Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Измерение pH, окислительно-восстановительных химических веществ и деградативной способности макропиносом с помощью двухфлуорофорной ратиометрической микроскопии

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62733
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Summary

Описаны протоколы измерения рН, окислительных событий и переваривания белка в отдельных макропиносомах живых клеток. Акцент делается на двойной флуорофорной логометрической микроскопии и преимуществах, которые она предлагает по сравнению с популяционными методами.

Abstract

В последние годы область макропиноцитоза стремительно росла. Макропиноцитоз возник как центральный механизм, с помощью которого врожденные иммунные клетки поддерживают гомеостаз организма и иммунитет. Одновременно и в отличие от своей гомеостатической роли, он также может управлять различными патологиями, включая рак и вирусные инфекции. В отличие от других способов эндоцитоза, средства, разработанные для изучения созревания макропиносом, остаются недостаточно развитыми. Здесь протокол описывает недавно разработанные инструменты для изучения окислительно-восстановительной среды в просвете ранних и созревающих макропиносом. Описаны методологии использования ратиометрической флуоресцентной микроскопии при оценке рН, производства активных форм кислорода и деградативной способности в просвете отдельных макропиносом живых клеток. Измерения одной органеллы дают преимущество выявления пространственно-временной гетерогенности, которая часто теряется при популяционных подходах. Акцент делается на основных принципах двойной флуорофорной ратиометрической микроскопии, включая выбор зонда, приборы, калибровку и одноклеточные и популяционные методы.

Introduction

Макропиноцитоз относится к поглощению большого количества внеклеточной жидкости в мембранно-связанные цитоплазматические органеллы, называемые макропиносомами1,2. Это высоко консервативный процесс, выполняемый свободноживущие одноклеточными организмами, такими как амеба Dictyostelium spp. 3, а также антозоаны4 и метазоаны2. В большинстве клеток макропиноцитоз является индуцированным событием. Перевязка рецепторов клеточной поверхности индуцирует протрузию актин-управляемых расширений плазматической мембраны, называемых оборками. Часть этих оборок, по какому-то плохо изученному механизму, запечатывается на их дистальных кончиках с образованием макропиносом (хотя за рамками данного метода статьи, для подробных обзоров по механике макропиноцитоза, пожалуйста, обратитесь к ссылкам1,2,5,6,7). Внеклеточный раздражитель, индуцируя макропиноцитоз, чаще всего является растворимым фактором роста5,8. Соответственно, макропиноцитарный случай позволяет проглотить болюс внеклеточного материала, из которого клетка может получать полезные метаболиты для облегчения роста. К сожалению, этот путь доставки питательных веществ также может привести к патологии. Некоторые раковые клетки содержат мутации, которые приводят к непрерывному или конститутивному макропиноцитозу. Непрерывная доставка питательных веществ способствует неконтролируемой пролиферации раковых клеток и связана с особенно агрессивными опухолями9,10,11,12,13. Аналогичным образом, вирусы могут индуцировать макропиноцитоз, чтобы получить доступ к клеткам-хозяевам, тем самым приводя к вирусной патологии14.

Макропиноцитоз также функционирует в поддержании иммунитета к патогенам. Некоторые врожденные иммунные клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки, участвуют в конститутивном и агрессивном отборе проб внеклеточной жидкости через макропиноцитоз6,15,16. Этот режим макропиноцитоза невероятно активен, и одна дендритная клетка может нагрубать себя объемом внеклеточной жидкости, эквивалентным ее собственному весу каждый час17. Несмотря на этот конститутивный отбор проб, макрофаги и дендритные клетки не реплицируются бесконтрольно, как это делают опухолевые клетки, вместо этого они, по-видимому, обрабатывают внеклеточный материал таким образом, что информация может быть извлечена для информирования о наличии или даже отсутствии потенциальных угроз. Информация извлекается в виде i) патоген-ассоциированных молекулярных паттернов, которые могут быть прочитаны внутриклеточными рецепторами распознавания патогенов и ii) коротких участков аминокислот, которые могут быть загружены на основные молекулы гистосовместимости для скрининга клетками адаптивной иммунной системы16,18,19. Подрывают ли патогены этот путь для обработки информации иммунными клетками, в настоящее время неясно.

Несмотря на эти четко определенные и критические роли макропиноцитоза как в поддержании иммунитета, так и в гомеостазе и в отличие от других более часто изучаемых способов эндоцитоза, мало что известно о внутренней (люминальной) работе макропиносом. Разработка стандартизированных протоколов и инструментов для изучения люминальной биохимии макропиносом не только поможет нам лучше понять их уникальную биологию, но и обеспечит понимание, которое может быть использовано для новых терапевтических стратегий, включая доставку лекарств20. Эта рукопись метода будет сосредоточена на недавно разработанных инструментах для препарирования на уровне одной органеллы различных аспектов люминальной биохимии макропиносом.

Флуорофоры могут быть использованы для измерения специфических биохимий органелл, если i) они разделяются преимущественно в интересующий их отсек и/или ii) претерпевают спектральные изменения в ответ на интересующий параметр. Например, в случае рН флуоресцентные слабые основания, такие как акридин оранжевый, крезиловый фиолетовый и красители LysoTracker, накапливаются преимущественно в кислых органеллах. Поэтому их относительная интенсивность является грубым признаком того, что меченая органелла является кислой. Другие рН-чувствительные флуорофоры, такие как флуоресцеин, pHrodo и cypHer5e, претерпевают спектральные изменения при связывании с протонами(рисунок 1A-C). Таким образом, изменения флуоресцентного излучения pH-чувствительных флуорофоров могут обеспечить полезное приближение pH. Использование одиночных флуорофоров, однако, представляет ряд недостатков. Например, изменения в фокальной плоскости, фотоотбеливание и изменения объема отдельных органелл, часто встречающиеся в макропиносомах21,могут вызывать изменения интенсивности флуоресценции одиночных флуорофоров, и это не может быть легко исправлено для22. Поэтому одноволновые оценки, хотя и полезны для визуализации кислотных компартментов, являются чисто качественными.

Более количественный подход заключается в нацеливание на чувствительный к параметрам флуорофор вместе с эталонным флуорофором на органеллу, которая представляет интерес. Эталонный флуорофор идеально нечувствителен к биохимическим изменениям внутри органеллы(рисунок 1D-F)и поэтому может быть использован для коррекции изменений в фокальной плоскости, органелларного объема и, в некоторой степени, фотоотбеливания23. Используя этот подход, называемый двойной флуорофорной ратиометрической флуоресценцией, коррекция может быть достигнута путем генерации отношения флуоресцентного излучения параметрического флуорофора к эталонного флуорофора.

Здесь протокол будет использовать принцип двойной флуорофорной ратиометрической визуализации для измерения рН, окислительных событий и деградации белка в макропиносомах. В каждом случае будет выбран флуорофор, чувствительный к интересуя параметру и эталонный флуорофор. Для того, чтобы нацеливать флуорофоры конкретно на макропиносомы, они будут ковалентно связаны с декстраном 70 кДа, который предпочтительно включен в макропиносомы24. Все анализы будут выполняться в клетках Raw264.7, но могут быть адаптированы к другим типам клеток. Там, где это возможно, коэффициенты флуоресценции будут откалиброваны по контрольной кривой для получения абсолютных значений. Важно отметить, что все измерения будут проводиться в живых клетках для динамической и количественной оценки просветной среды макропиносом.

При выборе pH-чувствительных флуорофоров необходимо взвесить ряд соображений. Первым является pKa флуорофора, который указывает диапазон значений pH, при котором зонд будет наиболее чувствительным. Если предположить, что вскоре после образования рН макропиносомы будет близок к рН внеклеточной среды (~рН 7,2) и что она будет постепенно подкисляться посредством взаимодействий с поздними эндосомами и лизосомами (~рН 5,0), то следует выбрать зонд с pKa, чувствительный в этом диапазоне(рисунок 2C). Флуорофорный флуоресцеин, который имеет pKa 6,4, оптимально чувствителен в этом диапазоне. Он широко использовался для измерения других подобных органелл, таких как фагосомы, и будет флуорофором выбора в этой рукописи22,25. В качестве эталонного флуорофора будет использоваться тетраметилродамин, который нечувствителен к рН(рисунок 1Е). Другие флуорофоры, такие как pHrodo и cypHer5e, могут быть заменены флуоресцеином, где спектральные свойства флуоресцеина соответствуют другим экспериментальным переменным. Некоторые предложенные эталонные флуорофоры для pHrodo и cypHer5e показаны на рисунке 1.

Вторым соображением является метод, с помощью которого два флуорофора будут нацелены конкретно на макропиносомы. Декстран размером 70 кДа, который имеет гидродинамический радиус примерно 7 нм, не прилипает неспециально к клеткам и включен в макропиносомы, но не покрытые клатрином ямки или кавеолы, и поэтому маркирует макропиносомы(Фиг.2А и Фиг.3А,В)16,24,26. В этом протоколе в качестве pH-чувствительных и эталонных зондов, соответственно, будут использоваться флуоресцеин-меченый декстран и тетраметилродамин (TMR) 70 кДа декстран.

В врожденных иммунных клетках макропиноцитоз и фагоцитоз представляют собой два основных пути интернализации экзогенного материала для обработки и последующего представления клеткам адаптивного иммунного ответа27. Тщательный и скоординированный контроль окислительно-восстановительной химии просвета фагосом и макропиносом имеет решающее значение для контекстно-специфической обработки экзогенного материала. Возможно, наиболее хорошо изученным регулятором окислительных событий в фагосомах является NADPH-оксидаза, большой многосубидный комплекс, который производит большое количество активных форм кислорода (АФК) в просвете фагосом28. Действительно, его активность занимает центральное место в соответствующей обработке антигена в фагосомах29,30. Тем не менее, активность NADPH-оксидазы на макропиносомных мембранах не была изучена.

В этом протоколе сукцинимидиловый эфир H2DCFDA используется для измерения окислительных событий в макропиносоме. Это модифицированная форма флуоресцеина (2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетат), которая минимально флуоресцентна в своей восстановленной форме. При окислении его флуоресцентное излучение значительно увеличивается. Стоит, однако, отметить существенное предостережение H2DCFDA - поскольку он основан на флуорофорном флуоресцеине, его флуоресценция также гасится в кислотных компартментах, и необходимо соблюдать осторожность для контроля этой переменной при разработке экспериментов28. Аналогично подходу к измерению рН, сукцинимидиловый эфир H2DCFDA будет ковалентно присоединен к декстрану 70 кДа, а декстран с маркировкой TMR 70 кДа будет использоваться в качестве эталонного флуорофора(рисунок 3A).

Флуоресцентный овальбумин будет использоваться для измерения деградации белка в макропиносомах. Используемый здесь овальбумин плотно маркирован красителем FL 4,4-дифтор-4-бора-3а,4а-диаза-с-идацен (BODIPY) FL, который является самозакаленным. При пищеварении высвобождаются сильно флуоресцентные пептиды, меченые красителем. Поскольку овальбумин не может быть легко конъюгирован с декстраном 70 кДа, клетки с меченым TMR декстраном 70 кДа и жидкофазным овальбумином будут совместно инкубированы. Сигнал TMR будет использоваться для генерации маски макропиносом во время поствизуального анализа, а сигнал, высвобождаемый из перевареного овальбумина, будет измеряться внутри маски(рисунок 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка клеток

  1. Выращивайте raw264.7 клетки при 37 °C и 5% CO2 до 70% слияния в RPMI, дополненные 10% термоинфактивированной сывороткой.
  2. За сутки до анализа посеяли Raw264.7 клеток плотностью 5 х 104 клетки на скважину в 96-скважинную пластину. Убедитесь, что каждая скважина содержит 100 мкл питательной среды. Убедитесь, что пластина с 96 скважинами имеет черные стороны и стеклянное дно для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для визуализации использовались пластины из 96 скважин. Пластины с 96 скважинами позволяют использовать меньшее количество клеток и реагентов по сравнению с более крупными камерами визуализации. Тем не менее, любая камера, предназначенная для визуализации живых клеток, может быть использована, и реагенты могут быть соответственно увеличены.
  3. В день анализа проверьте, являются ли скважины не менее чем на 70% впаденными.

2. Измерение рН макропиносом

  1. Подготовьте ячейки, как по описанию в разделе 1.
  2. Промыть все колодцы со 100 мкл HBSS при 37 °C.
  3. Заполните каждую скважину 100 мкл HBSS, содержащей 0,025 мг/мл меченого TMR декстрана 70 кДа и 0,025 мг/мл флуоресцеина 70 кДа декстрана.
  4. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C на 15 мин.
  5. Извлеките клетки из инкубатора и промыть клетки 6x со 100 мкл HBSS.
  6. Заполните каждую скважину 100 мкл HBSS при 37 °C.
  7. Поместите пластину на микроскоп с нагретой сценой и камерой.
  8. При необходимости отрегулируйте параметры возбуждения/излучения для каждого флуорофора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные условия для получения изображения будут варьироваться в зависимости от используемых флуорофоров и индивидуальных настройк микроскопов. Здесь изображения были получены на лазерном сканируемом конфокальном микроскопе Leica SP5. TMR был взволнован 543-лазерной линией, и излучение было собрано от 610 нм до 650 нм. Флуоресцеин возбуждался 488-лазерной линией и излучение собиралось от 500 нм до 550 нм. Был использован 63-кратный масляный погружной объектив и получен Z-объем 10 мкм с интервалом 0,5 мкм.
  9. Получите изображение из каждой скважины, чередуя флуорофоры между каждой скважиной.
  10. После первого приобретения проверьте, все ли скважины остались в фокусе по всей плите.
  11. Получайте изображения каждой скважины с интервалом 1-15 минут в течение желаемого периода времени.

3. Калибровка pH макропиносом in situ

  1. Во время получения изображения готовят 1 л богатого калием (K+-богатого) раствора, содержащего 140 мМ KCl, 1 мМ MgCl2,1 мМ CaCl2и 5 мМ глюкозы. Дополнить один объем 400 мл раствора, богатогоK+,25 мМ HEPES (из стокового раствора 1 М, рН 7,2) и отдельный объем 400 мл с 25 мМ MES (из 0,5 М, рН 6,0).
  2. Отрегулируйте 50 мл аликвотыK+-богатого раствора, буферизованный с 25mM HEPES, до pH 7,5 с использованием 10 M HCl или 10 M KOH по мере необходимости.
  3. Отрегулируйте три отдельные 50 мл аликвот раствора, богатогоK+,буферизованные с 25 мМ MES, до рН 6,5, рН 5,5 и рН 5,0, используя 10 М HCl или 10 М КОН по мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер ацетат-уксусной кислоты может быть предпочтительным для растворов с более низким рН.
  4. После завершения получения изображения удалите HBSS из 96-скважинной пластины, содержащей ячейки, и замените ее растворомK+,который находится при рН 7,5.
  5. Добавьте нигерацин до конечной концентрации 10 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нигерицин представляет собой ионофор, который обменивает K+ на H+. Установив концентрацию K+ богатого K+раствора на значение, которое приближается к K+ концентрации цитозоля, можно гарантировать, что нигерицин будет зажимать рН макропиносомы до цитозола, который, в свою очередь, отражает рН калибровочного буфера.
  6. Поместите пластину обратно на микроскоп и получите изображения каждой скважины, используя те же настройки сбора, что и выше.
  7. Повторите шаги 3.5 и 3.6 для каждого калибровочного буфера.

4. Анализ данных на макропиносомы pH

  1. Используя программное обеспечение FIJI, вычтите фон как из TMR, так и из флуоресцеинового канала.
  2. Сгенерируйте маску на канале TMR. Чтобы создать маску, преобразуйте изображение в двоичное изображение, выбрав «Настроить пороговое значение > > «Применить». Затем выделите двоичное изображение и выберите «Редактировать > выделение» > «Создать маску».
  3. Примените его как к изображениям TMR, так и к флуоресцеину. Для этого выделите маску и выберите «Редактировать > выделение» > «Создать выделение». Нажмите на изображение TMR и нажмите Shift + E, чтобы применить маску к каналу TMR. Аналогично нажмите на изображение флуоресцеина и нажмите Shift + E, чтобы применить маску к каналу OB.
  4. Запишите интенсивность ПМР и флуоресцеина для каждой макропиносомы в масках.
  5. Повторите шаги 4.1-4.3 для каждого временного момента из курса времени.
  6. Повторите шаги 4.1-4.3 для изображений, полученных в ходе калибровки in situ.
  7. Разделите интенсивность флуоресцеина на интенсивность ПМР, чтобы получить соотношение флуоресцеин:ТМР.
  8. Построй pH по отношению к соотношению флуоресцеин:TMR для калибровочных изображений.
  9. Подгонка кривой к данным калибровки.
  10. Интерполировать данные для каждого временного момента из временного курса, чтобы получить абсолютные значения pH.

5. Измерение окислительных событий в макропиносомах

  1. Подготовьте ячейки, как по описанию в разделе 1.
  2. За день до анализа приготовьте сукцинимидиловый эфир H2DCFDA с маркировкой декстран 70 кДа путем повторного применения 10 мг декстран-амино 70 кДа в 1 мл 0,1 М раствора бикарбоната натрия (рН 8,3). Добавьте 1 мг сукцинимидилового эфира H2DCFDA в раствор декстран-амино и инкубируют в течение 1 ч. Диализует декстран h2DCFDA с маркировкой 70 кДа против PBS. Не храните более 1 дня, так как декстран с маркировкой H2DCFDA 70 кДа будет окисляться при хранении.
  3. В день анализа промыть все колодцы со 100 мкл HBSS при 37 °C.
  4. Заполните каждую скважину 100 мкл HBSS, содержащего 0,025 мг/мл меченого TMR декстрана 70 кДа и 0,025 мг/мл H2DCFDA-меченого декстрана 70 кДа.
  5. Поместите клетки в инкубатор, установленный на 37 °C, на 15 мин.
  6. Извлеките клетки из инкубатора и промыть клетки 6x 100 мкл HBSS.
  7. Заполните каждую скважину 100 мкл HBSS при 37 °C.
  8. Поместите пластину на микроскоп с нагретой ступенью и камерой и отрегулируйте параметры возбуждения/излучения для каждого флуорофора по мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные условия для получения изображения будут варьироваться в зависимости от используемых флуорофоров и индивидуальных настройк микроскопов. Здесь изображения были получены на лазерном сканируемом leica SP5 конфокальным микроскопом. TMR был взволнован 543-лазерной линией, и излучение собиралось от 610 нм до 650 нм. H2DCFDA был взволнован 488-лазерной линией, и излучение было собрано от 500 нм до 550 нм. Был использован 63-кратный масляный погружной объектив, а Z-объем 10 мкм был получен с интервалом 0,5 мкм.
  9. Получите изображение из каждой скважины, чередуя флуорофоры между каждой скважиной.
  10. После первого приобретения проверьте, все ли скважины остаются в фокусе по всей плите.
  11. Получайте изображения каждой скважины с интервалом 1-15 минут в течение желаемого периода времени.

6. Анализ данных по окислительным событиям в макропиносомах

  1. Используя программное обеспечение FIJI, вычтите фон из каналов TMR и H2DCFDA.
  2. Сгенерируйте маску на канале TMR. Чтобы создать маску, преобразуйте изображение в двоичное изображение, выбрав «Настроить пороговое значение > > «Применить». Затем выделите двоичное изображение и выберите «Редактировать > выделение» > «Создать маску».
  3. Примените маску к изображениям TMR и H2DCFDA. Для этого выделите маску и выберите «Редактировать > выделение» > «Создать выделение». Нажмите на изображение TMR и нажмите Shift + E, чтобы применить маску к каналу TMR. Аналогичным образом, нажмите на изображение H2DCFDA и нажмите Shift + E, чтобы применить маску к каналу H2DCFDA.
  4. Запишите интенсивность TMR и H2DCFDA для каждой макропиносомы в масках.
  5. Повторите шаги 4.1-4.3 для каждого временного момента из курса времени.
  6. Разделите интенсивность H2DCFDA на интенсивность TMR для получения соотношения H2DCFDA: TMR.
  7. График соотношения H2DCFDA: TMR к времени.

7. Измерение переваривания белка в макропиносомах

  1. Подготовьте ячейки, как по описанию в разделе 1.
  2. В день анализа промыть все колодцы со 100 мкл HBSS при 37 °C.
  3. Растворяют овальбумин, меченый БОДИПИ, до концентрации 4 мг/мл в HBSS.
  4. Заполните каждую скважину 100 мкл HBSS, содержащего 0,025 мг/мл меченого TMR декстрана 70 кДа и 0,2 мг/мл овальбумина, меченого BODIPY.
  5. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C на 15 мин.
  6. Извлеките клетки из инкубатора и промыть клетки 6x 100 мкл HBSS.
  7. Заполните каждую скважину 100 мкл HBSS при 37 °C.
  8. Поместите пластину на микроскоп с нагретой ступенью и камерой и отрегулируйте параметры возбуждения/излучения для каждого флуорофора по мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные условия для получения изображения будут варьироваться в зависимости от используемых флуорофоров и индивидуальных настройк микроскопов. Здесь изображения были получены на лазерном сканируемом конфокальном микроскопе Leica SP5. TMR был взволнован 543-лазерной линией, и излучение собиралось от 610 нм до 650 нм. BODIPY был взволнован 488-лазерной линией, и излучение собиралось от 500 нм до 550 нм. Был использован 63-кратный масляный погружной объектив и получен Z-объем 10 мкм с интервалом 0,5 мкм.
  9. Получите изображение из каждой скважины, чередуя флуорофоры между каждой скважиной.
  10. После первого приобретения проверьте, все ли скважины остаются в фокусе по всей плите.
  11. Получайте изображения каждой скважины с интервалом 1-15 минут в течение желаемого периода времени.

8. Анализ данных для переваривания белка в макропиносомах

  1. Используя программное обеспечение FIJI, вычтите фон из каналов TMR и BODIPY.
  2. Сгенерируйте маску на канале TMR и примените ее к изображениям TMR и BODIPY, как показано в шагах 6.2 и 6.3 выше(рисунок 3B).
  3. Запишите интенсивность TMR и BODIPY для каждой макропиносомы в масках.
  4. Повторите шаги 4.1-4.3 для каждого временного момента из курса времени.
  5. Разделите интенсивность BODIPY на интенсивность TMR для получения соотношения BODIPY:TMR.
  6. График соотношения BODIPY:TMR по отношению к времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При измерении рН макропиносом существует период времени, за который нельзя измерить динамику подкисления. Этот период соответствует фазе загрузки декстрана (серый прямоугольный прямоугольный рисунок на рисунке 2C и рисунке 3C,D)и будет варьироваться в зависимости от типа используемой ячейки. Длина фазы нагрузки будет варьироваться в зависимости от (i) макропиноцитарной активности клеток и (ii) чувствительности используемого инструмента. Рекомендуется корректировать этот период в начале каждого эксперимента таким образом, чтобы соотношение сигнал/шум превышало 4:1 как для флуоресцеинового, так и для TMR-каналов. В необработанных клетках излучение флуоресцеина должно постепенно ослабевать по мере подкислений макропиносом, а сигнал ПМР должен оставаться либо постоянным, либо становиться ярче. Сигнал TMR может стать ярче, если макропиносомы уменьшатся в размере16,21. Это не повлияет на соотношение, так как флуоресцеиновый сигнал подвержен тем же изменениям в размере органеллара22. Соотношение флуоресцеин:ПМР будет постепенно уменьняться и будет плато в течение первых 15 минут приобретения(рисунок 2C). Это плато соответствует рН ~5, что примерно соответствует рН лизосом25. В конце каждого приобретения выполняется калибровка in situ. Соотношение флуоресцеин:ПМР должно быть наибольшим с калибровочным буфером при рН 7,5 и постепенно уменьшаться по мере того, как калибровочные буферы становятся более кислыми. Это позволяет создать калибровочную кривую(рисунок 2B). Затем флуоресцеин:ТМР можно интерполять для макропиносомального рН(рисунок 2C).

Окислительные события в макропиносомах также, вероятно, будут варьироваться в зависимости от используемого типа клеток. Рекомендуется нагрузить клетки H2DCFDA-декстраном, а также стимулировать NADPH-оксидазу с использованием форбола 12-миристата 13-ацетата (PMA) в качестве положительного контроля(рисунок 3C). Это даст лучшее представление о динамическом диапазоне анализа и позволит корректить настройки микроскопа. По мере того, как в макропиносомах происходят окислительные события, сигнал H2DCFDA будет постепенно становиться ярче. Сигнал TMR может оставаться постоянным или может изменяться в зависимости от размера макропиносомы, как обсуждалось выше. Соотношение H2DCFDA:TMR будет постепенно становиться больше и, вероятно, будет плато в течение первых 20-30 мин в инактивированных клетках Raw264.7(Рисунок 3A,C).

При измерении макропиносомального переваривания белка при переваривании овальбумина будет высвобождаться постепенно сильный флуоресцентный сигнал. В клетках Raw264.7 увеличение флуоресценции, высвобождаемой из переваренного овальбумина, меченого BODIPY, будет плато в течение первых 30 мин(рисунок 3B,D). Как и прежде, сигнал ПМР может оставаться постоянным или изменяться в зависимости от размера макропиносомы. Поскольку деградация овальбумина начинается сразу после закрытия макропиносом, отрицательный контроль может быть полезен при определении динамического диапазона анализа. С этой целью кислотные гидролазы внутри макропиносомы могут быть ингибированы с использованием ингибитора V-АТФазы, такого как конканамицин А (CcA)(Рисунок 3D)или Бафиломицин А.

Figure 1
Рисунок 1:Принципы двуххлорофорной ратиометрической визуализации. (А-С). Спектральное сканирование (возбуждение-фиксированное, эмиссионно-варьируемое) рН-чувствительных флуорофоров, взвешенных в буферах указанного рН. Флуоресцеин, pHrodo и cypHer5e обычно используются в качестве датчиков pH в клеточных анализах. (D-F). Спектральное сканирование (возбуждение-фиксированное, эмиссионно-варьируемое) рН-нечувствительных флуорофоров, взвешенных в буферах указанного рН. Красители, которые не изменяются с рН, делают полезными эталонные флуорофоры. Флуоресцеин, не являются оптимально чувствительными при более кислых значениях рН, испытываемых в эндосомах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Динамические измерения макропиносомального рН. (A)Raw264.7 клетки нагружали флуоресцеин-меченым декстраном 70 кДа и меченым TMR 70 кДа декстраном при 37 °C в присутствии или отсутствии 500 нг/мл липополисахарида (LPS) в течение 15 мин. Их также инкубировали с флуоресцеином, меченым 70 кДа декстраном, и 70 кДа-меченым 70 кДа декстраном при 4 °C в качестве контроля для неспецифического связывания декстрана. Вставки показывают отдельные ячейки (шкала = 20 мкм). (B) Калибровка in situ клеток Raw264.7, загруженных флуоресцеин-меченым декстраном 70 кДа и меченым TMR декстраном 70 кДа с использованиемK+-богатых буферов при указанном рН и нигерицине. (C) Макропиносома рН в клетках Raw264.7. Вставки представляют собой соотношение флуоресцеин:ПМР в отдельных макропиносомах. Серые поля указывают время, когда клетки загружались декстраном. Данные двух независимых экспериментов, каждый из которых содержал ≥ 80 клеток. Данные, представленные как средние ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Динамические измерения окислительных событий и переваривания белка в просвете макропиносом. (A)Клетки Raw264.7 нагружали меченым H2DCFDA декстраном 70 кДа и меченым TMR декстраном 70 кДа при 37 °C в течение 15 мин, с последующей 45-минутной погоней при 37 °C. Вставки показывают четные изображения (H2DCFDA/TMR) отдельных макропиносом. Шкала стержней = 20 мкм. (B)Ячейки Raw264.7 были загружены овальбумином, меченым BODIPY, и декстраном 70 кДа с маркировкой TMR при 37 °C в течение 15 мин, за которыми последовала 45-минутная погоня при 37 °C. Канал TMR использовался для генерации маски, которая была применена к каналу BODIPY. Вставки показывают отдельные клетки. Шкала стержней = 20 мкм. (C)Окисление H2DCFDA в просвете макропиносом. Клетки также стимулировали PMA в качестве положительного контроля. Серые поля указывают время, когда клетки загружались декстраном. Данные двух независимых экспериментов, каждый из которых содержал ≥ 80 клеток. Данные, представленные в виде среднего ± SEM. Каждый момент времени сравнивали с контролем PMA. Для статистического анализа использовался t-тестстудента. (D)Деградация овальбумина, меченая БОДИПИ, в макропиносомах. Конканамицин А (CcA) использовался в качестве отрицательного контроля, поскольку он предотвращает активацию гидролаз люминальной кислоты. Данные двух независимых экспериментов, каждый из которых содержал ≥ 80 клеток. Данные, представленные в виде среднего ± SEM. Каждая точка времени сравнивалась с контролем CcA. Для статистического анализа использовался t-тестстудента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя существует ряд протоколов как для низкопроизводительных, так и для высокопроизводительных измерений поглощения макропиноцитов в макрофагах, фибробластах и даже Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,было предпринято очень мало попыток измерить люминальную биохимию этих динамических отсеков. Вероятно, это связано с нехваткой зондов, которые могут быть эффективно нацелены на макропиносомальный компартмент, избегая при этом других эндоцитарных компартментов. Здесь описаны методы нацеливания на флуоресцентные зонды для динамического измерения рН, окислительных событий и переваривания белка в макропиносомах.

Ратиометрическая флуоресцентная микроскопия была основным методом, с помощью которого эндосомальный рН измерялся на протяжении десятилетий. Флуоресцеин широко используется для измерения эндосомального рН и продолжает оставаться любу фторофором, поскольку его pKa позволяет проводить точные измерения с типичным диапазоном эндосомальных значений рН (~ pH 7,2-4,5). Здесь в исследовании использовался флуоресцеин, конъюгированный с декстраном 70 кДа для макропиносомо-специфических измерений рН. Ограничением этого подхода является 15-минутный период загрузки декстрана, в течение которого макропиносомальный рН не может быть зарегистрирован. Этот период необходим для загрузки достаточного количества флуорофорного меченого декстрана в макропиносомальный компартмент, но эффективно исключает ранние измерения рН макропиносом. Это, однако, не исключает определения различных просветных параметров, таких как буферная способность, относительная утечка протонов и мощность перекачки V-АТФазы, все из которых получены из макропиносомных измерений рН. Как показано на фиг.1,для измерения рН-чувствительных флуорофоров может также использоваться ряд других рН-чувствительных флуорофоров, включая pHrodo (pKa = 6,8) и CypHer5e (pKa = 7,3). Однако, поскольку они имеют значительно более высокий pKa, чем флуоресцеин, они не являются оптимальными для измерения эндосомального рН при более кислых значениях рН.

Поскольку макропиносомы являются высокодинамичными органеллами и подвергаются значительному усадке вскоре после формирования16,21,требуется двойная флуорофорная ратиометрическая флуоресценция. Изменения флуоресценции, обусловленные изменениями объема макропиносом, корректируются для использования эталонного флуорофора во всех представленных анализах.

Окислительный опыт в клетках был измерен с использованием различных окислительно-чувствительных зондов, включая нитросиний тетразолий (NBT), люминол и H2DCFDA. Подходы, основанные на люминоле, особенно полезны для измерения производства АФК в популяции клеток, но их трудно адаптировать к измерениям, специфичным для органелл. NBT образует легко визуализируемое нерастворимое отложение, называемое формазаном, при окислении, но затемняет флуоресцентные сигналы и является нелинейным и трудно локализуемым. H2DCFDA высвобождает линейный флуоресцентный сигнал при окислении и может быть легко сопряжен с индикаторами, такими как декстран, для измерения органелл. Присоединении H2DCFDA к декстрану 70 кДа можно визуализировать окислительные явления в отдельных макропиносомах(рисунок 3B). Однако в этом подходе есть оговорка. Поскольку H2DCFDA является модифицированной формой флуоресцеина, высвобождаемый сигнал чувствителен к pH. Хотя прирост флуоресценции при окислении достаточно велик, чтобы его можно было обнаружить, он, несомненно, маскируется кислым просветом макропиносомы. Нечувствительный к pH вариант H2DCFDA ранее был коммерчески доступен и является предпочтительным; однако на момент подготовки этой рукописи этот продукт уже не был коммерчески доступен. АФК становится важной сигнальной молекулой и участвует в ремоделировании мембран, органелларном обороте, а в последнее время и в обработке материала антигенпрезентирующими клетками для представления Т-клеткам28,30. Представленный здесь метод может быть использован для изучения вклада макропиносомальной продукции АФК в эти различные физиологические процессы.

Переваривание белка в макропиносомах представляет интерес для изучения представления антигена иммунными клетками, а также для изучения приобретения питательных веществ раковыми клетками. Например, считается, что переваривание эндосомального белка дендритными клетками ограничивает пул пептидов, доступных для представления Т-клеткам на основных молекулах гистосовместимости. Поскольку макропиносомы являются основным путем приобретения антигена, измерения макропиносомального переваривания белка могут быть использованы для исследования молекулярного механизма, ответственного за тонкую настройку представления антигена. Ряд коммерчески доступных инструментов используется для измерения переваривания белка в эндосомальных компартментах. Особенно популярными оказались BSA и овальбуминовые зонды с маркировкой BODIPY, которые становятся сильно флуоресцентными при пищеварении. Они легко связаны с эндоцитарными индикаторами и могут быть нацелены на конкретные эндосомальные компартменты, такие как фагосомы. Зонды, однако, не легко связаны с декстраном и поэтому требуют подхода колокализации. Этот подход приводит к загрузке всех эндосомальных компартментов, включая макропиносомы, овальбумином, меченым BODIPY, и маска используется для измерения макропиносомно-специфической деградации. Этот подход требует лучшего разрешения и нелегко масштабировать для более крупных и высокопроизводительных анализов. Методы ковалентного соединения инструментов деградации белка с декстраном 70 кДа, вероятно, окажутся полезными и в настоящее время разрабатываются в нашей лаборатории.

Поскольку область макропиноцитоза продолжает расти34,инструменты для динамического измерения люминальной биохимии макропиносом, включая рН, окислительно-восстановительные химикаты, переваривание белка, концентрации ионов и липидные химикаты, дадут представление об уникальной биологии этих быстро развивающихся органелл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Мы благодарим Университет Калгари за его поддержку. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Робина Йейтса за доступ к реагентам, оборудованию и полезным дискуссиям.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black-walled 96 well plate PerkinElmer 6005430
CypHer5e, NHS ester Cytiva PA15401
Dextran-amino 70 kDa Invitrogen D1862
DQ-ovalbumin Invitrogen D12053
FITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1823
HBSS Gibco 14287
Nigericin Sigma Aldrich N7143
OxyBurst Green-SE Invitrogen D2935
pHrodo Red, SE Invitrogen P36600
Raw264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI medium Gibco 11875093
SP5 Confocal Microscope Leica -
TRITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1819
u-Dish Ibidi 81156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
  3. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
  4. Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
  5. Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
  6. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
  7. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
  8. Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  10. Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
  12. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
  13. Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
  14. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
  15. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
  16. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
  17. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
  18. Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
  19. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
  21. Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
  22. Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
  23. Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
  24. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  25. Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
  26. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
  27. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
  28. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
  29. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
  30. Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
  31. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
  32. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).
  33. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
  34. Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 174 макропиноцитоз макропиносомы эндоцитоз рН V-АТФаза протонная помпа активные формы кислорода ROS NADPH-оксидаза фагоцит макрофаг дендритные клетки
Измерение pH, окислительно-восстановительных химических веществ и деградативной способности макропиносом с помощью двухфлуорофорной ратиометрической микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring… More

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy. J. Vis. Exp. (174), e62733, doi:10.3791/62733 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter