Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Etablering af et blæksprutteøkosystem til biomedicinsk og bioengineeringsforskning

Published: September 22, 2021 doi: 10.3791/62705
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Neuroengineering division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 3Biomedical Imaging division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 4Department of Radiology, Michigan State University

Summary

Forståelse af blæksprutternes unikke fysiologiske og anatomiske strukturer kan i høj grad påvirke biomedicinsk forskning. Denne vejledning viser, hvordan man opretter og vedligeholder et havmiljø for at imødekomme denne art og omfatter state-of-the-art billeddannelse og analytiske tilgange til at visualisere blækspruttens nervesystemet anatomi og funktion.

Abstract

Mange udviklinger inden for biomedicinsk forskning er blevet inspireret af at opdage anatomiske og cellulære mekanismer, der understøtter specifikke funktioner i forskellige arter. Blæksprutten er et af disse ekstraordinære dyr, der har givet forskerne ny indsigt i områderne neurovidenskab, robotteknologi, regenerativ medicin og proteser. Forskning med denne art af blæksprutter kræver oprettelsen af komplekse faciliteter og intensiv pleje til både blæksprutte og dens økosystem, der er afgørende for projektets succes. Dette system kræver flere mekaniske og biologiske filtreringssystemer for at skabe et sikkert og rent miljø for dyret. Sammen med styresystemet kræves specialiseret rutinemæssig vedligeholdelse og rengøring for effektivt at holde anlægget i drift på lang sigt. Det anbefales at give disse intelligente dyr et beriget miljø ved at ændre tankens landskab, inkorporere en række byttedyr og introducere udfordrende opgaver, som de kan arbejde igennem. Vores resultater omfatter MR og en helkrops autofluorescence imaging samt adfærdsmæssige undersøgelser for bedre at forstå deres nervesystem. Blæksprutter besidder unik fysiologi, der kan påvirke mange områder af biomedicinsk forskning. At give dem et bæredygtigt økosystem er det første afgørende skridt i afdækningen af deres forskellige evner.

Introduction

Nye koncepter inden for biomedicinsk forskning og biomedicinsk teknik er ofte inspireret af at identificere specifikke strategier, som biologiske arter besidder til at tackle miljømæssige og fysiologiske forhold og udfordringer. For eksempel har forståelse af fluorescensegenskaberne i ildfluer ført til udvikling af nye fluorescerende sensorer, der kan rapportere cellulær aktivitet i andre modelorganismer1; identifikation af ionkanaler, der aktiveres af lys i alger, har ført til udvikling af cellulære og tidsmæssige specifikke lysbaserede neuromodulationer2,3,4,5; opdage proteiner i glas havkat, der navigerer i henhold til Jordens magnetfelt har ført til udviklingen af magnetisk-baseret-neuromodulation6,7,8,9,10,11; forståelse af sifonrefleksen i Aplysia har været medvirkende til at forstå det cellulære grundlag for adfærd12,13,14.

Forskere fortsætter med at udvide den nuværende bioengineering og fylogenetiske værktøjskasse ved at drage fordel af de unikke styrker og nye perspektiver på fysiologiske funktioner, som ikke-konventionelle laboratoriearter holder. Føderale agenturer er begyndt at støtte disse linjer af undersøgelser ved at finansiere nyt arbejde udført på forskellige arter.

En slægt af dyr med unikke anatomi og regenerering kapaciteter samt den adaptive kontrol af hver af sine arme, fascinerende biologer og ingeniører, og fængslende publikum fra alle dele af samfundet er Octopus17. Faktisk er mange aspekter af blækspruttens fysiologi og adfærd blevet undersøgt i løbet af de sidste årtier15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Men den seneste udvikling inden for molekylær og evolutionær biologi, robotteknologi, bevægelsesoptagelse, billeddannelse, maskinlæring og elektrofysiologi fremskynder opdagelser relateret til blækspruttefysiologi og adfærd og oversætter dem til innovative bioengineeringsstrategier27,28,29,30,31,32,33,34,35 36,37,38,39.

Her beskriver vi, hvordan man opretter og vedligeholder blækspruttehold, hvilket ville være af interesse og relevans for forskere og ingeniører fra forskellige baggrunde, videnskabelige interesser og mål. Ikke desto mindre fokuserer vores resultater på anvendelsen af blæksprutter i neurovidenskab og neuroengineeringsforskning. Blæksprutten har et højt udviklet nervesystem med 45 millioner neuroner i den centrale hjerne, 180 millioner neuroner i de optiske lapper og yderligere 350 millioner neuroner i de otte aksiale ledninger og perifere ganglier; til sammenligning har en hund et lignende antal neuroner og en kat kun halvdelen af det40. I modsætning til hvirveldyrnervesystemet er der kun 32K-efferent og 140K-afferentfibre, der forbinder de millioner af neuroner i blækspruttens hjerne med de millioner af neuroner i hver af deres arms aksiale ledninger40,41,42. Disse relativt få sammenkoblede fibre tyder på, at de fleste af detaljerne for udførelsen af motorprogrammerne udføres i selve den aksiale ledning, der understreger den unikt distribuerede neuronale kontrol, som blæksprutterne besidder. Blækspruttens arme har ekstraordinær finmotorisk kontrol, der gør det muligt for dem manipulationsevner som åbning af krukkelåg, selv når de er inde i beholderen. Denne højt udviklede prehensile motor kapacitet er unik for klassen af Blæksprutter (blæksprutte, blæksprutte og blæksprutte)43.

Gennem hundreder af millioner af års evolution har blæksprutten udviklet et bemærkelsesværdigt og sofistikeret genom og fysiologisk system43,44, der har inspireret til ny udvikling og fremskridt på tværs af videnskabelige og tekniske områder. For eksempel kan et vandafvisende klæbeplaster baseret på blækspruttens suckers anatomiske struktur holde sig til våde og tørre overflader45; et syntetisk camoufleringsmateriale inspireret af blækspruttens camouflagehud kan forvandle en flad 2D-overflade til en tredimensionel med bump og gruber46. Miniature bløde og autonome robotter (dvs. Octobots), der i fremtiden kunne tjene som kirurgiske værktøjer inde i kroppen47; og en arm (dvs. OctoArm) fastgjort til en tank-lignende robot48 er også blevet udviklet. Mange arter af blæksprutter anvendes i biomedicinsk forskning, f.eks Octopus vulgaris, Octopus sinensis, Octopus variabilis og Octopus bimaculoides (O. bimaculoides); O. vulgaris og O. bimaculoides er de mest almindelige34,49,50. Den nylige sekventering af forskellige blækspruttegenomer gør denne slægt af særlig interesse og åbner nye grænser inden for blæksprutteforskning34,43,51,52.

O. bimaculoides, der anvendes i vores set-up er en mellemstor art af blæksprutte, først opdaget i 1949, der kan findes i lavt vand ud for det nordøstlige Stillehav kyst fra det centrale Californien til den sydlige del af Baja California halvø17. Det kan genkendes af de falske øjnepotter på sin kappe under øjnene. Sammenlignet med Giant Pacific Octopus (Enteroctopus dofleini) og Common Octopus (O. vulgaris), er California Two-Spot Octopus (O. bimaculoides) relativt lille i størrelse, der starter mindre end et par centimeter og vokser hurtigt som ung. Når den hæves inden for et laboratorium, kan den voksne kappestørrelse vokse til en gennemsnitlig størrelse på 100 cm og veje op til 800 g53,54. Blæksprutter har en hurtig vækstperiode inden for deres første 200 dage; på det tidspunkt betragtes de som voksne og fortsætter med at vokse resten af deres liv55,56,57. Blæksprutter kan være kannibalistiske, især når begge køn er anbragt sammen i en tank; derfor skal de huses individuelt i separate tanke58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Michigan State University.

1. Octopus tank udstyr set-up

  1. For det første skal du få alle ikke-biologiske materialer til et akvarium, der vil blive indarbejdet i det marine miljøsystem, som vist i materialetabellen. Størrelser leveres i tommer.
  2. Vask alle slanger, rør og filter systemdele med 70% ethanol og deioniseret (DI) vand forud for installationen. Brug ikke sæbe eller andre kemikalier ved rengøring.
  3. Placer et glasfiberbord 13 tommer x 49 tommer x 1/2 tommer (del # 71) med fire bordben lavet af kulfiber og med dimensionerne på 2 tommer x 2 tommer x 23 tommer (del # 72). Fastgør benene direkte under hjørnerne af bordpladen.
  4. Under den øverste overflade, mellem hver af bordet ben, placere 2 tommer x 2 tommer lang (del # 72) kulfiber stabilisering seler fastgjort til undersiden af bordet og direkte mod kanten af den øverste hylde. Fastgør med skruer en anden hylde med de samme dimensioner direkte på jorden under bordet. Lad pumpen (se Materialebord) sidde direkte på den nederste hylde overflade, mens tanken sidder på den øverste overflade. Dette system er vist i figur 1.
    BEMÆRK: Vandudgangen fra tanken er tyngdekraften fodret, og alle slanger, undtagen dem, der fodrer ind og ud af tanken, skal være lavere end bunden af tanken for at sikre maksimalt drænhovedtryk.

Figure 1
Figur 1: Opsætning af blækspruttetanke. Vandindtag og udløb (a). Tre blækspruttetanke hver med et areal på 1,22 m x 0,3 m (b). Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Bor et enkelt 13/4 tommer hul, 2 tommer fra en af siderne af tanken, ved hjælp af glasskæring bor. Bunden af vandudgangssugningsskærmen bestemmer højden af udgangshullet som vist på højre side af figur 2a. Vandstanden bestemmes af sugeskærmen og skal være mindst 6 tommer fra toppen af tanken, hvilket giver mulighed for en vandsprøjtzone.
  2. Brug en PVC primer og cement til permanent at forbinde sektionerne. For at gøre dette skal du først skubbe slutningen af det tilsigtede mandlige PVC-rør ind i enden af det kvindelige rør. Placer et stykke malertape på ydersiden af den mandlige del, der stadig er synlig for at forhindre primeren og cementen i at vise på ydersiden af røret. Adskil delene efter tape og læg et let lag primer på ydersiden af hanrøret efter anvendelsen af cementen i samme område.
  3. Sæt det mandlige rør i det kvindelige rør så hurtigt som muligt efter påføring af cement og fjern båndet. 24 timer efter påføring af primeren og cementen skal nytilsluttede dele vaskes ud med DI-vand. For hærdning tid se på cement produkt for yderligere retninger.
    BEMÆRK: Sørg for, at opsætningen af alt slanger og udstyr er placeret korrekt, før PVC-primer og cement skal udføres. kravene til rørlængden kan variere.
  4. Derefter skal du permanent forbinde 1 tommer ydre diameter (OD) ende af sugeskærmen til 1 tommer indre diameter (ID) ende af albueleddet. Tilslut enden af albueleddet til lige PVC slange (1 tommer OD). Tilslut den anden side af den lige slange derefter til 1 tommer ID af gennem væggen lige adapter kvindelige sokkel forbinde.
    BEMÆRK: ID refererer til den bredeste afstand mellem indersiden af røret. OD refererer til ydersiden af slangebredden.
  5. Tilslut permanent den lige adapter gennem væggen til et lige 4 tommer langt PVC-rør med en 1 tommer OD (fra trin 1.8). Dette rør vil vende ud af tanken.
  6. Tilslut permanent det lige rør til midten af PVC-stikket (1 tommer ID Tee formet; fra trin 1.9). Derefter permanent tilslutte to 6 tommer lange (del # 69) rør (1 tommer OD) til både de modsatte ender af tee stik-ene vender direkte op for luft frigivelse og den anden direkte ned for vandgennemstrømning.
  7. Tilslut permanent det nedadgående udvidede lige rør (fra trin 1.10) til en kvindelig sokkel pigtrådsrør (1-tommer ID) lige adapter. Fastgør en 36 inches lang gummirør (3/4 tommer ID) til pigtråd rør adapter.
  8. Placer kølesystemet mellem vandudgangsslangen og sumpsystemet.
  9. Fastgør 3/4 tommer barb fittings, der følger med systemet, til kølerenhedens indgangs- og udgangsporte. Sæt gummislangen (fra trin 1.11) på kølerens indløbsbeslag.
  10. Tilslut et nyt stykke 3/4 tommer ID slange (fra trin 1.13) fra chiller output (fra trin 1.12) til indløbet af sumpsystemet som vist i figur 2b.
  11. Placer derefter 4 tommer x 12 tommer sokfilteret med porestørrelse på 200 μm i det udpegede område som vist i figur 2. Som afbildet i figur 2 skal proteinspemmeren og returpumpen også placeres i deres relevante områder. Sammen med returpumpen fastgøres den automatiske top off float ventil til den indvendige væg af pumpeområdet, 2 inches over toppen af pumpens vandindtag; Blokerer ikke pumpen fra at blive fjernet fra tanken, hvis det er nødvendigt.
  12. Tilslut permanent et lige 12-tommer langt rør (3/4 tommer OD) til pumpens stikkontakt (fra trin 1.15). På den anden ende af 3/4 tommer OD lige rør, permanent forbinde rørets OD til en 3/4 tommer ID 45 ° albue fælles. Til den anden ende af leddet, permanent tilslutte en 3/4 tommer OD slanger.
  13. Fastgør den anden ende af det lige rør (fra trin 1.16) til 3/4 tommer ID af en lige reducerende adapter. Tilslut permanent den større adapterafslutning (2"-OD) til uv-lysets indgang.
    BEMÆRK: Lige slangelængder kan variere.
  14. Derefter skal du matche placeringen af UV-lysindtag med pumpens udgangsrør (fra trin 1.17), så røret ikke bøjer mellem lys og pumpe (fra trin 1.15). Bor huller i stabiliseringsbøjlen, så de passer til UV-lysudlægshullerne. Match størrelsen på skruerne med boret, og fastgør UV-lyset til bordet ved hjælp af de givne skruer.
  15. Tilslut permanent 2-tommerssiden af en anden reducerende adapter til UV-lysets output (fra trin 1.18). Fastgør en 1-tommer OD af en 5-tommer lang lige rør til adapterens 1-tommer ID. Derefter forbindes et 90 ° hjørnestykke med 1-tommer ID til 1-tommer OD-røret; få den uopnåede ende af hjørnestykket, der peger mod den side af tanken, hvor vandtilførslen er beregnet til at gå (samme side som i trin 1.5).
  16. Tilslut permanent den anden ende af hjørnet (fra trin 1.19) til et 6 tommer langt rør (del #69), der har 1-tommer OD med input fra flowstyringsenheden (del #2). Tilslut permanent et andet 1-tommer OD-rør (del #69) til flowovervågningsenhedens output. længden skal strække sig mindst 3 tommer ud over siden af tanken.
  17. Brug en 13/4 tommer glas skære bor (del # 1), skære et nyt hul 3 inches over den påtænkte vandlinje og 2 inches væk fra siden af tanken (Figur 1a) på den side modsatte af den, der har vand output hul. Fastgør en anden gennem væggen skot montering med en 1-tommer slip (del # 77) vender ud af tanken.
  18. Til skot slip forbinde en lige rør med 1-tommer OD og 4 inches længde (del # 69) permanent. Skær slangen ned fra den sidste del af trin 1.21 for at matche den afstand, denne slange strækker sig fra tanken. Tilslut permanent et 90° rør (del #65) til hvert af de åbne rør og skær et sidste 1-tommers OD lige rør (del #69), der permanent forbinder begge hjørnestykker.
    BEMÆRK: Figur 3 viser en simpel repræsentation af akvariesystemet.
  19. Konfigurer resten af styresystemet (del #34), og sæt først strømstriben (del #53) op på selve bordet eller til en væg i nærheden. Ved siden af montere væskeovervågning modul (del # 2).
  20. Tilslut flowsensoren, strømstriben og lækagedetekteringssensorerne til modulet. Konfigurer vækstlyset (del #26), der er fastgjort til algebeholderen (figur 2).
  21. Sæt flowsensoren, UV-lys, vækstlys, pumpe og proteinskimmer i energibjælken. Konfigurer programmeringen af vandstyringssystemet i henhold til producentens manual.
  22. Forbered saltvand ved at blande en halv kop kommercielt tilgængelige salt mix med 1 gallon omvendt osmose (RO) eller deioniseret (DI) vand. Lav 45 gallon til fuldt ud at fylde en tank og sump system.
  23. Tænd pumpen i sumpsystemet flow controller og holde tilføje saltvand, indtil den automatiske top off ventil er i off position, så ingen ekstra ferskvand er påkrævet.
  24. Når vandet er fuldt, skal du holde op med at fylde og tænde for vandkølingsenheden for at indstille temperaturen mellem 18 °C og 22 °C, da dette er det foretrukne temperaturområde53. Tænd protein skimmer.
  25. Tilsæt 30 kg knust koral til bunden af tanken samt et lag af knust koral til bunden af algerne bin. Tilføj i flere levende klipper og andre tilføjelser til blæksprutte miljø. Placer en top til at dække åbningen af tanken.
    BEMÆRK: Levende klipper er døde koraller, der er beboet af makroskopisk marine liv som bakterier og alger.
  26. Tilsæt nitrificerende bakterier, der anvendes i saltvand akvarier som anvist på emballagen. Fortsæt med at tilføje dette som anvist, kontrollere temperatur, saltholdighed, pH, ammoniak, nitrit og nitrat dagligt med vandtestsæt, pH-sensor og temperatursensor. Sikre værdier for ammoniak-, nitrit- og nitratniveauer er under henholdsvis 0,5 ppm, 0,25 ppm og 10 ppm58.
  27. Sørg for, at UV-lys er slukket for de dage, hvor der tilsættes nitrificerende bakterier, så saltvandsmikroorganismerne kan vokse. Når parametrene er inden for sikre områder, kan UV-lyset genaktiveres.
  28. Når systemet er etableret, skal du også kontrollere, at pH og iltning er på henholdsvis 8,0-8,4 og Equation 159. Før du tilføjer dyr til akvariet, skal du kontrollere, om der er kobber- og iltniveauer i systemet ved hjælp af et kobbervandstestsæt.
    BEMÆRK: Kobber forårsager skade på hvirvelløse dyr, og det forstyrrer osmoregulation i fiskegæller60,61.
  29. Hvis der findes kobber i vandet, skal du teste DI/RO-vandkilden. Efter at have fastslået, at vandkilden ikke indeholder kobber, skal du udføre en 30% vandforandring og placere den aktiverede kulblok (del # 46) i vand. Hvis problemet fortsætter, skal du udføre en fuld vandforandr og rengøre alle delene.
  30. Når alle vandparametrene er bestemt til at være inden for sikre niveauer, tilsættes 10 spøgelsesrejer i systemet mindst en uge før tilsætning af blæksprutter. Dette vil bidrage til at indføre biomasse til bakterier og angive den samlede vandkvalitet.
  31. Tilføj yderligere akvarieøkosystemindbyggere til algebeholderen. Dette omfatter Chaetomorpha spp. (spaghetti alger), Trochus Sp. (stribet trochus snegl), og Mercenaria mercenaria (cherrystone muslinger).

Figure 2
Figur 2: Sumpsystem. Sidevisning af sumpsystemet (a). Topvisning af sumpsystemet (b). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Akvarium med sumpfiltreringssystem under tanken og miljøkontrolenhederne. Grønne pile angiver retningen af vandstrømmen gennem systemet. Vand, der strømmer fra sektion et til to til afkøling og på tre for at adskille tungt biologisk stof fra lettere stof. Tungt affald flyder til bunden og ud til sektion fem, mens det mindre biologiske stof strømmer ind i sokkefilteret inden for afsnit fire. Vand strømmer fra fire under sektion fem ind i protein skimmer i seks for at fjerne resterende affald i vandet. Alger bin indeholder mikroorganismer til at nedbryde affald, ammoniak og nitrater samt iltere vandet. I den sidste del af systemet tilsættes mere vand for at tage højde for fordampning, før det pumpes tilbage i tanken. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Lagertanke

  1. Sæt to høje 60-gallon vand lagertanke, en til saltvand og den anden for RO vand. Sørg for, at ferskvandstankens maksimale fyldlinje er højere end bordet. Fastgør en 1/4 tommer slange til den automatiske toppen af flydeventilen i sumpsystemet og fastgør den anden ende af slangen til bunden af ferskvandstanken.
    BEMÆRK: Dette er at genopfylde, hvis vandet fordamper. Salt vil blive i vandet.
  2. Fyld saltvandstanken med vand og tilsæt den proportionale mængde salt til tanken. Skær kontinuerligt saltvandsbeholderen til blanding og korrekt iltning. Vent i en time før brug for at sikre fuld blanding af saltet.
    BEMÆRK: Saltvandstanken er nyttig til genopfyldning af tankene efter rengøring.

3. Opsætning af madtanke

  1. For at holde rejerne i live i mere end en uge skal de opbevares i en separat tank fra blæksprutten med saltholdigheden under 30 ppt og temperaturen tæt på 25 °C.
  2. For at gøre det, en uge efter blækspruttetankene er modnet, overfør 8 gallon modnet saltvand til rejertanken. Tilsæt 15 kg knust koral til bunden af tanken. Tilføj et par levende klipper til tanken til skjulesteder til smeltning (Figur 4).
    BEMÆRK: Modnet havvand refererer til processen med at tillade marine bakterier at vokse inden for saltvandet som vist i trin 1.30.
  3. Fastgør et beholderfilter til kanten af tanken. Konfigurer beholderfilteret som anvist af producenten. Tilsæt en luftpumpe ved siden af tanken tilsluttet et rør med en vedhæftet luftsten sat ind i tanken.
  4. Rengør filteret, og skift filterpuderne hver uge. Desuden skal 25% af vandet ændres på samme tid. Kontroller dagligt kvælstof-, pH- og temperaturparametre i fødevaretankene med vandtestsæt som beskrevet i trin 1.30. Hvis vand kvælstof parametre forbliver høje, udføre yderligere vand ændringer og tilføje en kvælstof absorberende pose til vandet; eller hvis problemerne fortsætter længere end en måned, skal rejerne flyttes til en større tank.
  5. Tilsæt rejer, så snart knust koral sediment er spredt. For at tilføje rejer først, ved ankomsten, skal du flytte rejerne uden at sende vand til den lille saltvandstank i 5 minutter for at fjerne bioaffald. Derefter kan rejerne tilføjes direkte til tanken. Mosquito fisk, ved ankomsten, kan tilføjes direkte til rejer tanken.
    BEMÆRK: Rejer og myggefisk kan købes hos enhver kommerciel leverandør af levende dyr, der er opført på materialearket eller andre fødevareleverandører. Det er også muligt at tilbyde blæksprutter optøet rejer.
  6. Foder rejer og fisk med fiskeflager, død vegetation eller alger62, som anvist på madinstruktioner.
  7. Til krabbetanken tilsættes 1 gallon saltvand og 10 kg småsten. Læg småstenene på den ene side, der forlader tørt land på den ene side og 2 cm saltvand på den anden side (som nævnt i figur 4). De optimale miljøvandparametre for disse hvirvelløse dyr bør være henholdsvis 30-35 ppt og 22-25 °C for saltholdighed og temperatur11,63.
  8. Tilsæt spillemandskrabber direkte i tanken (figur 4). Krabber vil tilbringe det meste af deres liv på land, men kan være under vandet i et par dage ad gangen, hvilket gør tanken, der er delvist under vandet afgørende for deres langsigtede overlevelse.
  9. Foder spillemand krabber en gang om dagen ved at tilføje fisk flager i fadet på det tørre område af tanken. Rengør ugentligt ved at fjerne krabber og ændre 100% af saltvandet. Rengør småstenene.
  10. Opbevar marine toskallede bløddyr (muslinger og muslinger) i saltvandstanke, så blæksprutterne kan åbne sig selv og give en anden vandfiltreringsmekanisme64.
  11. Placer muslinger inde i en separat ubesatte tank i den første uge for at undgå at placere en unødvendig affaldsbelastning på blækspruttetankens filtreringssystem.
    BEMÆRK: Mens muslingerne har været blækspruttens foretrukne mad, er de mere tilbøjelige til at dø kort efter ankomsten og vil øge det biologiske affald i tanken betydeligt, hvis de er til stede i store mængder.

4. Introduktion af blæksprutte til tanken

  1. Sørg for, at ammoniak-, nitrit- og nitratniveauet er under henholdsvis 0,5 ppm, 0,25 ppm og 10 ppm. Har vand håndpumpe til rådighed for at fjerne blæksprutte blæk fra tanken. Det anbefales også at have to personer til denne procedure.
  2. Ved ankomsten skal posen placeres på vægten og trække posens vægt, efter at blæksprutten er fjernet. Tilsæt en luftsten til posen for at øge vand iltningen, mens du overfører dyret til deres tank. Mål skibsvandets temperatur og saltholdighed. Registrer tilfælde af langvarig sygdom efter forsendelse.
    1. Uden at overføre vand fra posen til tanken, hænge transportposen over hjørnet af tanken med posen delvist nedsænket i tankvandet for at begynde at ændre temperaturen på transportposen. Fjern 10% af vandet fra posen og dump ned i vasken. Tilsæt den samme mængde vand fra tanken til posen. Gentag hvert 10. minut, indtil vandtemperaturen i posen ikke er mere end 1° anderledes end vandtemperaturen i tanken.
    2. Når temperaturforskellen i posen og tanken er inden for 1 °, skal du sikre handsker bæres for at flytte blæksprutterne til deres individuelle tank. For at flytte skal du placere begge hænder under blæksprutten for at yde støtte under overførslen; den anden person skal forsigtigt trække de sugede arme fra siden af posen.
    3. Når blæksprutten er ude af posen, skal du flytte den hurtigt ind i vandet i sit nye habitat og overføre så lidt vand fra forsendelsesposen som muligt. Brug håndpumpen til at fjerne blæk blæksprutte udgivelser, når i tanken. Nu vejer posen med vand for at opnå omtrentlig vægt af dyret.
  3. I de første 2 uger efter ankomsten skal du overvåge blækspruttens daglige forbrug, der skal være omkring 4% til 8% af deres vægt58,65,66. Blæksprutten skal kontrolleres fire gange om dagen; dette kan reduceres til to gange om dagen efter 2 uger. Veje hver anden uge for at justere deres madforbrug efter behov.
    BEMÆRK: Nogle arter af blæksprutte er kendt for at flygte fra deres tank, så det er tilrådeligt at placere en 2,5 kg vægt på låget af deres tank.

5. Daglig pleje

  1. Ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt saltvandstestsæt til pH, ammoniak, nitrit og nitrat tilsættes den kit-ledede mængde tankvand til de fire reagensglas, der følger med sættet. Som angivet på testsættet skal du tilføje mængden af farvemetrisk reaktant til det tilsvarende rør.
  2. Hvis ammoniak-, nitrit- og nitratniveauet er over henholdsvis 0,5 ppm, 0,25 ppm og 10 ppm, skal biomassen skylles ud af sokkefilteret eller skifte til et nyt sokkefilter. Derudover renses biomasse fra toppen af skimmeren med en børste og tilføjer yderligere denitrificerende bakterier til tanken. Hvis problemerne fortsætter, skal du udskifte 25% af det friske saltvand.
    BEMÆRK: Ovenstående trin reducerer kvælstofforbindelser i økosystemet.
  3. Fjern alle døde krabber og rejer kadavere fra tanken samt enhver blæksprutte fækalt stof ved hjælp af en håndpumpe. Fjern alle de resterende levende krabber fra tanken og flyt dem tilbage til opbevaringstanken. Derefter omarrangere store genstande i tanken.
  4. Indfør halvdelen af antallet af krabber, som blæksprutten ville spise dagligt til tanken, der vejer 1,25 +/- 0,25 g. Foder optøede rejer eller små mandlige spillemand krabber til unge blæksprutter. Afhængigt af eksperimentet kan krabber og rejer introduceres overalt i tanken eller til blæksprutte direkte.
    BEMÆRK: Blæksprutterne daglige fødevareforbrug er 4%-8% af deres vægt67. Frosne rejer kan også leveres som fødekilde baseret på blækspruttens vægt.
  5. Tilbyd fem spøgelsesrejer dagligt. I gennemsnit blev tre forbrugt i dette eksperiment. For at give en række mad til blæksprutten, giv en levende musling eller musling en gang om ugen og altid opretholde tre myg fisk inde i tanken.
    BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at give dyrene en række fødevarer og kan forhindre dyr i at blive lokket af mad under forsøg. Fodringsplanen, der bruges her til bedst at overvåge blækspruttefodring og adfærd, er at introducere halvdelen af antallet af krabber baseret på vægt og øge antallet af rejer til fem om morgenen. Om aftenen introduceres den anden halvdel af krabberne til tanken.

6. Ugentlig sanitet

  1. Luk skimmer,pumpe og alger bin lys før rengøring af sumpsystemet. Sluk derefter for systemets automatiske ventil, før du fjerner vand. Endelig skal du fjerne skimmeren og alt vandet kun fra sumpsystemet.
  2. Skrub alger bin let for at fjerne det meste af biomassen fra sine vægge. Rengør resten af sumpområdet med en børste. Fjern strømpefilteret, rengør med eddike, og lad det tørre; rotere med en anden sok filter hver uge erstatte med nye hver tredje måned. Fjern og rengør biomasse fra toppen af skimmeren ugentligt.
    BEMÆRK: Undgå at bruge metal til at rense plasten, da det vil skabe ridser, der kan være tilbøjelige til mikrobiel vækst.
  3. Sæt skimmeren tilbage i systemet og begynd at genopfylde med saltvand. Når pumpeområdet er begyndt at fylde, kan alle systemer tændes igen. Stop med at tilsætte vand, når den automatiske top af flydeventilen er i slukket position.

Figure 4
Figur 4: Tank til spillemand krabber (Minuca pugnax). Bunden af tanken er halvt udpeget til tør seng og den anden halvdel til 2 cm lavt saltvand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Tank til spøgelsesrejer (Palaemonetes paludosus). Klipper i rejertanken giver plads til rejer til at skjule og smelte samt til vækst af mikroorganismer. Klik her for at se en større version af dette tal.

7. Pleje af utilpassne dyr

  1. Følg vejledningen reference66 for at vurdere blæksprutte wellness.
    BEMÆRK: For kvindelige blæksprutter begynder slutningen af livscyklussen normalt efter æglægning. Dyret vil begynde at reducere fødevareforbruget og vil stoppe med at spise helt og vil blive mere sløv. Levetiden efter end-of-life processen varierer. Der kan ikke træffes yderligere foranstaltninger undtagen fodring og overvågning af dyret. Senescent mænd vil reducere fødevareforbruget og blive sløv68.

8. Blæksprutte anæstesi

  1. Udfør blæksprutte anæstesi som beskrevet i Butler-Struben et al.69.
  2. Få en 6 L beholder med låg, der er mindst 15 cm høj. Placer 4 L vand direkte fra blækspruttetanken i beholderen og sørg for beluftning til 4 L saltvand ved hjælp af en lille luftpumpe med luftsten til at sprede ilt til vandmiljøet58.
  3. Før blæksprutte introduktion, tilføje 1% EtOH til beholderen. Før du håndterer blæksprutten, skal du registrere antallet af vejrtrækninger pr. minut ved at tælle udånding af vand fra sifonen.
    BEMÆRK: For blæksprutter i forskerens laboratorium er baseline respirations 16 - 24 vejrtrækninger i minuttet.
  4. Før du flytter blæksprutten, skal du registrere blækspruttens hudpigmentering og baseline vejrtrækningshastighed. Fjern blæksprutte fra tanken ved hjælp af en ren 4 L åben mund beholder ved scooping det op med dens omgivende vand.
    BEMÆRK: Under anæstesi indikerer vejrtrækningsrater ikke nødvendigvis fuldstændig anæstesi.
  5. Afvej blæksprutten, mens du er i beholderen, og flyt den derefter ved at placere begge hænder omkring blækspruttens krop og løfte den op. En anden person kan være nødvendig for at fjerne de sugede lemmer fra beholdervæggene.
  6. Flyt hurtigt blæksprutten ind i den forberedte beholder med 1% EtOH. Luk låget for at forhindre en mulig flugt.
  7. Optag blækspruttens åndedræt i minuttet ved at tælle udånding af vand fra sifon i slutningen af de første 5 minutter. Hvis åndedrættet forbliver over baseline, og dyret fortsætter med at reagere på en let knivspids, tilsættes yderligere 0,25% EtOH til vand. Tilsætning af ethanol til vand kan fortsætte til højst 3% EtOH.
    BEMÆRK: En indikation af, at blæksprutten er bevidstløs, er dens tab af kontrol over sine kromatophorer. I dette tilfælde huden synes lysere end normalt. En yderligere indikation er at knibe armene let og teste, om der er en motorisk respons. Hvis der stadig ikke er noget svar på dette tidspunkt, er blæksprutten bevidstløs, og eksperimenter kan udføres.
  8. Mens du er under bedøvelse, overvåge blæksprutte vejrtrækning og farve for at sikre, at det forbliver bevidstløs i løbet af proceduren. Hvis blæksprutten begynder at vågne under proceduren, skal du tilføje yderligere 0,25% EtOH.
  9. For at vende virkningerne af ethanol anæstesi, overføre blæksprutte til en ny 4 L eller større tank af iltet vand fra sin permanente bedrift tank. Når respirations vender tilbage til normal, bliver blæksprutten aktiv, og dens hud vender tilbage til normale pigmenter; den kan flyttes tilbage til sin tank.

9. Blæksprutte aktiv dødshjælp

  1. Følg de internationale standarder for blæksprutte aktiv dødshjælp som beskrevet i Fiorito et al., Moltschaniwskyj et al., og Butler-Struben et al57,58,69.
  2. Forbered en ny 6 L beholder med 4 L vand fra blækspruttens holdetank. Bland i MgCl2 til en koncentration på 4% til aktiv dødshjælp tanken. Udfør trin fra 8,1 til 8,9 for at bedøve blæksprutten.
  3. Flyt blæksprutten efter trin 8.8 til aktiv dødshjælpstanken. Når vejrtrækningen stopper, vent i 5 minutter og udfør en decerebration af blæksprutten eller hold i aktiv dødshjælpstanken i 5 ekstra minutter.

10. Adfærd af O. bimaculoides

  1. Foder ikke blæksprutten om morgenen, når de vil blive uddannet til at bruge en skruehættebeholder. Konfigurer en kameraoptagelsesenhed, der peger på det område, der er beregnet til fodring.
  2. Få et 50 mL skruehætterør med huller i diameteren på 1 mm i hele overfladen og hætten til vandgennemstrømning i hele beholderen. Placer en spillemand krabbe i beholderen. Placer en vægt i beholderen eller fastgjort til ydersiden for at forblive i bunden af tanken.
  3. Placer beholderen i bunden af tanken inden for det åbne område og i syne af blæksprutte og kameraet. Hvis krabben ikke er blevet spist efter 4 timer, skal du fjerne den fra røret og genoptage fodringsplanen for dagen. Fortsæt med at udføre denne øvelse dagligt.
    BEMÆRK: Dette fremgår af figur 6 og diskuteres i afsnittet om repræsentativt resultat.

11. Blæksprutte MRI

BEMÆRK: Tidligere blev fremkaldte funktionelle MR-reaktioner i blækspruttens nethinde målt i bedøvede dyr70. Her fik vi en ultrahøj rumlig opløsning MR-scanning af blækspruttens nervesystem, der krævede timers scanning. Således blev dette udført i en aflivet O. bimaculoides.

  1. Få MR-billeder ved hjælp af et 7T-system. Wrap blæksprutte i et køkken-grade polyvinylchlorid plastfolie for at opretholde hydrering af væv. Placer blæksprutte på wrap, tuck i enderne, og derefter rulle for at forsegle.
  2. Brug en volumen transmittere/modtag spole med en diameter på 4 cm til at få billeder af hjernen og flere arme. Brug T1 vægtet SJÆLDEN sekvens med følgende parametre: Gentagelsestid (TR) på 1500 ms, ekkotid (TE) på 20 ms, 117 x 117 x 500 μm opløsning, 100 gennemsnit, SJÆLDEN faktor 8. Disse er typiske MR-parametre for billeddannelse gnaver hjerner. Brug af en SJÆLDEN faktor gør billeddannelsen hurtigere, mens 100 billeder i gennemsnit samles for at øge signal-til-støj-forholdet71.
  3. Billede blæksprutte arm ved hjælp af en 86 mm volumen transmission spole og en 4 x 4 cm 4-kanals array modtage spole. Skær en arm af med kirurgisk saks og læg den i et 15 mL konisk rør fyldt med fosfat-buffered saltvand.
    BEMÆRK: Sekvensen var en T1_weighted inversionsgendannelsessekvens (MP-RAGE) med parametre: TR/TE = 4000/2.17 ms, inversionsforsinkelse 1050 ms, 100 x 100 x 500 μm opløsning, 9 gennemsnit, scanningstid 1,5 h (Figur 7). En inversion-recovery sekvens nuller signalet fra vand og øger kontrasten i billedet; denne sekvens blev valgt, fordi det giver mulighed for visualisering af den indre anatomi af armen72.

12. Kryo-fluorescenstomografi (CFT) billeddannelse

  1. flash-fryse blæksprutte: arbejde i en røg hætte. Dæk bunden af en Dewar med tøris, og fyld derefter med hexaner. Sænk langsomt blæksprutten ned i hexerne i løbet af ca. 10 min, tilsæt friske hexaner og tøris efter behov for fuldt ud at dække blæksprutten med kolde hexaner. Hold blæksprutten frosset ved -20 °C, indtil den er indlejret.
  2. Integrer og del blæksprutten: Opret en rektangulær form af passende størrelse til at holde blæksprutten ved hjælp af de værktøjer, der leveres af CFT-producenten. Dæk bunden af formen med OCT (optimal skæretemperatur) medier (standardmateriale, der anvendes i histologi laboratorier) og lad det fryse til en semi-solid gel.
  3. Placer den frosne blæksprutte i gellaget i OLT, og dæk derefter langsomt med OKT i 2-3 lag. Mellem hælde trin, fryse blok trin, indtil OLT er på gel fase. Når blæksprutten er helt dækket, fryses blokken i mindst 12 timer ved -20 °C.
  4. Læg prøven i kryo-fluorescenstomografisystemet73.
  5. Sektion og billede hele aflivede O. bimaculoider ved mesoskopisk opløsning ved hjælp af 3 emissions-/excitationsfiltre, hvorved der produceres flere 3D isotropiske datasæt.
  6. Når afsnittet når armen og fordøjelsessystemet, overfør sektionerne til diasene for yderligere histologi.
  7. Indlæs det rå datasæt i rekonstruktionssoftwaren fra CFT-leverandøren, der er specielt designet til at muliggøre hurtig behandling.
  8. Rekonstruer en 3-dimensionel stak ved hjælp af landemærkejustering, histogrammebalancering og fluorescenskorrektioner og normalisering, herunder fjernelse af fluorescenseffekter under overfladen for hver bølgelængde.
  9. Når den endelige 3D-stak er produceret af rekonstruktionsværktøjet, visualisere dataene med billedsoftwareværktøjet og oprette gennemflyvninger med hvidt lys og fluorescensoverlejringer sammen med 3D Maximum Intensity Projections (3D-MIPS), f.eks. Figur 873.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle dyrene i vores undersøgelser blev fremstillet af naturen, og dermed kunne deres nøjagtige alder ikke bestemmes, og deres ophold i laboratoriet var variabelt. Blæksprutte tilstand blev observeret dagligt. Vi så ikke parasitter, bakterier, hudskader eller unormal adfærd. Den gennemsnitlige vægt af dyr var 170,38 +/- 77,25 g. Hvert dyr beboede deres egen 40-gallon tank. Den gennemsnitlige ± standardafvigelse for de parametre, der er registreret for en tank over en uge, var: pH 8,4 ± 0,0, saltholdighed 34,06 ± 0,61 ppt, temperatur 18,7 ± 0,75 °C, ammoniak 0,11 ± 0,14 ppm, nitrit 0,25 ± 0,14 ppm og nitrat 1,43 ± 2,44 ppm.

Adfærd af O. bimaculoides: For at forstå sensorimotorisk funktion samt læring og hukommelse kapaciteter af blæksprutter, skrune reagensglas har vist sig at være en nyttig test (Figur 6). Det giver også et beriget miljø, der har vist sig nyttigt at opretholde kritiske fysiologiske mekanismer forbundet med neural nedbrydning74. Denne test blev udført dagligt med tre blæksprutter, og det tog blæksprutterne 4 dage i gennemsnit at lære at åbne et reagensglas.

Figure 6
Figur 6: Progression af en blæksprutte skrue låget af et rør. Brug kameraer til optagelse af videoer af grønne detektionsbokse, der er genereret fra kamerasoftwaren. I videoens sidste ramme er det blå objekt hætten på røret, der stiger mod tankens overflade efter at være blevet fjernet af blæksprutten. Skalalinje = 30 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

MR-scanning af blækspruttens nervesystem: En MR-scanning giver et middel til at visualisere blødt væv med stor rumlig opløsning. Vi har erhvervet ultrahøje rumlige opløsningsbilleder (100 mikron voxels) af O. bimaculoidernes nervesystem (figur 7). Denne teknik vil gøre det muligt at opnå detaljeret morfologi og fibersporing og orientering i et helt dyrs forberedelse.

Figure 7
Figur 7: MR-scanning af blækspruttens nervesystem. Høj opløsning MR-karakteristik af O. bimaculoides nervesystem. Vi erhvervede ex vivo MR-billeder af hjernen og armene på blæksprutten, der tilsammen danner et nervesystem, der indeholder over 500 millioner neuroner. Hjernen er i midten, og de to optiske lapper er forbundet på hver side (a). Et koronat syn på armene. Den aksiale hjerte kan ses i hver af de syv arme, der er fanget i denne visning (b). En sagittal visning af suckers viser en kompleks perifer nervøs struktur (c). Skalalinje = 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Kryo-fluorescens tomografi (CFT) billeddannelse: CFT er en topmoderne metode, der gør det muligt at erhverve højopløsningsbilleddannelse i et helt dyrepræparat. Systemet brugte kun autofluorescence til at generere 3-dimensionelt morfologisk billede af hele dyret. Som vist i figur 8, dette tilladt at visualisere hjernen og suckers, der er placeret langs armen i 470 bølgelængde (grøn) og fordøjelsessystemet i 555 (blå) og 640 (gul) bølgelængder.

Figure 8
Figur 8: Kryo-fluorescenstomografi (CFT) billeddannelse af O. bimaculoider. Hele blæksprutten blev indlejret i en blok og serielt skåret, mens den indsamlede hvide lys- og fluorescensbilleder efter hvert afsnit. Dette producerede et 3D isotropisk datasæt med tre fluorescensbølgelængder. Skalalinje = 30 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Systemopsætning:
Akvarieøkosystemet er udviklet på en måde, så både mekaniske og biologiske metoder til filtrering og iltning af vandet anvendes. Filtreringselementerne i systemet bruger sokkefiltre, proteinspemmere og regelmæssig rengøring for at opretholde nitrogen- og iltniveau. Endnu vigtigere er det, at vi også er afhængige af marine mikroorganismer til at forbruge de farlige nitrogenholdige forbindelser og andet biologisk affald samt befolke vandet gennem fotosynteseprocesser. Yderligere metoder, udover brugen af alger, at tilføje ilt til vandet er gennem udvendig belufter med vedhæftet luft sten. Før du tilføjer bakterier, anbefales det at tilføje levende sand eller knust koral som et vækstmedie. Uden medier vil organismerne tage længere tid at etablere sig i systemet. Denne udvikling vil tage 1-3 uger til effektivt at nedbryde bioaffald og stabilisere kvælstofcyklussen inden for passende parametre.

Miljøberigelse:
Kognitiv og sensorimotorisk berigelse kan hjælpe med neurogenese og blækspruttens generelle trivsel75. Berigelse kan bestå af sandet substrat, skaller, klipper og andre strukturer, der giver skjulesteder og dækning. Vi ændrer ofte konfigurationen af strukturerne i blækspruttetanken og introducerer nyt legetøj med interessante mekanikker for at motivere blæksprutten til at udforske. Vi fandt ud af, at det er bedst at bruge urtepotter med et hul i bunden til at huse blæksprutter. Dette giver mulighed for mindre traumatisk håndtering, hvor blæksprutten i et hus med en indgang kan blive skadet, når den forsøger at blive fjernet. Blæksprutten nyder at interagere med store Legos og skrue krukker med mad placeret indeni, som også beskrevet i Fiorito et al.58. Miljøberigelse er vigtig for blækspruttens kognitive og fysiologiske sundhed, som har vist sig at påvirke kritiske regenereringsmekanismer i blækspruttens nervesystem74,75.

Forbedringer:
Opsætningen af systemet kan ændres, såsom at øge størrelsen af tankene, ved hjælp af forskellige sumpsystemer samt forskelligt udstyr. Yderligere forbedringer, der kunne foretages, er at tilføje kølesystemet efter sumppumpens output på grund af strømbegrænsninger forårsaget af kølesystemet. Yderligere forbedringer ville være at indføre forskellige typer alger til bekæmpelse af nitratniveauer samt andre byttedyr, såsom andre ikke-giftige bløddyr og decapoder, som blæksprutten kan foretrække som yderligere muligheder.

Blæksprutter kræver konstant pleje og opmærksomhed, og de metoder, der anvendes i denne protokol, har vist sig at give et stabilt og sundt miljø for dets indbyggere. Mens de metoder, der er skitseret her, er for O. bimaculoides, kan den grundlæggende akvarieopsætning anvendes til de fleste havdyr med mindre variationer i systemets størrelse og udstyr. Disse dyrs unikke egenskaber gør dem ideelle til mange forskningsområder, og succesen af projekter, der involverer disse dyr, afhænger af husdyrholdets omhu. Blæksprutter med deres uforlignelige evner gør dem til en bemærkelsesværdig og vigtig dyremodel at anvende i biomedicinsk forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH UF1NS115817 (G.P.). G.P. er delvist støttet af NIH tilskud R01NS072171 og R01NS098231. Vi vil gerne takke Patrick Zakrzewki og Mohammed Farhoud fra Emit Imaging for hjælp og støtte til indsamling og visualisering af data på Xerra Imaging Platform. MSU har en forskningsaftale med Bruker Biospin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-3/4 in. Drill Bit Home Depot 204074205 Glass cutting tool
Part number:1
1" flow sensors Neptune Systems Local Dealer Pipe with sensor to measure water flow
Part number:2
1" Slip Bulkhead Strainer Bulk Reef Supply 207113 Strainer for water leaving tank
Part number:3
10 gallon tank Preuss Pets Local Dealer Fiddler crab holding tank
Part number:4
4 inch X 12 inch 200 Micron Nylon Monofiliment Mesh Filter Sock w/ Plastic Ring AQUAMAXX UJ41171 Filter for large organic matter in sump
Part number:5
40 gallon aquarium Preuss Pets Local Dealer 4 Food aquarium tanks
Part number:6
60g poly tanks - rectangle Preuss Pets Local Dealer 2 Water Storage (salt and freshwater)
Part number:7
Active Aqua 1/10th HP Hydroponic or Aquarium Chiller 2018 Model WayWe 719574198463 For cooling water continuously
Part number:8
ALAZCO 2 Soft-Grip Handle Heavy-Duty Tile Grout Brush ALAZCO B06W2FT5V5 Tank Cleaning
Part number:9
Ammonia Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 33D For water testing
Part number:10
Apex system WiFi Neptune Systems Local Dealer System connection for off site monitoring
Part number:11
API Aquarium Test Kit Amazon B001EUE808 For water testing
Part number:12
API Copper Test Kit Amazon B0006JDWH8 For water testing
Part number:13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 Watt Series Units Aqua Ultraviolet A00028 For removing bacteria leaving sump system
Part number:14
AquaClear 50 Foam Filter Inserts, 3 pack Aquaclear A1394 Food Tank Carbon Filter Inserts
Part number:15
Aqueon QuietFlow LED PRO Aquarium Power Filter 30 Aqueon 100106082 Food tank filtering units
Part number:16
Auto Top Off Kit (ATK) (Each includes 1 FMM module, 2 optical sensors and 1 float) Neptune Systems Local Dealer For freshwater tank
Part number:17
Automatic top off from RODI (LLC) Neptune Systems Local Dealer From water storage to octopus tanks
Part number:18
Banded Trochus Snail LiveAquaria CN-112080 For algae bin
Part number:19
Chaetomorpha Algae, Aquacultured LiveAquaria BVJ-76354 For algae bin
Part number:20
Clams - Live, Hard Shell, Cherrystone, Wild, USA Dozen Fulton Fish Market N/A Live food
Part number:21
Classic Sea Salt Mix - Tropic Marin Bulk Reef Supply 211813 Salt for tank water
Part number:22
Clear Masterkleer Soft PVC Plastic Tubing, for Air and Water, 3/4" ID, 1" OD McMaster 5233K71 Cleaning tool
Part number:23
Continuum Aquablade-P Acrylic Safe Algae Scraper W/ Plastic Blade - 15 Inch Marine Depot 4C31001 Cleaning tool
Part number:24
Copper Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 65L For water testing
Part number:25
Curve Refugium CREE LED Aquarium Light Eshopps 6500K Algae bin light
Part number:26
Eheim 1262 return pumps EHEIM 1250219 Pump for storage tanks
Part number:27
Eshopps R-100 Refugium Sump GEN 3 Eshopps 15000 Sump system
Part number:28
Ethyl Alcohol, 200 Proof Sigma-Aldrich 64-17-5 Anesthesia
Part number:29
Extech DO600 ExStik II Dissolved Oxygen Meter Extech DO600 Oxygen measurement
Part number:30
Fiddler Crabs; live; dozen NORTHEAST BRINE SHRIMP N/A Live food
Part number:31
Filter Cartridges Aqueon 100106087 Food tank filters
Part number:32
Florida Crushed Coral Dry Sand - CaribSea Bulk Reef Supply 212959 Sediment for bottom of tank
Part number:33
FMM module Neptune Systems Local Dealer Controller for apex system
Part number:34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - Fritz Bulk Reef Supply 213036 Bacteria start
Part number:35
Hand Operated Drum Pump, Siphon, Basic Pump with Spout, For Container Type Bucket, Pail Grainger 38Y789 Water Hand Pump
Part number:36
High pH Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 27 For water testing
Part number:37
Imagitarium Fine Mesh Net for Shrimp Petco 2580993 Shrimp and fish transfer net
Part number:38
Leak Detection Kit (LDK) - Includes FMM module plus 2 ALD sensors Neptune Systems Local Dealer Placed on floor to detect water
Part number:39
Lee`S Algae Scrubber Pad Jumbo - Glass Marine Depot LE12007 Cleaning tool
Part number:40
Live rocks Preuss Pets Local Dealer Habitat for octopus
Part number:41
Long Bottle Cleaning Brush 17" Extra Long Haomaomao B07FS7J7PN Tank Cleaning
Part number:42
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M1028-100ML Euthanasia
Part number:43
Magnetic Probe Rack Neptune Systems Local Dealer For holding apex sensor probes
Part number:44
Marine Ghost Shrimp NORTHEAST BRINE SHRIMP N/A Live food
Part number:45
Marineland C-Series Canister Carbon Bags Filter Media, 2 count Chewy 98331 For elevated copper levels
Part number:46
Nitra-Zorb Bag Aquarium Pharmaceuticals AP2213 Absorbs nitrogen compounds
Part number:47
Nitrate Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals LR1800 For water testing
Part number:48
Nitrite Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 26 For water testing
Part number:49
Pawfly 2 Inch Air Stones Cylinder 6 PCS Bubble Diffuser Airstones for Aquarium Fish Tank Pump Blue Amazon B076S56XWX Aerate water
Part number:50
Penn Plax Airline Tubing for Aquariums –Clear and Flexible Resists Kinking, 8 Feet Standard Amazon B0002563MM Tubing for connecting air pump to air stone
Part number:51
Plumbing with unions/valves plus 3/4" flex hose Preuss Pets Local Dealer Water transport
Part number:52
PM1 module Neptune Systems Local Dealer Power control module for apex
Part number:53
Protein skimmer Reef Octopus AC20284 Removes biowaste from system
Part number:54
PVC Apex Mounting board, grommets, wire mounts Neptune Systems Local Dealer Helps ensure organization for wires and tubing within system
Part number:55
PVC Regular Cement and 4-Ounce NSF Purple Primer Amazon Oatey - 30246 For connecting PVC pipes
Part number:56
RODI unit Neptune Systems Local Dealer RO Water
Part number:57
Salinity Probes HANNA probes HI98319 Measures salinity of water
Part number:58
Seachem Pristine Aquarium Treatment Seachem 1438 Provides bacteria that break down excess food, waste and detritus
Part number:59
Seachem Stability Fish Tank Stabilizer Seachem 116012607 Seachem Stability will rapidly and safely establish the aquarium biofilter in freshwater and marine systems
Part number:60
Set of lexan tops Preuss Pets Local Dealer Aquarium tank lids
Part number:61
Set of Various extended length aquabus cables Neptune Systems Local Dealer Cables for Apex system
Part number:62
SLSON Aquarium Algae Scraper Double Sided Sponge Brush Cleaner Long Handle Fish Tank Scrubber for Glass Aquariums Amazon B07DC2TZCJ Cleaning tool
Part number:63
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 45 Degree Elbow Adapter, 3/4 Socket Female x 3/4 Socket Male McMaster 4880K189 PVC pipe
Part number:64
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 90 Degree Elbow Adapter, 1 Socket Female x 1 Socket Male McMaster 4880K773 PVC pipe
Part number:65
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Adapter, 1 Socket-Connect Female x 1 Barbed Male McMaster 4880K415 PVC pipe
Part number:66
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Straight Reducer, 2 Socket Female x 3/4 Socket Female McMaster 4880K008 PVC pipe
Part number:67
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Tee Connector, White, 1 Size Socket-Connect Female McMaster 4880K43 PVC pipe
Part number:68
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 1 Pipe Size, 10 Feet Long McMaster 48925K13 PVC pipe
Part number:69
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 3/4 Pipe Size, 5 Feet Long McMaster 48925K92 PVC pipe
Part number:70
Structural FRP Fiberglass Sheet, 48" Wide x 96" Long, 1/2" Thick McMaster 8537K15 Table top material
Part number:71
Structural FRP Fiberglass Square Tube, 10 Feet Long, 2" Wide x 2" High Outside, 1/8" Wall Thickness McMaster 8548K33 Structural table material
Part number:72
Tank Sediment TopDawg Pet Supply 8479001207 Sediment for bottom of fiddler crab tank
Part number:73
Temperature probe Neptune Systems Local Dealer Temperature probe for tanks
Part number:74
Tetra TetraMarine Large Saltwater Flakes for all Marine Fish Amazon B00025K0US Fish, shrimp, and crab food
Part number:75
Tetra Whisper Aquarium Air Pump for 10 gallon Aquariums Petco 2335234 Air pump for smaller tanks
Part number:76
Thick-Wall Through-Wall Pipe Fitting, for Water, PVC Connector, 1 Socket-Connect Female McMaster 36895K843 PVC pipe
Part number:77
Vectra s2 pump Bulk Reef Supply 212141 Aquarium Pump
Part number:78
Water Pump TACKLIFE GHWP1A Pump for cleaning tanks
Part number:79
Wyze Cam v2 1080p HD Indoor WiFi Smart Home Camera with Night Vision Amazon B076H3SRXG DeepLabCut Recording
Part number:80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), 299 (2007).
  3. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  4. Li, N., et al. Optogenetic-guided cortical plasticity after nerve injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8838-8843 (2011).
  5. Airan, R. D., Li, N., Gilad, A. A., Pelled, G. Genetic tools to manipulate MRI contrast. NMR Biomedicine. 26 (7), 803-809 (2013).
  6. Cywiak, C., et al. Non-invasive neuromodulation using rTMS and the electromagnetic-perceptive gene (EPG) facilitates plasticity after nerve injury. Brain Stimulation. 13 (6), 1774-1783 (2020).
  7. Hwang, J., et al. Regulation of Electromagnetic Perceptive Gene Using Ferromagnetic Particles for the External Control of Calcium Ion Transport. Biomolecules. 10 (2), (2020).
  8. Lu, H., et al. Transcranial magnetic stimulation facilitates neurorehabilitation after pediatric traumatic brain injury. Scientific Reports. 5, 14769 (2015).
  9. Krishnan, V., et al. Wireless control of cellular function by activation of a novel protein responsive to electromagnetic fields. Bioscience Reports. 8 (1), 8764 (2018).
  10. Mitra, S., Barnaba, C., Schmidt, J., Pelled, G., Gilad, A. A. Functional characterization of an electromagnetic perceptive protein. bioRxiv. , 329946 (2020).
  11. Hunt, R. D., et al. Swimming direction of the glass catfish is responsive to magnetic stimulation. PLoS One. 16 (3), 0248141 (2021).
  12. Kandel, E. R., Krasne, F. B., Strumwasser, F., Truman, J. W. Cellular mechanisms in the selection and modulation of behavior. Neurosciences Research Program bulletin. 17, 521 (1979).
  13. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. An analysis of dishabituation and sensitization of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. International Journal of Neuroscience. 2 (2), 79-98 (1971).
  14. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bioscience Reports. 21 (5), 565-611 (2001).
  15. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Effect of temperature on laboratory growth, reproduction and life-span of octopus-bimaculoides. Marine Biology. 98 (3), 369-379 (1988).
  16. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Behavior, body patterning and reproductive-biology of octopus-bimaculoides from California. Malacologia. 29 (1), 41-55 (1988).
  17. Pickford, B. M. The Octopus bimaculatus problem: A study in sibling species. Bulletin of the Bingham Oceanographic Collection. 12, 1-66 (1949).
  18. Sumbre, Y., Fiorito, G., Flash, T. Control of octopus arm extension by a peripheral motor program. Science. 293 (5536), 1845-1848 (2001).
  19. Gutfreund, Y., et al. Organization of octopus arm movements: a model system for studying the control of flexible arms. Journal of Neuroscience. 16 (22), 7297-7307 (1996).
  20. Gutfreund, Y., Matzner, H., Flash, T., Hochner, B. Patterns of motor activity in the isolated nerve cord of the octopus arm. The Biological Bulletin. 211 (3), 212-222 (2006).
  21. Hague, T., Florini, M., Andrews, P. L. R. Preliminary in vitro functional evidence for reflex responses to noxious stimuli in the arms of Octopus vulgaris. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 100-105 (2013).
  22. Hochner, B., Brown, E. R., Langella, M., Shomrat, T., Fiorito, G. A learning and memory area in the octopus brain manifests a vertebrate-like long-term potentiation. Journal of Neurophysiology. 90 (5), 3547-3554 (2003).
  23. Hochner, B., Glanzman, D. L. Evolution of highly diverse forms of behavior in molluscs. Current Biology. 26 (20), 965-971 (2016).
  24. Hvorecny, L. M., et al. Octopuses (Octopus bimaculoides) and cuttlefishes (Sepia pharaonis, S. officinalis) can conditionally discriminate. Animal Cognition. 10 (4), 449-459 (2007).
  25. Kier, W. M., Stella, M. P. The arrangement and function of octopus arm musculature and connective tissue. Journal of Morphology. 268 (10), 831-843 (2007).
  26. Levy, G., Hochner, B. Embodied organization of octopus vulgaris morphology, vision, and locomotion. Frontiers in Physiology. 8, 164 (2017).
  27. Giorgio-Serchi, F., Arienti, A., Laschi, C. Underwater soft-bodied pulsed-jet thrusters: Actuator modeling and performance profiling. The International Journal of Robotics Research. 35 (11), 1308-1329 (2016).
  28. Han, S., Kim, T., Kim, D., Park, Y., Jo, S. Use of deep learning for characterization of microfluidic soft sensors. IEEE Robotics and Automation Letters. 3 (2), 873-880 (2018).
  29. Hanassy, S., Botvinnik, A., Flash, T., Hochner, B. Stereotypical reaching movements of the octopus involve both bend propagation and arm elongation. Bioinspiration and Biomimetics. 10 (3), 035001 (2015).
  30. Hochner, B., Shomrat, T., Fiorito, G. The octopus: a model for a comparative analysis of the evolution of learning and memory mechanisms. The Biological Bulletin. 210 (3), 308-317 (2006).
  31. Imperadore, P., Fiorito, G. Cephalopod tissue regeneration: consolidating over a century of knowledge. Frontiers in Physiology. 9, 593 (2018).
  32. Imperadore, P., et al. Nerve regeneration in the cephalopod mollusc Octopus vulgaris: label-free multiphoton microscopy as a tool for investigation. Journal of the Royal Society, Interface. 15 (141), 20170889 (2018).
  33. Levy, G., Flash, T., Hochner, B. Arm coordination in octopus crawling involves unique motor control strategies. Current Biology. 25 (9), 1195-1200 (2015).
  34. Li, F., et al. Chromosome-level genome assembly of the East Asian common octopus (Octopus sinensis) using PacBio sequencing and Hi-C technology. Molecular Ecology Resources. 20 (6), 1572-1582 (2020).
  35. Lopes, V. M., Rosa, R., Costa, P. R. Presence and persistence of the amnesic shellfish poisoning toxin, domoic acid, in octopus and cuttlefish brains. Marine Environmental Research. 133, 45-48 (2018).
  36. Mazzolai, B., Margheri, L., Dario, P., Laschi, C. Measurements of octopus arm elongation: Evidence of differences by body size and gender. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 160-164 (2013).
  37. McMahan, W., et al. Proceedings 2006 IEEE International Conference on Robotics and Automation, 2006. , 2336-2341 (2006).
  38. Meisel, D. V., Kuba, M., Byrne, R. A., Mather, J. The effect of predatory presence on the temporal organization of activity in Octopus vulgaris. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 75-79 (2013).
  39. Nesher, N., Levy, G., Grasso, F. W., Hochner, B. Self-recognition mechanism between skin and suckers prevents octopus arms from interfering with each other. Current Biology. 24 (11), 1271-1275 (2014).
  40. Wells, M. J. Octopus : Physiology and behaviour of an advanced invertebrate. , Chapman and Hall. Halsted Press. (1978).
  41. Young, J. Z. The anatomy of the nervous system of Octopus vulgaris. , Clarendon Press. (1971).
  42. Zullo, L., Sumbre, G., Agnisola, C., Flash, T., Hochner, B. Nonsomatotopic organization of the higher motor centers in octopus. Current Biology. 19 (19), 1632-1636 (2009).
  43. Albertin, C. B., et al. The octopus genome and the evolution of cephalopod neural and morphological novelties. Nature. 524 (7564), 220-224 (2015).
  44. Albertin, C. B., Simakov, O. Cephalopod Biology: At the intersection between genomic and organismal novelties. Annual Review if Animal Biosciences. 8, 71-90 (2020).
  45. Baik, S., et al. A wet-tolerant adhesive patch inspired by protuberances in suction cups of octopi. Nature. 546 (7658), 396-400 (2017).
  46. Pikul, J. H., et al. Stretchable surfaces with programmable 3D texture morphing for synthetic camouflaging skins. Science. 358 (6360), 210 (2017).
  47. Wehner, M., et al. An integrated design and fabrication strategy for entirely soft, autonomous robots. Nature. 536 (7617), 451-455 (2016).
  48. McMahan, W., et al. Field trials and testing of the OctArm continuum manipulator. Proceedings 2006 IEEE International Conference on Robotics and Automation, 2006. ICRA. , 2336-2341 (2006).
  49. Hochner, B., Brown, E. R., Langella, M., Shomrat, T., Fiorito, G. A learning and memory area in the octopus brain manifests a vertebrate-like long-term potentiation. Journal of Neurophysiology. 90 (5), 3547-3554 (2003).
  50. Tapia-Vasquez, A. E., et al. Proteomic identification and physicochemical characterisation of paramyosin and collagen from octopus (Octopus vulgaris) and jumbo squid (Dosidicus gigas). International Journal of Food Science & Technology. 55 (10), 3246-3253 (2020).
  51. Kim, B. -M., et al. The genome of common long-arm octopus Octopus minor. GigaScience. 7 (11), (2018).
  52. Zarrella, I., et al. The survey and reference assisted assembly of the Octopus vulgaris genome. Scientific data. 6 (1), 13 (2019).
  53. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Effect of temperature on laboratory growth, reproduction and life span of Octopus bimaculoides. Marine Biology. 98 (3), 369-379 (1988).
  54. Stoskopf, M. K., Oppenheim, B. S. Anatomic features of Octopus bimaculoides and Octopus digueti. Journal of Zoo and Wildlife Medicine. 27 (1), 1-18 (1996).
  55. Ramos, J. E., et al. Body size, growth and life span: implications for the polewards range shift of Octopus tetricus in south-eastern Australia. PLoS One. 9 (8), 103480 (2014).
  56. Hanlon, R. T., Forsythe, J. W. Advances in the laboratory culture of octopuses for biomedical research. Lab Animal Science. 35 (1), 33-40 (1985).
  57. Moltschaniwskyj, N. A., Carter, C. G. Protein synthesis, degradation, and retention: mechanisms of indeterminate growth in cephalopods. Physiological and Biochemical Zoology. 83 (6), 997-1008 (2010).
  58. Fiorito, G., et al. Guidelines for the care and welfare of Cephalopods in Research -A consensus based on an initiative by CephRes, FELASA and the Boyd Group. Lab Animal. 49, 2 Suppl 1-90 (2015).
  59. Valverde, J. C., Garcia, B. G. Suitable dissolved oxygen levels for common octopus (Octopus vulgaris cuvier, 1797) at different weights and temperatures: analysis of respiratory behaviour. Aquaculture. 244 (1-4), 303-314 (2005).
  60. Cardeilhac, P. T., Whitaker, B. R. Copper Treatments: Uses and Precautions. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. 18 (2), 435-448 (1988).
  61. Hodson, P. V., Borgman, U., Shear, H. Toxicity of copper to aquatic biota. Copper in the Environment. (2), John Wiley. 307-372 (1979).
  62. Poole, B. M. Techniques for the culture of ghost shrimp (palaemonetes pugio). Environmental Toxicology and Chemistry. 7 (12), 989-995 (1988).
  63. Burggren, W. W. Respiration and circulation in land crabs: novel variations on the marine design. American Zoologist. 32 (3), 417-427 (1992).
  64. Reitsma, J., Murphy, D. C., Archer, A. F., York, R. H. Nitrogen extraction potential of wild and cultured bivalves harvested from nearshore waters of Cape Cod, USA. Marine Pollution Bulletin. 116 (1), 175-181 (2017).
  65. Messenger, J. B. Cephalopod chromatophores: neurobiology and natural history. Biological Reviews. 76 (4), 473-528 (2001).
  66. Morgan Holst, M. M., Miller-Morgan, T. The Use of a species-specific health and welfare assessment tool for the giant pacific octopus, enteroctopus dofleini. Journal of Applied Animal Welfare Science. 24 (3), 272-291 (2021).
  67. Rosas, C., et al. Energy balance of Octopus maya fed crab or an artificial diet. Marine Biology. 152 (2), 371-381 (2007).
  68. Anderson, R. C., Wood, J. B., Byrne, R. A. Octopus Senescence: The Beginning of the end. Journal of Applied Animal Welfare Science. 5 (4), 275-283 (2002).
  69. Butler-Struben, H. M., Brophy, S. M., Johnson, N. A., Crook, R. J. In vivo recording of neural and behavioral correlates of anesthesia induction, reversal, and euthanasia in cephalopod molluscs. Frontiers in Physiology. 9, 109 (2018).
  70. Jiang, X., et al. Octopus visual system: A functional MRI model for detecting neuronal electric currents without a blood-oxygen-level-dependent confound. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1311-1319 (2014).
  71. Hennig, J., Nauerth, A., Friedburg, H. RARE imaging: a fast imaging method for clinical MR. Magnetic Resonance in Medicine. 3 (6), 823-833 (1986).
  72. Brant-Zawadzki, M., Gillan, G. D., Nitz, W. R. MP RAGE: a three-dimensional, T1-weighted, gradient-echo sequence--initial experience in the brain. Radiology. 182 (3), 769-775 (1992).
  73. emit-Xerra. , Available from: http://emit-imaging.com/xerra/ (2021).
  74. Bertapelle, C., Polese, G., Di Cosmo, A. Enriched environment increases PCNA and PARP1 Levels in Octopus vulgaris central nervous system: first evidence of adult neurogenesis in Lophotrochozoa. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (4), 347-359 (2017).
  75. Maselli, V., Polese, G., Soudy, A. -S. A., Buglione, M., Cosmo, A. D. Cognitive stimulation induces differential gene expression in Octopus vulgaris: The key role of protocadherins. Biology. 9, Basel. (2020).

Tags

Bioengineering udgave 175
Etablering af et blæksprutteøkosystem til biomedicinsk og bioengineeringsforskning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

VanBuren, T., Cywiak, C., Telgkamp,… More

VanBuren, T., Cywiak, C., Telgkamp, P., Mallett, C. L., Pelled, G. Establishing an Octopus Ecosystem for Biomedical and Bioengineering Research. J. Vis. Exp. (175), e62705, doi:10.3791/62705 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter