Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Summary

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare l'estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 C. elegans e visualizzare l'attività di trascrizione in un sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans è stato un importante sistema modello per la ricerca biologica da quando è stato introdotto nel 1963. Tuttavia, C. elegans non è stato pienamente utilizzato nello studio biochimico delle reazioni biologiche utilizzando i suoi estratti nucleari come la trascrizione in vitro e la replicazione del DNA. Un ostacolo significativo per l'uso di C. elegans negli studi biochimici è interrompere la spessa cuticola esterna del nematode senza sacrificare l'attività dell'estratto nucleare. Mentre diversi metodi sono usati per rompere la cuticola, come l'omogeneizzazione di Dounce o la sonicazione, spesso portano all'instabilità delle proteine. Non esistono protocolli stabiliti per isolare proteine nucleari attive da larve o C. elegans adulti per reazioni in vitro . Qui, il protocollo descrive in dettaglio l'omogeneizzazione dello stadio larvale 4 C. elegans utilizzando un omogeneizzatore Balch. L'omogeneizzatore Balch utilizza la pressione per forzare lentamente gli animali attraverso uno stretto spazio che rompe la cuticola nel processo. Il design uniforme e la lavorazione precisa dell'omogeneizzatore Balch consentono una rettifica costante degli animali tra gli esperimenti. Il frazionamento dell'omogeneizzatore ottenuto dall'omogeneizzatore di Balch produce un estratto nucleare funzionalmente attivo che può essere utilizzato in un metodo in vitro per l'analisi dell'attività di trascrizione di C. elegans.

Introduction

Il piccolo nematode caenorhabditis elegans è un organismo modello semplice ma potente per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche. Fin dalla sua introduzione nel 1963, i nematodi sono stati preziosi per rispondere a domande di neurobiologia, metabolismo, invecchiamento, sviluppo, immunità e ^genetica1. Alcune delle molte caratteristiche dell'animale che lo rendono un organismo modello ideale includono il breve tempo di generazione, l'efficacia dell'interferenza dell'RNA, il corpo trasparente e le mappe completate sia del suo lignaggio cellulare che del sistema nervoso.

Mentre i contributi del nematode alla scienza sono vasti, sono stati sottoutilizzati per chiarire il sistema di trascrizione eucariotica, con la maggior parte della nostra comprensione di questi meccanismi proveniente da studi che utilizzano estratto nucleare da lievito, moscerino della frutta e coltura cellulare di ^mammiferi2. Il più grande ostacolo che dissuade i ricercatori dall'estrarre l'estratto nucleare funzionale è la cuticola esterna dura del nematode. Questo esoscheletro comprende collageni reticolati, cuticlini, glicoproteine e lipidi, rendendo C. elegans dallo stadio larvale all'età adulta resistente all'estrazione di proteine attraverso forze chimiche o ^meccaniche3. Un sistema di trascrizione in vitro che utilizza l'estratto nucleare di C. elegans è stato sviluppato una volta, ma non ampiamente adottato a causa della portata limitata del sistema, e l'uso dell'omogeneizzatore Dounce per preparare l'estratto potrebbe portare all'instabilità proteica4,5.

A differenza del precedente protocollo per l'isolamento dell'estratto nucleare che utilizzava un omogeneizzatore Dounce per rompere C. elegans, questo protocollo utilizza un omogeneizzatore Balch. L'omogeneizzatore Balch è costituito da due componenti principali: una sfera in carburo di tungsteno e un blocco in acciaio inossidabile con un canale forato da un'estremità all'altra. L'omogeneizzatore Balch viene caricato con la sfera in carburo di tungsteno e tappato su entrambi i lati per sigillare la camera di macinazione. Le siringhe possono essere caricate sulle due porte verticali che conducono nella camera di rettifica. Quando il materiale viene fatto passare da una siringa all'altra attraverso la camera di macinazione, la pressione delle siringhe forza il materiale attraverso uno stretto spazio tra la sfera e la parete della camera. Questa pressione lenta e costante rompe il materiale fino a raggiungere una dimensione costante che è in grado di passare facilmente attraverso lo stretto spazio. Forzare C. elegans attraverso lo stretto spazio attraverso una pressione costante ma delicata rompe gli animali aperti, rilasciando il loro contenuto nel buffer circostante. La commutazione delle dimensioni della sfera stringe ulteriormente lo spazio, rompendo le cellule appena rilasciate e liberando i nuclei nel buffer. Più istanze di centrifugazione separano i nuclei dal resto dei detriti cellulari, consentendo la raccolta di un estratto nucleare pulito. L'omogeneizzatore Balch è preferito all'omogeneizzatore Dounce per diversi motivi: il sistema può gestire un gran numero di animali, rendendo possibile l'estrazione di un'elevata quantità di proteine attive in un solo tentativo; la lavorazione precisa delle sfere e del blocco di acciaio consente una rettifica costante tra più campioni; il pesante blocco di acciaio funge da dissipatore di calore, allontanando uniformemente il calore dalla camera di macinazione, prevenendo la denaturazione.

Dopo l'isolamento, l'attività trascrizionale dell'estratto nucleare deve essere verificata prima di essere utilizzata in qualsiasi esperimento biochimico. Tradizionalmente, l'attività di trascrizione è stata misurata utilizzando nucleotidi radiomarcati per tracciare e visualizzare l'RNA appena sintetizzato. Tuttavia, l'etichettatura radioattiva può essere onerosa in quanto richiede precauzioni durante l'uso e lo ^smaltimento6. I progressi tecnologici consentono oggi ai ricercatori di utilizzare metodi molto meno dannosi o fastidiosi per misurare anche piccole quantità di RNA utilizzando tecniche come la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)⁷. Qui, il protocollo descrive un metodo per isolare l'estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 (L4) C. elegans e visualizzare l'attività di trascrizione in un sistema in vitro.

Protocol

1. Preparazioni dei media

1. Preparare piastre di agar sterili in brodo di lisogenesi (LB) e fluidi liquidi seguendo le istruzioni del produttore.
2. Striscia Escherichia coli (E. coli) ceppo OP50 su una piastra di agar LB. Incubare la striscia batterica a 37 °C durante la notte.
3. Conservare la piastra striata di E. coli OP50 a 4 °C dopo l'incubazione. La piastra E. coli OP50 può essere conservata in modo sicuro a 4 °C per 2 settimane se avvolta in parafilm per evitare la perdita di umidità.
4. Preparare 2 L di Nematode Growth Media (NGM) utilizzando la ricetta nella Tabella 1.
   NOTA: La nistatina è facoltativa. La nistatina aiuta a prevenire la crescita di muffe e altri contaminanti fungini sulle piastre NGM. Le grandi piastre di 150 mm di diametro hanno una maggiore probabilità di catturare spore fungine quando il coperchio viene rimosso per il versamento e la semina di E. coli OP50. La nistatina può essere acquistata premiscelata in soluzione sterile da fornitori a 10.000 unità / ml o può essere acquistata come polvere sterile e miscelata con acqua sterile. La nistatina non può essere autoclavata, né può essere efficacemente sterilizzata con filtro. L'attenzione alla tecnica asettica è fondamentale quando si mescola una soluzione di nistatina in laboratorio. Autoclave 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 e 1 M MgSO4 a 121 °C per 15 min. Il filtro sterilizza il colesterolo attraverso un filtro da 0,22 μm dopo essere stato disciolto in etanolo al 95%.
5. Dopo aver aggiunto i reagenti al supporto, versare NGM in quaranta piastre di Petri da 150 mm. Ogni piatto da 150 mm richiede 50 ml per essere riempito. Lasciare raffreddare le piastre NGM durante la notte a temperatura ambiente.
6. Inoculare due tubi conici da 50 mL contenenti 25 mL di LB sterile con E. coli OP50 dalla precedente piastra striata. Incubare il brodo a 37 °C per 24 ore in un incubatore vibrante mantenuto a 200 giri/min.
   NOTA: Per coerenza, inoculare entrambi i tubi con la stessa singola colonia dalla piastra striata. Se ciò si rivela difficile, inoculare 5 mL di LB sterile con una singola colonia in un tubo conico da 50 mL e incubare la coltura per 16 ore a 37 °C in un incubatore vibrante mantenuto a 200 giri /min il giorno prima di preparare le piastre NGM. Conservare la coltura liquida fresca a 4 °C per un massimo di due giorni. Inoculare i due 25 mL di brodo con 25 μL di coltura liquida e incubare nelle stesse condizioni di cui sopra.
7. Semina piastre NGM fresche con 1 mL di coltura liquida fresca di E. coli OP50 e spargi con uno spanditore sterilizzato a fiamma uniformemente sulla superficie della piastra in modo asettico per creare un grande prato batterico che copre la maggior parte della piastra, facendo attenzione a non diffondere i batteri da un bordo all'altro. Lasciare che l'E. coli OP50 cresca a temperatura ambiente per 72-96 ore o fino a quando non appare un prato visibilmente spesso.
   NOTA: Dopo 24 ore, spostare le piastre NGM appena seminate in un contenitore coperto per ridurre la perdita di umidità e prolungare la vita delle piastre.

2. Preparazioni animali e sincronizzazione della candeggina

1. Trasferire 5 C. elegans adulti gravidi ben nutriti, di tipo selvatico, a ciascuna delle 10 piastre NGM fresche seminate con E. coli OP50, per un totale di 50 animali.
2. Lascia che gli animali depongano le uova. Lasciare che la progenie cresca a 20 °C fino a raggiungere lo stadio adulto gravido.
3. Utilizzare 15 mL di tampone M9 (Tabella 2) per raccogliere i nuovi adulti gravidi di tipo selvatico ben nutriti dalle dieci piastre di manutenzione e trasferire gli animali in un tubo conico etichettato da 15 ml.
4. Centrifugare gli animali a 1.000 x g per 3 minuti per pellettare tutti gli animali sul fondo del tubo.
5. In un tubo conico separato, etichettato da 15 mL, mescolare 2 mL di candeggina con 5 mL di 1 N NaOH per la sincronizzazione della candeggina. Vortice la soluzione per mescolare accuratamente.
   NOTA: Utilizzare la soluzione di candeggina + NaOH lo stesso giorno in cui è preparata per essere efficace.
6. Rimuovere delicatamente il surnatante dagli animali centrifugati utilizzando una pipetta sterile da 10 ml. Tentare di rimuovere il più possibile il buffer M9 per migliorare la rottura degli animali.
7. Aggiungere 500 μL della soluzione di candeggina + NaOH al pellet animale e avviare un timer per 4 minuti.
8. A mano o usando un bilanciere, scuotere delicatamente il tubo per rompere completamente il pellet animale e lasciare che gli animali si muovano liberamente nella soluzione di candeggina + NaOH. Continuare a dondolare il tubo per tutta la durata di 4 minuti.
   NOTA: La quantità di candeggina + soluzione naOH necessaria può variare a seconda delle dimensioni del pellet animale da sincronizzare. Ottimizza questa tecnica in anticipo con quantità variabili di animali e candeggina + soluzione NaOH.
9. Dopo 4 minuti, controllare l'efficienza di rottura al microscopio di dissezione. Assicurarsi che la maggior parte degli animali adulti gravidi siano rotti e che il loro contenuto interno venga rilasciato, comprese le uova.
10. Se gli animali non sono aperti, ruotare brevemente il tubo alla massima velocità, quindi controllare di nuovo al microscopio.
    NOTA: Mentre le uova sono resistenti alla soluzione di candeggina + NaOH, non sono impermeabili. Le uova non devono essere esposte alla soluzione di candeggina + NaOH più a lungo del necessario. Lo stallo troppo lungo durante la fase di rottura dell'animale può portare a problemi di sviluppo per la progenie.
11. Aggiungere 10 ml del tampone M9 alla soluzione animale rotta.
12. Centrifugare le uova e i resti a 1.000 x g per 3 min.
13. Pipettare via il surnatante, assicurandosi di non toccare il nuovo pellet contenente tutte le uova sul fondo del tubo.
14. Aggiungere altri 10 mL del tampone M9 e centrifugare di nuovo per 3 minuti a 1.000 x g.
15. Ripetere i passaggi 2.13-2.14 altre due volte per assicurarsi che nessuna delle soluzioni di candeggina + NaOH rimanga.
16. Dopo il terzo lavaggio tampone M9, rimuovere il surnatante e aggiungere 10 ml di tampone S-basale (Tabella 2).
17. Capovolgere il tubo per rompere il pellet sul fondo per sospendere le uova allo stesso modo nel tampone.
18. Posizionare il tubo su un bilanciere e scuotere delicatamente il tubo per 22 ore a 20 °C per consentire alle uova di schiudersi e raggiungere l'arresto dello stadio larvale 1 (L1).
19. Dopo 22 ore, centrifugare il tubo contenente animali L1 sincronizzati per 3 minuti a 1000 x g.
20. Pipettare e scartare il surnatante lasciando circa 1 mL di tampone nel tubo.
21. Utilizzando una micropipetta, disturbare il pellet animale per ottenere una sospensione omogenea di animali L1 nel buffer rimanente.
22. Trasferire una singola goccia della sospensione omogenea di animali L1 su una piastra NGM etichettata da 150 mm seminata con E. coli OP50.
23. Calcola la densità animale per goccia contando visivamente il numero di animali L1 per goccia usando un microscopio di dissezione. Una piastra NGM da 150 mm con un prato completamente cresciuto di E. coli OP50 può supportare fino a 500 animali dello stadio L1 per raggiungere lo stadio adulto gravido.
24. Trasferire gli animali L1 su sei piastre NGM da 150 mm con E. coli OP50. Assicurarsi di non sovraccaricare la piastra.
    NOTA: Se non è chiaro se gli animali avranno abbastanza cibo per lo sviluppo tra L1 e adulto gravido, aggiungere meno animali a ciascun piatto e utilizzare più piatti.
25. Lasciare che gli animali crescano per 72 ore a 20 °C fino a raggiungere lo stadio adulto gravido e iniziare a deporre le uova.
26. Esegui un secondo ciclo di sincronizzazione della candeggina sugli animali adulti gravidi di tipo selvatico sincronizzati e ben nutriti.
27. Posizionare gli animali L1 sincronizzati su dieci piastre NGM da 150 mm seminate con E. coli OP50, con circa 1.000 animali per piastra.
28. Lasciare che i nuovi animali L1 sincronizzati crescano per 48 ore a 20 °C fino a raggiungere lo stadio L4.
    NOTA: L'obiettivo è quello di ottenere un pellet di circa 700 - 800 μL di animali L4. Troppi animali possono rendere difficile l'uso dell'omogeneizzatore Balch; questo può portare a tensioni muscolari durante il funzionamento dell'omogeneizzatore e possibili perdite dalle siringhe a causa dell'aumento della pressione.

3. Preparazione dell'omogeneizzatore Balch

1. Preparare tamponi sia ipotonici che ipertonici come indicato nella Tabella 3 e nella Tabella 4.
   NOTA: I tamponi ipotonici e ipertonici possono essere preparati in anticipo e conservati in modo sicuro a 4 °C.
2. Pulire l'omogeneizzatore Balch inondando la camera di macinazione con etanolo al 70%, quindi risciacquare la camera con acqua deionizzata per rimuovere l'etanolo in eccesso.
   NOTA: Evitare l'uso di agenti caustici per pulire l'omogeneizzatore Balch. Un accurato risciacquo con etanolo e acqua deionizzata dovrebbe essere sufficiente per pulirlo.
3. Inserire la sfera in carburo di tungsteno da 7,9820 mm (18 μm di spazio) nella camera di rettifica.
4. Tappare ogni estremità della canna dell'omogeneizzatore Balch e fissare i tappi con le viti a pollice fornite.
5. Preparare 5 mL di "tampone ipotonico completo" per campione: aggiungere 5 μL di 1 M DTT (concentrazione finale: 1 mM DTT) e 100 μL di inibitore della proteasi 100x, cocktail monouso (concentrazione finale: 2x). Tenere il tampone sul ghiaccio.
6. Preparare 5 mL di "tampone ipertonico completo" per campione: aggiungere 5 μL di 1 M DTT (concentrazione finale: 1 mM DTT) e 100 μL di inibitore della proteasi 100x, cocktail monouso (concentrazione finale: 2x). Tenere il tampone sul ghiaccio.
   NOTA: Utilizzare il tampone ipotonico e ipertonico completo lo stesso giorno di preparazione. Non conservarlo per un uso successivo. Conservare 1 M DTT come aliquote monouso a -20 °C. Conservare il cocktail monouso inibitore della proteasi a 4 °C.
7. Riempire una siringa sterile da 2 mL con 1 mL di "tampone ipotonico completo" e lavare delicatamente la camera di macinazione dell'omogeneizzatore Balch. Lasciare circa 500 μL di "tampone ipotonico completo" nella camera.
8. Conservare l'omogeneizzatore lavato sul ghiaccio e lasciarlo raffreddare per 30 minuti.
   NOTA: L'omogeneizzatore deve essere ghiacciato prima di macinare gli animali. Il processo di macinazione può produrre calore a causa dell'attrito e denaturare le proteine nucleari. Assicurarsi che l'omogeneizzatore metallico sia ghiacciato per evitare che ciò accada. Assicurati di evitare che l'acqua del ghiaccio circostante entri nell'omogeneizzatore. Utilizzare due siringhe sterili per tappare i fori nell'omogeneizzatore e impedire a eventuali liquidi non intenzionali di entrare nella camera di macinazione.

4. Raccolta di animali

NOTA: viene fornita una guida di riferimento rapido che segna i passaggi principali per la raccolta, l'interruzione e il frazionamento degli animali (Figura 1).

1. Raccogliere gli animali L4 ben nutriti con tampone M9 in un tubo conico da 15 ml e centrifugare gli animali a 1000 x g per 3 minuti. Rimuovere il surnatante e continuare a lavare il pellet animale fino a quando il surnatante non è chiaro.
2. Lavare gli animali con tampone ipotonico da 3 ml di 4 °C e centrifugare nuovamente a 1000 x g per 3 min.
   NOTA: Durante il lavaggio finale con il tampone ipotonico a 4 °C, gli animali possono attaccarsi al lato del tubo. Questo è normale e può causare una piccola perdita di animali durante la rimozione del surnatante.
3. Rimuovere il tampone ipotonico e aggiungere 1 mL di "tampone ipotonico completo" al pellet animale. Trasferire la sospensione animale in una nuova siringa sterile da 2 mL.
   NOTA: durante il trasferimento degli animali sulla siringa utilizzando una micropipetta, pipettare delicatamente una soluzione sterile di Tween20 allo 0,1% per rivestire l'interno della punta della pipetta per ridurre il numero di animali persi a causa dell'adesione alle pareti della punta della pipetta.

5. Frazionamento

1. Sul ghiaccio, omogeneizzare gli animali spingendo delicatamente gli animali attraverso la camera di macinazione dell'omogeneizzatore Balch caricato con la sfera da 7,9820 mm e in una nuova siringa sterile. Ripetere spingendo gli animali attraverso la camera di macinazione per 30 cicli completi.
   NOTA: un "ciclo completo" è definito come il movimento completo su e giù dello stantuffo di una siringa.
   Questa fase di rettifica utilizza una sfera da 7,9820 mm (cuscinetto a sfere da 18 μm).
2. Dopo 30 cicli, rimuovere il più possibile la sospensione animale dall'omogeneizzatore Balch e conservare la siringa, ribaltare in un microtubo da 1,7 ml.
3. Rimuovere la sfera da 7,9820 mm dalla camera di macinazione e pulirla con acqua deionizzata. Asciugare e riportare la palla al suo tubo etichettato.
4. Inserire la sfera da 7,9880 mm (12 μm di spazio libero) nella camera di rettifica e richiudere l'omogeneizzatore.
5. Lavare nuovamente la camera di macinazione con 1 mL di "tampone ipotonico completo" ghiacciato.
6. Rettificare la sospensione per 25 cicli completi.
7. Dopo 25 cicli, rimuovere la sospensione animale dall'omogeneizzatore Balch, trasferire la sospensione in un microtubo pulito da 1,7 ml e conservarla sul ghiaccio.
   NOTA: Smontare e pulire l'omogeneizzatore Balch con etanolo al 70% e acqua deionizzata. Assicurarsi di riportare la sfera da 7,9880 mm al tubo appropriato.
8. Pellet i corpi animali e i detriti centrifugando la sospensione a 500 x g, 4 °C per 5 min.
9. Pipettare 40 μL del surnatante a un tubo etichettato come "frazione di ingresso" e conservarlo sul ghiaccio.
   NOTA: Scrivere tutte le etichette con una penna antialcol per evitare di spalmarle in seguito.
10. Trasferire il surnatante rimanente in un nuovo tubo da 1,7 ml, avendo cura di evitare di toccare il pellet sul fondo del tubo e quindi scartare il pellet.
11. Centrifugare il surnatante per pellettizzare i nuclei a 4.000 x g, 4 °C per 5 min.
12. Trasferire il surnatante, facendo attenzione a non disturbare i nuclei pellettati, in un nuovo tubo da 1,7 ml ed etichettare il tubo come "frazione citosolica".
    NOTA: Centrifugare ulteriormente la frazione citosolica a 17.000 x g, 4 °C per 30 minuti per rimuovere qualsiasi materiale insolubile rimanente e utilizzarlo come controllo negativo per le macchie occidentali (in particolare per le proteine nucleari).
13. Lavare il pellet di nuclei con 500 μL di "tampone ipotonico completo" e trasferire il pellet in un nuovo tubo da 1,7 mL. Centrifugare il pellet sospeso a 4.000 x g, 4 °C per 5 min.
14. Scartare il surnatante e aggiungere 500 μL di "tampone ipotonico completo" fresco al pellet nucleare e trasferire la sospensione in un nuovo tubo da 1,7 ml. Centrifugare nuovamente il campione a 4.000 x g, 4 °C per 5 min.
15. Rimuovere il surnatante e sciogliere il pellet in 40 μL di "tampone ipertonico completo". Trasferire la nuova sospensione nucleare in un nuovo tubo da 1,7 ml, etichettare il tubo come "frazione nucleare" e conservarlo sul ghiaccio.
16. Determinare la concentrazione proteica delle tre frazioni utilizzando un kit di quantificazione fluorescente.
    NOTA: La quantità di proteina nucleare acquisita da questo metodo può variare da 1-2 μg/μL.
17. Aliquotare le frazioni nucleari in tubi monouso contenenti 6 μg della proteina nucleare e congelare a scatto in un bagno di ghiaccio secco ed etanolo. Conservare a -80 °C fino a nuovo utilizzo.

6. Test di trascrizione

1. Accendere e preriscaldare un blocco di calore a 30 °C.
2. Rimuovere quanto segue dal sistema di trascrizione in vitro dell'estratto di Nulcear: 50 mM _MgCl2, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP e il modello di controllo positivo del promotore CMV. Scongelare sul ghiaccio.
   NOTA: Amplificare il modello di DNA a controllo positivo utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà e memorizzarlo come aliquote monouso normalizzate.
3. Mescolare e centrifugare i rNTP scongelati prima di preparare una soluzione di lavoro da 10 mM.
   NOTA: Aggiungere 2 μL di ogni rATP, rCTP, rGTP e rUTP a 12 μL di _H2O per ottenere 10 mM di ogni rNTP. Questa composizione può essere scalata se necessario.
4. Aliquotare la miscela rNTP in tubi monouso etichettati e conservare a -20 °C per un uso futuro.
5. In un tubo fresco da 1,5 ml etichettato "Mastermix" aggiungere i reagenti per reazione come indicato nella Tabella 5
6. Trasferire 14 μL del Mastermix a ciascun tubo di reazione
7. Aggiungere 11 μL meno (volume per 5 μg dell'estratto nucleare) di 1x Buffer di trascrizione a ciascun tubo di reazione.
8. Aggiungere 5 μg di estratto nucleare a ciascun tubo di reazione.
9. Picchiettare delicatamente il tubo di reazione per miscelare il contenuto all'interno e centrifugare i tubi dopo la miscelazione per assicurarsi che nessun materiale di reazione sia attaccato alla parete dei tubi.
10. Incubare le reazioni a 30 °C per 30 min.
11. Arrestare immediatamente la reazione aggiungendo 400 μL di tampone RLT fornito dal kit di estrazione dell'RNA.
    NOTA: A questo punto, è sicuro fermarsi. I campioni possono essere conservati a -80 °C fino a un'ulteriore pulizia con il kit di estrazione dell'RNA.

7. Pulizia dell'RNA

1. Preparare la soluzione madre di DNasi I utilizzando il set DNasi privo di RNasi fornito nel kit di estrazione dell'RNA. Sciogliere la DNasi I liofilizzata in 550 μL di acqua priva di RNasi. Mescolare delicatamente la soluzione. Non vortice . Aliquotare la soluzione di DNasi I in tubi monouso da 10 μL e conservare le aliquote a -20 °C.
2. Preparare il 70% e l'80% di etanolo utilizzando etanolo di grado molecolare e acqua priva di RNasi.
3. Spostare i campioni e i reagenti in un'area di lavoro priva di RNasi prima di iniziare la pulizia.
4. Aggiungere 400 μL di etanolo al 70% a ciascun campione e pipettare delicatamente per mescolare bene.
5. Trasferire 400 μL del campione in una colonna di spin di estrazione dell'RNA etichettata con una provetta di raccolta da 2 mL e centrifugare il campione a 8.500 x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso.
6. Ripetere il passaggio 7.5 con il campione rimanente ed eliminare il flusso.
7. Aggiungere 350 μL di tampone RW1 (kit di estrazione dell'RNA) a ciascuna colonna. Centrifugare le colonne a 8.500 x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso.
8. Aggiungere 70 μL di tampone RDD (kit di estrazione dell'RNA) a una singola aliquota di 10 μL di soluzione madre di DNasi I e mescolare delicatamente. Non vortice.
9. Aggiungere la miscela di incubazione DNasi I (80 μL) direttamente alla membrana della colonna di spin. Incubare le colonne a temperatura ambiente per 15 min.
   NOTA: Assicurarsi di aggiungere la soluzione di DNasi I alla membrana. Evitare di perdere parte della soluzione alla parete della colonna o all'O-ring.
10. Dopo 15 minuti, aggiungere 350 μL di buffer RW1 alle colonne. Centrifuga per 30 s a 8.500 x g. Scartare il flusso attraverso.
11. Posizionare le colonne in nuovi tubi di raccolta da 2 ml. Aggiungere 500 μL di tampone RPE (kit di estrazione dell'RNA) alla colonna di spin. Centrifugare le colonne a 8.500 x g per 30 s per lavare la membrana. Scartare il flusso attraverso.
12. Aggiungere 500 μL di etanolo all'80% a ciascuna colonna e centrifugare le colonne a 8.500 x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso.
13. Posizionare le colonne in nuovi tubi di raccolta da 2 ml. Lasciando aperti i coperchi delle colonne, centrifugare le colonne a 17.900 x g per 5 min. Scartare il flusso attraverso.
14. Posizionare le colonne in tubi etichettati da 1,7 ml. Aggiungere 17 μL di acqua priva di RNasi direttamente al centro della membrana della colonna di spin. Lasciare riposare le colonne a temperatura ambiente per 1 minuto. Centrifugare le colonne a 17.900 x g per 1 min.
15. Scartare la colonna e conservare il tubo da 1,7 ml con il campione di RNA appena purificato.

8. Digestione del DNA

1. Preriscaldare due blocchi di calore a 37 °C e 65 °C.
2. Aggiungere 2 μL di 10x Buffer di reazione a ciascun campione.
3. Aggiungere 1 μL (1 MBU) di DNasi a ciascun campione.
4. Impostare una pipetta a 10 μL e pipettare la nuova soluzione su e giù per miscelare delicatamente. Non vortice.
5. Incubare i campioni di RNA a 37 °C per 30 minuti per digerire il DNA rimanente.
6. Inattivare la DNasi incubando i campioni sul blocco termico a 65 °C per 10 min.
   NOTA: è sicuro fermarsi a questa fase e conservare l'RNA a -80 °C per eseguire la trascrizione inversa in un secondo momento.

9. Trascrizione inversa

1. Quando si programma il termociclatore, aggiungere un ulteriore passaggio di 1 ora e 37 °C prima dell'incubazione per preriscaldare il termociclatore. Eseguire il programma con la "fase di preriscaldamento" durante la preparazione dei campioni e lasciare che il termociclatore raggiunga i 37 °C. Quando i campioni per la trascrizione inversa sono pronti, saltare la fase di preriscaldamento a 37 °C e procedere alla fase di incubazione effettiva (Tabella 6). Se il termociclatore non ha una funzione di salto, aggiungere un passaggio di 1 min e 37 °C prima dell'incubazione. Lasciare che il termociclatore si riscaldi alla temperatura corretta prima di mettere in pausa il sistema e aggiungere i campioni preparati.
2. Preparare una soluzione di lavoro da 10 μM di primer inverso di trascrizione in _H2O privo di RNasi e conservarla sul ghiaccio.
3. Scongelamento su ghiaccio, tampone 10x dal kit di trascrizione inversa, miscela dNTP (5 mM ogni dNTP), inibitore della RNasi e trascrittasi inversa.
4. Preparare un Mastermix (per reazione) aggiungendo i componenti menzionati nella Tabella 7 in un tubo PCR pulito da 0,2 ml.
5. Aliquota 18 μL del Mastermix in nuovi tubi PCR da 0,2 mL per ciascun campione.
6. Aggiungere 2 μL di RNA trattato con DNasi per ciascun campione nei loro tubi rispettivamente etichettati.
7. Incubare i campioni a 37 °C per 1 ora in un termociclatore preriscaldato.
8. Spostare i campioni a -20 °C per la conservazione dopo la trascrizione inversa o procedere direttamente alla fase successiva.
   NOTA: è sicuro fermarsi a questo passaggio; conservare il cDNA a -20 °C per un uso successivo.

10. Amplificazione specifica del prodotto

1. Scongelamento su ghiaccio: cDNA, 10 μM di trascrizione in avanti e 10 μM di trascrizione inversa primer, e PCR 2x Premix A.
   NOTA: Aliquotare la PCR 2x Premix A in volumi più piccoli per ridurre il tempo di scongelamento.
2. Creare un Mastermix (per reazione) aggiungendo i componenti menzionati nella Tabella 8 in un tubo PCR pulito da 0,2 ml.
3. Aliquota 24 μL di Mastermix per ciascun campione in provette PCR da 0,2 mL etichettate come pulite.
4. Aggiungere 1 μL di cDNA di ciascun campione nelle rispettive provette.
5. Incubare i campioni nel termociclatore utilizzando le condizioni di programma menzionate nella Tabella 9
6. Dopo l'incubazione, conservare i prodotti PCR a 4 °C o -20 °C per la conservazione a lungo termine.

11. Analisi del gel

1. Utilizzare 1x tampone TAE per preparare un gel che contiene il 2% p/v di agarosio e 1x di macchia di gel.
2. Eseguire i prodotti PCR a 50 V e 300 mA per 1 ora o fino a quando non vi è una chiara separazione della banda.
3. Immagine del gel utilizzando il programma di esposizione automatizzato precaricato nel gel imager.

Representative Results

Seguendo i passaggi delineati dovrebbe produrre estratto nucleare funzionale (Figura 1), la deviazione nelle fasi di macinazione o lavaggio può portare a scarsa attività o bassi rendimenti. Se si ottiene un estratto nucleare funzionale di C. elegans , trascriverà la regione a valle del promotore CMV sul modello di DNA quando aggiunto al test in vitro precedentemente descritto. Il trascritto di RNA risultante può essere purificato dalle proteine nucleari e dal modello di DNA utilizzando metodi convenzionali. Senza il DNA modello, la trascrizione inversa e il successivo prodotto PCR possono essere solo il risultato dell'RNA trascritto dall'estratto nucleare. I prodotti PCR possono essere visualizzati su un gel di agarosio, l'intensità della banda del DNA può essere indicativa della qualità della proteina nucleare e dell'isolamento dell'RNA. Un'intensità di banda debole può essere causata dall'inattivazione dell'estratto nucleare da calore o scarsa preparazione del tampone. Un'intensità di banda eccessivamente forte può essere il risultato della contaminazione del DNA a causa della scarsa purificazione dell'RNA o di una digestione impropria della DNasi. Isolamenti nucleari coerenti e di successo produrranno bande di intensità simili, e sia i controlli trascrizionali che quelli negativi alla PCR non dovrebbero avere alcun prodotto PCR visibile (Figura 2).

Figura 1. Cenni di isolamento dell'estratto nucleare. Il diagramma di flusso delinea i principali passi per isolare l'estratto nucleare da C. elegans. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. L'estratto nucleare di C. elegans mantiene la sua attività. L'immagine in gel mostra i prodotti di trascrizione dell'estratto nucleare delle larve di C. elegans L4 utilizzando il modello di DNA promotore CMV. L'isolamento riuscito delle proteine nucleari attive si tradurrà in un prodotto PCR a 132 bp dopo la trascrizione in vitro , come si è visto nelle corsie 1 e 2. L'isolamento non riuscito comporterà una banda debole o l'assenza di un prodotto PCR simile alla corsia 3. Questa visualizzazione dell'attività di trascrizione tramite amplificazione PCR è un modo semplice per valutare la qualità dell'isolamento dell'estrazione nucleare. Il controllo PCR positivo viene prodotto aggiungendo il modello di DNA promotore CMV alla reazione PCR e il controllo negativo è privo del DNA modello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Piastre di crescita del nematode
Agar	20,4 g
Cloruro di sodio	2,8 g
Bacto peptone	2,3 g
dH2O	975 ml
Autoclave a 121 °C per 30 min
Lasciare raffreddare il supporto a 50 °C prima di aggiungere quanto segue
1 M CaCl2 (sterile)	1 ml
1 M MgSO4 (sterile)	1 ml
10.000 unità/ml di nistatina (sterile)	3 ml
5 mg/mL colesterolo in etanolo al 95% (filtro sterilizzato)	1 ml
1M KPO4 pH 6.0 (sterile)	25 ml

Tabella 1.

M9 Buffer
KH2PO4 ·	3 gr
Na2HPO4	6 gr
NaCl	5 gr
dH2O	1.000 ml
Autoclave a 121 °C per 15 min
1 M MgSO4 (sterile)	1 mL (aggiungere dopo l'autoclave)
Tampone S-basale
KH2PO4 ·	6 gr
K2HPO4 ·	1 g
NaCl	5,85 g
dH2O	1.000 ml
Autoclave a 121 °C per 15 min
Colesterolo 5 mg/mL (Sterile)	1 mL (aggiungere dopo l'autoclave)

Tabella 2.

Tampone ipotonico
Soluzione stock	Volume	Concentrazione finale
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 ml	15 mM
1 M KCl	5,0 ml	10 mM
1 m MgCl2	2,5 ml	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 ml	0,1 mM
1 M Saccarosio	175 ml	350 metri quadrati
dH2O	309,9 ml
Filtro sterilizzato

Tabella 3.

Tampone ipertonico
Soluzione stock	Volume	Concentrazione finale
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 ml	15 mM
1 M KCl	200 ml	400 mM
1 m MgCl2	2,5 ml	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 ml	0,1 mM
10% Interpolazione 20	5 ml	0.10%
50% Glicerolo	100 ml	10%
dH2O	184,9 ml
Filtro sterilizzato

Tabella 4.

MgCl2, 50 mM	1,5 μL
miscela rNTP, 10 mM ciascuno	1,0 μL
Modello DNA, 25 ng/μL	4,0 μL
H2O senza RNasi	7,5 μL

Tabella 5.

Passo	Temp	Ore	Numero ciclo
Preriscaldare	37 °C	60 minuti	1x
Trascrizione inversa	37 °C	60 minuti	1x
Tenere	10 °C		1x

Tabella 6.

Buffer di trascrizione inversa 10x	2,0 μL
dNTP Mix (5 mM ogni dNTP)	2,0 μL
Primer inverso di trascrizione (10 μM)	2,0 μL
Inibitore della RNasi	1,0 μL
Sensiscript Trascrittasi inversa	1,0 μL
H2O senza RNasi	10,0 μL

Tabella 7.

H2O senza RNasi	6,25 μL
Primer a prua di trascrizione (10 μM)	2,5 μL
Primer inverso di trascrizione (10 μM)	2,5 μL
PCR 2X Premiscela A	12,5 μL
Miscela enzimatica PCR	0,25 μL

Tabella 8.

Passo	Temp	Ore	Numero ciclo
Denaturazione iniziale	92 °C	60 anni	1x
Denaturare	92 °C	30 anni
Temperare	59 °C	30 anni	35 volte
Estensione	72 °C	30 anni
Tenere	10 °C		1x

Tabella 9.

Discussion

C. elegans è un organismo modello attraente per studiare il sistema di trascrizione eucariotica a causa del suo basso costo di manutenzione e della facilità di manipolazione genetica. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento coerente dell'estratto nucleare funzionalmente attivo da L4 C. elegans . Sebbene questo protocollo si concentrasse sulla visualizzazione dell'attività di trascrizione, il cDNA prodotto post-trascrizionalmente può essere quantificato utilizzando RT-qPCR per ottenere una misurazione più precisa dell'attività di ^{trascrizione8}. Questo metodo di isolamento delle proteine nucleari da C. elegans può aiutare ad espandere lo studio del meccanismo di trascrizione eucariotica. Poiché C. elegans non è una coltura di cellule in un piatto o in una colonia di lievito, ma piuttosto un animale in libertà, isolare e ricercare il suo estratto nucleare può dare una visione più chiara di come il meccanismo trascrizionale può cambiare nel tempo o in vari ambienti. Ciò consente ai ricercatori di trarre vantaggio dal basso costo e dalla resilienza di C. elegans . C. elegans, a differenza di altri organismi modello o colture cellulari, è molto più indulgente quando appare la contaminazione batterica o del lievito. Una popolazione di C. elegans può essere facilmente ripulita dalla contaminazione utilizzando protocolli stabiliti, risparmiando tempo e fatica quando si verifica la ^{contaminazione9}. Nel complesso, l'utilizzo di estratto nucleare da C. elegans per saggi biochimici può essere un'opzione più economica e flessibile rispetto all'acquisto di estratto nucleare da un fornitore o alla gestione di organismi modello meno indulgenti.

Mentre questo protocollo è relativamente semplice, ci sono ancora passaggi critici che richiedono un'attenzione particolare per il successo dell'isolamento dell'estratto nucleare. È importante che durante la preparazione dei tamponi ipotonici e ipertonici completi, le due soluzioni siano chiaramente etichettate e separate. Se i tamponi vengono commutati in qualsiasi momento durante l'isolamento, ciò potrebbe portare all'inattivazione delle proteine nucleari o a uno scarso frazionamento delle proteine citosoliche dalle proteine nucleari. Le proteine nucleari isolate dovrebbero anche, se necessario, essere diluite in un tampone ipertonico, non in acqua o in qualsiasi altra soluzione. L'alta concentrazione di sale aiuta a preservare l'attività delle proteine e una soluzione ipotonica può uccidere questa ^attività10.

Un'altra sfida che può sorgere durante la parte di macinazione di questo protocollo proviene dai detriti che aderiscono alla superficie delle sfere di tungsteno. Mentre si afferma che le sfere devono essere lavate e asciugate dopo ogni ciclo di macinazione, il materiale si attaccherà alla superficie liscia delle sfere. Questo materiale di solito appare come anelli color ruggine attorno alla circonferenza delle sfere ed è abbastanza spesso da bloccare lo spazio tra la palla e la parete della camera di macinazione. Questo blocco è evidente in quanto diventa sempre più difficile spingere gli animali attraverso la smerigliatrice, che alla fine può portare a lesioni muscolari o rotture della siringa. Se le palline di tungsteno iniziano a mostrare scolorimento, immergerle in acqua calda per 5 minuti, quindi pulire la superficie con un nuovo tampone abrasivo. Evitare l'uso di soluzioni detergenti acide o di base. Dopo aver lucidato delicatamente, le sfere di tungsteno dovrebbero tornare alla loro lucentezza originale e sarà notevolmente più facile macinare i campioni.

Questo protocollo è progettato per isolare l'intero estratto nucleare da C. elegans. Non è stato testato per l'uso su altri organismi modello. L'estratto nucleare di altri organismi può richiedere tamponi diversi e il promotore del CMV potrebbe non essere sufficiente per guidare la trascrizione in altri campioni non mammiferi. Anche l'estratto nucleare raccolto con questo metodo non è tessuto o cellulare-specifico; qualsiasi attività di trascrizione misurata con questo metodo esamina gli animali nel loro insieme che possono nascondere i sottili cambiamenti tra i tessuti.

Gli usi futuri di questo protocollo potrebbero essere la misurazione del meccanismo di riparazione o replicazione del DNA di C. elegans dopo il danno al DNA. La frazione citosolica raccolta durante il processo di isolamento potrebbe essere utilizzata per misurare la quantità di proteine solubili e quantificare l'attività di queste proteine in modo simile alla misurazione della trascrizione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010