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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Mesure du pH, de la chimie redox et de la capacité dégradative des macropinosomes à l’aide de la microscopie ratiométrique à double fluorophore

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62733
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Summary

Nous décrivons des protocoles pour mesurer le pH, les événements oxydatifs et la digestion des protéines dans les macropinosomes individuels dans les cellules vivantes. L’accent est mis sur la microscopie ratiométrique à double fluorophore et les avantages qu’elle offre par rapport aux techniques basées sur la population.

Abstract

Ces dernières années, le domaine de la macropinocytose s’est développé rapidement. La macropinocytose est apparue comme un mécanisme central par lequel les cellules immunitaires innées maintiennent l’homéostasie et l’immunité de l’organisme. Simultanément, et contrairement à son rôle homéostatique, il peut également conduire à diverses pathologies, y compris le cancer et les infections virales. Contrairement à d’autres modes d’endocytose, les outils développés pour étudier la maturation des macropinosomes restent sous-développés. Ici, le protocole décrit des outils nouvellement développés pour étudier l’environnement redox dans la lumière des macropinosomes précoces et en cours de maturation. Les méthodologies d’utilisation de la microscopie à fluorescence ratiométrique pour évaluer le pH, la production d’espèces réactives de l’oxygène et la capacité de dégradation dans la lumière des macropinosomes individuels dans les cellules vivantes sont décrites. Les mesures d’organites uniques offrent l’avantage de révéler l’hétérogénéité spatio-temporelle, qui est souvent perdue avec les approches basées sur la population. L’accent est mis sur les principes de base de la microscopie ratiométrique à double fluorophore, y compris la sélection des sondes, l’instrumentation, l’étalonnage et les méthodes unicellulaires par rapport aux méthodes basées sur la population.

Introduction

La macropinocytose fait référence à l’absorption de grandes quantités de liquide extracellulaire dans des organites cytoplasmiques liés à la membrane appelés macropinosomes1,2. C’est un processus hautement conservé effectué par des organismes unicellulaires libres, tels que l’amibe Dictyostelium spp. 3, ainsi que les anthozoaires4 et les métazoaires2. Dans la plupart des cellules, la macropinocytose est un événement induit. La ligature des récepteurs de la surface cellulaire induit la saillie d’extensions de membrane plasmique entraînées par l’actine appelées volants. Une fraction de ces volants, par un mécanisme mal compris, scellent à leurs extrémités distales pour former des macropinosomes (bien qu’au-delà de la portée de cet article sur les méthodes, pour des examens détaillés sur la mécanique de la macropinocytose, veuillez vous référer aux références1,2,5,6,7). Le stimulus extracellulaire induisant la macropinocytose est le plus souvent un facteur de croissance soluble5,8. En conséquence, l’événement macropinocytaire permet l’ingestion d’un bolus de matériel extracellulaire à partir duquel la cellule peut dériver des métabolites utiles pour faciliter la croissance. Malheureusement, cette voie d’administration de nutriments peut également entraîner une pathologie. Certaines cellules cancéreuses hébergent des mutations qui entraînent une macropinocytose continue ou constitutive. L’apport continu de nutriments facilite la prolifération incontrôlée des cellules cancéreuses et a été lié à des tumeurs particulièrement agressives9,10,11,12,13. De même, les virus peuvent induire une macropinocytose pour accéder aux cellules hôtes, entraînant ainsi une pathologie virale14.

La macropinocytose fonctionne également dans le maintien de l’immunité aux agents pathogènes. Certaines cellules immunitaires innées telles que les macrophages et les cellules dendritiques s’engagent dans l’échantillonnage constitutif et agressif du liquide extracellulaire via la macropinocytose6,15,16. Ce mode de macropinocytose est incroyablement actif, et une seule cellule dendritique peut s’engorger d’un volume de liquide extracellulaire équivalent à son propre poids toutes les heures17. Malgré cet échantillonnage constitutif, les macrophages et les cellules dendritiques ne se répliquent pas de manière incontrôlable comme le font les cellules tumorales, mais semblent plutôt traiter le matériel extracellulaire de manière à ce que l’information puisse être extraite pour informer de la présence, voire de l’absence, de menaces potentielles. L’information est extraite comme i) des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes qui peuvent être lus par les récepteurs de reconnaissance intracellulaire des agents pathogènes et ii) de courtes étendues d’acides aminés qui peuvent être chargées sur les principales molécules d’histocompatibilité pour le dépistage par les cellules du système immunitaire adaptatif16,18,19. Il n’est pas clair à l’heure actuelle si les agents pathogènes subvertissent cette voie pour le traitement de l’information par les cellules immunitaires.

Malgré ces rôles bien définis et critiques de la macropinocytose à la fois dans le maintien de l’immunité et de l’homéostasie et contrairement à d’autres modes d’endocytose plus couramment étudiés, peu de fonctionnement interne (luminal) des macropinosomes sont connus. Le développement de protocoles et d’outils standardisés pour étudier la biochimie luminale des macropinosomes nous aidera non seulement à mieux comprendre leur biologie unique, mais fournira également des informations qui peuvent être exploitées pour de nouvelles stratégies thérapeutiques, y compris l’administration de médicaments20. Ce manuscrit de méthode se concentrera sur des outils récemment développés pour disséquer, au niveau de l’organite unique, divers aspects de la biochimie luminale des macropinosomes.

Les fluorophores peuvent être utilisés pour mesurer des biochimies spécifiques d’organites si i) ils se divisent préférentiellement dans le compartiment d’intérêt et/ou ii) s’ils subissent des changements spectraux en réponse au paramètre d’intérêt. Par exemple, dans le cas du pH, les bases faibles fluorescentes, telles que l’orange acridine, le violet crésylique et les colorants LysoTracker, s’accumulent préférentiellement dans les organites acides. Par conséquent, leur intensité relative est une indication approximative que l’organite marqué est acide. D’autres fluorophores sensibles au pH, tels que la fluorescéine, le pHrodo et le cypHer5e, subissent des changements spectraux lors de la liaison aux protons(Figure 1A-C). Les modifications de l’émission de fluorescence des fluorophores sensibles au pH peuvent donc fournir une approximation utile du pH. L’utilisation de fluorophores simples présente toutefois un certain nombre d’inconvénients. Par exemple, les modifications du plan focal, le photobleachage et les modifications du volume des organites individuels, un phénomène courant dans les macropinosomes21,peuvent induire des modifications de l’intensité de fluorescence des fluorophores simples, ce qui ne peut pas être facilement corrigé pour22. Les évaluations à longueur d’onde unique, bien qu’utiles pour visualiser les compartiments acides, sont donc purement qualitatives.

Une approche plus quantitative consiste à cibler le fluorophore sensible aux paramètres avec un fluorophore de référence à l’organite d’intérêt. Le fluorophore de référence est idéalement insensible aux changements biochimiques au sein de l’organite(Figure 1D-F)et peut donc être utilisé pour corriger les changements dans le plan focal, le volume organellaire et, dans une certaine mesure, le photobleachage23. En utilisant cette approche, appelée fluorescence ratiométrique à double fluorophore, la correction peut être obtenue en générant un rapport entre l’émission de fluorescence du fluorophore sensible aux paramètres et le fluorophore de référence.

Ici, le protocole utilisera le principe de l’imagerie ratiométrique à double fluorophore pour mesurer le pH, les événements oxydatifs et la dégradation des protéines dans les macropoinosomes. Dans chaque cas, un fluorophore sensible au paramètre d’intérêt sera sélectionné et un fluorophore de référence. Afin de cibler les fluorophores spécifiquement sur les macropinosomes, ils seront couplés de manière covalente à 70 kDa dextran, qui est préférentiellement incorporé dans les macropinosomes24. Tous les tests seront effectués dans des cellules Raw264.7 mais peuvent être adaptés à d’autres types de cellules. Dans la mesure du possible, les rapports de fluorescence seront étalonnés par rapport à une courbe de référence pour obtenir des valeurs absolues. Il est important de savoir que toutes les mesures seront effectuées dans des cellules vivantes pour une évaluation dynamique et quantitative de l’environnement luminal des macropinosomes.

Lors de la sélection de fluorophores sensibles au pH, un certain nombre de considérations doivent être pesées. Le premier est le pKa du fluorophore, qui indique la plage de valeurs de pH à laquelle la sonde sera la plus sensible. Si l’on suppose que peu de temps après la formation, le pH du macropinosome sera proche de celui du milieu extracellulaire (~pH 7,2) et qu’il s’acidifiera progressivement par des interactions avec les endosomes et les lysosomes tardifs (~pH 5,0), alors une sonde avec un pKa sensible dans cette plage(Figure 2C)doit être sélectionnée. La fluorescéine fluorophore, qui a un pKa de 6,4, est extrêmement sensible dans cette plage. Il a été largement utilisé pour mesurer d’autres organites similaires, tels que les phagosomes, et sera le fluorophore de choix dans ce manuscrit22,25. Comme fluorophore de référence, on utilisera de la tétraméthylrhodamine, qui est insensible au pH(figure 1E). D’autres fluorophores, tels que pHrodo et cypHer5e, peuvent être substitués à la fluorescéine lorsque les propriétés spectrales de la fluorescéine correspondent à d’autres variables expérimentales. Certains fluorophores de référence suggérés pour pHrodo et cypHer5e sont illustrés à la figure 1.

Une deuxième considération est la méthode par laquelle les deux fluorophores seront ciblés spécifiquement sur les macropinosomes. Le dextran de la taille 70 kDa, qui a un rayon hydrodynamique d’environ 7 nm, ne colle pas non spécifiquement aux cellules et est incorporé dans les macropinosomes, mais pas dans les fosses revêtues de clathrine ou les caveolae, et marque donc les macropinosomes (Figure 2A et Figure 3A, B)16,24,26. Dans ce protocole, le dextran de 70 kDa marqué à la fluorescéine et le dextran de 70 kDa marqué à la tétraméthylrhodamine (TMR) seront utilisés comme sondes sensibles au pH et de référence, respectivement.

Dans les cellules immunitaires innées, la macropinocytose et la phagocytose représentent les deux principales voies d’internalisation du matériel exogène pour le traitement et la présentation ultérieure aux cellules de la réponse immunitaire adaptative27. Le contrôle minutieux et coordonné de la chimie redox de la lumière des phagosomes et des macropoinosomes est essentiel au traitement spécifique au contexte du matériau exogène. Le régulateur d’événements oxydatifs dans les phagosomes est peut-être le NADPH oxydase, un grand complexe multi-sous-unités qui produit de grandes quantités d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la lumière des phagosomes28. En effet, son activité est centrale pour un traitement approprié de l’antigène au sein des phagosomes29,30. Pourtant, l’activité de la NADPH oxydase sur les membranes macropinosomales n’a pas été explorée.

Dans ce protocole, l’ester de succinimidyle H2DCFDA est utilisé pour mesurer les événements oxydatifs au sein du macropinosome. Il s’agit d’une forme modifiée de fluorescéine (diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine), qui est peu fluorescente sous sa forme réduite. Lors de l’oxydation, son émission de fluorescence augmente considérablement. Il convient toutefois de noter une mise en garde importante de H2DCFDA - comme il est basé sur la fluorescéine fluorophore, sa fluorescence est également trempée dans des compartiments acides, et il faut prendre soin de contrôler cette variable lors de la conception des expériences28. Semblable à l’approche de mesure du pH, l’ester de succinimidyle H2DCFDA sera attaché de manière covalente à 70 kDa dextran et le dextran de 70 kDa marqué TMR sera utilisé comme fluorophore de référence(Figure 3A).

L’ovalbumine fluorescente sera utilisée pour mesurer la dégradation des protéines dans les macropinosomes. L’ovalbumine utilisée ici est densément étiquetée avec un colorant FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) qui est auto-trempé. Lors de la digestion, des peptides fortement fluorescents marqués par un colorant sont libérés. Comme l’ovalbumine ne peut pas être facilement conjuguée à 70 kDa dextran, les cellules avec 70 kDa dextran marqué TMR et ovalbumine en phase fluide seront co-incubées. Le signal TMR sera utilisé pour générer un masque de macropoinosomes lors de l’analyse post-imagerie, et le signal libéré de l’ovalbumine digérée sera mesuré à l’intérieur du masque(Figure 3B).

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Protocol

1. Préparation des cellules

  1. Cultiver des cellules Raw264.7 à 37 °C et 5% de CO2 à 70% de confluence dans rpmI complété par 10% de sérum inactivé par la chaleur.
  2. Un jour avant le test, ensemencez des cellules Raw264.7 à une densité de 5 x 104 cellules par puits dans une plaque de 96 puits. S’assurer que chaque puits contient 100 μL de milieu de croissance. Assurez-vous que la plaque de 96 puits a des côtés noirs et un fond en verre pour l’imagerie.
    REMARQUE: Ici, des plaques de 96 puits ont été utilisées pour l’imagerie. Les plaques de 96 puits permettent d’utiliser de plus petites quantités de cellules et de réactifs par rapport aux chambres d’imagerie plus grandes. Cependant, n’importe quelle chambre conçue pour l’imagerie de cellules vivantes peut être utilisée et les réactifs peuvent être mis à l’échelle en conséquence.
  3. Le jour de l’essai, vérifiez si les puits sont confluents à au moins 70 %.

2. Mesure du pH des macropinosomes

  1. Préparez les cellules comme dans la section 1.
  2. Laver tous les puits avec 100 μL de HBSS à 37 °C.
  3. Remplir chaque puits avec 100 μL de HBSS contenant 0,025 mg/mL de dextran de 70 kDa marqués TMR et 0,025 mg/mL de dextran 70 kDa marqué à la fluorescéine.
  4. Placez les cellules dans un incubateur réglé à 37 °C pendant 15 min.
  5. Retirez les cellules de l’incubateur et lavez les cellules 6x avec 100 μL de HBSS.
  6. Remplir chaque puits avec 100 μL de HBSS à 37 °C.
  7. Placez la plaque sur le microscope avec un étage et une chambre chauffés.
  8. Ajustez les paramètres d’excitation/émission pour chaque fluorophore au besoin.
    REMARQUE: Les conditions idéales pour l’acquisition d’images varient en fonction des fluorophores utilisés et des réglages de microscope individuels. Ici, les images ont été acquises sur un microscope confocal à balayage laser Leica SP5. TMR a été excité avec une ligne laser 543 et l’émission a été collectée de 610 nm à 650 nm. La fluorescéine a été excitée avec une ligne laser 488 et l’émission a été collectée de 500 nm à 550 nm. Un objectif d’immersion dans l’huile de 63x a été utilisé et un volume Z de 10 μm a été acquis à des intervalles de 0,5 μm.
  9. Acquérir une image de chaque puits, en alternant entre les fluorophores entre chaque puits.
  10. Après la première acquisition, vérifiez si tous les puits sont restés concentrés sur l’ensemble de la plaque.
  11. Acquérir des images de chaque puits à des intervalles de 1 à 15 minutes pendant la durée souhaitée.

3. Étalonnage in situ du pH des macropinosomes

  1. Lors de l’acquisition de l’image, préparer 1 L de solution riche en potassium (K+riche) contenant 140 mM KCl, 1 mM MgCl2,1 mM CaCl2et 5 mM de glucose. Compléter un volume de 400 mL de la solution riche enK+avec 25 mM d’HEPES (à partir d’une solution mère de 1 M, pH 7,2) et un volume séparé de 400 mL avec 25 mM de MES (à partir d’une solution mère de 0,5 M, pH 6,0).
  2. Ajuster une aliquote de 50 mL de la solution riche en K+tamponnée avec 25mM HEPES à pH 7,5 en utilisant 10 M HCl ou 10 M KOH selon les besoins.
  3. Ajustez trois aliquotes distinctes de 50 mL de la solution riche en K+tamponnées avec 25 mM MES à pH 6,5, pH 5,5 et pH 5,0 en utilisant 10 M HCl ou 10 M KOH au besoin.
    REMARQUE: Un tampon acétate-acide acétique peut être préférable pour les solutions à pH plus bas.
  4. Une fois l’acquisition de l’image terminée, retirez le HBSS de la plaque de 96 puits contenant les cellules et remplacez-le par la solution riche en K+à pH 7,5.
  5. Ajouter la nigéricine à une concentration finale de 10 μg/mL.
    NOTE: Nigericin est un ionophore qui échange K+ pour H+. En réglant la concentration K+ de la solution riche en K+à une valeur qui se rapproche de la concentration K+ du cytosol, on peut s’assurer que la nigéricine fixera le pH du macropinosome à celui du cytosol, qui à son tour reflète le pH du tampon d’étalonnage.
  6. Replacez la plaque sur le microscope et acquérez des images de chaque puits en utilisant les mêmes paramètres d’acquisition que ci-dessus.
  7. Répétez les étapes 3.5 et 3.6 pour chaque tampon d’étalonnage.

4. Analyse des données pour le pH des macropinosomes

  1. À l’aide du logiciel FIJI, soustrayez l’arrière-plan du TMR et du canal de la fluorescéine.
  2. Générez un masque sur le canal TMR. Pour générer un masque, convertissez l’image en image binaire en sélectionnant Ajuster > Seuil > Appliquer. Ensuite, mettez en surbrillance l’image binaire et sélectionnez Modifier > Sélection > Créer un masque.
  3. Appliquez-le à la fois sur les images TMR et fluorescéine. Pour ce faire, mettez le masque en surbrillance et sélectionnez Modifier > Sélection > Créer une sélection. Cliquez sur l’image TMR et appuyez sur Maj + E pour appliquer le masque sur le canal TMR. De même, cliquez sur l’image de la fluorescéine et appuyez sur Maj + E pour appliquer le masque sur le canal OB.
  4. Enregistrez l’intensité du TMR et de la fluorescéine pour chaque macropinosome dans les masques.
  5. Répétez les étapes 4.1 à 4.3 pour chaque point temporel du cours temporel.
  6. Répétez les étapes 4.1 à 4.3 pour les images capturées lors de l’étalonnage in situ.
  7. Divisez l’intensité de la fluorescéine par l’intensité tmR pour générer le rapport fluorescéine:TMR.
  8. Tracez le pH par rapport aux rapports fluorescéine:TMR pour les images d’étalonnage.
  9. Ajustez une courbe aux données d’étalonnage.
  10. Interpolez les données pour chaque point temporel du parcours temporel pour obtenir des valeurs de pH absolues.

5. Mesure des événements oxydatifs dans les macropinosomes

  1. Préparez les cellules comme dans la section 1.
  2. Un jour avant le dosage, préparer l’ester de succinimidyle H2DCFDA marqué 70 kDa dextran en remettant en cause 10 mg de dextran-amino de 70 kDa dans 1 mL de solution de bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,3). Ajouter 1 mg de l’ester de succinimidyle H2DCFDA à la solution dextran-amino et incuber pendant 1 h. Dialyze le dextran 70 kDa labellé H2DCFDA contre PBS. Ne pas conserver pendant plus de 1 jour car le dextran de 70 kDa marqué H2DCFDA s’oxydera lors du stockage.
  3. Le jour de l’essai, laver tous les puits avec 100 μL de HBSS à 37 °C.
  4. Remplissez chaque puits avec 100 μL de HBSS contenant 0,025 mg/mL de dextran de 70 kDa marqué TMR et 0,025 mg/mL de dextran de 70 kDa marqué H2DCFDA.
  5. Placer les cellules dans un incubateur réglé à 37 °C pendant 15 min.
  6. Retirez les cellules de l’incubateur et lavez les cellules 6x avec 100 μL de HBSS.
  7. Remplir chaque puits avec 100 μL de HBSS à 37 °C.
  8. Placez la plaque sur le microscope avec un étage et une chambre chauffés et ajustez les paramètres d’excitation / émission pour chaque fluorophore au besoin.
    REMARQUE: Les conditions idéales pour l’acquisition d’images varient en fonction des fluorophores utilisés et des réglages de microscope individuels. Ici, les images ont été acquises sur un microscope confocal à balayage laser Leica SP5. TMR a été excité avec une ligne laser 543, et l’émission a été collectée de 610 nm à 650 nm. H2DCFDA a été excité avec une ligne laser 488 et l’émission a été collectée de 500 nm à 550 nm. Un objectif d’immersion dans l’huile de 63x a été utilisé et un volume Z de 10 μm a été acquis à des intervalles de 0,5 μm.
  9. Acquérir une image de chaque puits, en alternant entre les fluorophores entre chaque puits.
  10. Après la première acquisition, vérifiez si tous les puits restent au centre de l’attention sur l’ensemble de la plaque.
  11. Acquérir des images de chaque puits à des intervalles de 1 à 15 minutes pendant la durée souhaitée.

6. Analyse des données pour les événements oxydatifs dans les macropinosomes

  1. À l’aide du logiciel FIJI, soustrayez l’arrière-plan des canaux TMR et H2DCFDA.
  2. Générez un masque sur le canal TMR. Pour générer un masque, convertissez l’image en image binaire en sélectionnant Ajuster > Seuil > Appliquer. Ensuite, mettez en surbrillance l’image binaire et sélectionnez Modifier > Sélection > Créer un masque.
  3. Appliquez le masque sur les images TMR et H2DCFDA. Pour ce faire, mettez le masque en surbrillance et sélectionnez Modifier > Sélection > Créer une sélection. Cliquez sur l’image TMR et appuyez sur Maj + E pour appliquer le masque sur le canal TMR. De même, cliquez sur l’image H2DCFDA et appuyez sur Maj + E pour appliquer le masque sur le canal H2DCFDA.
  4. Enregistrez l’intensité TMR et H2DCFDA pour chaque macropinosome dans les masques.
  5. Répétez les étapes 4.1 à 4.3 pour chaque point temporel du cours temporel.
  6. Divisez l’intensité H2DCFDA par l’intensité TMR pour générer un rapport H2DCFDA: TMR.
  7. Tracez le rapport H2DCFDA: TMR par rapport au temps.

7. Mesure de la digestion des protéines dans les macropinosomes

  1. Préparez les cellules comme dans la section 1.
  2. Le jour de l’essai, laver tous les puits avec 100 μL HBSS à 37 °C.
  3. Dissoudre l’ovalbumine étiquetée BODIPY à une concentration de 4 mg/mL dans HBSS.
  4. Remplissez chaque puits avec 100 μL de HBSS contenant 0,025 mg/mL de dextran de 70 kDa marqué TMR et 0,2 mg/mL d’ovalbumine portant le label BODIPY.
  5. Placez les cellules dans un incubateur réglé à 37 °C pendant 15 min.
  6. Retirez les cellules de l’incubateur et lavez les cellules 6x avec 100 μL de HBSS.
  7. Remplir chaque puits avec 100 μL de HBSS à 37 °C.
  8. Placez la plaque sur le microscope avec un étage et une chambre chauffés et ajustez les paramètres d’excitation / émission pour chaque fluorophore au besoin.
    REMARQUE: Les conditions idéales pour l’acquisition d’images varient en fonction des fluorophores utilisés et des réglages de microscope individuels. Ici, les images ont été acquises sur un microscope confocal à balayage laser Leica SP5. TMR a été excité avec une ligne laser 543, et l’émission a été collectée de 610 nm à 650 nm. BODIPY a été excité avec une ligne laser 488, et l’émission a été collectée de 500 nm à 550 nm. Un objectif d’immersion dans l’huile de 63x a été utilisé et un volume Z de 10 μm a été acquis à des intervalles de 0,5 μm.
  9. Acquérir une image de chaque puits, en alternant entre les fluorophores entre chaque puits.
  10. Après la première acquisition, vérifiez si tous les puits restent au centre de l’attention sur l’ensemble de la plaque.
  11. Acquérir des images de chaque puits à des intervalles de 1 à 15 minutes pendant la durée souhaitée.

8. Analyse des données pour la digestion des protéines dans les macropinosomes

  1. À l’aide du logiciel FIJI, soustrayez l’arrière-plan des canaux TMR et BODIPY.
  2. Générez un masque sur le canal TMR et appliquez-le aux images TMR et BODIPY comme aux étapes 6.2 et 6.3 ci-dessus(Figure 3B).
  3. Enregistrez l’intensité TMR et BODIPY pour chaque macropinosome dans les masques.
  4. Répétez les étapes 4.1 à 4.3 pour chaque point temporel du cours temporel.
  5. Divisez l’intensité BODIPY par l’intensité TMR pour générer le rapport BODIPY:TMR.
  6. Tracez le rapport BODIPY:TMR par rapport au temps.

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Representative Results

Lors de la mesure du pH des macropinosomes, il existe une période de temps pendant laquelle la dynamique de l’acidification ne peut pas être mesurée. Cette période correspond à la phase de chargement du dextran (boîte grise dans la Figure 2C et la Figure 3C,D) et variera en fonction du type de cellule utilisé. La durée de la phase de charge variera avec (i) l’activité macropinocytaire des cellules et (ii) la sensibilité de l’instrument utilisé. Il est recommandé d’ajuster cette période au début de chaque expérience de manière à obtenir un rapport signal/bruit supérieur à 4:1 pour les canaux fluorescéine et TMR. Dans les cellules non traitées, l’émission de fluorescéine devrait s’affaiblir progressivement à mesure que les macropoinosomes s’acidifient, et le signal TMR devrait rester constant ou devenir plus lumineux. Le signal TMR peut devenir plus lumineux si les macropoinosomes rétrécissent en taille16,21. Cela n’affectera pas le rapport car le signal de la fluorescéine est soumis aux mêmes variations de taille organellaire22. Le rapport fluorescéine/TMR deviendra progressivement plus petit et plafonnera dans les 15 premières minutes d’acquisition(Figure 2C). Ce plateau correspond à un pH de ~5, ce qui correspond à peu près au pH des lysosomes25. À la fin de chaque acquisition, un étalonnage in situ est effectué. Le rapport fluorescéine/TMR devrait être plus grand avec le tampon d’étalonnage à pH 7,5 et devenir progressivement plus petit à mesure que les tampons d’étalonnage deviennent plus acides. Cela permet de génération d’une courbe d’étalonnage(Figure 2B). Les rapports fluorescéine/TMR peuvent ensuite être interpolés pour le pH macropinosomal(Figure 2C).

Les événements oxydatifs dans les macropinosomes sont également susceptibles de varier avec le type de cellule utilisé. Il est recommandé de charger les cellules avec H2DCFDA-dextran, et de stimuler la NADPH oxydase en utilisant le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme témoin positif (Figure 3C). Cela donnera une meilleure idée de la plage dynamique du test et permettra d’ajuster les paramètres du microscope. Au fur et à mesure que des événements oxydatifs se produisent dans les macropinosomes, le signal H2DCFDA deviendra progressivement plus lumineux. Le signal TMR peut rester constant ou varier avec la taille du macropinosome, comme indiqué ci-dessus. Le rapport H2DCFDA:TMR deviendra progressivement plus grand et plafonnera probablement dans les 20 à 30 premières minutes dans les cellules Raw264.7 inactivées(Figure 3A,C).

Lors de la mesure de la digestion des protéines macropinosomales, un signal fluorescent progressivement fort sera libéré au fur et à mesure que l’ovalbumine est digérée. Dans les cellules Raw264.7, l’augmentation de la fluorescence libérée de l’ovalbumine digérée marquée par BODIPY plafonnera dans les 30 premières minutes(Figure 3B,D). Comme précédemment, le signal TMR peut rester constant ou peut varier avec la taille du macropinosome. Comme la dégradation de l’ovalbumine commence immédiatement après la fermeture du macropinosome, un contrôle négatif peut être utile pour déterminer la plage dynamique du test. À cette fin, les hydrolases acides dans le macropinosome peuvent être inhibées à l’aide d’un inhibiteur de la V-ATPase, tel que la concanamycine A (CcA)(Figure 3D)ou la bafilomycine A.

Figure 1
Figure 1: Principes de l’imagerie ratiométrique à double fluorophore. (A-C). Balayages spectraux (à excitation fixe, à émission variable) de fluorophores sensibles au pH en suspension dans des tampons du pH indiqué. La fluorescéine, le pHrodo et le cypHer5e sont couramment utilisés comme capteurs de pH dans les tests cellulaires. (D-F). Balayages spectraux (à excitation fixe, à émission variée) de fluorophores insensibles au pH en suspension dans des tampons du pH indiqué. Les colorants qui ne varient pas avec le pH font des fluorophores de référence utiles. La fluorescéine n’est pas sensible de manière optimale aux valeurs de pH plus acides rencontrées dans les endosomes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Mesures dynamiques du pH macropinosomal. (A) Les cellules Raw264.7 ont été chargées de dextran de 70 kDa marqué à la fluorescéine et de dextran de 70 kDa marqué par TMR à 37 °C en présence ou en l’absence de 500 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS) pendant 15 min. Ils ont également été incubés avec du dextran de 70 kDa marqué à la fluorescéine et du dextran de 70 kDa marqué TMR à 4 °C comme contrôle de la liaison non spécifique du dextran. Les encarts montrent des cellules individuelles (barres d’échelle = 20 μm). (B) Étalonnage in situ de cellules Raw264.7 chargées de dextran de 70 kDa marqué à la fluorescéine et de dextran de 70 kDa marqués TMR à l’aide de tampons riches enK+au pH et à la nigericine indiqués. (C) PH des macropinosomes dans les cellules Raw264.7. Les insets représentent le rapport fluorescéine:TMR dans les macropinosomes individuels. Les cases grises indiquent les moments où les cellules ont été chargées de dextran. Données de deux expériences indépendantes contenant chacune ≥ 80 cellules. Données représentées sous forme de moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: Mesures dynamiques des événements oxydatifs et de la digestion des protéines dans la lumière des macropinosomes. (A) Les cellules Raw264.7 ont été chargées de dextran de 70 kDa marqué h2DCFDA et de dextran de 70 kDa marqué TMR à 37 °C pendant 15 min, suivi d’une poursuite de 45 minutes à 37 °C. Les encadrés montrent des images ratioées (H2DCFDA/TMR) de macropoinosomes individuels. Barres d’échelle = 20 μm. (B) Les cellules Raw264.7 ont été chargées d’ovalbumine portant le label BODIPY et de dextran de 70 kDa marqués TMR à 37 °C pendant 15 min, suivis d’une poursuite de 45 min à 37 °C. Le canal TMR a été utilisé pour générer un masque, qui a été appliqué sur le canal BODIPY. Les encarts montrent des cellules individuelles. Barres d’échelle = 20 μm. ( C )OxydationH2DCFDA dans la lumière des macropinosomes. Les cellules ont également été stimulées avec la PMA comme témoin positif. Les cases grises indiquent les moments où les cellules ont été chargées de dextran. Données de deux expériences indépendantes, chacune contenant ≥ 80 cellules. Données représentées sous forme moyenne ± SEM. Chaque point temporel a été comparé au contrôle PMA. Le test t d’unélève a été utilisé pour l’analyse statistique. (D) Dégradation de l’ovalbumine étiquetée BODIPY dans les macropinosomes. La concanamycine A (CcA) a été utilisée comme témoin négatif car elle empêche l’activation des hydrolases d’acide luminal. Données de deux expériences indépendantes, chacune contenant ≥ 80 cellules. Données représentées sous forme moyenne ± SEM. Chaque point temporel a été comparé au contrôle CcA. Le test t d’unélève a été utilisé pour l’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Bien qu’il existe un certain nombre de protocoles pour les mesures à faible et à haut débit de l’absorption macropinocytaire dans les macrophages, les fibroblastes et même Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, très peu de tentatives ont été faites pour mesurer la biochimie luminale de ces compartiments dynamiques. Cela est probablement dû à une pénurie de sondes qui peuvent être ciblées efficacement sur le compartiment macropinosomal tout en évitant les autres compartiments endocytaires. Voici les techniques permettant de cibler les sondes fluorescentes pour la mesure dynamique du pH, des événements oxydatifs et de la digestion des protéines dans les macropoinosomes.

La microscopie à fluorescence ratiométrique est la principale technique par laquelle le pH endosomale est mesuré depuis des décennies. La fluorescéine a été largement utilisée pour mesurer le pH endosomale et continued’être le fluorophore de choix car son pK a permet des mesures précises avec la gamme typique de valeurs de pH endosomal (~ pH 7,2-4,5). Ici, l’étude a utilisé la fluorescéine conjuguée à 70 kDa dextran pour les mesures de pH spécifiques aux macropinosomes. Une limitation de cette approche est la période de charge de dextran de 15 minutes pendant laquelle le pH macropinosomique ne peut pas être enregistré. Cette période est nécessaire pour charger suffisamment de dextran marqué au fluorophore dans le compartiment macropinosomal, mais empêche effectivement les mesures précoces du pH des macropinosomes. Cela n’empêche toutefois pas la détermination de divers paramètres luminaux tels que la capacité tampon, la fuite relative de protons et la puissance de pompage de la V-ATPase, qui sont tous dérivés de mesures de pH macropinosomal. Comme le montre la figure 1,un certain nombre d’autres fluorophores sensibles au pH peuvent également être utilisés pour mesurer le pH, notamment pHrodo (pKa = 6,8) et CypHer5e (pKa = 7,3). Cependant, comme ils ont un pK a significativement plus élevé quela fluorescéine, ils ne sont pas optimaux pour mesurer le pH endosomale à des valeurs de pH plus acides.

Comme les macropinosomes sont des organites très dynamiques et subissent un retrait important peu de temps après la formationde 16,21,une fluorescence ratiométrique à double fluorophore est nécessaire. Les changements de fluorescence dus aux changements dans le volume des macropinosomes sont corrigés pour l’utilisation d’un fluorophore de référence dans tous les essais présentés.

Les événements oxydatifs dans les cellules ont été mesurés à l’aide de diverses sondes sensibles à l’oxydoréo, notamment le tétrazolium nitro bleu (NBT), le luminol et le H2DCFDA. Les approches à base de luminol sont particulièrement utiles pour mesurer la production de ROS dans une population de cellules, mais sont difficiles à adapter aux mesures spécifiques aux organites. Le NBT forme un dépôt insoluble facilement visualisé appelé formazan lors de l’oxydation, mais obscurcit les signaux fluorescents et est à la fois non linéaire et difficile à localiser. H2DCFDA libère un signal fluorescent linéaire lors de l’oxydation et peut être facilement conjugué à des traceurs tels que le dextran pour des mesures spécifiques aux organites. En attachant H2DCFDA à 70 kDa dextran, les événements oxydatifs au sein de macropinosomes individuels(Figure 3B)peuvent être visualisés. Il y a cependant une mise en garde à cette approche. Comme H2DCFDA est une forme modifiée de fluorescéine, le signal libéré est sensible au pH. Bien que le gain de fluorescence lors de l’oxydation soit suffisamment important pour être détecté, il est sans aucun doute masqué par la lumière acide du macropinosome. Une variante insensible au pH de H2DCFDA a déjà été disponible dans le commerce et est préférable; cependant, au moment de la préparation de ce manuscrit, ce produit n’était plus disponible dans le commerce. Ros émerge comme une molécule de signalisation importante et a été impliqué dans le remodelage de la membrane, le trafic organellaire, et plus récemment dans le traitement du matériau par les cellules présentatrices d’antigènes pour la présentation aux cellules T28,30. La méthode présentée ici peut être utilisée pour étudier la contribution de la production macropinosomale de ROS à ces différents processus physiologiques.

La digestion des protéines dans les macropinosomes présente un intérêt pour l’étude de la présentation des antigènes par les cellules immunitaires ainsi que pour l’étude de l’acquisition des nutriments par les cellules cancéreuses. Par exemple, on pense que la digestion des protéines endosomales par les cellules dendritiques limite le pool de peptides disponibles pour la présentation aux cellules T sur les principales molécules d’histocompatibilité. Comme les macropinosomes sont une voie majeure d’acquisition d’antigènes, des mesures de la digestion des protéines macropinosomales peuvent être utilisées pour sonder la machinerie moléculaire responsable du réglage fin de la présentation des antigènes. Un certain nombre d’outils disponibles dans le commerce sont utilisés pour mesurer la digestion des protéines dans les compartiments endosomaux. Les sondes BSA et ovalbumine étiquetées BODIPY, qui deviennent fortement fluorescentes lors de la digestion, se sont avérées particulièrement populaires. Ils sont facilement couplés à des traceurs endocytaires et peuvent être ciblés sur des compartiments endosomaux spécifiques, tels que les phagosomes. Les sondes, cependant, ne sont pas facilement couplées au dextran et nécessitent donc une approche de colocalisation. Cette approche entraîne le chargement de tous les compartiments endosomaux, y compris les macropinosomes, avec de l’ovalbumine portant le label BODIPY, et un masque est utilisé pour mesurer la dégradation spécifique des macropoinosomes. Cette approche nécessite une meilleure résolution et n’est pas facile à mettre à l’échelle pour des analyses plus importantes et à plus haut débit. Les techniques de covalente de coupler les outils de dégradation des protéines à 70 kDa dextran s’avéreront probablement utiles et sont actuellement en cours de développement dans notre laboratoire.

Alors que le domaine de la macropinocytose continue de croître34, des outils permettant de mesurer dynamiquement la biochimie luminale des macropinosomes, y compris le pH, la chimie redox, la digestion des protéines, les concentrations d’ions et la chimie des lipides, fourniront un aperçu de la biologie unique de ces organites en évolution rapide.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions l’Université de Calgary pour son soutien. Nous tenons également à remercier le Dr Robin Yates pour son accès aux réactifs, à l’équipement et aux discussions utiles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black-walled 96 well plate PerkinElmer 6005430
CypHer5e, NHS ester Cytiva PA15401
Dextran-amino 70 kDa Invitrogen D1862
DQ-ovalbumin Invitrogen D12053
FITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1823
HBSS Gibco 14287
Nigericin Sigma Aldrich N7143
OxyBurst Green-SE Invitrogen D2935
pHrodo Red, SE Invitrogen P36600
Raw264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI medium Gibco 11875093
SP5 Confocal Microscope Leica -
TRITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1819
u-Dish Ibidi 81156

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Mesure du pH, de la chimie redox et de la capacité dégradative des macropinosomes à l’aide de la microscopie ratiométrique à double fluorophore
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Wilkinson, L., Canton, J. Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy. J. Vis. Exp. (174), e62733, doi:10.3791/62733 (2021).

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