ikke signifikant forskellig fra N2. Men i svømning assay (Figur 5), både TDP-43 (WT-lav) og TDP-43 (WT-høj) er væsentligt forskellige fra N2, samt væsentligt forskellige fra hinanden. På trods af at både TDP-43(M337V) og tau(WT) har alvorlige gennemsøgningsvanskeligheder ved radial bevægelse (figur 4), er det også kun tau (WT), der er i stand til at thrash nok til at blive sporet af softwaren (Figur 5). TDP-43(M337V) dyr er ude af stand til at thrash, og software-baseret analyse registrerer ikke eller spore disse orme præcist. Således blev data om disse orme ikke indsamlet (ND, ingen data).

Figur 1: Arbejdsprocessen for radial bevægelsesanalyse. Paneler A-E viser de generelle trin i radial bevægelse assay. Trinene er som følger: (A) NGM Plader, med OP50 seedet til kanterne, er udarbejdet ved mærkning og mærkning centrale prik, (B) orme er placeret i midten af agar som markeret af den centrale prik, (C) orme får lov til at bevæge sig frit i en bestemt mængde tid, (D) plade er vendt nedefra og op og den endelige placering af hver orm er markeret i en anden farve end den centrale prik, (E) Afstanden fra den midterste prik til hver sidste ormplacering målt enten manuelt eller digitalt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Digital måling af den endelige placering ved hjælp af ImageJ.  Afstand fra midtermålinger kan måles i hånden eller digitalt for at måle digitalt ved hjælp af ImageJ (A) scan bagsiden af pladen med en lineal i rammen. (B) Tegn en kendt længde ved hjælp af stregværktøjet. (C) Brug den kendte længde, der er trukket i (B), til at indstille skalaen [Analysér | Angiv skala...]. (D) Brug stregværktøjet til at tegne en streg fra midtpunktet til et endeligt placeringsmærke, gentag for hvert mærke. (E) En pensel linje markerer det første mærke målte hjælpemidler i scoring (squiggly sort linje nær 1 mærke). Endelige placeringsmærker er nummereret i gult for at illustrere retningsbestemthed af scoring. (F) Målinger registreres i vinduet Resultater. Gem resultater andre steder til statistisk analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Materialer og hardwarejusteringer til brug af softwaren. (A) Materialer, der anvendes til den softwareassisteret svømmeanalyse. (B) Generel opsætning af softwaren og nødvendige materialer, bemærk, at huset er i hævet position. (C) Linsen montering beslag højde kan justeres. Dette billede viser det justerbare spor og en båndindikator, der markerer den foretrukne højde til udførelse af svømmeanalyser. Det er nødvendigt at justere brightfield lys og kamera fokus før optagelse. (D) En 35 mm analyseplade placeres på scenen, dyr i M9 tilsættes til pladen, og en 1 min timer startes. (E) Det er undertiden fordelagtigt at dreje pladen forsigtigt for at flytte orme tættere på midten - observere placering på live capture skærmen; Alternativt kan et par dråber M9 fra en pipettor bruges til at adskille orme. (F) Juster fokusringen på kameralinsen, observere orme på skærmen for at bestemme optimal fokus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Radial bevægelsesanalyser registrerer forskelle i krybehastighed. Ukonstimuleret spredning af udviklingsstader L4 larver blev målt ved hjælp af radial bevægelse assay beskrevet ovenfor og afbildet som μm/min rejste (A-B). De samme data, der er afbildet i (A) og (B), viser to forskellige mulige grafiske præsentationer. I (A) vises data som en søjlegraf, hvilket gør relative forskelle mellem stammer klarere. I (B) er den endelige forskydning af hver ormplotted inden for grafen, så variationen i befolkningen bedre visualiseres. For at vurdere betydningen blandt testede stammer blev der anvendt envejsanalyse af varians (ANOVA) med Tukeys multiple comparison-test. **p=0,0022, ****p<0.0001, ns=ikke signifikant. TDP-43(M337V) og tau(WT) er også væsentligt forskellige fra N2, p<0.0001. Fejllinjer i (A) er standardfejl af middelværdien (SEM) og i (B) er standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Svømme assays opdage forskelle i prygl i væske. Hyppigheden af svømning (thrashing eller bølgefrekvens i væske) blev målt ved hjælp af upartisk computerassisteret scoring og analyse beskrevet ovenfor og afbildet som thrashes / min (A-B). De samme data afbildet i (A) og (B). I (A) afbildes data som en søjlegraf, hvilket gør relative forskelle mellem stammer lettere at se. I (B) afbildes data fra hver enkelt orm, der er scoret, i grafen, hvilket gør det muligt at visualisere variationen i populationen bedre. For at vurdere betydningen blandt testede stammer blev der anvendt en envejsanalyse af variansen (ANOVA) med Tukeys multiple comparison-test. s<0.0001, ns=not signifikant. TDP-43(WT-moderat) og tau(WT) er også væsentligt forskellige fra N2, p<0.0001.Fejllinjer i (A) er standardfejl af middelværdien (SEM) og i (B) er standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Mutant TDP-43 orme rejser mindre end vilde orme. Plader, der viser en repræsentativ forskel i den endelige placering af iscenesat L4 N2 (vildtype) og TDP-43(M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), en stamme, der udtrykker mutant human TDP-43 med alvorligt nedsat motorisk funktion efter 1 times usografisk kravle ved stuetemperatur. Plader er markeret med en rød prik til midtpunktet og blå prikker til dyrenes endelige placering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Registrering af svømmeadfærd ved hjælp af billed- og sporingssoftwaren. (A) Sporingsarbejdsgangen og placeringen af videooptagelsesikonet. (B) Vinduet Videooptagelse vises i Live View, og de vigtigste aspekter fremhæves. De grønne "Live view"-ord ændres til en rød "Optagelse", når optageknappen er aktiveret. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Forberedelse og sporing af svømmeadfærd. Denne figur viser en række skærmbilleder, der kan hjælpe med at konfigurere en videobilledsekvens til sporing. Den generelle protokol til forberedelse af en videosekvens er at åbne hver arbejdsprocesmenu i denne rækkefølge: Importer billedsekvens | Angiv | Juster | Find og spor | Gem projekt. Vinduet Analyser data kan kun bruges, når en projektfil er sporet. (A) viser en åbnet .avi (video) fil efter import af sekvensen til softwaren inde fra arbejdsprocessen Spor . (B) Vinduet Angiv sekvensoplysninger indeholder et sted til noter, der angiver/ændrer skalaen, og kontrollerer metadataene for en videosekvens. Instruktioner til ændring af skalaen findes i dette vindue og skal følges, når kameraet sænkes eller hæves (B). Billede (C) viser indstillingerne for vinduet Juster billede . (D) Skærmbillede, der viser fanen Registrering i vinduet Find og spor . Detektering af orme bruges til at træne softwaren og skal indstilles for hver videosekvens. Yderligere registreringsparametre kan indstilles her, hvis det ønskes. (E) Skærmbillede af fanen Sporing i vinduet Find og spor med de anbefalede indstillinger for sporing af svømmeadfærd. Dette er det sidste trin i opsætningen af en videosekvens. Gem sekvensen som et projekt ved hjælp af vinduet Gem projekt . Gentag disse trin for hver videosekvens. Indstillinger kan gemmes som en konfiguration for at reducere arbejdsbyrden og sikre, at alle sekvenser behandles ens (ikke vist). Hvis du vil spore projektfiler til analyse, skal du gå til Batcharbejdsgangen . (F) viser det ikon, der bruges til at navigere til batcharbejdsgangen , og (G) viser batchafviklingsvinduet, fremhæver tilføj- og startknapperne og viser det forventede udseende af en projektfil, der er blevet sporet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Analyse af svømmeadfærd. Når en projektfil er blevet sporet, kan den åbnes ved hjælp af [Fil | Åbn projekt]. Orme vises med grønt som vist i (A). Skrubbe gennem videoen tilbyder en hurtig kontrol af, at videoen behandles som forventet, grøn fremhævning vil forsvinde, mens skrubbe. Vinduet Dataanalyse og Afbildning åbnes fra arbejdsgangselementet Analyser data . (B) viser vinduet Dataanalyse og Afbildning med placeringsvisning åbnet (standard), alle spor er fremhævet. Under datapunkterne er et plot, der viser det registrerede spor for hver fremhævet orm. Sporoversigtsanalysen bruges til beregnede sving pr. minut. (C-D) viser sporoversigtsrapporten og eksportdetaljerne. (E-F) viser sporoversigten i et regneark, og hvordan man beregner sving pr. minut, output målt i denne analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Radial bevægelse:
Opløsningen af denne analyse styres let ved at ændre tidsvariablen. At øge længden af tid gør det lettere at observere forskelle mellem dyr med alvorlige fænotyper og derved identificere subtile forskelle. Men fordi denne analyse måler forskydning, hvis analysen tid forlænges for længe, dyr med normal motilitet, såsom N2, vil rejse til kanterne af pladen, og fouragering adfærd vil føre til backtracking. Dette vil kunstigt reducere målingen af tilbagelagt afstand. Tidsperioder, der er for lange, kan resultere i, at forskellene mellem stammer, især mellem dyr med mindre alvorlige motorfænotyper, forsvinder, efterhånden som dyrene bliver jævnt spredt over pladen. Afkortning af tidsvariablen forhindrer mere aktive orme i at finde pladens kanter. Denne metode sporer ikke den samlede tilbagelagte afstand for hver orm, men komprimerer den tilbagelagte afstand for hver orm til en lineær afstand fra midten af pladen. Som sådan er det i sagens natur mindre robust end en metode, der registrerer den samlede sporlængde for individuelle orme. Men, radial bevægelse assay kræver meget lidt forsker uddannelse, bruger relativt overkommelige reagenser, der er almindeligt tilgængelige i de fleste orm labs, og er følsom nok til at producere betydelige og reproducerbare resultater. For laboratorier, der foretrækker automatiseret video tracking, flere metoder er tidligere blevet etableret for at spore og analysere gennemsøgning ^{bevægelser12}, eller software parametre, der anvendes til svømning assay i dette papir kan ændres for at tillade crawling afsløring og analyse.

Dette eksperiment er normalt gjort i tredominere uafhængige replikerer, med et sæt af 30-40 orme pr replika. Hver replikation er opdelt på to forskellige 100 mm eller 150 mm plader, med 15-20 orme pr plade. Brug af flere orme end anbefalet pr plade kan gøre det svært at score effektivt. Et samlet antal scorede på 90 + er tilstrækkeligt drevet til at etablere betydning for mild, moderat eller svær motilitet værdiforringelse. At være i overensstemmelse med timingen mellem de scorede stammer er afgørende for nøjagtighed og reproducerbarhed. 30 minutter er generelt lang nok til at fastslå forskelle mellem moderate til alvorlige fænotyper såsom transgene stammer, der udtrykker human mutant TDP-43 i forhold til vilde orme (Figur 4). Hvis tidsvariablen forlænges, er det tilrådeligt også at øge pladens størrelse fra 100 mm til 150 mm. Miljømæssige faktorer såsom temperatur og fugtighed kan påvirke denne analyse, som typisk udføres ved omgivende stuetemperatur, så det er vigtigt altid at bruge en wild-type (N2) kontrol, når man sammenligner på tværs af replikater. Derudover kan denne analyse måle motiliteten af nogle stammer, der ikke udviser normal svømning adfærd i væske (prygl), hvilket gør det til et nyttigt supplement til svømning assay.

Svømning assay:
Brugen af billed- og anskaffelsessystemet til at automatisere sporing og analyse af ormsvømning giver mulighed for strenge og upartiske data. Der er dog flere faktorer under den indledende opsætning af eksperimentet, der skal kontrolleres mellem prøverne. Disse omfatter tid til at akklimatificere sig til væske, før du begynder optagelse, omgivende forhold (dvs. temperatur, fugtighed) og konsekvente lys- og optagelsesindstillinger. På optagelsesstadiet er der flere funktioner, der hjælper med at reducere variationen mellem plader. Disse omfatter et integreret spormonteret kamera og lysfeltsstadie, der gør optagelse af video konsistent mellem plader, afskærmning rundt på scenen, der forhindrer refleksioner, blænding og luftbevægelser under optagelse, og en robust softwarepakke, der pålideligt registrerer orme og giver mulighed for manuel korrektion af spor i video efterbehandling. I denne protokol optages videoer af en 35 mm plade med orme i 1 minut og behandles derefter ved hjælp af softwarepakken. Efter behandling sikrer manuel korrektion af spor, at ormadfærd registreres nøjagtigt uden forvirrende sporingsfejl. Slå antal og spor varighedsdata bruges til at bestemme sving pr. minut som en endelig udlæsning. For at sikre reproducerbarhed indsamles data over mindst 3 uafhængige replikeringsforsøg, hver med 40-50 dyr scoret, for at opnå et samlet endeligt antal dyr 120-150. Dette tal er tilstrækkeligt til at diskriminere små forskelle i svømning adfærd fra kontrol orme. Nogle orme har motoriske underskud for alvorlige til at blive fanget af svømning assays. For eksempel, hvis dyrene placeres i en flydende medium krølle i stedet for at udføre den forventede prygl svar, vil denne analyse ikke registrere disse bevægelser præcist og en anden bevægelse assay, såsom radial bevægelse, kan bedre fange disse motilitet fejl. Den angivne protokol bruger et kommercielt tilgængeligt billedsystem (se Materialetabel for at få flere oplysninger), men andre ormsporingssystemer kan give et lignende værktøj, hvor nogle er open ^source12. Tidligere offentliggjorte metoder beskriver manuel scoring af orm ^thrashing13. Mens den automatiserede analyse producerer en række målinger for hver enkelt orm, detektering af kroppen bøjninger, som måles i thrashes per minut, giver ensartede resultater mellem eksperimenter og spor godt med konventionelle scoring af orm thrashes af øjet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	-	Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass	VWR	14673-010	Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.
Disposable petri dishes, 35x10mm	VWR	10799-192	Assay plates for WormLab Imaging System
Disposable petri dishes, 60x15mm	VWR	25384-090	Stock plates for worms
Disposable petri dishes, 100x15mm	VWR	25384-302	Standard radial locomotion assay plate
Disposable petri dishes, 150x15mm	VWR	25384-326	Longer time frame radial locomotion assay plate
Dissecting microscope	Leica	M80	Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays
Fine-tipped markers	VWR	52877-810	Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.
Flatbed Scanner	Amazon	Epson Perfection V850	Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine
ImageJ	NIH	-	Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
M9 buffer	VWR	IC113037012	Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
NGM (Nematode Growth Medium)	VWR	76347-412	Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
OP50  bacteria	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Primary food source for C. elegans
p1000 pipettor	VWR	76207-552	Pipettor, used in swimming assay
p1000 tips	VWR	83007-384	Tips for pipettor, used in swimming assay
Platinum wire, 0.2032mm diameter	VWR	BT136585-5M	Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.
Ruler	VWR	56510-001	Need to score radial locomotion assays
WormLab Imaging System	MBF Bioscience	WormLab	The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system