Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vævssamling og RNA-udvinding fra human osteoarthritic knee joint

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Primære væv fra patienter efter total knæ leddyr giver en eksperimentel model for slidgigt forskning med maksimal klinisk oversættelsesevne. Denne protokol beskriver, hvordan man identificerer, behandler og isolerer RNA fra syv unikke knævæv for at støtte mekanistisk undersøgelse i human slidgigt.

Abstract

Slidgigt (OA) er en kronisk og degenerativ ledsygdom, der oftest påvirker knæet. Da der i øjeblikket ikke er nogen kur, er total knæ leddyr (TKA) et almindeligt kirurgisk indgreb. Forsøg med primære humane OA-væv fra TKA giver mulighed for at undersøge sygdomsmekanismer ex vivo. Mens OA tidligere blev anset for at påvirke primært brusk, Det er nu kendt for at påvirke flere væv i leddet. Denne protokol beskriver patientvalg, prøvebehandling, vævs homogenisering, RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol (baseret på RNA-renhed, integritet og udbytte) fra hvert af syv unikke væv til støtte for sygdomsmekanismeundersøgelse i knæleddet. Med informeret samtykke blev der udtaget prøver fra patienter, der gennemgik TKA for OA. Væv blev dissekeret, vasket, og opbevares inden for 4 timer af kirurgi ved flash frysning for RNA eller formalin fiksering for histologi. Indsamlet væv omfattede ledbrusk, subchondral knogle, menisk, infrapatellar fedt pad, forreste korsbånd, synovium, og vastus medialis skrå muskel. RNA-ekstraktionsprotokoller blev testet for hver vævstype. Den mest betydningsfulde ændring involverede den metode til opløsning, der anvendes til lavcellet, højmatrix, hårdt væv (betragtes som brusk, knogle og menisk) versus relativt højcellet, lavmatrix, blødt væv (betragtes som fedtpude, ledbånd, synovium og muskler). Det blev konstateret, at pulverisering var passende for hårdt væv, og homogenisering var passende for blødt væv. En tilbøjelighed for nogle forsøgspersoner til at give højere RNA integritet nummer (RIN) værdier end andre forsøgspersoner konsekvent på tværs af flere væv blev observeret, hvilket tyder på, at underliggende faktorer såsom sygdom sværhedsgrad kan påvirke RNA kvalitet. Evnen til at isolere RNA af høj kvalitet fra primære humane OA-væv giver en fysiologisk relevant model for sofistikerede genekspressionsforsøg, herunder sekventering, der kan føre til klinisk indsigt, der lettere oversættes til patienter.

Introduction

Knæet er den største synoviale fælles i den menneskelige krop, der omfatter tibiofemoral fælles mellem skinnebenet og lårbenet og patellofemoral fælles mellem patella og lårbenet1. Knoglerne i knæet er foret med ledbrusk og understøttes af forskellige bindevæv, herunder menisci, fedt, ledbånd og muskler, og en synovial membran indkapsler hele leddet for at skabe et synovialvæskefyldt hulrum1,2,3 ( Figur1). Et sundt knæ fungerer som en mobil hængselled, der tillader friktionsfri bevægelse i frontplan1,3. Under patologiske forhold kan bevægelse blive begrænset og smertefuld. Den mest almindelige degenerative knæledsygdom er slidgigt (OA)4. En række risikofaktorer er kendt for at prædisponere for OA udvikling, herunder ældre alder, fedme, kvindelig sex, fælles traumer, og genetik, blandt andre5,6. Der er i øjeblikket en anslået 14 millioner mennesker i USA med symptomatisk knæ OA, med forekomsten stigende på grund af stigende befolkning alder og satser for fedme7,8. Oprindeligt anses for at være en sygdom i brusk, OA er nu forstået som en sygdom i hele fælles9. Almindeligt observerede patologiske ændringer i OA omfatter ledbrusk erosion, osteophyte dannelse, subchondral knogle fortykkelse, og betændelse i synovium9,10. Da der ikke er nogen kendt kur mod OA, fokuserer behandlinger primært på symptom (f.eks. smertebehandling)11,12, og når OA er gået videre til slutstadiet, er ledudskiftningskirurgi ofte angivet13.

Fælles udskiftning operationer kan enten være delvis eller total knæ udskiftninger, med total knæ leddyr (TKA), herunder udskiftning af hele tibiofemoral artikulation og patellofemoral fælles. Fra 2020 udføres ca. 1 million TSA'er i USA hvert år14. Under TKA resects en ortopædkirurg den øverste del af tibial plateauet og de nedre lårbenskondyler (figur 2A, 2B), der skal udstyres med proteseimplantater. Nogle gange fejlfortolkes af patienter, i en TKA, kun 8-10 mm resected fra slutningen af hver knogle, som efterfølgende er udjævnet eller dukket op igen, med metal. En indspættet polyethylenforing danner lejeoverfladen (dvs. polstring) mellem de to metalimplantater. Derudover er flere bløde vævskomponenter i leddet helt eller delvist fjernet for at opnå en ordentlig fælles balance. Blandt disse væv er mediale og laterale menisci (Figur 2C), infrapatellar fedt pad (Figur 2D), forreste korsbånd (ACL; Figur 2E), synovium (Figur 2F) og vastus medialis skrå muskel (VMO; Figur 2G) 15. Selvom TKAs generelt er en succes for OA behandling, omkring 20% af patienterne rapporterer tilbagevendende smerter efter operationen16. Sammen med de høje omkostninger og relative invasivitet af proceduren, disse begrænsninger peger på behovet for yderligere forskning for at identificere alternative behandlinger for at afbøde udviklingen af OA.

At udforske sygdomsmekanismer i OA, der kan præsentere nye muligheder for terapeutisk intervention, eksperimentelle systemer, herunder celler, væv explants, og dyremodeller kan anvendes. Celler dyrkes typisk i monolag og er afledt af primære humane eller animalske væv (f.eks chondrocytter isoleret fra brusk) eller udødeliggjorte celler (f.eks ATDC517 og CHON-00118). Mens celler kan være nyttige til at manipulere eksperimentelle variabler i et kontrolleret kulturmiljø, fanger de ikke betingelserne for det naturlige led, som er kendt for at påvirke cellefænotyper19. For bedre at generobre den komplekse kaskade af kemisk, mekanisk og celle-til-celle kommunikation, der ligger til grund for OA, findes der et alternativ i primære humane eller animalske vævsprøver, hvad enten de anvendes friske eller kultiverede ex vivo som explants, for at bevare vævsstrukturen og cellemikromiljøet20. For at studere den fælles in vivoer små (f.eks. mus21) og store (f.eks. heste22) dyremodeller for OA (f.eks. gennem kirurgisk induktion, genetisk ændring eller aldring) også nyttige. Oversættelse fra disse modeller til menneskelig sygdom kan dog begrænses af anatomiske, fysiologiske og metaboliske forskelle, blandt andre23. I betragtning af fordele og ulemper ved eksperimentelle systemer maksimerer de vigtigste styrker ved at være artsspecifikke og opretholde den ekstracellulære niche, der tilbydes af det primære menneskelige OA-væv, forskningsresultaternes translationelle potentiale.

Primære humane OA væv kan let opnås efter TKA, hvilket gør den høje frekvens af TKAs en værdifuld ressource for forskning. Blandt potentielle eksperimentelle anvendelser er genekspression og histologiske analyser. At realisere potentialet i primære menneskelige OA væv for disse forskningsmetoder og andre, skitseret er følgende centrale overvejelser. For det første er brugen af patientprøver underlagt etisk regulering, og protokoller skal opfylde IRB's godkendelser (Institutional Review Board)24. For det andet skaber den iboende heterogenitet af humane primære syge væv og påvirkningen af variabler som alder og køn blandt andet behovet for omhyggelig patientvalg (dvs. anvendelse af kriterier for støtteberettigelse) og datafortolkning. For det tredje kan de unikke biologiske egenskaber ved forskellige væv i leddet (f.eks. lav cellulæritet af brusk og menisk25)give udfordringer under forsøg (f.eks. isolering af høj kvalitet og mængde RNA). Denne rapport behandler disse overvejelser og indeholder en protokol for patientvalg, prøvebehandling, vævs homogenisering, RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol (dvs. vurdering af RNA-renhed og -integritet; Figur 3) at tilskynde til brug af primære humane OA væv i forskersamfundet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse protokol blev godkendt og fulgte institutionelle retningslinjer, der er fastsat af Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB # 13995).

1. Patientvalg

  1. Identificer patienterne blandt dem, der er planlagt til at gennemgå TKA med en ortopædkirurg.
  2. Vælg patienterne baseret på de kriterier for støtteberettigelse, der er defineret i forsøgsprotokollen. Eksempler på inklusionskriterier omfatter at være 18 år eller ældre og have en bekræftet diagnose af knæ slidgigt. Eksempler på udelukkelseskriterier omfatter gennemgår delvis knæ udskiftning eller har en bekræftet diagnose af leddegigt.
  3. Kontakt patienterne for at få informeret samtykke forud for operationen.

2. Prøvebehandling (til RNA)

BEMÆRK: Udfør al vævsbehandling i et klasse II biosikkerhedskab, og følg sterile teknikker. Brug altid passende PPE (nitrilhandsker, kittel, sikkerhedsbriller) ved behandling af humane prøver. Flere knoglefragmenter produceres under TKA, en stor mængde knogle / brusk vil potentielt være til rådighed for dissektion. På grund af sygdomsprogression, ledbrusk degeneration kan være mere alvorlig på nogle knogledele, som kan indregnes i eksperimentelle design. Kun væv, der mandat elektrokauteri for resektion har termiske kant skader, og en samordnet kirurgisk indsats er lavet for at skaffe de fleste væv med en skalpel for at minimere skader. Resected væv skal holdes hydreret på alle tidspunkter med steril PBS.

  1. Desinficer alle arbejdsflader og udstyr med 70% ethanol, RNase dekontaminering, DEPC-behandlet vand og igen med 70% ethanol. Tør restvæsken af med rent, fnugfrit væv. Sammenkædninger, knogleskærere og skalpeller er enten autoklavede eller gennemblødte i 70% ethanol i mindst 10 minutter før brug. Hold udstyret nedsænket i 70% ethanol, når det ikke er i umiddelbar brug.
  2. Pre-label mindst tre cryovials med afidentificeret prøve navn og aliquot nummer for hvert væv (f.eks TKA-1 Brusk 1).
    1. Identificer hver vævstype fra prøven baseret på forskellene i størrelse, form, farve og tekstur som vist og beskrevet i figur 2. Identificer brusk (Figur 2A pil), knogle (Figur 2B pil), menisk (Figur 2C), infrapatellar fedt pad (Figur 2D), forreste korsbånd (Figur 2E), synovium (Figur 2F), og vastus medialis skrå muskel (Figur 2G).
  3. Isoler ledbrusk.
    1. Vælg en knogledel med minimal bruskforringelse.
    2. Brug en No.10 skalpel, skære gennem brusk dybde så vidt muligt at dissekere den fulde tykkelse af brusk lag.
      BEMÆRK: En Skalpel nr. 10 vil kun trænge ind i brusk, ikke knogle.
    3. Brug bruskens fulde tykkelse, dissekerer tre 5 mm terninger.
  4. Isoler subchondral knoglen.
    1. Brug den samme knoglesektion, hvorfra brusk blev indsamlet.
    2. Brug en No.10 skalpel, skrabe eventuelle resterende brusk og resterende væv fra knogleoverfladen.
    3. Hold knogledelen, der skal skæres med sammenkrump og brug knogleskærerne til at skære tre 5 mm terninger.
  5. Isoler menisken.
    1. Identificer en relativt ubeskadiget del af enten mediale eller laterale menisk.
    2. Ved hjælp af en No.10 skalpel og sammentræd, dissekere tre 5 mm terninger.
  6. Isoler infrapatellar fedt pad.
    1. Ved hjælp af en No.10 skalpel og tang, skære den gule del af vævet i tre lige store og homogene portioner (~ 500 mg hver).
  7. Isoler det forreste korsbånd (ACL).
    1. Ved hjælp af en No.10 skalpel og sammentræd, dissekere tre 5 mm terninger.
  8. Isoler synoviummet.
    1. Brug en No.10 skalpel og sammentrækninger, isolere den lyserøde cellulære del af membranen så meget som muligt ved at skrabe væk fedtvæv.
    2. Dissekere tre lige store og homogene portioner (~ 200 mg hver).
  9. Isoler vastus medialis skrå muskel (VMO).
    1. Brug en No.10 skalpel og sammentræd, fjerne fedtvæv fra prøven, forlader kun det røde muskelvæv.
    2. Dissekere tre 5 mm terninger.
      BEMÆRK: Den oprindelige størrelse af vævet begrænser størrelsen af portionerne.
  10. Skyl vævsdelene med steril PBS for at fjerne eventuelle rester eller snavs.
  11. For at udføre histologi skal du rette hver vævsdel som beskrevet i del 3.
  12. For at udføre RNA-ekstraktion skal du skære hver af de tre vævsdele i mindre stykker (~ 1-2 mm   terninger).
    1. Overfør de mindre stykker til en 2 mL cryovial, sikker hætter tæt, flash fryse ved at nedsænke i flydende nitrogen i 30 s, og derefter overføre til en -80 °C fryser til langtidsopbevaring (op til 4 måneder testet i den nuværende protokol). Gentag dette for alle aliquots af alle væv.
    2. Fortsæt til vævs homogenisering som beskrevet i del 4.

3. Prøvebehandling (til histologi)

FORSIGTIG: Formalin er et farligt kemikalie, der kun anvendes i en kemisk røghætte.

  1. Fyld præmærkede 15 ML koniske rør med 10% formalinopløsning.
  2. Ved hjælp af sammenkøjere overføres vævssektionen til de formalinfyldte rør.
  3. Fastgør vævene i formalin i 1 uge ved stuetemperatur, mens du ryster / ophidser, hvis det er muligt.
  4. Efter 1 uge skal formalinen kasseres i korrekt bortskaffelse af kemisk affald, skylle vævene med PBS og derefter overføres til et friskt 15 mL konisk rør, der indeholder 70% ethanol til langtidsopbevaring ved 4 °C, indtil prøverne er indlejret til indskæring.
    BEMÆRK: Kun for ben/brusk skal du udføre afkalkning som følger.
  5. Efter 1 uge skal formalinen kasseres i korrekt bortskaffelse af kemisk affald og skylle vævene med PBS.
  6. Vævet overføres til et 50 mL konisk rør med 45 mL 10% EDTA-opløsning (pH 7.4).
  7. Hvis det ikke er muligt at ryste/omrøre, skal rørene vendes 10-15 gange dagligt.
  8. Kassér og udskift EDTA-løsningen én gang om ugen.
    1. To gange om ugen testes teksturen med et instrument (dvs. spatel) eller behandskede finger for at bekræfte afkalkning ved at observere deformation, når trykket påføres. Den tid, det tager at afkalke knoglevævet, vil variere mellem prøverne fra 4-6 uger.
  9. Når vævet er afkalket, skylles det med PBS, og der overføres til et friskt 15 mL konisk rør, der indeholder 70 % ethanol til langtidsopbevaring ved 4 °C, indtil prøverne er indlejret til indskæring.

4. Vævs homogenisering

FORSIGTIG: Protokollen bruger det farlige kemiske phenol. Arbejde med phenol skal udføres i en kemisk røghætte.

BEMÆRK: Rengør alt udstyr og overflader, der skal anvendes med 70% ethanol (blød i mindst 10 min), efterfulgt af RNase dekontaminering (blød i mindst 10 min), skyl med DEPC-behandlet vand, tør af med et rent, fnugfrit køkkenrulle og derefter respray eller blød med 70% ethanol.

  1. Homogenisering af hårdt væv (ledbrusk, subchondral knogle, menisk)
    1. Før homogenisering, chill mørtel, støder, og spatel ved hjælp af flydende nitrogen. Disse skal holdes så kolde som muligt for at forhindre tøprøve.
    2. Prøverne behandles én ad gangen, og de øvrige prøver opbevares ved -80 °C, indtil de anvendes.
    3. Vævsprøven overføres til mørtel ved hjælp af en kølet spatel. hæld yderligere flydende nitrogen oven på vævet og lad det fordampe. Knus vævet ved hjælp af støderen. Gentagne gange tilsættes mere flydende nitrogen til vævsprøven, lad det fordampe, og fortsæt derefter med at slibe med støderen for at lave et fint pulver.
    4. Efter pulverformning af vævet så meget som muligt overføres til et forkølet 1,5 mL mikrocentrifugerør.
      1. Pre-chill rør ved at nedsænke i flydende nitrogen i 30 s før væv overførsel.
    5. Tilsæt 1 mL af syre-guanidinium-phenolopløsningen til hvert rør og hold den på is.
    6. 1.1.3-4.1.5 for hver hård vævsprøve.
    7. Efter hvert væv, rengør mørtel, støder, og spatel med 70% ethanol, RNase dekontaminering, DEPC-behandlet vand, og en ekstra blød i 70% ethanol. Tør eventuel resterende væske af med et rent, fnugfrit væv.
    8. Inkuber prøverne på is i yderligere 20 min.
  2. Homogenisering af blødt væv (infrapatellarfedtpude, ACL, synovium, VMO)
    1. Desinficer homogenisatoren ved at køre rør af 70% ethanol, RNase dekontaminering, DEPC-behandlet vand og yderligere 70% ethanolvask, hver for 30 s. Tør eventuel resterende væske af med et rent, fnugfrit væv. Gentag dette mellem hvert eksempel.
    2. Pre-label 5 mL runde bundrør til hver prøve. Tilsæt 1 mL af syre-guanidinium-phenolopløsningen til hvert rør.
      1. Der arbejdes på én prøve ad gangen, så andre prøver kan behandles ved -80 °C, indtil de anvendes.
    3. Overfør vævet til et præmærket 5 mL rør med syre-guanidinium-phenol.
    4. Homogeniser vævene i 30 s pulser, holde på is under og mellem pulser. Gentag indtil vævet er visuelt opløst eller for højst fem 30 s pulser.
      BEMÆRK: Nogle fibrøse væv (dvs. muskel) kan ikke homogeniseres grundigt.
    5. Inkuber det opløste væv på is og gå videre til den næste prøve.
      1. Homogenisatoren rengøres som beskrevet i trin 4.2.1. Sørg for vævsstykker ikke forbliver i tænderne på sonden; fjernes med sterile sammenkriske kræfter, hvis det er nødvendigt.
    6. Efter homogenisering af alle prøverne inkuberes på is i syre-guanidinium-phenol i yderligere 20 min.
    7. Prøverne overføres fra runde bundrør til præmærkede og forkølede 1,5 mL mikrocentrifugrør.

5. RNA-udvinding fra væv

FORSIGTIG: Denne protokol anvender farlige kemikalier som phenol, kloroform og isopropanol. Udfør alt arbejdet i en kemisk røghætte.

BEMÆRK: Udstyr og reagenser er kun forbeholdt RNA-arbejde og skal være af passende kemisk kvalitet til molekylære anvendelser (dvs. sterilt, nukleasefrit). Denne protokol følger både afsnit 4.1 og 4.2 vævs homogenisering protokoller. Rengør alt udstyr og overflader, der skal anvendes med 70% ethanol (blød i mindst 10 min), efterfulgt af RNase dekontaminering (blød i mindst 10 min). Skyl med DEPC-behandlet vand, tør den resterende væske af med et rent, fnugfrit køkkenrulle, og sprøjt eller blød derefter med 70% ethanol.

  1. Centrifuge mikrocentrifugerørene ved 10000 x g i 10 min ved 4 °C for at pille snavs.
  2. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 mL mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: For fedtvæv vil et lipidlag nogle gange være til stede på toppen. Undgå at overføre dette ved at gennembore laget på siden af røret med en pipettespids.
  3. Der tilsættes 200 μL kloroform pr. 1 mL af syre-guanidinium-phenolopløsningen til hver prøve. Ryst rørene kraftigt i hånden i 30 s til at blande. Inkuber derefter på is i 2 minutter.
  4. Centrifugeprøver ved 10000 x g i 12 min ved 4 °C.
    BEMÆRK: Efter centrifugering vil der være dannet tre lag: en vandig fase, der indeholder RNA, en hvid DNA-interfase og en lyserød proteinfase i bunden.
  5. Overfør ~500 μL af den øvre, vandige fase til et nyt 1,5 mL mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: Forstyr ikke interfasen og proteinfraktionerne. Opbevar disse faser ved -80 °C for fremtidig DNA- eller proteinisolation.
  6. Tilsæt en lige stor mængde syre-guanidinium-phenolopløsning til den overførte vandige fase, bland ved at vende røret 8-10 gange. Inkuber røret på is i 20 min.
  7. Der tilsættes 200 μL kloroform pr. 1 mL af syre-guanidinium-phenolopløsningen til hver prøve. Ryst kraftigt i hånden i 30 s til at blande og derefter inkubere på is i 2 min.
  8. Centrifugeprøver ved 10000 x g i 12 min ved 4 °C.
  9. Overfør <500 μL af vandig fase til et nyt mikrocentrifugrør, pas på ikke at forurene prøven med de andre faser.
    FORSIGTIG: Kassér de resterende faser med passende metoder til bortskaffelse af farligt materiale.
  10. Tilsæt et lige stort volumen (som vandig fase) på 100% isopropanol til hver prøve. Bland ved at vende røret 8-10 gange. Inkuber på is i 5 minutter.
    1. Der tilsættes 1 μL glykogen coprecipitant til hver prøve for at hjælpe med at lokalisere RNA-pelleten efter centrifugering.
  11. Centrifugere prøverne ved 12000 x g i 25 min ved 4 °C.
  12. Find pellet i røret (hvis du bruger coprecipitant, vil det fremstå blåt). Hæld forsigtigt supernatanten af.
  13. Vask pellet ved at tilføje 1 mL iskold 75% ethanol til hver prøve, vortex at løsne pellet fra bunden af røret.
    BEMÆRK: Forbered 75% ethanol ved hjælp af molekylær kvalitet ren ethanol og nucleasefrit vand.
  14. Centrifuge ved 7000 x g i 5 min ved 4 °C. Hæld forsigtigt supernatanten af.
  15. Gentag trin 5.13 og 5.14 to gange mere.
  16. Quick spin (<2000 x g for 5 s) for at bringe eventuel resterende væske til bunden af røret. Brug en P20 pipette til at fjerne eventuelle resterende ethanol fra bunden af rørene.
    1. Undgå at røre ved RNA-pelleten med en pipettespids. Skift tip mellem prøverne.
  17. Med rørhætter åbne, lufttørre prøver ved stuetemperatur i 10 min.
    BEMÆRK: Pellet kan blive gennemsigtig, når den tørrer. At sikre, at al restethanol er fordampet, vil forbedre RNA-renheden.
  18. Tilsæt 25 μL nucleasefrit vand til hvert rør for at opløse pelleten.
  19. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
  20. Rør forsigtigt op og ned for at blande RNA'et.
  21. Aliquot 5 μL af prøven i et nyt rør til kvalitetskontrolanalyse (del 6). Opbevar de resterende 20 μL ved -80 °C til genekspressionsanalyser.

6. Kvalitetskontrol

  1. Bestem RNA's koncentration og renhed ved hjælp af et spektrofotometer i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
  2. Bestem RNA-integriteten ved hjælp af en elektroforeseenhed i overensstemmelse med producentens anvisninger.
    BEMÆRK: Fortynd RNA'et til at være inden for spåndetekteringsgrænserne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Syv unikke menneskelige knæled væv er tilgængelige for indsamling fra patienter, der gennemgår TKA for OA (Figur 1). I denne protokol blev hvert af disse væv identificeret og behandlet inden for 4 timer efter kirurgisk fjernelse (Figur 2). Efter de trin, der er beskrevet i figur 3, blev dele af hvert væv formalin-faste til histologisk vurdering (figur 4), mens andre dele blev flash-frosne til RNA-isolation. Adskillelse af hårdt væv fra blødt væv ved opløsningsmetode (henholdsvis pulverisering versus homogenisering), RNA med høj integritet og renhed blev udvundet fra hver vævstype med repræsentative resultater vist i tabel 1 (kolonner af høj kvalitet). Især, nogle forsøgspersoner gav lavere kvalitet RNA på tværs af flere væv(Tabel 1, Lav kvalitet kolonner), tyder på, at på trods af en optimeret metode, eksterne faktorer (f.eks sygdom sværhedsgrad) kan påvirke RNA kvalitet på tværs af vævstyper.

Figure 1
Figur 1: Skematisk for det menneskelige knæled, der viser et sidekors. Hver af de syv mærkede væv indsamles under TKA og anvendes til forskningsformål som beskrevet i denne protokol. VMO = vastus medialis skrå muskel. Billede adgang til og ændret fra OpenStax College under en kreativ commons licens26. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative bruttobilleder for hvert af de syv væv, der er fremstillet af patienter, der gennemgår TKA. (A) Forreste lårbensknogle skåret med pil, der peger på ledbrusk, der skal indsamles. Brusk er identificeret ved en hvidlig lag findes på overfladen af knoglen. (B) Forreste lårbensknogle skåret med pil, der peger på subchondral knogle, der skal indsamles. (C) Menisk. Undgå at indsamle brændte sektioner forårsaget af elektrokauterisering under TKA. (D) Infrapatellar fedt pad (gul i farve). (E) Forreste korsbånd (hvid, fibrøst, svampet væv). (F) Synovium. Den ene side vil fremstå lyse og fibrøst, ofte indeholdende fedtvæv, mens den modsatte side vil fremstå lyserød og mindre fibrøst. Den lyserøde side af membranen indeholder synovialfor. (G) Vastus medialis skrå muskel (rød). Dette kan ofte være den mindste vævsdel og kan indeholde nogle fedtvæv. Skalalinje = 2 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Oversigt over de skridt, der er taget for at indsamle primære humane OA væv til histologi og RNA. Denne protokol beskriver patientvalg, prøvebehandling for histologi og RNA, vævs homogenisering for hårdt væv og blødt væv, RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol for syv primære menneskelige knæ OA-væv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Histologiske sektioner for hvert af de syv væv, der er fremstillet af patienter, der gennemgår TKA. Hæmatoxylin og eosin-farvede sektioner er vist ved 6x forstørrelse i panel A-F med indsat forstørret til 40x i paneler A '-F' og A". (A, A') Ledbrusk; (A, A") subchondral knogle; (B, B') menisk; (C, C)infrapatellar fedt pad; D, D') forreste korsbånd; (E, E') synovium; (F, F') vastus medialis skrå muskel. Vægtstænger = 400 μm for A-F og 50 μm for A'-F' og A". Klik her for at se en større version af dette tal.

Væv N RIN - Det er en meget, vi skal have. (ng/μL) i 25 μL A260:A280 A260:A230
Høj kvalitet Lav kvalitet Høj kvalitet Lav kvalitet Høj kvalitet Lav kvalitet Høj kvalitet Lav kvalitet Høj kvalitet Lav kvalitet
"Hårdt væv"
Ledbrusk 10 4 7.0 ± 0,8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1.80 ± 0,09 1.47 ± 0,34 1.40 ± 0,36 0,45 ± 0,26
Subchondral knogle 10 4 7.8 ± 0,6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1.96 ± 0,05 1.90 ± 0,17 1.72 ± 0,27 1.12 ± 0,62
Menisk 10 4 7.5 ± 0,6 2.4 ± 0,3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1.91 ± 0,05 1.71 ± 0,15 1.41 ± 0,47 0,77 ± 0,59
"Blødt væv"
Infrapatellar Fat Pad 10 3 8.5 ± 0,6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1.99 ± 0.01 2.02 ± 0,03 2.09 ± 0,17 1.47 ± 0,71
Forreste korsbånd 8 3 7.4 ± 0,4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1.97 ± 0.03 1.91 ± 0.18 1.88 ± 0.20 1.35 ± 0,70
Synovium 9 3 8.5 ± 0,6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1.99 ± 0.04 2.00 ± 0,03 2.05 ± 0.11 1.91 ± 0.20
Vastus Medialis Skrå 9 3 8.5 ± 0,6 8.4 ± 0,7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1.96 ± 0.03 1.99 ± 0,03 1.82 ± 0.11 1.62 ± 0,27

Tabel 1. Kvalitet og kvantitet af RNA isoleret fra OA væv indsamlet fra TKA patienter. RIN = RNA-integritetsnummer. Data, der præsenteres som gennemsnitlige ± standardafvigelse for RIN, A260:A280 og A260:A230-nøgletal og middelværdi (interval) for RNA-koncentrationsværdier. Prøver af høj kvalitet består af patienter, hvorfra alle vævstyper gav RNA med RIN > 6 (n = 8-10). Prøver af lav kvalitet består af patienter, hvorfra flere vævstyper gav RNA med RIN < 6 (n = 3-4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den forelagte protokol har vist sig at være en succes med at indsamle syv primære humane OA-væv til RNA-udvinding (tabel 1) og histologisk behandling (figur 4). Før indsamling af patientprøver er det nødvendigt at etablere en IRB-godkendt protokol, ideelt i samarbejde med en kirurg eller et kirurgisk team. Anvendelse af en standardiseret protokol til indsamling af prøver (f.eks. resektion fra ensartede in situ-steder) er afgørende for at maksimere eksperimentel reproducerbarhed. Vævsprøver skal transporteres til laboratoriet i sterile beholdere og behandles inden for 4 timer efter operationen for at undgå nedbrydning. Under væv dissektion og behandling holdes alt væv hydreret i steril PBS og skylles i frisk, steril PBS for at fjerne potentielle overfladeforurenende stoffer som biofluider og andet uønsket snavs, før de flash-fryses til RNA-ekstraktion eller formalin-fast til histologi. En nyttig anvendelse af histologisk analyse er bekræftelse af vævstyperne og sygdommens sværhedsgrad, da disse kan skelnes af cellenummer, fordeling og morfologi, blandt andre faktorer, der kan observeres af standardpletter som hæmatoxylin og eosin (Figur 4).

Primære humane OA væv kan udgøre udfordringer for udvinding af RNA af tilstrækkelig mængde og kvalitet, som defineret ved renhed og integritet27. RNA mængde er en funktion af den samlede cellulære væv, og i knæleddet, der er lav-celle, high-matrix væv såsom brusk, knogle og menisk, og relativt høj-celle, lav-matrix væv såsom fedt pad, ACL, synovium, og VMO. For eksempel er både ledhyalinbrusk og meniscal fibrocartilage28 karakteriseret ved lav cellulæritet, med den ekstracellulære matrix, der indeholder varierende mængder kollagen, proteoglycaner og andre glycoproteiner28,29. Færre celler resulterer i mindre RNA pr. volumen væv (reducerende mængde) og mere protein resulterer i co-rensning med RNA (reduktion af renhed)25,30. RNA renhed kan bestemmes ved spektrofotometri, hvor A260:A280 og A260:A230 værdier af <1.5 afspejler tilstedeværelsen af organiske forurenende stoffer (f.eks protein) og værdier på ~ 2,0 afspejler ren RNA31. RNA-integriteten afspejler nedbrydningsniveauet, hvad enten det skyldes eksperimentelle tilstande (dvs. forskydningskræfter) eller af enzymatisk fordøjelse (f.eks. nukleaser), og bestemmes ofte af elektroforetemisk analyse. Et RNA Integrity Number (RIN) på 1 afspejler nedbrudt RNA , og en RIN på 10 afspejler intakt RNA31,32. Til RNA-sekventering anbefales et minimum RIN på 7 ofte33,34,35. Data præsenteret i tabel 1 viser, at disse A260:A280, A260:A230og RIN tærskler blev opfyldt på tværs af alle væv fra patienten prøver i høj kvalitet RNA gruppe sammenlignet med patient prøver i lav kvalitet RNA gruppe, bortset fra nogle A260:A230 værdier, som kan afspejle proteinforurening af RNA i lavcellevævet med høj matrix. Mens der er mange faktorer, der kan bidrage til kvaliteten af RNA isoleret fra en given patient prøve, blandt dem kan være niveauet af sygdommens sværhedsgrad. Den syge karakter af OA væv tyder nedbrydende processer sker gennem øgede niveauer af enzymer, der kan fordøje væv, men også RNA, og dermed reducere kvaliteten.

Denne protokol for RNA ekstraktion har til formål at maksimere RNA mængde og kvalitet fra primære menneskelige OA væv. Det mest kritiske skridt vedrørte, om vævene blev opløst ved at blive pulveriseret eller homogeniseret, og dette viste sig at korrelere med vævscellulæritet og matrixsammensætning. I første omgang blev alle syv væv underkastet den samme protokol, hvor væv først blev pulveriseret af mørtel og støder ved hjælp af flydende nitrogen, derefter overført til syre-guanidinium-phenolopløsning og yderligere homogeniseret ved hjælp af en håndholdt vævs homogenisator. Denne metode produceret gunstige RNA udbytte, renhed, og integritet for fedt pad, ACL, synovium, og VMO (kollektivt blødt væv, også, relativt høj celle, lav-matrix), men ugunstige resultater for brusk, knogle og menisk (kollektivt hårdt væv; også, lavcellet, høj-matrix). Baseret på disse observationer blev de syv væv opdelt i to grupper med henblik på yderligere protokolforbedring. Det blev observeret, at den yderligere homogenisering havde minimal effekt på yderligere opløsning af det hårde væv, efter at de var blevet pulveriseret til et fint pulver. Omvendt blev dissociation af det bløde væv med succes opnået med homogenisering alene og krævede ikke pulverisering. Derfor blev homogeniseringen af det hårde væv og pulveriseringen af det bløde væv elimineret. Dette var gavnligt for at minimere klipning kræfter, behandlingstid, og temperatur udsving, som alle kan forbedre RNA integritet. To runder af phenol /chloroform fase adskillelse for alle syv væv blev udført, da dette er blevet rapporteret at forbedre RNA renhed uden at reducere udbyttet31.

En potentiel begrænsning af denne protokol er den batcheffekt, der kan opstå ved at adskille vævene i to grupper, hvis det eksperimentelle design kræver sammenligning mellem alle væv. Anvendelsen af pulverisering versus homogeniseringsmetoder kan ændre tekniske (f.eks. behandlingstid) og miljømæssige (f.eks. temperaturudsving) forhold, der kan indføre variabilitet36. En anden begrænsning er den potentielle inkonsekvens i at identificere, dissekere og orientere (for histologisk afsnit) vævene inden for og på tværs af forsøgspersoner. En tredje begrænsning er vores manglende evne til at bekræfte potentielle sammenhænge mellem patientens sygdom sværhedsgrad og RNA kvalitet i den aktuelle rapport. En fjerde begrænsning er manglen på adgang til sunde kontrolvæv til sammenligning. Selvom kontrolprøver kan være tilgængelige fra kadavere, disse er mindre let tilgængelige end OA væv fra TKA. En eksperimentel strategi for at omgå dette er at bruge hvert emne som deres egen kontrol, uanset om de foretager sammenligninger på tværs af væv eller inden for væv, der sammenligner behandling med kontrol eller læsioneret med bevarede områder. Endelig tillader anvendelse af vævseksplanter til RNA-ekstraktion ikke genekspressionsanalyse af de enkelte celletyper, der udgør vævene (f.eks. synoviale fibroblaster versus synoviale makrofager37).

På trods af de noterede begrænsninger er primære menneskelige OA-væv en værdifuld ressource til forskning, der giver fordele i forhold til andre eksperimentelle systemer til OA, herunder bevarelse af celle niche23. Men, primære menneskelige OA væv kan være underudnyttet i forskning på grund af logistiske eller tekniske udfordringer. Denne protokol beskriver patientvalg, prøvebehandling, vævs homogenisering, RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol for at understøtte brugen af prøverne fra TKA. Efter prøvebehandling kan der forfølges flere eksperimentelle tilgange, herunder genekspression og histologi, blandt andre. Mest relevant for det hurtigt udviklende omics-område er evnen til at isolere tilstrækkelige mængder RNA af høj kvalitet til applikationer som RNA-sekventering38,39. Molekylære profiler kan sammenlignes inden for og på tværs af væv fra forsøgspersoner med specifikke sygdomsfænotyper (f.eks. baseret på alder, køn og andre OA risikofaktorer). Insights opnået kan informere nye terapeutiske veje, der lettere kan oversættes tilbage til OA patientpopulationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne takker de forsøgsdeltagere, der gjorde denne forskning mulig og dedikerer denne rapport til nye forskere inden for slidgigt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Tags

Biologi udgave 173
Vævssamling og RNA-udvinding fra human osteoarthritic knee joint
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter