Summary
Denne protokollen beskriver to sensitive analyser for diskriminering blant milde, moderate og alvorlige motoriske svekkelse i C. elegans modeller av amyotrofisk lateral sklerose, med generell nytte for C. elegans stammer, med endret bevegelighet.
Abstract
Den nevrodegenerative sykdommen amyotrofisk lateral sklerose (ALS) har progressiv tap av motoriske nevroner ledsaget av muskelsvakhet og motorisk svekkelse som forverres med tiden. Mens det er gjort betydelige fremskritt for å bestemme genetiske drivere av ALS for en undergruppe av pasienter, har de fleste tilfeller en ukjent etiologi. Videre er mekanismene som ligger til grunn for motorisk nevron dysfunksjon og degenerasjon ikke godt forstått; Derfor er det et løpende behov for å utvikle og karakterisere representative modeller for å studere disse prosessene. Caenorhabditis elegans kan tilpasse bevegelsen til de fysiske begrensningene i omgivelsene, med to primære bevegelsesparadigmer studert i et laboratoriemiljø som kryper på en fast overflate og svømmer i væske. Disse representerer et komplekst samspill mellom sensasjon, motoriske nevroner og muskler. C. elegans modeller av ALS kan vise svekkelse i ett eller begge disse bevegelsesparadigmene. Denne protokollen beskriver to sensitive analyser for evaluering av bevegelighet i C. elegans: en optimalisert radial bevegelsesanalyse som måler kryping på en solid overflate og en automatisert metode for sporing og analyse av svømming i væske (thrashing). I tillegg til karakteriseringen av baseline motorisk svekkelse av ALS-modeller, kan disse analysene oppdage undertrykkelse eller forbedring av fenotypene fra genetiske eller små molekylintervensjoner. Dermed har disse metodene verktøy for å studere ALS-modeller og enhver C. elegans belastning som viser endret bevegelighet.
Introduction
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en svekkende, aldringsrelatert nevrodegenerativ sykdom med en spesiell innvirkning på motoriske nevroner. Sykdommen har tap av motoriske nevroner i hjernen og ryggmargen og progressiv motorisk svekkelse. Dette resulterer i stor funksjonell funksjonshemming og for tidlig død, vanligvis innen 3-5 år etter diagnosen1. Mutasjoner i minst 38 gener kan forårsake ALS; Imidlertid akkumulerer de fleste pasienter med ALS allestedsnærværende inneslutninger av proteinet TDP-43 som deres primære patologi i nevroner og glialceller2,3,4. En rekke dyremodeller er utviklet for å studere de underliggende mekanismene som forårsaker eller bidrar til ALS in vivo (gjennomgått in5). I C. elegans inkluderer disse modellene genetiske tap-av-funksjon mutasjoner i homologer av ALS-forårsakende gener eller transgent uttrykk for menneskelige ALS-gener. Det er mange fordeler med å modellere ALS i C. elegans. C. elegans er et gjennomførbart enkelt dyr med et differensiert nervesystem, godt karakteriserte atferdsparadigmer og betydelig genetisk homologi til mennesker6,7. Mange verktøy eksisterer for å jobbe med C. elegans, inkludert robuste genomredigeringsevner, in vivo fluorescerende reportere av nevrodegenerasjon, RNAi screening paradigmer, tractable genetikk, og etablerte atferdsmessige og fenotypiske analyser. C. elegans modeller av ALS recapitulate aspekter av menneskelig sykdom, inkludert akkumulering av uoppløselig protein, nevrodegenerasjon, og tidlig død8,9. Videre er motorisk dysfunksjon med forstyrrelse av både krypende og svømmende oppførsel til stede i mange C. elegans ALS-modeller.
Denne protokollen beskriver to metoder for å karakterisere C. elegans motorfenotyper: radial bevegelsesanalyse for evaluering av kryping på en solid overflate og vurdering av svømming i væske (thrashing) ved hjelp av WormLab automatisert sporing og analyse. Disse sensitive metodene for karakterisering av motorunderskudd tillater sammenligninger av alvorlighetsgrad og tilbyr verktøy for måling av undertrykkelse og forbedringer av motoriske fenotyper. Den radiale bevegelsesanalysen kvantifiserer forskjeller i krypende bevegelighet (sinusformet bevegelse på en solid overflate) blant populasjoner av ormer. Denne analysen drar nytte av C. elegans naturlige ustimulerte leteatferd ved å plassere ormer på ett sted på en tallerken og markere deres endelige plassering etter en gitt periode10. Alternativt teller svømming i flytende (bankende) analyser kroppsbøyninger av individuelle ormer over en bestemt tidsperiode. Den manuelle tellingen av kroppsbøyninger av det menneskelige øye er tidkrevende og viser vanligvis betydelig variasjon mellom eksperimenter. Bruken av dataassistert automatisert sporing og analyse kan eliminere mye av denne variasjonen. I tillegg til karakteriseringen av baseline motorisk svekkelse av ALS-modeller, kan både radial bevegelse og svømmeanalyser oppdage modulering av distinkte lokomotoriske fenotyper fra genetiske eller små molekylintervensjoner. Disse metodene har verktøy for å studere ALS-modeller og enhver C. elegans belastning som viser endret bevegelighet.
Protocol
1. Radial bevegelsesanalyse
- Forbered 100 mm eller 150 mm diameter Petri retter omtrent halvfull av nematode vekstmedier (NGM) og frø med en jevn plen av OP50 bakterier for å dekke hele overflaten av agaren.
- Vend NGM-analyseplatene opp-ned og merk bunnen med en identifikator for C. elegans-stammene som skal analyses, 2 plater per stamme (figur 1A).
- Lag en liten prikk med markøren i midten av opp-ned-platen (figur 1A).
- Når du arbeider med et dissekeringsmikroskop, overfører du 15-20 iscenesatte matched11 ormer til midten av analyseplaten rett over senterpunktet (synlig gjennom NGM) ved hjelp av et platinatrådplukk (figur 1B).
MERK: Prøv å overføre alle ormene samtidig eller så raskt som mulig.- Still inn en timer i 30 min etter at ormer er plassert i midten av platen. Sett lokket tilbake på platen og sett det til side (figur 1C).
- Fortsett å overføre ormer til alle stammer er på de angitte analyseplatene, og noter omtrent hvor lang tid det tar å overføre mellom plater (sikt på ~ 1 min mellom platene). Hold alle platene i samme rekkefølge som de ble satt opp.
- Etter 30 min, begynn å score den første platen.
- Fjern lokket og plasser platen med forsiden ned under dissekeringsmikroskopet, slik at den merkede baksiden av platen vender opp, og NGM-agaren er mellom synslinjen og ormene. Platen vil være opp-ned fra normal bruk.
- Juster mikroskopfokuset til ormer er synlige gjennom agaren.
- Bruk en annen farget filtpenn fra midtpunktet, legg en liten prikk på plasseringen av hver orm - følg ormsporene gjennom bakteriell plen for å finne de mest distale dyrene.
- Kontroller kanten på platen, da noen ormer kan ende opp der. Du kan også telle og registrere antall ormer i midtpunktpunktet (figur 1D).
- Fortsett å merke alle analyseplater i rekkefølge, slik at alle plater har 30 min aktivitetstid, og vær forsiktig med å ta hensyn til tiden det tok å sette opp platen. Utfør deretter manuelle eller digitale målinger som beskrevet i trinn 1.8 eller 1.9.
- Utføre manuelle mål ved hjelp av en linjal.
- Bruk en linjal til å måle i mm, avstanden fra midtpunktet til de endelige stedsmarkeringene for hver orm og registrer avstanden. Merk det første poenget med en liten markeringslinje for å holde oversikt over fremdriften under scoring.
- Registrer lengdedata for hver prikk fortløpende ved å rotere platen med urviseren (figur 1E).
- Utfør digital måling ved hjelp av en skanner og ImageJ.
- Bruk en planskanner til å skanne baksiden av analyseplaten(e) ved siden av en linjal (tall som vender mot skanneoverflaten) (figur 2A).
- Åpne det skannede platebildet i ImageJ eller et lignende program.
MERK: ImageJ er en gratis Java-basert bildebehandlingsprogramvare som driftes av NIH. - Klikk på rettlinjeverktøyet , og tegn deretter en linje som forbinder 1 cm og 2 cm på det skannede bildet av linjalen (figur 2B).
MERK: Hvis du holder nede Skift-datatasten, tvinges linjen til nærmeste vinkel på 45°. - Gå til Analyser-menyen og bruk den til å angi skalaen (Analyser | Still inn skala) (figur 2C).
- Angi kjent avstand (10) og lengdeenheter (mm) i de aktuelle boksene, ikke juster avstanden i piksler tall. Merk av for Global for å bruke samme skala på alle bilder som analyseres i hver ImageJ-økt. Hvis ikke, angir du skalaen for hvert bilde ved åpning (figur 2D). Klikk OK.
MERK: Trinn 1.9.2-1.9.5 utføres for å stille inn måleskalaen. Målinger for dette bildet vil nå automatisk relatere lengden på linjer til det definerte bildepunkt: lengdeforholdet. Bilder som skannes med 300 ppt, har et omtrentlig forhold på 11,8 piksler per mm. - Bruk penselverktøyet til å markere like over det første punktet som skal scores.
MERK: Dette er en visuell indikator for den første ormen som scores. - Bruk rettlinjet verktøy til å tegne en linje fra midtpunktet til det første ormedatapunktet.
- Klikk M-tasten på tastaturet for å måle avstanden. Du kan også navigere til Analyser-menyen og velge Mål (analyser | mål). I begge tilfeller vises målingen i et nytt vindu. Dette vinduet samler inn alle mål per bilde.
- Hold midtpunktet konstant, flytt enden av linjen ved å berøre det første ormepunktet til neste ormepunkt, flytte med klokken og klikke M-tasten for å måle.
- Fortsett å måle hvert punkt med klokken til alle poengene er scoret.
-
Kopier og lim inn lengdemålingsdata i et regneark for å lagre dem. Gjenta deretter prosessen for hvert skannede platebilde.
MERK: Trinn 1.9.6 - 1.9.11 måler ormeforskyvningsverdiene (figur 2E-F).
- Utføre statistisk analyse.
- Kombiner replikeringer i ett enkelt eksperiment, slik at et totalt antall poengsummer er mellom 30 og 40 ormer.
- Utfør uavhengige eksperimentelle replikeringer på forskjellige dager og med uavhengige populasjoner av ormer for å ende opp med 3 uavhengige eksperimentelle repliker.
- Analyser data ved hjelp av passende statistiske analyser som Student t-test for 2 stammer eller 1-veis ANOVA for tre eller flere stammer.
2. Dataanalysert svømmeanalyse
MERK: Denne protokollen inneholder detaljerte instruksjoner for det kommersielt tilgjengelige WormLab-maskinvare- og programvaresystemet (se Materialfortegnelse). Arbeidsflyten kan imidlertid brukes på andre dataanalyserte svømmeanalysesystemer.
- Sette opp og spille inn videoer.
- Hev skjermingen på bildemaskinvaren (figur 3) og kontroller at kamerahøyden er satt til ønsket plassering.
MERK: Den optimale høyden for å fange ormer på en 35 mm plate er slik at den tredje fra den nederste gjengede skrueboringen er synlig under den justerbare kameramonteringsbraketten, men det er ikke sett noe ekstra monteringshull over skrueboringen (ca. 30,5 cm over scenen) (figur 3C). Dette vil resultere i et opptaksforhold på 11,43 μm/piksel. Vurder å legge til en "riktig høyde"-indikator slik at dette er lettere å bekrefte før du begynner analysen. Se protokolltrinn 2.18 for å ta høydejusteringer. - Åpne den tilknyttede programvaren (tilleggsfigur 1A).
- Klikk videoinnspillingsikonet (film med en trekant som peker mot høyre i midten) for å åpne et nytt videoopptaksvindu . Kameraet vil være i Live View, men displayet vil være svart (tilleggsfigur 1B).
- Trykk ned på dimmerknappen og vri den med klokken for å justere lyset.
MERK: Dimmerknappen er på scenen til bildesystemet i nærheten av den lyse feltlyskilden. Live view-visningen videoopptak blir fra svart til opplyst. - Tilbake i Videoopptak-vinduet klikker du på Innstillinger-fanen , juster som følger: Videomodus: 2456 x 2052_Mono8, Bildefrekvens: 14, Utgang: monokrom, Eksponering: 0,00300 s, Forsterkning: 1 dB , Gamma: 1, Roter 180 (sjekk på).
- Gå tilbake til Innspilling-fanen . Velg innspillingsmappen (tilleggsfigur 1B).
MERK: Det er her alle opptak og prosjektfiler vil bli lagret. Opprett unike mapper for individuelle eksperimenter for å holde orden på dataene. - Tilordne et filnavn ved å skrive det inn i tekstboksen Filprefiks .
MERK: Programvaren vil automatisk legge til et progressivt nummer på slutten av prefikset i formatet "0001". Det anbefales å ha et konsekvent navneskjema for filene, for eksempel : "YYYYMMDD_treatmentName_rep #_". - Angi andre opptaksinnstillinger på følgende måte: Buffer: 128 bilder (standard), Varighet (kontroll): 00 t:01min:00 s. Ignorer eller deaktiver andre innstillinger i denne kategorien.
- Plasser analyseplaten, lokket opp, på enhetsstadiet, og midtstill det på videoopptaksskjermen ; fjern lokket.
MERK: Forbered analyseplater på forhånd. Hver tallerken består av en 35 mm Petri-tallerken som er omtrent halvfull av usett (ingen bakteriell plen) NGM. - Bruk en mikropipette til å vaske scenen synkroniserte11 ormer i 1 ml M9 på analyseplaten - sikt på ca 50 ormer (figur 3D). Virvle platen forsiktig for å bringe dyrene til midten eller bruk en mikropipette for å legge til noen dråper M9 for å skille dyr (figur 3E). Still inn en timer på 60 s slik at ormer akklimatiseres til svømming.
MERK: Platen vil ikke være 100% synlig på skjermen. Dyr spores ikke nøyaktig mens de overlapper. - Mens tidtakeren teller ned, justerer du kamerafokuset manuelt ved å dreie fokuseringsringen på objektivets kropp på kameraet mens du ser på skjermen (figur 3F). Det er mulig å zoome inn på ormene ved hjelp av en rullehjulmus som gir mer presis fokusering.
- Når du har stilt inn fokus, justerer du lysknappen slik at skjermen er så lys som mulig uten overeksponering (vises som røde piksler på skjermen).
- Etter 60 s trykker du på Record-knappen .
MERK: Videoen går fra Live View til Opptak , og en tidtaker vil være synlig. Når opptaket er fullført, går videoopptaksvisningen tilbake til Live View (tilleggsfigur 1B). - Fjern platen etter opptak og sett opp neste plate. Gi prefikset nytt navn etter behov. Vask ormer i analyseplaten, inkuber i 60 s, og registrer hver behandling.
- Når du har fullført alle opptakene for et eksperiment, lukker du alle åpne videofaner og slår av lyskilden ved å trykke på dimmerknappen.
- Lukk Videoopptak-vinduet ved å klikke på den røde x-knappen øverst til høyre i vinduet. Alternativt kan du lukke hele programvarepakken og åpne den på nytt.
- Forbered videoer for sporing.
- Velg den første knappen på denne menyen, Importer bildesekvens, på menyen Arbeidsflytsidefelt, og finn og dobbeltklikk på en video. Videoen åpnes i det midterste vinduet (tilleggsfigur 2A).
MERK: Standardvisningen for programvaren er menyen for arbeidsflytsidepanelet . Denne menyen kan også nås via rullegardinmenyen se øverst under Vis [Vis | Arbeidsflyt]. Arbeidsflyt-menyen har flere visningsalternativer. Spor-visningen passer på dette tidspunktet i protokollen. Hvis knappen Angi sekvensinformasjon ikke vises i menyen, er ikke dette riktig visning. Se først på bunnen av menyen og kontroller at kategorien Arbeidsflyt er aktiv, og kontroller deretter at Spor-visningen er aktiv ved å klikke Spor-ikonet . Hvor menyer vises i vinduet, avhenger av skjermstørrelsen og plasseringen av andre åpne menyer. Menyer kan flyttes ved å dra og slippe, endre størrelse og lukke. De fleste menyene kan også åpnes via rullegardinmenyen Vis . - Velg Angi sekvensinformasjon på Arbeidsflyt-menyen (tilleggsfigur 2B). I det nye menyvinduet kontrollerer du navneoppsettet, legger til notater og validerer metadata.
- Kontroller at skaleringen er riktig innstilt. Skala: 11,43 μm/piksel og Mål fylles automatisk når 1000 μm er 87 piksler. Hvis kamerahøyden er justert på en annen måte enn det som er foreskrevet her, følger du instruksjonene i denne menyen for å oppdatere vekten. Klikk Lagre -knappen.
- Velg Juster bilde på Arbeidsflyt-menyen, og en ny hurtigmeny kalt Bildejusteringer åpnes (Tilleggsfigur 2C). Velg Mørke ormer på lys bakgrunn (lyst felt).
- Juster flere innstillinger. Anbefalte bildebehandlingsinnstillinger er som følger: Bakgrunnsutjevning: 10, gaussisk utjevning: 5, Fyll hull: 2, Filter for små objekter: 0, og hopp over integralderivatsegmentering.
- Juster terskelnivået slik at dyrene er helt fylt med grønt, men likevel forskjellig fra bakgrunnen. Klikk Bruk.
MERK: Det er tillatt å plukke opp noen gjenstander som ikke er ormer. - Velg Finn og spor på Arbeidsflyt-menyen (tilleggsfigur 2D).
MERK: En meny vises på siden av videoen med tre faner: Oppdage, Spore og reparere. Markøren vil se ut som en pekefinger når den er over videovisningen. Alternativt kan du klikke på Velg-ikonet (markørpilen) i ikonmenyen øverst til venstre i programvaren.- Bruk fingervelgerverktøyet til å velge 3-7 ormer og klikke Oppdag ormer i kategorien Gjenkjenning .
MERK: Dette valget hjelper programvaren med å identifisere ormer nøyaktig for gitte forhold og må gjøres for hver video. Etter noen sekunder vil de fleste ormene bli uthevet i grønt og ha et tall i gult. Ormer som berører eller er krøllet opp, vil sannsynligvis ikke bli uthevet; Programmet vil imidlertid mest sannsynlig finne dem under sporing. Det finnes et alternativ for å justere gjenkjenningsparameterne. Standardene fungerer imidlertid bra under de fleste forhold. Hvis det foretas justeringer i gjenkjenningsparameterne, må du passe på å være konsekvent mellom prøver og replikeringer.
- Bruk fingervelgerverktøyet til å velge 3-7 ormer og klikke Oppdag ormer i kategorien Gjenkjenning .
- I vinduet Finn og spor går du til kategorien Sporing (Tilleggsfigur 2E). Fjern merket for Spor ormer på kanten av bildet i Sporingsparametere-merket Bruk backtracking.
- Sett den makssporede hypotesen til 5. Sett sporingsmodus til Svømming.
MERK: Innstillingen Maks sporet hypotese justerer hvor mange potensielle ormspor en enkelt sporet orm har lov til å ha, og gir programmet litt spillerom i hvor nøyaktig man sporer en enkelt orm uten å miste oversikten over den. 5 er en god setting for svømming. - Flytt til delen Avanserte innstillinger , og angi følgende: Rammer ormer kan berøre grensen: 50, Rammer ormer kan overlappe: 500, Posisjonstoleranse: 0,50, Figurtoleranse: 0,50. Lagre disse innstillingene og distribuer dem for alle videoer i et eksperiment (og utover) ved å lagre dem som en konfigurasjon.
MERK: Sporfiltrering anbefales ikke og kan enkelt gjøres etter behandling, la det være. - Gå til Konfigurasjonsbehandling (tannhjulikon) øverst til venstre på ikonmenyen. Når du klikker på menyen i sidefeltet i Konfigurasjonsbehandling , åpnes menyen. Deretter klikker du på Lagre (gir +) -ikonet, gir denne konfigurasjonen et navn og en beskrivelse, og deretter klikker du på OK .
- Hvis du vil ha tilgang til denne konfigurasjonen i fremtiden, åpner du Konfigurasjon-menyen , velger ønsket konfigurasjon og klikker ikonet Last inn (gir opp) . Deretter legger du til sekvensinformasjon, finjusterer terskelnivået og velger ormer for gjenkjenning. Alle andre innstillinger vil være de samme.
- Klikk Lagre prosjekt på Arbeidsflyt-menyen, kontroller lagringsplasseringen og legg til et prosjektfilnavn (samsvarende prosjektfilnavnet med videonavnet hjelper med kontinuitet). Lukk videoen.
MERK: Disse prosjektene lagres med WPR-filtypen. - Gjenta for alle videoer: Importer bildesekvens (2.18), Last inn lagret konfigurasjon (2.28.1), juster terskelen (2.23), angi sekvensinformasjon (2.19), oppdag ormer (2.24.1), lagre prosjektet (2.29), lukk video.
- Spor videoer
- Hvis du vil spore prosjektfilene, går du til Arbeidsflyt-menyen og klikker ikonet Bunke (mappe som inneholder ormesider) (Tilleggsfigur 2F).
MERK: Batchbehandlingspanelet vises (tilleggsfigur 2G). Noen ganger er det skjult, men kan nås helt nederst på Batch Workflow-menyen ; Det kan hende at vinduet må utvides for å se det. - Klikk Legg til under Filvalg-delen på denne menyen for satsvis behandling . Naviger til og velg alle prosjektfilene (WPR) som skal behandles, klikk Åpne.
MERK: Menyen Gruppebehandling fylles ut med den valgte filbanen, en statusindikator og en grå fremdriftslinje for hver fil. - Klikk startknappen (spill av-knappikonet). Legg merke til den grønne fremdriftsindikatoren i den første filen. Tillat at alle filene behandles. Når alle filene er lest som ferdige (grønne), kan programvaren lukkes (Tilleggsfigur 2G).
- Hvis en prosjektfil blir sittende fast, bør du vurdere å kjøre den påhengte filen av seg selv, dette løser vanligvis problemet. Hvis dette ikke løser problemet, åpner du prosjektfilen, sletter de merkede ormene (Finn og spor-menyen ), og velger på nytt fra et nytt opplæringssett. Deretter behandler du prosjektfilen på nytt.
- Hvis du vil spore prosjektfilene, går du til Arbeidsflyt-menyen og klikker ikonet Bunke (mappe som inneholder ormesider) (Tilleggsfigur 2F).
- Reparere spor (anbefales)
MERK: Reparasjon av spor kan øke nøyaktigheten til sporene. Vanlige rettelser er å kombinere spor som tydelig tilhører samme orm som det menneskelige øyet ser på som, slette spor som ikke er nøyaktige eller ikke fange ekte ormedata, og dele spor som er feilrepresentert fordi ormer berører (fjern den dårlige delen og kombiner spor fra før og etter den dårlige delen hvis det er praktisk mulig).- Åpne programvaren og åpne en prosjektfil [Fil | Åpent prosjekt] av interesse. Klikk Åpne , og klikk Ja for å bruke denne filen. Vent til temporalfilteret lastes inn. Den behandlede videoen vil være på skjermen; ormer vil bli uthevet i grønt og skissert i gult. Bruk videospilleren til å skrubbe gjennom eller spille av videoen.
- Velg Finn og spor på Arbeidsflyt-menyen (tilleggsfigur 2D). Bytt til kategorien Reparer . Aktiver velgermarkøren ved å klikke på velgerverktøyikonet (markørpil). Skrubb gjennom videoen, finn og velg et ormespor, og bruk deretter reparasjonsmenyen til å opprette ønsket endring.
MERK: For å løse de fleste problemer strategisk raskt, zoom inn slik at omtrent 1/6 av platen er synlig, start med området rundt spor #1. Skrubb raskt gjennom videokontrollen etter ormer som på mystisk vis vises ut av ingensteds, spor der tallene endres, eller ormer som støter på hverandre, redigering etter hvert som problemer oppstår. Følg ormer i numerisk rekkefølge fra startposisjonen. Skrubb frem og tilbake for å følge hver orm etter behov til hele platen er reparert. Vær forsiktig med kantene på platen; Ofte vises falske ormer i skyggene av platekanter.
- Dataanalyse
- Velg Analyser data på Arbeidsflyt-menyen (tilleggsfigur 3A).
MERK: Et nytt vindu med navnet Dataanalyse og plotting vises (Tilleggsfigur 3B). I dette vinduet kan du vurdere og vise bevegelsesdataene for ormepopulasjonen i en bestemt prosjektfil på mange måter. De fleste av disse analysene gjør det mulig å velge bestemte, flere eller alle ormer fra en gitt video, slik at sporinformasjon kan plottes på forskjellige måter. - Hvis du vil analysere svingantall, navigerer du til Spor sammendrag [Posisjons- og hastighets- | Sporsammendrag] (tilleggsfigur 3C). Bruk Eksporter-knappen nederst til høyre til å eksportere data i et lesbart regnearkformat (.csv), velg en bane til ønsket plassering av regnearket, inkludert å gi det nytt navn til noe minneverdig. Standardinnstillingene er et godt valg (tilleggsfigur 3D).
- Lim inn disse dataene, i tillegg til andre relevante prosjektdatasett i en konsolidert regnearkarbeidsbok (Tilleggs figur 3E).
- Bruk Svingantall og Spor varighet til å beregne svinger per min for hvert spor i ved hjelp av regnearkfunksjoner (=svinger/sporvarighet * 60), eller bruk en annen beregning etter ønske (tilleggsfigur 3F).
MERK: Svinger per minutt fanger opp veldig lik informasjon som en manuell bankende analyse som er en mye brukt beregning av aktivitet i væske, men det er mange alternativer, og det er ganske mulig at en annen beregning kan identifisere andre interessante data for en gitt behandling eller sammenligning. - Hvis du vil, kan du skjerm for ormestørrelse, sporvarighet og/eller andre valgte metrikkverdidata ved hjelp av betingede formateringsverktøy for å utheve spor for fjerning hvis de potensielt er forvirrende. Opprettholde konsistent databehandling mellom behandlinger og replikeringer.
- Analyser data ved hjelp av passende statistiske analyser som Student t-test for 2 stammer, eller 1-veis ANOVA for 3 eller flere stammer. Utfør uavhengige eksperimentelle replikeringer på forskjellige dager og med uavhengige populasjoner av ormer for minst 3 uavhengige eksperimentelle repliker.
- Velg Analyser data på Arbeidsflyt-menyen (tilleggsfigur 3A).
Representative Results
Både radial bevegelse og svømmeanalyser gir sensitiv påvisning av bevegelighetshemming (figur 4 og figur 5). For å undersøke mekanismene som ligger til grunn for patologisk TDP-43 i ALS, er det utviklet C. elegans-modeller som uttrykker villtype eller ALS-mutant menneskelig TDP-43 pan-neuronally. Disse dyrene viser molekylære og cellulære egenskaper som minner om ALS, inkludert motorisk dysfunksjon9. Viktigst, de viser moderat bevegelighet svekkelse med uttrykk for vill type menneskelig TDP-43 og mer alvorlig bevegelighet svekkelse hos dyr som uttrykker ALS-mutant TDP-43 ved hjelp av både radial bevegelse og svømming analyser. Noen mutante eller transgene dyr vil ha større svekkelse i kryping enn svømming, eller omvendt. Ved å bruke to forskjellige motilitetsanalyser oppnås et klarere bilde av fenotypiske forskjeller mellom stammer.
Sirkulær bevegelse
Når de plasseres på en frø agar tallerken, C. elegans utforske sine omgivelser, inkludert oppsøke grensene for deres matkilde. Radiale bevegelsesanalyser er en måte å dra nytte av den oppførselen som en beregning for fysisk form. Ved å analysere lokomotorisk oppførsel (krypende på en solid overflate) på en kontrollert og kvantifiserbar måte, tilbyr radial lokomotorisk analyse et enkelt og effektivt verktøy for å vurdere alvorlighetsgraden av motorunderskudd og andre motorrelaterte fenotyper. Radiale bevegelsesanalyser fanger opp forskjeller i bevegelighet i moderat eller alvorlig svekkede ALS-modellormer og tilbyr en basislinje for å sammenligne modulering av motilitetsfenotyper eller endringer i bevegelighet med alderen (figur 6). Denne strategien kan brukes til å kvantifisere krypende oppførsel av enhver belastning som har endret bevegelse fra vill type (N2) eller kontroll ormer. Denne metoden er imidlertid kanskje ikke et godt valg for å vurdere dyr som ikke klarer å krype normalt, for eksempel rullemutanter eller dyr som er lammet. Vanligvis vil wild-type ormer presentere en gjennomsnittlig forskyvning mellom 200-300 μm / min når de heves og testes ved 20 °C. Eksempeldataene som presenteres i figur 4 , viser forventede resultater som sammenligner N2, to forskjellige transgene stammer som uttrykker villtype menneskelig TDP-43 med en mild fenotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller sterkere fenotype [TDP-43(WT-moderat), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], en transgen stamme som uttrykker mutant menneskelig TDP-43 med en alvorlig fenotype [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), og en transgen stamme som uttrykker en annen nevrodegenerativ sykdom assosiert protein, vill type menneskelig tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De to stammene som uttrykker villtype TDP-43 har forskjellige grader av svekkelse som påvist ved radial bevegelse. TDP-43 (WT-low) er ikke signifikant forskjellig fra N2, mens TDP-43 (WT-høy) viser klare forskjeller i bevegelighet. TDP-43(M337V) og tau (WT) stammer har mer alvorlige svekkelser i motilitet.
Svømmeanalyse
C. elegans engasjerer seg i stereotypisk svømming (thrashing) bevegelse når de er nedsenket i væske. Umiddelbart ved nedsenking begynner ormer å karakteristisk bøye hodet og halen mot hverandre med en bøyevinkel på ca. 45°, med vinkeltoppunktet som midtpunktet til ormen. Ormer veksler bøyning i ventrale og dorsale retninger. En thrash, målt ved programvaren, representerer bevegelsen av å gå fra rett til en kroppsbøyevinkel på 20 ° eller større, uavhengig av retning (vinkelterskel kan justeres etter behandling i analyse- og plottingsvinduet [Arbeidsflyt | Analysere data | Kroppsform | Bøyevinkel | Midtpunkt | AmplitudeTerskel: # grader]. Svømmeanalysen som er beskrevet her, bruker automatisert databasert sporing og analyse for å gi objektiv scoring av svømmeaktivitet. Det forventes at wild-type (N2) ormer i gjennomsnitt vil være mellom 150-200 thrashes per min når de heves og registreres ved 20 °C. Eksempeldataene som presenteres i figur 5, viser forventede resultater som sammenligner N2, to forskjellige transgene stammer som uttrykker villtype menneskelig TDP-43 med en mild fenotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller sterkere fenotype [TDP-43(WT-moderat), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], og en transgen stamme som uttrykker en annen nevrodegenerativ sykdom assosiert protein, vill type menneskelig tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Den transgene stammen som uttrykker ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] banker ikke i væske, og det er derfor betegnet på grafen som ND (ingen data). Denne analysen kan diskriminere forskjellige fenotyper enn den radiale bevegelsesanalysen vist i figur 4. I den radiale bevegelsesanalysen (figur 4) var for eksempel TDP-43(WT-low) ikke signifikant forskjellig fra N2. I svømmeanalysen (figur 5) er imidlertid både TDP-43(WT-low) og TDP-43(WT-high) signifikant forskjellig fra N2, samt vesentlig forskjellig fra hverandre. Til tross for at både TDP-43(M337V) og tau(WT) har alvorlige gjennomsøkingshemminger ved radial bevegelse (figur 4), er det bare tau(WT) som kan banke nok til å spores av programvaren (figur 5). TDP-43(M337V) dyr er ikke i stand til å banke, og programvarebasert analyse oppdager eller sporer ikke disse ormene nøyaktig. Dermed ble data om disse ormene ikke samlet inn (ND, ingen data).
Figur 1: Arbeidsflyt for stråleoppgraderingsanalyse. Paneler A-E viser de generaliserte trinnene i radial bevegelsesanalyse. Trinnene er som følger: (A) NGM-plater, med OP50 frø til kantene, fremstilles ved å merke og markere sentrale prikker, (B) ormer plasseres i midten av agaren som er merket med den sentrale prikken, (C) ormer kan bevege seg fritt i en bestemt tidsperiode, (D) platen vendes nedenfra og den endelige plasseringen av hver orm er merket i en annen farge enn den sentrale prikken, (E) Avstanden fra midtpunktet til hver endelige ormplassering målt enten for hånd eller digitalt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Digital måling av endelig plassering ved hjelp av ImageJ. Avstand fra sentermålinger kan måles for hånd eller digitalt, for å måle digitalt ved hjelp av ImageJ (A) skanne baksiden av platen med en linjal i rammen. (B) Tegn en kjent lengde ved hjelp av linjeverktøyet. (C) Bruk den kjente lengden som er trukket inn (B) for å angi skala [Analyser | Angi skala...]. (D) Bruk linjeverktøyet til å tegne en linje fra midtpunktet til et endelig stedsmerke, gjenta for hvert merke. (E) En pensellinje som markerer det første merket målte hjelpemidler i skåring (bølgete svart linje nær 1-merket). Endelige plasseringsmerker nummereres i gult for å illustrere retningen på poengsummen. (F) Målinger registreres i Resultat-vinduet. Lagre resultater andre steder for statistisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Material- og maskinvarejusteringer for bruk av programvaren. (A) Materialer som brukes til den programvareassisterte svømmeanalysen. (B) Generelt oppsett av programvaren og nødvendige materialer, vær oppmerksom på at huset er i hevet posisjon. (C) Høyden på linsemonteringsbraketten kan justeres. Dette bildet viser det justerbare sporet og en båndindikator som markerer den foretrukne høyden for å utføre svømmeanalyser. Det er nødvendig å justere brightfield-lyset og kamerafokuset før opptak. (D) En 35 mm analyseplate er plassert på scenen, dyr i M9 legges til platen, og en 1 min timer startes. (E) Det er noen ganger fordelaktig å forsiktig virvle platen for å flytte ormer nærmere midten - observere plassering på live fangstskjermen; Alternativt kan noen dråper M9 fra en pipettor brukes til å skille ormer. (F) Juster fokusringen på kameralinsen, følg ormene på skjermen for å bestemme optimal fokus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Radiale bevegelsesanalyser oppdager forskjeller i gjennomsøkingshastighet. Ustimulert spredning av utviklingsoppredede L4 larver ble målt ved hjelp av radial bevegelsesanalyse beskrevet ovenfor og grafert som μm / min reist (A-B). De samme dataene som er tegnet inn i (A) og (B), demonstrerer to forskjellige mulige grafiske presentasjoner. I (A) vises data som en stolpediagram, noe som gjør relative forskjeller mellom stammer tydeligere. I (B) lagres den endelige forskyvningen av hver orm i grafen, slik at variasjonen i populasjonen kan visualiseres bedre. For å evaluere signifikans blant belastninger som ble testet, ble enveisanalyse av varians (ANOVA) med Tukeys multisammenligningstest brukt. **p=0,0022, ****p<0,0001, ns=ikke signifikant. TDP-43(M337V) og tau(WT) er også vesentlig forskjellig fra N2, p<0.0001. Feilfelt i (A) er standardfeil av gjennomsnittet (SEM) og i (B) er standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Svømmeanalyser oppdager forskjeller i banking i væske. Svømmehastigheter (thrashing eller undulation frekvens i væske) ble målt ved hjelp av objektiv dataassistert scoring og analyse beskrevet ovenfor og grafert som thrashes / min (A-B). Samme data tegnet inn (A) og (B). I (A) vises data som en stolpediagram, noe som gjør det enklere å se relative forskjeller mellom stammer. I (B) tegnes data fra hver enkelt orm i diagrammet, slik at variasjonen i populasjonen kan visualiseres bedre. For å evaluere signifikans blant tester av stammer ble det brukt en enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) med Tukeys multisammenligningstest. p<0.0001, ns=ikke signifikant. TDP-43 (WT-moderat) og tau(WT) er også vesentlig forskjellig fra N2, p<0.0001.Feilfelt i (A) er standardfeil av gjennomsnittet (SEM) og i (B) er standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Mutant TDP-43-ormer reiser mindre enn wild-type ormer. Plater som viser en representativ forskjell i den endelige plasseringen av iscenesatt L4 N2 (wild-type) og TDP-43(M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), en stamme som uttrykker mutant menneskelig TDP-43 med alvorlig nedsatt motorisk funksjon etter 1 time med ustimulert kryping ved romtemperatur. Plater er merket med en rød prikk for midtpunktet og blå prikker for dyrets endelige plassering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Registrere svømmeatferd ved hjelp av bilde- og sporingsprogramvaren. (A) Sporingsarbeidsflyten og plasseringen av videoopptaksikonet. (B) Video Capture-vinduet vises i Live View, og de viktigste aspektene er uthevet. De grønne "Live view" ordene endres til en rød "Opptak" når opptaksknappen er aktivert. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Klargjøring og sporing av svømmeatferd. Denne figuren viser en rekke skjermbilder for å hjelpe deg med å sette opp en videobildesekvens for sporing. Den generelle protokollen for å klargjøre en videosekvens er å åpne hver arbeidsflytmeny i denne rekkefølgen: Importer bildesekvens | Angi | for sekvensinformasjon Juster bilde | Oppdage og spore | Lagre prosjekt. Vinduet Analyser data kan bare brukes etter at en prosjektfil er sporet. (A) viser en åpnet .avi (videofil) etter at du har importert sekvensen til programvaren fra Spor-arbeidsflyten . (B) Vinduet Angi sekvensinformasjon gir deg et sted for notater, angir/endrer skalaen og kontrollerer metadataene for en videosekvens. Instruksjoner for endring av vekten finnes i dette vinduet og bør følges når kameraet senkes eller heves (B). Bilde (C) viser innstillingene for Juster bilde-vinduet . (D) Skjermbilde som viser gjenkjenningsfanen i Finn og spor-vinduet . Detektering av ormer brukes til å lære opp programvaren og må angis for hver videosekvens. Flere gjenkjenningsparametere kan angis her hvis ønskelig. (E) Skjermbilde av Kategorien Sporing i vinduet Finn og spor med de anbefalte innstillingene for å spore svømmeatferd. Dette er det siste trinnet når du skal konfigurere en videosekvens. Lagre sekvensen som et prosjekt ved hjelp av Vinduet Lagre prosjekt . Gjenta disse trinnene for hver videosekvens. Innstillinger kan lagres som en konfigurasjon for å redusere arbeidsmengden og sikre at alle sekvenser behandles likt (vises ikke). Hvis du vil spore prosjektfiler for analyse, navigerer du til den satsvise arbeidsflyten. (F) viser ikonet som brukes til å navigere til den satsvise arbeidsflyten, og (G) viser vinduet for satsvis behandling, uthever legg til- og startknappene og viser det forventede utseendet til en prosjektfil som er sporet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Analyse av svømmeatferd. Når en prosjektfil er sporet, kan den åpnes ved hjelp av [Fil | Åpne Prosjekt]. Ormer vises i grønt som vist i (A). Skrubbing gjennom videoen gir en rask sjekk av at videoen som behandles som forventet, grønn utheving vil forsvinne mens du skrubber. Vinduet Dataanalyse og plotting åpnes fra arbeidsflytelementet Analyser data . (B) viser vinduet Dataanalyse og plotting med posisjonsvisning åpnet (standard), alle sporene er uthevet. Under datapunktene er det et tegn som viser det registrerte sporet for hver uthevede orm. Analysen av sporsammendrag brukes til å beregne svinger per minutt. (C-D) viser rapporten for sporsammendrag og eksporterer detaljer. (E-F) viser sporsammendraget i et regneark og hvordan du beregner svinger per minutt, utdataene målt i denne analysen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Sirkulær bevegelse:
Oppløsningen av denne analysen styres enkelt ved å endre tidsvariabelen. Å øke tiden gjør det lettere å observere forskjeller mellom dyr med alvorlige fenotyper, og dermed identifisere subtile forskjeller. Men fordi denne analysen måler forskyvning, hvis analysetiden forlenges for lenge, vil dyr med normal bevegelighet, som N2, reise til kantene på platen, og foraging oppførsel vil føre til backtracking. Dette vil kunstig redusere målingen av tilbakelagt distanse. Tidsperioder som er for lange, kan føre til at forskjeller mellom stammer forsvinner, spesielt mellom dyr med mindre alvorlige motoriske fenotyper, da dyr blir jevnt spredt over platen. Forkorting av tidsvariabelen vil forhindre at mer aktive ormer finner kantene på platen. Denne metoden sporer ikke den totale tilbakelagte avstanden for hver orm, men komprimerer tilbakelagt distanse for hver orm i en lineær avstand fra midten av platen. Som sådan er det iboende mindre robust enn en metode som registrerer den totale sporlengden på individuelle ormer. Imidlertid krever radial bevegelsesanalyse svært lite forskeropplæring, bruker relativt rimelige reagenser som vanligvis er tilgjengelige i de fleste ormelaboratorier, og er følsom nok til å produsere betydelige og reproduserbare resultater. For laboratorier som foretrekker automatisert videosporing, er det tidligere etablert flere metoder for å spore og analysere gjennomsøkingsbevegelser12, eller programvareparametrene som brukes til svømmeanalysen i dette dokumentet, kan endres for å tillate krypedeteksjon og analyse.
Dette eksperimentet gjøres vanligvis i triplikate uavhengige repliker, med et sett med 30-40 ormer per replikering. Hver replikering er delt på to forskjellige 100 mm eller 150 mm plater, med 15-20 ormer per plate. Å bruke flere ormer enn anbefalt per plate kan gjøre det vanskelig å score effektivt. Et totalt antall skår på 90+ er tilstrekkelig drevet til å etablere betydning for mild, moderat eller alvorlig motilitetshemming. Å være i samsvar med timing mellom belastninger scoret er avgjørende for nøyaktighet og reproduserbarhet. 30 minutter er generelt lang nok til å etablere forskjeller mellom moderate til alvorlige fenotyper som transgene stammer som uttrykker human mutant TDP-43 sammenlignet med wild-type ormer (figur 4). Hvis tidsvariabelen forlenges, anbefales det også å øke størrelsen på platen fra 100 mm til 150 mm. Miljøfaktorer som temperatur og fuktighet kan påvirke denne analysen, som vanligvis utføres ved omgivelsestemperatur, så det er viktig å alltid bruke en wild-type (N2) kontroll når du sammenligner på tvers av repliker. I tillegg kan denne analysen måle motiliteten til noen stammer som ikke viser normal svømmeadferd i væske (thrashing), noe som gjør det til et nyttig supplement til svømmeanalysen.
Svømmeanalyse:
Bruken av bilde- og oppkjøpssystemet for å automatisere sporing og analyse av ormsvømming gir mulighet for strenge og objektive data. Det er imidlertid flere faktorer under det første oppsettet av eksperimentet som må kontrolleres mellom prøver. Disse inkluderer tiden for å akklimatisere seg til væske før du begynner å registrere, omgivelsesforhold (dvs. temperatur, fuktighet) og konsekvente lys- og opptaksinnstillinger. På innspillingsstadiet er det flere funksjoner som bidrar til å redusere variasjon mellom plater. Disse inkluderer et integrert spormontert kamera og lysfeltstadium som gjør innspilling av video konsistent mellom plater, skjerming rundt scenen som forhindrer refleksjoner, gjenskinn og luftbevegelser mens du tar opp, og en robust programvarepakke som pålitelig oppdager ormer og muliggjør manuell korreksjon av spor i video etterbehandling. I denne protokollen blir videoer av en 35 mm plate med ormer spilt inn i 1 minutt og deretter behandlet ved hjelp av programvarepakken. Etter behandling sikrer manuell korrigering av spor at ormeatferd registreres nøyaktig uten å forvirre sporingsfeil. Svingantall og sporvarighetsdata brukes til å bestemme svinger per minutt som en endelig avlesning. For å sikre reproduserbarhet samles data over minst 3 uavhengige replikeringsforsøk, hver med 40-50 dyr scoret, for å oppnå et kombinert sluttnummer på dyr 120-150. Dette tallet er tilstrekkelig til å diskriminere små forskjeller i svømmeadferd fra kontrollormer. Noen ormer har motoriske underskudd som er for alvorlige til å bli fanget opp av svømmeanalyser. For eksempel, hvis dyrene plassert i en flytende middels krølle i stedet for å utføre den forventede bankende responsen, vil denne analysen ikke registrere disse bevegelsene nøyaktig, og en annen bevegelsesanalyse, for eksempel radial bevegelse, kan bedre fange opp disse motilitetsfeilene. Den medfølgende protokollen bruker et kommersielt tilgjengelig bildebehandlingssystem (se Tabell over materialer for mer informasjon), men andre ormsporingssystemer kan gi et lignende verktøy, der noen er åpen kildekode12. Tidligere publiserte metoder beskriver manuell scoring av orm thrashing13. Mens den automatiserte analysen produserer en rekke beregninger for hver enkelt orm, gir deteksjon av kroppsbøyninger som måles i thrashes per minutt, konsistente resultater mellom eksperimenter og spor godt med konvensjonell scoring av orm thrashes for øye.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen avsløringer.
Acknowledgments
Vi takker anmelderne for nyttige kommentarer og forslag. Vi takker Aleen Saxton, Brandon Henderson og Jade Stair for fremragende teknisk assistanse. Vi takker Brian Kraemer og Rebecca Kow for hjelp til å utvikle disse analysene. Dette materialet er et resultat av arbeid som støttes med ressurser og bruk av fasiliteter ved VA Puget Sound Health Care System. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra USA (USA) Institutt for veteransaker (VA) Biomedisinsk laboratorieforsknings- og utviklingstjeneste [Merit Review Grant #I01BX004044 til N.F.L.]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | - | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
| Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
| Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
| Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
| Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
| Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
| Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
| Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
| ImageJ | NIH | - | Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/ |
| M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
| p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
| p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
| Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
| WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |
References
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N.
- Arai, T., et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Mejzini, R., et al. ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now. Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).
- Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. ALS/FTLD: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).
- Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).
- Robatzek, M., Thomas, J. H. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network. Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M. WormBook. Hart, A. C. , 1551 (2006).
