생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Summary

여기서는 애벌레 4C. 예르간 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활동을 시각화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

Caenorhabditis elegans는 1963년에 도입된 이래 생물학 연구를 위한 중요한 모형 시스템이었습니다. 그러나, C. elegans는 체외 전사 및 DNA 복제와 같은 핵 추출물을 사용하여 생물학적 반응의 생화학 연구에서 완전히 활용되지 않았습니다. 생화학 연구에서 C. elegans를 사용 하 여 중요 한 장애물은 핵 추출 물의 활동을 희생 하지 않고 선충의 두꺼운 외부 큐 티 클을 방해. 여러 가지 방법은 Dounce 균질화 또는 초음파 처리와 같은 표피를 깨는 데 사용되지만 종종 단백질 불안정으로 이어질 수 있습니다. 체외 반응에 대한 애벌레 또는 성인 C. elegans에서 활성 핵 단백질을 격리하기위한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 여기서, 프로토콜은 발치 균질화제를 사용하여 애벌레 단계 4 C. elegans의 균질화를 자세히 설명합니다. 발치 균질화는 압력을 사용하여 동물을 천천히 좁은 틈새를 통해 동물을 강제로 밀어 내어 그 과정에서 큐티클을 깨뜨린다. 발치 균질화제의 균일한 디자인과 정밀한 가공은 실험 사이에 동물의 일관된 분쇄를 가능하게 합니다. 발치 균질화로부터 얻은 균질화는 C. 예르건의 전사 활성을 속이는 시험관 내 방법으로 사용될 수 있는 기능적으로 활성 핵 추출물을 산출한다.

Introduction

작고 자유로운 선충 인 Caenorhabditis elegans 는 광범위한 생물학적 질문을 해결하기위한 간단하면서도 강력한 모델 유기체입니다. 1963년에 도입된 이래, 선충은 신경생물학, 신진대사, 노화, 발달, 면역 및 유전학¹에 있는 질문에 대답하는 데 귀중했습니다. 이상적인 모델 유기체를 만드는 동물의 많은 특성 중 일부는 짧은 세대 시간, RNA 간섭의 효과, 투명한 신체 및 세포 혈통과 신경계 의 완성 된지도를 포함합니다.

과학에 대한 선충의 기여는 광대하지만, 그들은 효모, 과일 파리 및 포유류 ^{세포 배양}2에서 핵 추출물을 사용하여 연구에서 오는 이러한 메커니즘에 대한 우리의 이해의 대부분과 함께, 진핵 전사 시스템을 해명하기 위해 활용되었습니다. 기능성 핵 추출물추출에서 연구원을 설득하는 가장 큰 장애물은 선충의 거친 외부 표피입니다. 이 외골격은 교차 연결된 콜라겐, 큐티클린, 당단백질 및 지질을 포함하며, 화학적 또는 기계적 힘을 통한 단백질 추출에 내성이 있는 성년기에 이르기까지 C. 엘레간을 만듭니다³. C. elegans 핵 추출물을 이용한 체외 전사 시스템은 한때 개발되었지만 시스템의 제한된 범위로 인해 널리 채택되지 않았으며, 추출물을 준비하기 위한 두스균제의 사용은 단백질 불안정성으로 이어질 수 있다^4,5.

C. elegans를 깨기 위해 Dounce 균질화제를 활용한 핵 추출물 격리를 위한 이전 프로토콜과 달리 이 프로토콜은 발치 균질화제를 사용합니다. 발치 균질화는 텅스텐 초경 공과 한쪽 끝에서 다른 끝까지 지루하게 채널이있는 스테인레스 스틸 블록의 두 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 발치 균질화는 텅스텐 초경 공으로 로드되고 분쇄 챔버를 밀봉하기 위해 양쪽에 덮여있다. 주사기는 연삭 챔버로 이어지는 두 개의 수직 포트에 로드할 수 있습니다. 재료가 분쇄 챔버를 통해 다른 주사기에서 다른 주사기에서 전달될 때, 주사기의 압력은 공과 챔버의 벽 사이의 좁은 간격을 통해 재료를 강제로. 이 느리고 일정한 압력은 좁은 틈새를 쉽게 통과할 수 있는 일관된 크기에 도달할 때까지 재료를 분해합니다. 일정한 압력을 통해 좁은 간격을 통해 C. elegans를 강제로 동물을 열어, 주변 버퍼로 자신의 내용을 해제. 볼 크기를 전환하면 간격이 더욱 강화되어 새로 방출된 세포를 깨고 핵을 완충제로 풀어 놓습니다. 원심분리의 여러 인스턴스는 핵을 세포 잔해의 나머지 부분과 분리하여 깨끗한 핵 추출물의 수집을 허용합니다. 발치 균질화는 여러 가지 이유로 Dounce 균질화보다 선호됩니다 : 시스템은 한 번의 시도에서 높은 양의 활성 단백질을 추출 할 수 있도록 많은 수의 동물을 처리 할 수 있습니다. 공과 강철 블록의 정확한 가공은 여러 샘플 사이의 일관된 연삭을 허용합니다. 무거운 강철 블록은 방열판 역할을하며 연삭 챔버에서 균일하게 열을 끌어 들여 데칭을 방지합니다.

격리 후, 핵 추출물 전사 활성은 생화학 적 실험에 사용되기 전에 검증되어야합니다. 전통적으로, 전사 활성은 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 측정하여 새로 합성된 RNA를 추적하고 시각화하였다. 그러나 방사성 라벨은 사용 및 폐기 시 예방 조치가 필요하기 때문에 부담스러울 수 있습니다⁶. 기술 발전은 오늘날 연구원들이 훨씬 덜 유해하거나 번거로운 방법을 사용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)⁷과 같은 기술을 사용하여 소량의 RNA 양을 측정 할 수 있게합니다. 여기서, 프로토콜은 애벌레 단계 4 (L4) C. elegans 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활성을 시각화하는 방법을 설명합니다.

Protocol

1. 미디어 준비

1. 제조 업체의 지시에 따라 멸균 리소제니 국물 (LB) 한천 플레이트 및 액체 매체를 준비합니다.
2. LB 한천 플레이트 에서 연속 에슈리치아 대장균 (대장균) 변형 OP50. 하룻밤 사이에 37°C에서 박테리아 를 배양합니다.
3. 인큐베이션 후 4°C에 대장균 OP50 행판을 보관합니다. 대장균 OP50 플레이트는 수분 손실을 방지하기 위해 파라필름에 싸인 경우 2주 동안 4°C로 안전하게 보관할 수 있다.
4. 표 1의 레시피를 사용하여 선충 성장 미디어(NGM)의 2L을 준비합니다.
   참고: Nystatin은 선택 사항입니다. Nystatin은 NGM 플레이트에서 곰팡이 및 기타 곰팡이 오염이 증가하는 것을 방지하는 데 도움이됩니다. 큰 150mm 직경 플레이트는 대장균 OP50을 붓고 파종하기 위해 뚜껑을 제거할 때 곰팡이 포자를 잡을 확률이 높습니다. Nystatin은 10,000 단위 / mL에서 공급 업체로부터 멸균 용액으로 미리 혼합 구입하거나 멸균 분말로 구입하고 멸균 물과 혼합 할 수 있습니다. Nystatin은 자동 으로 사용할 수 없으며 효과적으로 걸이 로소빙 될 수 없습니다. 실험실에서 nystatin의 솔루션을 혼합하는 동안 무균 기술에 대한 주의가 중요합니다. 오토클레이브 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6.0, 1M _MgSO4 에서 121°C에서 15분. 필터는 95% 에탄올에 용해된 후 0.22 μm 필터를 통해 콜레스테롤을 살균한다.
5. 시약을 미디어에 추가한 후 NGM을 40 150mm 페트리 요리에 붓습니다. 각 150mm 접시에는 50mL가 필요합니다. NGM 플레이트를 실온에서 밤새 식힙니다.
6. 이전 줄무늬 플레이트로부터 대장균 OP50을 함유한 멸균 LB 25mL을 함유한 2개의 50mL 원추형 튜브를 접종한다. 200 rpm에서 유지흔들리는 인큐베이터에서 24 시간 동안 37 °C에서 국물을 배양합니다.
   참고: 일관성을 위해, 줄무늬 플레이트에서 동일한 단일 콜로니로 두 튜브를 접종합니다. 이것이 어려운 것으로 판명되면, 50mL 원추형 튜브에서 단일 콜로니를 가진 멸균 LB의 5mL을 접종하고 NGM 플레이트를 준비하기 전날 200 rpm에 유지된 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 16h의 배양문화를 배양한다. 신선한 액체 배양을 최대 2일 동안 4°C에 보관하십시오. 상기와 동일한 조건하에서 액체 배양 25μL로 25mL의 국물을 접종하고 배양한다.
7. 신선한 대장균 OP50 액체 배양 1mL의 씨앗 신선한 NGM 플레이트와 무균 판의 표면에 걸쳐 균등하게 화염 살균 스프레더로 확산 플레이트의 대부분을 커버 큰 박테리아 잔디를 만들, 가장자리에서 가장자리에 박테리아를 확산하지 않도록주의. 대장균 OP50이 72-96h의 실온에서 또는 눈에 띄게 두꺼운 잔디가 나타날 때까지 성장하도록 허용합니다.
   참고: 24시간 후에 갓 시드된 NGM 플레이트를 덮인 용기로 이동하여 수분 손실을 줄이고 플레이트의 수명을 연장합니다.

2. 동물 제제 및 표백제 동기화

1. 대장균 OP50으로 시드된 10개의 신선한 NGM 플레이트에 5마리의 잘 먹이는 야생형, 그레이드 성인 C. 엘레간을 총 50마리의 동물로 옮기.
2. 동물이 알을 낳을 수 있도록 합니다. 그들은 중력 성인 단계에 도달 할 때까지 자손이 20 °C에서 성장하자.
3. 15mL의 M9 버퍼(표 2)를 사용하여 10개의 유지 보수 플레이트에서 새로운 잘 먹인 야생형, 중력성인을 수집하고 동물을 15mL 원전 튜브로 이송한다.
4. 원심 분리는 튜브의 바닥에있는 모든 동물을 펠렛 3 분 동안 1,000 x g 에서 동물을 원심 분리합니다.
5. 별도의 15mL 원색 튜브에서 표백제 동기화를 위해 표백제 2mL과 1 N NaOH의 5mL를 혼합합니다. 철저하게 혼합하는 용액을 소용돌이.
   참고 : 표백제 + NaOH 솔루션을 사용하여 효과가 있을 준비가 된 날에 사용하십시오.
6. 10mL 멸균 파이펫을 사용하여 원심 분리 된 동물에서 상체를 부드럽게 제거하십시오. 동물의 파괴를 개선하기 위해 가능한 한 많은 M9 버퍼를 제거하려고합니다.
7. 표백제 + NaOH 용액 500μL을 동물 펠릿에 넣고 4분 동안 타이머를 시작합니다.
8. 손으로 또는 로커를 사용하여 튜브를 부드럽게 흔들어 동물 펠릿을 완전히 부수고 동물이 표백제 + NaOH 용액에서 자유롭게 움직일 수 있도록하십시오. 전체 4 분 기간 동안 튜브를 흔들어 계속.
   참고: 필요한 표백제 + NaOH 솔루션의 양은 동기화되는 동물 펠릿의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 다양한 양의 동물과 표백제 + NaOH 솔루션으로 이 기술을 미리 최적화하십시오.
9. 4 분 후, 해부 현미경에서 파괴 효율을 확인합니다. 중력성 성인 동물의 대부분이 파손되고, 계란을 포함한 내부 내용이 방출되었는지 확인합니다.
10. 동물이 분리되지 않으면 튜브를 최대 속도로 잠시 소용돌이치면 현미경으로 다시 확인하십시오.
    참고 : 계란은 표백제 + NaOH 용액에 저항하지만, 그들은 불침투성없습니다. 계란은 필요 이상으로 표백제 + NaOH 용액에 노출되어서는 안됩니다. 동물 파괴 단계 동안 너무 오래 실속 은 자손에 대한 발달 문제로 이어질 수 있습니다.
11. 깨진 동물 용액에 M9 버퍼 10mL를 추가합니다.
12. 계란을 원심 분리하고 3 분 동안 1,000 x g 의 유해를 유지합니다.
13. 피펫 은 튜브의 바닥에있는 모든 계란을 포함하는 새로운 펠릿을 만지지 않도록, 멀리 상체.
14. M9 버퍼와 원심분리기의 10mL를 1,000 x g에서 3분 동안 다시 추가 합니다.
15. 표백제 + NaOH 용액이 남아 있지 않도록 2.13-2.14 단계를 두 번 더 반복하십시오.
16. 세 번째 M9 버퍼 워시 후, 상체를 제거하고 S-기초 버퍼 (표 2)의 10 mL을 추가합니다.
17. 튜브를 뒤집어 바닥에 있는 펠릿을 부러뜨려 버퍼에서 계란을 동등하게 중단합니다.
18. 튜브를 로커에 놓고 20°C에서 22시간 동안 튜브를 부드럽게 흔들어 알이 부화하고 애벌레 스테이지 1(L1) 체포에 도달할 수 있도록 합니다.
19. 22 h 후, 1000 x g에서 3 분 동안 동기화 된 L1 동물을 포함하는 튜브원심분리기.
20. 피펫과 튜브에 버퍼의 약 1 mL을 떠나 상체를 폐기.
21. 마이크로 파이프를 사용하여, 나머지 버퍼에 L1 동물의 균일 한 현탁액을 만들기 위해 동물 펠릿을 방해.
22. 대장균 OP50을 시드한 라벨이 부착된 150mm NGM 플레이트에 L1 동물의 균일한 서스펜션의 단일 액자를 전달한다.
23. 해부 현미경을 사용하여 드롭당 L1 동물의 수를 시각적으로 계산하여 방울당 동물 밀도를 계산합니다. 대장균 OP50의 완전히 자란 잔디가 있는 150mm NGM 플레이트는 L1 스테이지의 최대 500마리의 동물을 지원하여 중력 성인 단계에 도달할 수 있습니다.
24. 대장균 OP50을 사용하여 L1 동물을 6개의 150mm NGM 플레이트로 이송합니다. 플레이트에 과부하가 걸리지 않도록 하십시오.
    참고: 동물이 L1과 중력 성인 사이의 개발을위한 충분한 음식을 가질 지 여부가 불분명하면 각 접시에 동물을 더 적게 추가하고 접시를 더 사용합니다.
25. 동물이 중력 성인 단계에 도달하고 알을 낳기 시작할 때까지 20 °C에서 72 시간 동안 자라도록 하십시오.
26. 동기화된 잘 공급되는 야생형 그레이드 성인 동물에 대한 두 번째 표백제 동기화를 수행합니다.
27. 동기화된 L1 동물을 대장균 OP50으로 시드한 10개의 150mm NGM 플레이트에 놓고, 플레이트당 약 1,000마리의 동물을 배치합니다.
28. 새로운 동기화된 L1 동물이 L4 단계에 도달할 때까지 20°C에서 48시간 동안 자랄 수 있도록 합니다.
    참고: 목표는 L4 동물의 약 700 - 800 μL 펠릿을 얻는 것입니다. 너무 많은 동물은 발치 균질화제를 사용하기 어렵게 만들 수 있습니다; 이 균질화 와 증가 압력으로 인해 주사기에서 가능한 누설을 작동 하는 동안 근육 긴장으로 이어질 수 있습니다.

3. 발치 균질화 제고 준비

1. 표 3 및 표 4에 언급된 바와 같이 저혈압 및 고온 완충제를 모두 준비합니다.
   참고: 저근증 및 고온 완충제는 사전에 제조하고 4°C에서 안전하게 보관할 수 있습니다.
2. 발치 균질화제를 70% 에탄올로 분쇄챔버에 침수한 다음, 탈이온화된 물로 챔버를 헹구어 과도한 에탄올을 제거합니다.
   참고: 부식성 제제를 사용하여 발치 균질화제를 청소하지 마십시오. 에탄올과 탈온화 된 물로 철저한 헹구는 것만으로도 청소하기에 충분합니다.
3. 7.9820mm(18μm 갭 클리어런스) 텅스텐 초경공을 연삭 챔버에 삽입합니다.
4. 발치 균질화의 배럴의 각 끝을 캡과 제공된 엄지 나사와 함께 캡을 확보.
5. 샘플당 '완전한 저혈압 버퍼'의 5mL 준비: 1 M DTT의 5 μL(최종 농도: 1 mM DTT) 및 100x 프로테아제 억제제의 100μL, 일회용 칵테일(최종 농도: 2x)을 추가합니다. 버퍼를 얼음 위에 유지합니다.
6. 샘플당 '완전한 고독 버퍼'의 5mL 준비: 1 M DTT의 5 μL(최종 농도: 1mM DTT) 및 100x 프로테아제 억제제의 100μL, 일회용 칵테일(최종 농도: 2x)을 추가합니다. 버퍼를 얼음 위에 유지합니다.
   참고: 준비 당일 전체 저혈압 및 고독 버퍼를 사용합니다. 나중에 사용할 수 있습니다. -20°C에서 일회용 알리쿼트로 1 M DTT를 저장합니다. 프로테아제 억제제 일회용 칵테일을 4°C에 보관합니다.
7. 멸균 2 mL 주사기를 1mL의 '완전한 저혈압 버퍼'로 채우고 발치 균질화의 분쇄 챔버를 부드럽게 플러시하십시오. 챔버에 약 500 μL의 '완전한 저혈압 버퍼'를 둡니다.
8. 플러시 균질화제를 얼음위에 보관하고 30분 동안 식힙니다.
   참고 : 균질화는 동물을 분쇄하기 전에 얼음 차가운해야합니다. 분쇄 공정은 마찰로 인해 열을 생성하고 핵 단백질을 변성시킬 수 있습니다. 금속 균질화제는 이런 일이 발생하지 않도록 얼음 이질화가 차가운지 확인하십시오. 주변 얼음의 물이 균질화기에 들어가는 것을 피하십시오. 두 개의 멸균 주사기를 사용하여 균질화의 구멍을 연결하고 의도하지 않은 액체가 연삭 챔버에 들어가는 것을 차단하십시오.

4. 동물 컬렉션

참고: 동물의 수집, 중단 및 분획에 대한 주요 단계를 표시하는 빠른 참조 가이드가 제공됩니다(그림 1).

1. 15mL 원물 튜브에서 M9 버퍼로 잘 공급되는 L4 동물을 수집하고 동물을 1000 x g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 상체가 명확해질 때까지 동물 펠릿을 계속 씻습니다.
2. 동물을 4°C의 3mL로 씻어 내고 원심분리기를 1000 x g 에서 3분 동안 다시 씻으십시오.
   참고 : 4 ° C 저혈압 완충제로 최종 세척 하는 동안, 동물튜브의 측면에 충실 수 있습니다. 이것은 정상이며 상퍼를 제거하는 동안 동물의 작은 손실을 초래할 수 있습니다.
3. 저혈압 버퍼를 제거하고 동물 펠릿에 "완전한 저혈압 버퍼"의 1mL을 추가합니다. 동물 현탁액을 새로운 2mL 멸균 주사기로 옮기.
   참고: 마이크로피펫을 사용하여 동물을 주사기로 옮기는 동안, 피펫 팁 의 내부를 코팅하는 멸균 0.1% Tween20 용액을 부드럽게 피펫하여 파이펫 팁 벽에 달라붙는 것으로 인해 잃어버린 동물의 수를 줄입니다.

5. 분별

1. 얼음에서 7.9820mm 공으로 적재된 발치 균질화제의 분쇄 챔버를 통해 동물을 부드럽게 밀어 새로운 멸균 주사기로 동물을 균질화합니다. 30 전체 사이클에 대한 분쇄 챔버를 통해 동물을 밀어 반복합니다.
   참고: '전체 주기'는 주사기 플런저의 전체 위아래로 동작으로 정의됩니다.
   이 연삭 스텝은 7.9820mm 볼(18 μm 볼 베어링)을 사용합니다.
2. 30 사이클 후, 발치 균질화에서 가능한 한 많은 동물 현탁액을 제거하고 주사기를 저장하고 1.7 mL 마이크로 튜브에 팁을 넣습니다.
3. 연삭 챔버에서 7.9820mm 공을 제거하고 탈이온된 물로 청소하십시오. 건조하고 라벨이 붙은 튜브에 공을 반환합니다.
4. 7.9880mm(12μm 갭 클리어런스) 공을 연삭 챔버에 삽입하고 균질화기를 다시 밀봉합니다.
5. 1mL의 얼음 차가운 '완전한 저혈압 버퍼'로 분쇄 챔버를 다시 플러시하십시오.
6. 서스펜션을 25회 완전 사이클로 갈아보겠습니다.
7. 25사이클 후, 발치 균질화에서 동물 현탁액을 제거하고 서스펜션을 깨끗한 1.7mL 마이크로튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.
   참고: 발치 균질화제를 70% 에탄올과 탈온화물로 분해하고 청소합니다. 7.9880mm 공을 적절한 튜브로 되돌려 보십시오.
8. 500 x g , 4°C에서 5분 동안 현탁액을 원심분리하여 동물의 몸과 이물질을 펠렛합니다.
9. '입력 분획'이라고 표시된 튜브에 상체의 파이펫 40 μL을 얼음에 보관합니다.
   참고: 나중에 얼룩을 피하기 위해 모든 라벨에 알코올 방지 펜으로 작성합니다.
10. 나머지 상체를 새로운 1.7 mL 튜브로 옮기고 튜브 바닥에 있는 펠릿을 만지지 않도록 주의를 기울인 다음 펠릿을 폐기하십시오.
11. 4,000 x g, 4°C에서 4°C에서 5분 동안 핵을 펠릿하는 상체원 원심분리기.
12. 상체를 옮기고, 펠릿 핵을 방해하지 않도록 주의하고, 새로운 1.7 mL 튜브로 튜브를 '세포자극분획'으로 표시한다.
    참고: 17,000 x g, 4°C에서 세포분획을 30분 동안 더 원심분리하여 잔류 불용성 물질을 제거하고 서부 얼룩(특히 핵 단백질용)에 대한 부정적인 대조군으로 사용합니다.
13. 핵 펠릿을 500μL의 '완전한 저혈압 완충제'로 세척하고 펠릿을 새로운 1.7mL 튜브로 옮겨냅니다. 4,000 x g에서 부유 한 펠릿을 원심 분리 , 5 분 동안 4 °C.
14. 상체를 폐기하고 핵 펠릿에 신선한 '완전한 저혈압 버퍼'의 500 μL을 추가하고 현탁액을 새로운 1.7 mL 튜브로 옮기십시오. 원심 분리는 4,000 x g , 5 분 동안 4 °C에서 다시 샘플을 원심 분리합니다.
15. 상체를 제거하고 펠릿을 40 μL의 '완전한 고장성 버퍼'로 용해하십시오. 새로운 핵 현탁액을 새로운 1.7mL 튜브로 옮기고 튜브를 '핵 분획'으로 표시하고 얼음 에 보관하십시오.
16. 형광 정량화 키트를 사용하여 3분분의 단백질 농도를 결정한다.
    참고: 이 방법에서 획득한 핵 단백질의 양은 1-2 μg/μL에 달할 수 있습니다.
17. 핵 분획을 핵 단백질 의 6 μg를 포함하는 일회용 튜브에 알리쿼트하고 드라이 아이스와 에탄올 욕조에서 동결을 스냅합니다. 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에 보관하십시오.

6. 전사 분석

1. 가열하고 30 °C에 열 블록을 예열.
2. 50m _MgCl2, 핵 추출물 1x 전사 버퍼, 100mMrATP, 100mMM rGTP, 100mMM rUTP, CMV 프로모터 양성 제어 템플릿 : 체외 전사 시스템에서 Nulcear 추출물에서 다음을 제거합니다. 얼음 위에 해동.
   참고: 고충실도 폴리머라제를 사용하여 양성 제어 DNA 템플릿을 증폭하고 정규화된 일회용 알리쿼트로 저장합니다.
3. 10mM 작업 솔루션을 준비하기 전에 해동 된 rNTP를 혼합하고 원심분리합니다.
   참고: 각 rATP, rCTP, rGTP 및 rUTP의 2μL을 _H2O의 12 μL에 추가하여 각 rNTP의 10mMMMM를 달성합니다. 이 컴포지션은 필요한 경우 확장할 수 있습니다.
4. 일조튜브에 라벨을 부착하고 향후 사용을 위해 -20°C에 저장하는 rNTP 혼합물을 알리쿼트한다.
5. "마스터믹스"라고 표시된 신선한 1.5 mL 튜브에서 표 5에 언급된 바와 같이 반응당 시약을 추가합니다.
6. 각 반응 튜브에 마스터믹스의 14 μL 전송
7. 각 반응 튜브에 1x 전사 버퍼의 11 μL 마이너스(핵 추출물의 5μg의 부피)를 추가합니다.
8. 각 반응 튜브에 핵 추출물 의 5 μg를 추가합니다.
9. 반응 튜브를 부드럽게 탭하여 내부의 내용을 혼합하고 혼합 후 튜브를 펄스 원심분리기를 사용하여 반응 물질이 튜브 벽에 달라붙지 않도록 합니다.
10. 30°C에서 30분 동안 반응을 배양한다.
11. RNA 추출 키트에서 제공하는 400 μL의 RLT 버퍼를 추가하여 반응을 즉시 중단합니다.
    참고: 이 시점에서 중지해도 안전합니다. 샘플은 RNA 추출 키트로 더 청소할 때까지 -80°C에서 저장할 수 있습니다.

7. RNA 정리

1. RNA 추출 키트에 제공된 RNase-Free DNase 세트를 사용하여 DNase I 스톡 솔루션을 준비합니다. RNase가 없는 물의 550 μL에서 lyophilized DNase I를 용해하십시오. 용액을 부드럽게 섞습니다. 소용돌이하지 마십시오. 10 μL 일회용 튜브에 DNase I 용액을 알리쿼트와 -20 °C에 알리쿼트 저장.
2. 분자 등급 에탄올과 RNase 가 없는 물을 사용하여 70% 및 80% 에탄올을 준비하십시오.
3. 정리를 시작하기 전에 샘플과 시약을 RNase 가 없는 작업 공간으로 이동합니다.
4. 각 샘플에 70% 에탄올의 400 μL을 추가하고 부드럽게 파이펫을 섞어 잘 섞습니다.
5. 샘플의 400 μL을 2mL 수집 튜브가 있는 표지된 RNA 추출 스핀 컬럼으로 옮기고 30s용 8,500 x g 의 원심분리기샘플을 분리한다. 흐름을 삭제합니다.
6. 나머지 샘플과 함께 7.5 단계를 반복하고 흐름을 폐기합니다.
7. 각 컬럼에 RW1 버퍼(RNA 추출 키트)의 350 μL을 추가합니다. 30초동안 8,500 x g 의 원심분리기입니다. 흐름을 삭제합니다.
8. DNase I 스톡 용액의 단일 10 μL 알리쿼트에 RDD 버퍼(RNA 추출 키트)의 70 μL을 추가하고 부드럽게 섞습니다. 소용돌이하지 마십시오.
9. DNase I 인큐베이션 믹스(80 μL)를 스핀 컬럼 멤브레인에 직접 추가합니다. 15분 동안 실온에서 기둥을 배양합니다.
   참고: 멤브레인에 DNase I 솔루션을 추가해야 합니다. 열 벽 또는 O 링에 대한 솔루션의 일부를 잃지 마십시오.
10. 15분 후, 350μL의 RW1 버퍼를 열에 추가합니다. 8,500 x g에서 30 s의 원심 분리기 . 흐름을 삭제합니다.
11. 컬럼을 새로운 2mL 수집 튜브에 넣습니다. 스핀 컬럼에 RPE 버퍼(RNA 추출 키트)의 500 μL을 추가합니다. 30 초막세척을 위해 8,500 x g 의 컬럼을 원심분리합니다. 흐름을 삭제합니다.
12. 각 열에 80% 에탄올의 500 μL을 추가하고 30초 동안 8,500xg의 원심 분리기를 원심분리합니다. 흐름을 삭제합니다.
13. 컬럼을 새로운 2mL 수집 튜브에 넣습니다. 기둥 뚜껑을 열어 놓고 기둥을 17,900 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 흐름을 삭제합니다.
14. 기둥을 라벨이 붙은 1.7mL 튜브에 넣습니다. 스핀 컬럼 멤브레인의 중앙에 직접 RNase가 없는 물 17μL을 추가합니다. 기둥을 실온에서 1분 동안 쉬게 하십시오. 1분 동안 17,900 x g 의 원심 분리합니다.
15. 컬럼을 버리고 1.7 mL 튜브를 신선하게 정제된 RNA 샘플로 유지하십시오.

8. DNA 소화

1. 37°C 및 65°C에서 두 개의 열 블록을 예열합니다.
2. 각 샘플에 10x 반응 버퍼의 2 μL을 추가합니다.
3. 각 샘플에 DNase의 1 μL(MBU)을 추가합니다.
4. 파이펫을 10μL로 설정하고 새로운 용액을 위아래로 파이펫하여 부드럽게 섞습니다. 소용돌이하지 마십시오.
5. 남은 DNA를 소화하기 위해 37°C에서 RNA 샘플을 30분 동안 배양합니다.
6. 10 분 동안 65 °C에서 열 블록에 샘플을 배양하여 DNase를 비활성화합니다.
   참고: 이 단계에서 멈추고 RNA를 -80°C에 저장하여 나중에 역전사를 수행하는 것이 안전합니다.

9. 역전사

1. 써모사이클러를 프로그래밍할 때 인큐베이션 전에 1h, 37°C 단계를 추가하여 열순환기를 예열합니다. 샘플을 준비하는 동안 '예열 단계'로 프로그램을 실행하고 열 순환기가 37 °C에 도달 할 수 있습니다. 역전사용 시료가 준비되면 37°C 예열 단계를 건너뛰고 실제 배양 단계(표 6)로 진행한다. 써모사이클러에 건너뛰기 기능이 없는 경우 인큐베이션 전에 1분 37°C 단계를 추가합니다. 시스템을 일시 중지하고 준비된 샘플을 추가하기 전에 열 순환기에서 적절한 온도로 가열되도록 합니다.
2. RNase 가없는 _H2O에서 전사 역 프라이머의 10 μM 작업 솔루션을 준비하고 얼음에 저장합니다.
3. 얼음 에 해동, 역 전사 키트에서 10 배 버퍼, dNTP 믹스 (5 mMM 각 dNTP), RNase 억제제, 및 역 전사.
4. 표 7에 언급된 성분을 깨끗한 0.2 mL PCR 튜브에 추가하여 마스터믹스(반응당)를 준비한다.
5. 각 샘플에 대해 마스터믹스의 알리쿼트 18 μL이 새로운 0.2 mL PCR 튜브로 들어갑니다.
6. 각각의 표지된 튜브에 각 샘플에 대해 DNase 처리된 RNA의 2 μL을 추가합니다.
7. 예열된 열순환기에서 1h에 대해 37°C에서 샘플을 배양합니다.
8. 시료를 -20°C로 이동하여 역전사 후 저장하거나 다음 단계로 직접 진행한다.
   참고: 이 단계에서 중지하는 것이 안전합니다. cDNA를 -20°C에 저장하여 나중에 사용할 수 있습니다.

10. 특정 제품 증폭

1. 얼음 에 해동 : cDNA, 10 μM 전사 앞으로 10 μM 전사 및 10 μM 전사 역 프라이머, PCR 2x 프리믹스 A.
   참고: PCR 2x 프리믹스 A를 더 작은 볼륨으로 알리쿼트하여 해동 시간을 줄입니다.
2. 표 8에 언급된 성분을 깨끗한 0.2 mL PCR 튜브에 추가하여 마스터믹스(반응당)를 만듭니다.
3. 각 샘플에 대한 마스터믹스의 Aliquot 24 μL은 0.2 mL PCR 튜브를 깨끗하게 라벨로 표시합니다.
4. 각 샘플의 cDNA 1 μL을 각 튜브에 추가합니다.
5. 표 9에 언급된 프로그램 조건을 사용하여 열순환기의 샘플을 배양합니다.
6. 인큐베이션 후 PCR 제품을 4°C 또는 -20°C로 저장하여 장기 보관하십시오.

11. 젤 분석

1. 1x TAE 버퍼를 사용하여 아가로즈와 1x 젤 얼룩의 2 %w / v가 들어있는 젤을 준비하십시오.
2. PCR 제품을 50 V 및 300 mA에서 1시간 동안 또는 명확한 대역 분리가 있을 때까지 실행합니다.
3. 젤 이미저에서 미리 로드된 자동 노출 프로그램을 사용하여 젤을 이미지합니다.

Representative Results

설명된 단계에 따라 기능성 핵 추출물 (그림 1)을 산출해야 하며, 연삭 또는 세척 단계의 편차는 활동이 좋지 않거나 수율이 낮을 수 있습니다. 기능성 C. elegans 핵 추출물이 얻어지면, 이전에 기술된 시험관 분석 에 추가될 때 DNA 템플릿상CMV 프로모터의 하류 영역을 전사한다. 결과 RNA 전사체는 종래의 방법을 사용하여 핵 단백질 및 DNA 템플릿으로부터 정제될 수 있다. 템플릿 DNA없이, 역 전사 및 후속 PCR 제품은 핵 추출물에 의해 전사 된 RNA의 결과일 수 있습니다. PCR 제품은 아가로즈 젤상에서 시각화될 수 있으며, DNA 대역의 강도는 핵단백질 및 RNA 절연의 품질을 나타낼 수 있다. 약한 대역 강도는 열 또는 완충 제고불량에 의해 핵 추출물의 불활성화에 의해 발생할 수 있다. 지나치게 강한 대역 강도는 RNA 정화 불량 또는 부적절한 DNase 소화로 인한 DNA 오염의 결과일 수 있습니다. 일관되고 성공적인 핵 격리는 유사한 강도의 밴드를 생성하고, 전사 및 PCR 부정적인 컨트롤 모두 눈에 보이는 PCR 제품이 없어야한다 (그림 2).

그림 1. 핵 추출 절연의 개요. 순서도는 C. elegans에서 핵 추출을 분리하기위한 주요 단계를 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. C. 예레간 핵 추출물은 그 활동을 유지합니다. 상기 겔 이미지는 CMV 프로모터 DNA 템플릿 을 이용한 C. 엘레간 L4 유충 핵 추출물의 전사 산물을 나타낸다. 활성 핵 단백질의 성공적인 격리는 차선 1과 2에서 볼 수 있듯이 체외 전사 후 132 bp PCR 생성됩니다. 격리가 실패하면 약한 대역이 발생하거나 레인 3과 유사한 PCR 제품이 없습니다. PCR 증폭을 통한 전사 활성의 이러한 시각화는 핵 추출 절연의 품질을 평가하는 간단한 방법입니다. 양성 PCR 제어는 CMV 프로모터 DNA 템플릿을 PCR 반응에 추가하여 생성되며, 음의 제어는 템플릿 DNA가 결여되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

선충 성장 미디어 플레이트
아가르 (Agar)	20.4 g
소금	2.8 g
바토 펩톤	2.3 g
dH2O	975 mL
30 분 동안 121 °C에서 오토 클레이브
다음을 추가하기 전에 미디어를 50°C로 냉각하도록 허용
1 M CaCl2 (멸균)	1 mL
1 M MgSO4 (멸균)	1 mL
10,000대/mL 니스타틴(멸균)	3 mL
5 mg/mL 콜레스테롤 95% 에탄올 (필터 멸균)	1 mL
1M KPO4 pH 6.0 (멸균)	25 mL

표 1.

M9 버퍼
KH2PO4	3 g
Na2HPO4	6 g
나Cl	5 g
dH2O	1,000mL
121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브
1 M MgSO4 (멸균)	1 mL (오토클레이브 후 추가)
S-기저 버퍼
KH2PO4	6 g
K2HPO4	1 g
나Cl	5.85 g
dH2O	1,000mL
121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브
콜레스테롤 5 mg/mL (멸균)	1 mL (오토클레이브 후 추가)

표 2.

저혈압 버퍼
스톡 솔루션	음량	최종 농도
1 M HEPES KOH pH 7.6	7.5 mL	15 mM
1 M KCl	5.0 mL	10mM
1 M MgCl2	2.5 mL	5 mM
0.5 M EDTA	0.1 mL	0.1 mM
1 M 수크로즈	175 mL	350 mM
dH2O	309.9 mL
필터 살균

표 3.

하이퍼토닉 버퍼
스톡 솔루션	음량	최종 농도
1 M HEPES KOH pH 7.6	7.5 mL	15 mM
1 M KCl	200 mL	400mM
1 M MgCl2	2.5 mL	5 mM
0.5 M EDTA	0.1 mL	0.1 mM
10% 트웬 20	5 mL	0.10%
50% 글리세롤	100 mL	10%
dH2O	184.9 mL
필터 살균

표 4.

MgCl2, 50 mM	1.5 μL
rNTP 믹스, 각각 10mM	1.0 μL
템플릿 DNA, 25 ng/μL	4.0 μL
RNase 프리 H2O	7.5 μL

표 5.

걸음	임시 직원	시간	사이클 번호
예	37 °C	약 60분	1x
역전사	37 °C	약 60분	1x
들다	10°C		1x

표 6.

10x 역전사 버퍼	2.0 μL
dNTP 믹스 (각 dNTP 5mM)	2.0 μL
전사 역 프라이머 (10 μM)	2.0 μL
RNase 억제제	1.0 μL
센스 스크립트 역 전사	1.0 μL
RNase 프리 H2O	10.0 μL

표 7.

RNase 프리 H2O	6.25 μL
전사 포워드 프라이머 (10 μM)	2.5 μL
전사 역 프라이머 (10 μM)	2.5 μL
PCR 2X 프리믹스 A	12.5 μL
PCR 효소 믹스	0.25 μL

표 8.

걸음	임시 직원	시간	사이클 번호
초기 자연	92 °C	60 s	1x
변성	92 °C	30 s
안닐 ()	59°C	30 s	35x
확장	72 °C	30 s
들다	10°C		1x

표 9.

Discussion

C. elegans 는 저비용 유지 보수와 유전 조작의 용이성 으로 인해 진핵 전사 시스템을 연구하는 매력적인 모델 유기체입니다. 여기서 L4 C. elegans 로부터 기능적으로 활성 핵 추출물의 일관된 절연을 위한 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 전사 활성을 시각화하는 데 초점을 맞추고 있지만, 전사 후 생성된 cDNA는 RT-qPCR을 사용하여 전사 활성⁸의 보다 정밀한 측정을 얻을 수 있다. C. elegans 에서 핵 단백질을 분리하는 이 방법은 진핵 전사 기계의 연구를 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다. C. elegans 는 요리나 효모 식민지에 있는 세포의 문화가 아니라 자유 로밍 동물이기 때문에 핵 추출물을 고립시키고 연구하는 것은 전사 기계가 시간이 지남에 따라 또는 다양한 환경에서 어떻게 변할 수 있는지에 대한 명확한 통찰력을 줄 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 C. elegans 의 저렴한 비용과 탄력성을 활용할 수 있습니다. C. 다른 모델 유기체 또는 세포 배양과 는 달리, 세균 또는 효모 오염이 나타날 때 훨씬 더 용서합니다. C. elegans 의 인구는 확립 된 프로토콜을 사용하여 오염을 쉽게 청소 할 수 있으며 오염이 발생할 때 시간과 노력을 절약 할 수 있습니다⁹. 전반적으로, 생화학 적 분석을 위해 C. elegans 에서 핵 추출물을 사용하는 것은 공급 업체에서 핵 추출물을 구입하거나 덜 용서 하는 모델 유기체를 다루는 것에 비해 더 저렴하고 유연한 옵션이 될 수 있습니다.

이 프로토콜은 비교적 간단하지만 핵 추출물의 성공적인 격리에 특별한 주의가 필요한 중요한 단계가 여전히 있습니다. 완전한 저혈압 및 고온 완충제를 준비하는 동안 두 솔루션의 라벨이 명확하게 표시되고 분리되는 것이 중요합니다. 버퍼가 격리 하는 동안 어느 시점에서 전환 하는 경우, 이 핵 단백질의 불 활성화 또는 핵 단백질에서 세포 단백질의 가난한 분획으로 이어질 수 있습니다. 또한, 필요한 경우, 물이나 다른 용액이 아닌 고토닉 완충제로 희석되어야 한다. 높은 염 농도 단백질의 활동을 보존 하는 데 도움이, 그리고 저 포 닉 솔루션이 활동을 죽일 수 있습니다¹⁰.

이 프로토콜의 연삭 부분 중에 발생할 수있는 또 다른 도전은 텅스텐 공의 표면에 고준 파편에서 온다. 매 연삭 사이클마다 공을 씻고 건조해야 한다는 것이 명시되어 있지만, 재료는 공의 매끄러운 표면에 부착됩니다. 이 물질은 일반적으로 공의 둘레 주위에 녹슨 색 의 고리로 나타나고 공과 연삭 챔버의 벽 사이의 간격을 차단할 만큼 충분히 두껍습니다. 이 막힘은 결국 근육 손상또는 주사기의 파열로 이어질 수있는 분쇄기를 통해 동물을 밀어 점점 더 어려워짐에 따라 눈에 띈다. 텅스텐 볼이 변색을 보이기 시작하면 뜨거운 물에 5 분 동안 담근 다음 새로운 수색 패드로 표면을 청소하십시오. 산성 또는 기본 세척 용액을 사용하지 마십시오. 부드럽게 연마 한 후, 텅스텐 공은 원래의 빛으로 돌아와야하며 샘플을 갈기가 눈에 띄게 쉬울 것입니다.

이 프로토콜은 C. elegans에서 전체 핵 추출물을 분리하도록 설계되었습니다. 그것은 다른 모델 유기체에 사용을 위해 테스트 되지 않았습니다. 다른 유기체로부터의 핵 추출물은 상이한 완충제가 필요할 수 있으며, CMV 프로모터는 다른 비포유류 샘플에서 전사를 유도하기에 충분하지 않을 수 있다. 이 방법을 사용하여 수집된 핵 추출물은 조직 또는 세포특이적 또한 아니다. 이 방법을 사용하여 측정된 모든 전사 활동은 조직 간의 미묘한 변화를 숨길 수 있는 동물을 전체적으로 봅니다.

이 프로토콜의 미래 사용은 DNA 손상 후에 C. elegans 의 DNA 복구 또는 복제 기계를 측정할 수 있었습니다. 격리 과정에서 수집된 세포균 분획은 수용성 단백질의 양을 측정하고 전사측정과 유사한 방식으로 이러한 단백질의 활성을 정량화하는 데 활용될 수 있다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010