Summary
Descrevemos protocolos para medir pH, eventos oxidativos e digestão de proteínas em macropinosos individuais em células vivas. Uma ênfase é colocada na microscopia metométrica de dupla fluorofora e nas vantagens que oferece sobre técnicas de base populacional.
Abstract
Nos últimos anos, o campo da macropinocitose cresceu rapidamente. A macropinocistose emergiu como um mecanismo central pelo qual as células imunes inatas mantêm a homeostase e a imunidade do organismo. Simultaneamente, e ao contrário de seu papel homeostático, também pode conduzir várias patologias, incluindo câncer e infecções virais. Ao contrário de outros modos de endocitose, as ferramentas desenvolvidas para estudar a maturação de macropinossomos permanecem subdesenvolvidas. Aqui o protocolo descreve ferramentas recém-desenvolvidas para estudar o ambiente redox dentro do lúmen de macropinosos precoces e maduros. Metodologias para o uso de microscopia de fluorescência métrica ratiorada na avaliação do pH, produção de espécies reativas de oxigênio e a capacidade degradante dentro do lúmen de macropinosos individuais em células vivas são descritas. Medidas únicas de organela oferecem a vantagem de revelar a heterogeneidade espacial, que muitas vezes se perde com abordagens de base populacional. A ênfase é colocada nos princípios básicos da microscopia multiscopia multiscopia multiscopia fluoroforatométrica, incluindo seleção de sondas, instrumentação, calibração e métodos unicelulares versus populações.
Introduction
Macropinocistose refere-se à absorção de grandes quantidades de fluido extracelular em organelas citoplasmáticas ligadas à membrana chamadas macropinossomos1,2. É um processo altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida livre, como a ameba Dictyostelium spp. 3, assim como anthozoans4 e metazoanos2. Na maioria das células, a macropinocitose é um evento induzido. A ligadura dos receptores de superfície celular induz a saliência de extensões de membrana plasmática movidas por actina, referidas como babados. Uma fração desses babados, por algum mecanismo mal compreendido, sela em suas pontas distais para formar macropinossomos (embora além do escopo deste artigo de métodos, para revisões detalhadas sobre a mecânica da macropinocitose, consulte as referências1,2,5,6,7). O estímulo extracelular que induz a macropinocitose é, na maioria dasvezes,um fator de crescimento solúvel5,8. Assim, o evento macropinocítico permite a ingestão de um bolus de material extracelular do qual a célula pode derivar metabólitos úteis para facilitar o crescimento. Infelizmente, esse caminho para o parto de nutrientes também pode impulsionar a patologia. Certas células cancerígenas abrigam mutações que resultam em macropinotose contínua ou constitutiva. A entrega contínua de nutrientes facilita a proliferação descontrolada de células cancerosas e tem sido associada a tumores particularmente agressivos9,10,11,12,13. Da mesma forma, os vírus podem induzir a macropinocitose a ter acesso às células hospedeiras, conduzindo assim a patologia viral14.
A macropinocistose também funciona na manutenção da imunidade aos patógenos. Certas células imunes inatas, como macrófagos e células dendríticas, envolvem-se na amostragem constitutiva e agressiva do fluido extracelular via macropinocistose6,15,16. Este modo de macropinocistose é incrivelmente ativo, e uma única célula dendrítica pode engorgar-se com um volume de fluido extracelular equivalente ao seu próprio peso a cada hora17. Apesar dessa amostragem constitutiva, macrófagos e células dendríticas não se replicam incontrolavelmente como as células tumorais, em vez disso, parecem processar o material extracelular de tal forma que as informações podem ser extraídas para informar sobre a presença, ou mesmo ausência, de ameaças potenciais. As informações são extraídas como i) padrões moleculares associados ao patógeno que podem ser lidos por receptores de reconhecimento de patógenos intracelulares e ii) pequenos trechos de aminoácidos que podem ser carregados em moléculas de histocompatibilidade principal para triagem por células do sistema imunológico adaptativo16,18,19. Não está claro se os patógenos subvertem esse caminho para o processamento de informações por células imunes.
Apesar desses papéis bem definidos e críticos para a macropinocistose tanto na manutenção da imunidade quanto na homeostase e em contraste com outros modos mais comumente estudados de endocitose, pouco dos trabalhos internos (luminosos) dos macropinossos são conhecidos. O desenvolvimento de protocolos e ferramentas padronizadas para estudar a bioquímica luminal dos macropinossos não só nos ajudará a entender melhor sua biologia única, mas fornecerá insights que podem ser aproveitados para novas estratégias terapêuticas, incluindo o fornecimento de medicamentos20. Este manuscrito metodu em ferramentas recentemente desenvolvidas para dissecar, no nível único da organela, vários aspectos da bioquímica luminal dos macropinossomos.
Fluoroforos podem ser usados para medir bioquímicas específicas de organelas se i) eles particionam preferencialmente no compartimento de interesse e/ou ii) sofrem alterações espectrais em resposta ao parâmetro de interesse. Por exemplo, no caso do pH, bases fracas fluorescentes, como laranja acridina, violeta cresyl, e os corantes LysoTracker se acumulam preferencialmente em organelas ácidas. Portanto, sua intensidade relativa é uma indicação aproximada de que a organela rotulada é ácida. Outros fluoroforos responsivos ao pH, como fluoresceína, pHrodo e cypHer5e, sofrem alterações espectrais ao se vincularem a prótons(Figura 1A-C). Alterações na emissão de fluorescência de fluoroforos sensíveis ao pH podem, portanto, fornecer uma aproximação útil do pH. O uso de fluoroforos únicos, no entanto, apresenta uma série de desvantagens. Por exemplo, alterações no plano focal, fotobleachamento e alterações no volume de organelas individuais, uma ocorrência comum em macropinosomos21,podem induzir alterações na intensidade de fluorescência de fluoroforos únicos, e isso não pode ser facilmente corrigido para22. As avaliações de comprimento de onda única, embora úteis para visualizar compartimentos ácidos, são, portanto, puramente qualitativas.
Uma abordagem mais quantitativa é atingir o fluoróforo sensível aos parâmetros, juntamente com um fluoróforo de referência à organela de interesse. O fluoróforo de referência é idealmente insensível às alterações bioquímicas dentro da organela (Figura 1D-F) e pode, portanto, ser usado para corrigir para alterações no plano focal, volume organellar e, em certa medida, fotobleaching23. Utilizando esta abordagem, referida como fluorescência multitorscência de fluorofora dupla, a correção pode ser alcançada gerando uma razão da emissão de fluorescência do fluorophore sensível aos parâmetros para o fluorophore de referência.
Aqui, o protocolo utilizará o princípio da imagem métrica de dupla fluorofora para medir pH, eventos oxidativos e degradação de proteínas dentro de macropinossos. Em cada caso, será selecionado um fluoróforo sensível ao parâmetro de interesse e a um fluoróforo de referência. Para direcionar os fluoroforos especificamente aos macropinossomos, eles serão covalentemente acoplados a 70 kDa dextran, que é preferencialmente incorporado em macropinossos24. Todos os ensaios serão realizados em células Raw264.7, mas podem ser adaptados a outros tipos de células. Sempre que possível, as razões de fluorescência serão calibradas em relação a uma curva de referência para ganhar valores absolutos. É importante ressaltar que todas as medições serão realizadas em células vivas para avaliação dinâmica e quantitativa do ambiente luminal dos macropinossomos.
Ao selecionar fluoroforos sensíveis ao pH, uma série de considerações devem ser ponderadas. O primeiro é o pKa do fluoróforo, que indica a faixa de valores de pH em que a sonda será mais sensível. Se for assumido que logo após a formação, o pH do macropinossomo estará próximo ao do meio extracelular (~pH 7.2) e que ele irá acidificar progressivamente através de interações com endósmos e lysosomos tardios (~pH 5.0), então uma sonda com um pKa sensível dentro dessa faixa(Figura 2C) deve ser selecionada. O fluoresceína fluorofora, que tem um pKa de 6.4, é otimizado dentro dessa faixa. Tem sido usado extensivamente para medir outras organelas semelhantes, como os faósmos, e será o fluoróforo de escolha neste manuscrito22,25. Como fluoróforo de referência, será utilizada a tetrametilrhodamina, que é insensível ao pH(Figura 1E). Outros fluoroforos, como pHrodo e cypHer5e podem ser substituídos por fluoresceína onde as propriedades espectrais da fluoresceína correspondem a outras variáveis experimentais. Alguns fluoroforos de referência sugeridos para pHrodo e cypHer5e são mostrados na Figura 1.
Uma segunda consideração é o método pelo qual os dois fluoroforos serão direcionados especificamente para macropinossomos. O Dextran do tamanho 70 kDa, que tem um raio hidrodinâmico de aproximadamente 7 nm, não gruda não especificamente nas células e é incorporado em macropinossos, mas não em poços revestidos de clathrin ou caveolae, e, portanto, marca macropinossos(Figura 2A e Figura 3A,B)16,24,26. Neste protocolo, o dextran de 70 kDa e tetramethylrhodamina (TMR) rotulados de 70 kDa dextran serão usados como sondas sensíveis ao pH e referência, respectivamente.
Nas células imunes inatas, macropinocistose e fagocitose representam as duas principais rotas para a internalização do material exógeno para processamento e posterior apresentação às células da resposta imune adaptativa27. O controle cuidadoso e coordenado da química redox do lúmen de fágoras e macropinossos é fundamental para o processamento específico do contexto do material exógeno. Talvez o regulador mais bem estudado de eventos oxidativos em fagosmos é o NADPH oxidase, um grande complexo multi-subunidade que produz grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio (ROS) dentro do lúmen de fagosomes28. De fato, sua atividade é central para o processamento adequado de antígenos dentro dos fágoras29,30. No entanto, a atividade do NADPH oxidase em membranas macropinosômicas não foi explorada.
Neste protocolo, o éster de succinimidyl H2DCFDA é usado para medir eventos oxidativos dentro do macropinosome. Esta é uma forma modificada de fluoresceína (2',7'-diclorodihioresceto), que é minimamente fluorescente em sua forma reduzida. Após a oxidação, sua emissão de fluorescência aumenta significativamente. No entanto, vale a pena notar uma ressalva significativa do H2DCFDA - como é baseada na fluoresceína fluorofora, sua fluorescência também é saciada em compartimentos ácidos, e deve-se tomar cuidado para controlar essa variável ao projetar experimentos28. Semelhante à abordagem para medir o pH, o éster succinimidil H2DCFDA será covalentemente anexado ao dextran de 70 kDa e o dextran de 70 kDa com rótulo TMR será usado como fluoróforo de referência(Figura 3A).
Ovalbumina fluorescente será usada para medir a degradação da proteína dentro de macropinossomos. O ovalbumin usado aqui é densamente rotulado com um corante FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) fl que é auto-extinto. Após a digestão, peptídeos fortemente fluorescentes com tinta são liberados. Como o ovalbumin não pode ser facilmente conjugado a dextran de 70 kDa, as células com dextran de 70 kDa com tmr e ovalbumina de fase fluida serão co-incubadas. O sinal TMR será usado para gerar uma máscara macropinosa durante a análise pós-imagem, e o sinal liberado da ovalbumina digerida será medido dentro da máscara(Figura 3B).
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Protocol
1. Preparação de células
- Cultivar células Raw264.7 a 37 °C e 5% de CO2 a 70% de confluência em RPMI suplementado com soro inativado por calor de 10%.
- Um dia antes do ensaio, as células raw264.7 com uma densidade de 5 x 104 células por poço em uma placa de 96 poços. Certifique-se de que cada poço contém 100 μL de meio de crescimento. Certifique-se de que a placa de 96 poços tenha lados pretos e um fundo de vidro para imagem.
NOTA: Aqui, foram utilizadas placas de 96 poços para imagem. As placas de 96 poços permitem o uso de quantidades menores de células e reagentes em relação a câmaras de imagem maiores. No entanto, qualquer câmara projetada para imagens de células vivas pode ser usada, e reagentes podem ser ampliados em conformidade. - No dia do ensaio, verifique se os poços são pelo menos 70% confluentes.
2. Medindo pH macropinoso
- Prepare as células como na seção 1.
- Lave todos os poços com 100 μL de HBSS a 37 °C.
- Encha cada poço com 100 μL de HBSS contendo 0,025 mg/mL de dextran de 70 kDa com etiqueta TMR e 0,025 mg/mL de fluoresceína rotulada 70 kDa detranx.
- Coloque as células em uma incubadora fixada a 37 °C por 15 minutos.
- Remova as células da incubadora e lave as células 6x com 100 μL de HBSS.
- Encha cada poço com 100 μL de HBSS a 37 °C.
- Coloque a placa no microscópio com um palco e câmara aquecidos.
- Ajuste os parâmetros de excitação/emissão de cada fluorophore conforme necessário.
NOTA: As condições ideais para aquisição de imagens variam de acordo com as configurações de fluoroforos usados e as configurações individuais do microscópio. Aqui, as imagens foram adquiridas em um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP5. A TMR estava animada com uma linha de 543 lasers e a emissão foi coletada de 610 nm a 650 nm. A fluoresceína estava animada com uma linha de 488 lasers e a emissão foi coletada de 500 nm a 550 nm. Utilizou-se um objetivo de imersão de óleo de 63x e adquirido um volume Z de 10 μm em intervalos de 0,5 μm. - Adquira uma imagem de cada poço, alternando entre fluoroforos entre cada poço.
- Após a primeira aquisição, verifique se todos os poços permaneceram em foco em toda a placa.
- Adquira imagens de cada poço em intervalos de 1-15 min pelo tempo desejado.
3. Calibração in situ do pH macropinoso
- Durante a aquisição de imagem, prepare 1 L de solução rica em potássio (K+-rico) contendo 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2e 5 mM de glicose. Suplemente um volume de 400 mL da solução K+rica com HEPES de 25 mM (a partir de uma solução de estoque de 1 M, pH 7.2) e um volume separado de 400 mL com MES de 25 mM (de uma solução de estoque de 0,5 M, pH 6.0).
- Ajuste uma alíquota de 50 mL da solução K+rica tamponada com HEPES de 25mM para pH 7.5 usando 10 M HCl ou 10 M KOH conforme necessário.
- Ajuste três alíquotas separadas de 50 mL da solução K+rica tamponada com MES de 25mM para pH 6.5, pH 5.5 e pH 5.0 usando 10 M HCl ou 10 M KOH conforme necessário.
NOTA: Um tampão de ácido acetato-acético pode ser preferível para soluções de pH mais baixas. - Após a conclusão da aquisição de imagem, remova o HBSS da placa de 96 poços contendo as células e substitua-a pela solução k+rica que está em pH 7.5.
- Adicione nígericina a uma concentração final de 10 μg/mL.
NOTA: Níger é um ionóforo que troca K+ por H+. Ao definir a concentração K+ da solução K+-rica para um valor que se aproxima da concentração K+ do citosol, pode-se garantir que a nigericina irá fixar o pH do macropinosome ao do citosol, que por sua vez reflete o pH do tampão de calibração. - Coloque a placa de volta no microscópio e adquira imagens de cada poço usando as mesmas configurações de aquisição que acima.
- Repita as etapas 3.5 e 3.6 para cada buffer de calibração.
4. Análise de dados para pH macropinosome
- Usando o software FIJI, subtraia o fundo tanto do TMR quanto do canal fluoresceína.
- Gere uma máscara no canal TMR. Para gerar uma máscara, converta a imagem em uma imagem binária selecionando Ajustar > limiar > aplicar. Em seguida, destaque a imagem binária e selecione Editar > Seleção > Criar máscara.
- Aplique-o tanto nas imagens TMR quanto em fluoresceína. Para isso, destaque a máscara e selecione Editar > Seleção > Criar Seleção. Clique na imagem TMR e pressione Shift + E para aplicar a máscara no canal TMR. Da mesma forma, clique na imagem fluorescein e pressione Shift + E para aplicar a máscara no canal OB.
- Registo o TMR e a intensidade de fluoresceína para cada macropinosome dentro das máscaras.
- Repita as etapas 4.1-4.3 para cada ponto de tempo do curso de tempo.
- Repita as etapas 4.1-4.3 para as imagens capturadas na calibração in situ.
- Divida a intensidade da fluoresceína pela intensidade de TMR para gerar a relação fluoresceína:TMR.
- Plote o pH contra as relações fluoresceína:TMR para as imagens de calibração.
- Encaixe uma curva nos dados de calibração.
- Interpolar os dados para cada ponto de tempo do curso de tempo para obter valores absolutos de pH.
5. Medir eventos oxidativos dentro de macropinossos
- Prepare as células como na seção 1.
- Um dia antes do ensaio, prepare o éster de succinimidil H2DCFDA rotulado de 70 kDa dextran por reutilização de 10 mg de dextran-amino de 70 kDa em 1 mL de solução de bicarbonato de sódio de 0,1 M (pH 8.3). Adicione 1 mg do éster de succinimidil H2DCFDA à solução dextran-amino e incubar por 1h. Dialyze o H2DCFDA rotulado de 70 kDa dextran contra PBS. Não guarde por mais de 1 dia, pois o dextran de 70 kDa com rótulo H2DCFDA irá oxidar no armazenamento.
- No dia do ensaio, lave todos os poços com 100 μL de HBSS a 37 °C.
- Encha cada poço com 100 μL de HBSS contendo 0,025 mg/mL de dextran de 70 kDa com etiqueta TMR e 0,025 mg/mL de H2DCFDA com etiqueta de 70 kDa dextran.
- Coloque as células em uma incubadora a 37 °C por 15 minutos.
- Remova as células da incubadora e lave as células 6x com 100 μL de HBSS.
- Encha cada poço com 100 μL de HBSS a 37 °C.
- Coloque a placa no microscópio com um estágio e câmara aquecidos e ajuste os parâmetros de excitação/emissão de cada fluorohore conforme necessário.
NOTA: As condições ideais para aquisição de imagens variam de acordo com as configurações de fluoroforos usados e as configurações individuais do microscópio. Aqui foram adquiridas imagens em um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP5. A TMR estava animada com uma linha de 543 lasers, e a emissão foi coletada de 610 nm a 650 nm. H2DCFDA estava animado com uma linha de 488 laser e a emissão foi coletada de 500 nm a 550 nm. Utilizou-se um objetivo de imersão de óleo de 63x, e um volume Z de 10 μm foi adquirido em intervalos de 0,5 μm. - Adquira uma imagem de cada poço, alternando entre fluoroforos entre cada poço.
- Após a primeira aquisição, verifique se todos os poços permanecem em foco em toda a placa.
- Adquira imagens de cada poço em intervalos de 1-15 min pelo tempo desejado.
6. Análise de dados para eventos oxidativos dentro de macropinossos
- Usando o software FIJI, subtraia o plano de fundo dos canais TMR e H2DCFDA.
- Gere uma máscara no canal TMR. Para gerar uma máscara, converta a imagem em uma imagem binária selecionando Ajustar > limiar > aplicar. Em seguida, destaque a imagem binária e selecione Editar > Seleção > Criar máscara.
- Aplique a máscara nas imagens TMR e H2DCFDA. Para isso, destaque a máscara e selecione Editar > Seleção > Criar Seleção. Clique na imagem TMR e pressione Shift + E para aplicar a máscara no canal TMR. Da mesma forma, clique na imagem H2DCFDA e pressione Shift + E para aplicar a máscara no canal H2DCFDA.
- Regisso da intensidade TMR e H2DCFDA para cada macropinosome dentro das máscaras.
- Repita as etapas 4.1-4.3 para cada ponto de tempo do curso de tempo.
- Divida a intensidade H2DCFDA pela intensidade TMR para gerar uma razão H2DCFDA: TMR.
- Plote a relação H2DCFDA: TMR contra o tempo.
7. Medir a digestão proteica dentro de macropinossomos
- Prepare as células como na seção 1.
- No dia do ensaio, lave todos os poços com HBSS de 100 μL a 37 °C.
- Dissolver ovalbumin com etiqueta BODIPY para uma concentração de 4 mg/mL no HBSS.
- Encha cada poço com 100 μL de HBSS contendo 0,025 mg/mL de dextran rotulado em TMR de 70 kDa e 0,2 mg/mL de ovalbumina com etiqueta BODIPY.
- Coloque as células em uma incubadora fixada a 37 °C por 15 minutos.
- Remova as células da incubadora e lave as células 6x com 100 μL de HBSS.
- Encha cada poço com 100 μL de HBSS a 37 °C.
- Coloque a placa no microscópio com um estágio e câmara aquecidos e ajuste os parâmetros de excitação/emissão de cada fluorohore conforme necessário.
NOTA: As condições ideais para aquisição de imagens variam de acordo com as configurações de fluoroforos usados e as configurações individuais do microscópio. Aqui, as imagens foram adquiridas em um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP5. A TMR estava animada com uma linha de 543 lasers, e a emissão foi coletada de 610 nm a 650 nm. BODIPY estava animado com uma linha de 488 laser, e a emissão foi coletada de 500 nm a 550 nm. Utilizou-se um objetivo de imersão de óleo de 63x e adquirido um volume Z de 10 μm em intervalos de 0,5 μm. - Adquira uma imagem de cada poço, alternando entre fluoroforos entre cada poço.
- Após a primeira aquisição, verifique se todos os poços permanecem em foco em toda a placa.
- Adquira imagens de cada poço em intervalos de 1-15 min pelo tempo desejado.
8. Análise de dados para digestão de proteínas dentro de macropinosos
- Usando o software FIJI, subtraia o plano de fundo dos canais TMR e BODIPY.
- Gere uma máscara no canal TMR e aplique-a tanto nas imagens TMR quanto no BODIPY como nas etapas 6.2 e 6.3 acima(Figura 3B).
- Registo a intensidade TMR e BODIPY para cada macropinosome dentro das máscaras.
- Repita as etapas 4.1-4.3 para cada ponto de tempo do curso de tempo.
- Divida a intensidade BODIPY pela intensidade TMR para gerar a razão BODIPY:TMR.
- Plote a relação BODIPY:TMR contra o tempo.
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Representative Results
Ao medir o pH macropinosome, há um período de tempo para o qual a dinâmica da acidificação não pode ser medida. Este período corresponde à fase de carregamento do dextran (caixa cinza na Figura 2C e Figura 3C,D) e variará dependendo do tipo de célula utilizada. O comprimento da fase de carregamento varia-se com (i) a atividade macropinocítica das células e (ii) a sensibilidade do instrumento utilizado. Recomenda-se ajustar este período no início de cada experimento de modo que uma relação de sinal:ruído superior a 4:1 seja alcançada tanto para os canais fluoresceína quanto para os canais TMR. Em células não tratadas, a emissão de fluoresceína deve tornar-se progressivamente mais fraca à medida que os macropinossomos acidificam, e o sinal TMR deve permanecer constante ou tornar-se mais brilhante. O sinal TMR pode ficar mais brilhante se os macropinossomos encolherem no tamanho16,21. Isso não afetará a razão, pois o sinal de fluoresceína está sujeito às mesmas variações no tamanhoorganellar 22. A relação fluoresceína:TMR se tornará progressivamente menor e subirá dentro dos primeiros 15 minutos de aquisição(Figura 2C). Este platô corresponde a um pH de ~5, que corresponde aproximadamente ao pH de lysososomes25. Ao final de cada aquisição, é realizada uma calibração in situ. A relação fluoresceína:TMR deve ser maior com o buffer de calibração em pH 7.5 e tornar-se progressivamente menor à medida que os buffers de calibração se tornam mais ácidos. Isso permite a geração de uma curva de calibração(Figura 2B). As relações fluoresceína:TMR podem então ser interpoladas para pH macropinosomal(Figura 2C).
Eventos oxidativos dentro de macropinossomos também são susceptíveis de variar com o tipo de célula sendo usado. Recomenda-se carregar as células com H2DCFDA-dextran, e estimular o NADPH oxidase utilizando phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) como controle positivo(Figura 3C). Isso dará uma melhor ideia do alcance dinâmico do ensaio e permitirá o ajuste das configurações do microscópio. À medida que os eventos oxidativos ocorrem dentro dos macropinossomos, o sinal H2DCFDA se tornará progressivamente mais brilhante. O sinal TMR pode permanecer constante ou pode variar com o tamanho do macropinosome, como discutido acima. A razão de H2DCFDA:TMR se tornará progressivamente maior e provavelmente irá subir dentro dos primeiros 20-30 min em células Raw264.7 inativadas(Figura 3A,C).
Ao medir a digestão da proteína macropinosômica, um sinal fluorescente progressivamente forte será liberado à medida que o ovalbumina for digerido. Nas células Raw264.7, o aumento da fluorescência liberada da ovalbumina rotulada pelo BODIPY digerida será platô dentro dos primeiros 30 min (Figura 3B,D). Como antes, o sinal TMR pode permanecer constante ou pode variar de acordo com o tamanho do macropinossomo. Como a degradação da ovalbumina começa imediatamente após o fechamento macropinosome, um controle negativo pode ser útil na determinação do alcance dinâmico do ensaio. Para isso, hidrolases ácidas dentro do macropinossomo podem ser inibidas usando um inibidor do V-ATPase, como a Concanamicina A (CcA) (Figura 3D) ou Bafilomicina A.
Figura 1: Princípios da imagem multimétrica de dupla fluorofora. (A-C). Escaneamentos espectrais (fixos em excitação, emissões variadas) de fluoroforos sensíveis ao pH suspensos em buffers do pH indicado. Fluoresceína, pHrodo e cypHer5e são comumente usados como sensores de pH em ensaios celulares. (D-F). Escaneamentos espectrais (fixos em excitação, variação de emissões) de fluoroforos insensíveis de pH suspensos em buffers do pH indicado. Corantes que não variam com pH fazem fluoroforos úteis de referência. Fluoresceína, não são otimizamente sensíveis aos valores de pH mais ácidos experimentados em endósceos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Medições dinâmicas de pH macropinosomal pH. (A) As células brutas264,7 foram carregadas com fluoresceína rotulada 70 kDa dextran e TMR-rotulada 70 kDa dextran a 37 °C na presença ou ausência de 500 ng/mL de Lipopolysaccarcharide (LPS) para 15 min. Eles também foram incubados com fluoresceína rotulada de 70 kDa dextran e TMR-labeled 70 kDa dextran a 4 °C como um controle para a ligação não específica de dextran. Os insets mostram células individuais (Barras de escala = 20 μm). (B) Na calibração in situ de células Raw264.7 carregadas com fluoresceína rotulada 70 kDa dextran e TMR rotulada 70 kDa dextran usando buffers K+ricos no pH indicado e nigericina. (C) PH macropinosome em células Raw264.7. Os insets representam a razão fluoresceína:TMR em macropinossos individuais. Caixas cinzas indicam os tempos em que as células estavam sendo carregadas com dextran. Dados de dois experimentos independentes cada um contendo ≥ 80 células. Dados representados como ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medições dinâmicas de eventos oxidativos e digestão proteica dentro do lúmen de macropinossomos. (A) As células Raw264.7 foram carregadas com H2DCFDA-labeled 70 kDa dextran e TMR-labeled 70 kDa detranx a 37 °C por 15 min, seguido por uma perseguição de 45 min a 37 °C. Os insets mostram imagens racionadas (H2DCFDA/TMR) de macropinossos individuais. Barras de escala = 20 μm. (B) As células Raw264.7 foram carregadas com ovalbumin com etiqueta BODIPY e dextran de 70 kDa com 37 °C por 15 min, seguidas por uma perseguição de 45 min a 37 °C. O canal TMR foi usado para gerar uma máscara, que foi aplicada ao canal BODIPY. Os insets mostram células individuais. Barras de escala = 20 μm. (C) Oxidação H2DCFDA dentro do lúmen dos macropinosmos. As células também foram estimuladas com PMA como um controle positivo. Caixas cinzas indicam os tempos em que as células estavam sendo carregadas com dextran. Dados de dois experimentos independentes, cada um contendo ≥ 80 células. Dados representados como ± SEM. Cada ponto de tempo foi comparado com o controle pma. O teste tde um aluno foi usado para análise estatística. (D) Degradação ovalbumina rotulada pelo BODIPY dentro de macropinossomos. A concanamicina A (AC) foi utilizada como controle negativo, pois impede a ativação de hidrolases de ácido luminal. Dados de dois experimentos independentes, cada um contendo ≥ 80 células. Dados representados como ± SEM. Cada ponto de tempo foi comparado com o controle da CcA. O teste tde um aluno foi usado para análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora existam uma série de protocolos para medidas de baixo e alto rendimento de absorção macropinóctica em macrófagos, fibroblastos e até mesmo dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, muito poucas tentativas foram feitas para medir a bioquímica luminal desses compartimentos dinâmicos. Isso é provavelmente devido a uma escassez de sondas que podem ser eficientemente direcionadas ao compartimento macropinosômico, evitando outros compartimentos endocíticos. Descritas aqui são as técnicas para direcionar sondas fluorescentes para a medição dinâmica do pH, eventos oxidativos e digestão de proteínas dentro de macropinossomos.
A microscopia de fluorescência racionadora tem sido a técnica primária pela qual o pH endosomal tem sido medido por décadas. A fluoresceína tem sido amplamente utilizada para medir pH endossomal e continua a ser o fluoróforo de escolha, pois seupK permite medições precisas com a faixa típica de valores de pH endosomais (~pH 7.2-4.5). Aqui, o estudo utilizou fluoresceína conjugada a 70 kDa dextran para medições de pH específicas de macropinossomo. Uma limitação dessa abordagem é o período de carregamento de 15 min do dextran durante o qual o pH macropinosômico não pode ser registrado. Este período é necessário para carregar dextran com rótulo fluorforeiro suficiente no compartimento macropinosômico, mas efetivamente impede medições precoces de pH macropinosome. Isso não impede, no entanto, determinações de vários parâmetros luminosos, como a capacidade de tampão, vazamento relativo de prótons e poder de bombeamento V-ATPase, todos derivados de medições de pH macropinosóis. Como mostrado na Figura 1, uma série de outros fluoroforos sensíveis ao pH também podem ser usados para medir pH, incluindo pHrodo (pKa = 6,8) e CypHer5e (pKa = 7,3). No entanto, como eles têm um pKa significativamente maior do que fluoresceína, eles não são ideais para medir pH endossomal a valores de pH mais ácidos.
Como macropinossomos são organelas altamente dinâmicas e sofrem uma redução significativa logo após a formaçãode 16,21, fluorescência enceoscência enceoscência multiprodutos de fluoforas duplas é necessária. Alterações na fluorescência devido a alterações no volume de macropinossos são corrigidas para o uso de um fluorophore de referência em todos os ensaios apresentados.
Eventos oxidativos nas células foram medidos usando uma variedade de sondas sensíveis ao redox, incluindo tetrazolium nitroblue (NBT), luminol e H2DCFDA. Abordagens baseadas em luminol são particularmente úteis para medir a produção de ROS em uma população de células, mas são difíceis de adaptar-se a medidas específicas de organela. O NBT forma um depósito insolúvel facilmente visualizado chamado formazan sobre a oxidação, mas obscurece sinais fluorescentes e é ao mesmo tempo não linear e difícil de localização. H2DCFDA libera um sinal fluorescente linear após a oxidação e pode ser prontamente conjugado a rastreadores como o dextran para medidas específicas da organela. Ao anexar H2DCFDA a dextran de 70 kDa, eventos oxidativos dentro de macropinossos individuais(Figura 3B) podem ser visualizados. Há, no entanto, uma ressalva a essa abordagem. Como h2DCFDA é uma forma modificada de fluoresceína, o sinal liberado é sensível ao pH. Embora o ganho de fluorescência sobre a oxidação seja grande o suficiente para ser detectado, é sem dúvida mascarado pelo lúmen ácido do macropinossomo. Uma variante insensível de pH do H2DCFDA já foi previamente disponível comercialmente e é preferível; no entanto, no momento da preparação deste manuscrito, este produto não estava mais disponível comercialmente. A ROS está emergindo como uma importante molécula de sinalização e tem sido implicada na remodelação de membranas, tráfico de organellar e, mais recentemente, no processamento do material por células que apresentam antígenos para apresentação às células T28,30. O método aqui apresentado pode ser utilizado para estudar a contribuição da produção de ROS macropinosômico para esses diversos processos fisiológicos.
A digestão proteica em macropinossomos interessa ao estudo da apresentação de antígenos por células imunes, bem como no estudo da aquisição de nutrientes por células cancerosas. Por exemplo, acredita-se que a digestão de proteínas endossomais por células dendríticas limite a piscina de peptídeos disponíveis para apresentação às células T nas principais moléculas de histocompatibilidade. Como os macropinossomos são uma das principais rotas de aquisição de antígenos, as medidas de digestão de proteínas macropinossômicas podem ser usadas para sondar o maquinário molecular responsável pela apresentação de antígenos finos. Uma série de ferramentas disponíveis comercialmente são usadas para medir a digestão de proteínas em compartimentos endossomais. As sondas BSA e ovalbumin rotuladas pelo BODIPY, que se tornam fortemente fluorescentes após a digestão, têm se mostrado particularmente populares. Eles são facilmente acoplados a rastreadores endocíticos e podem ser direcionados a compartimentos endosomais específicos, como fagosomes. As sondas, no entanto, não são prontamente acoplada ao Dextran e, portanto, requerem uma abordagem de co-localização. Essa abordagem resulta no carregamento de todos os compartimentos endossomais, incluindo macropinossomos, com ovalbumin rotulados pelo BODIPY, e uma máscara é usada para medir a degradação macropinosome-específica. Esta abordagem requer uma melhor resolução e não é facilmente dimensionada para análises maiores e mais elevadas de rendimento. Técnicas para acoplamento covalente de ferramentas de degradação de proteínas a 70 kDa dextran provavelmente serão úteis e estão sendo desenvolvidas em nosso laboratório.
À medida que o campo da macropinocistose continua a crescer34, ferramentas para medir dinamicamente a bioquímica luminal de macropinossomos, incluindo pH, químicas de redox, digestão de proteínas, concentrações de íons e químicas lipídicas fornecerão uma visão da biologia única dessas organelas em rápida evolução.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos à Universidade de Calgary pelo apoio. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Robin Yates pelo acesso a reagentes, equipamentos e discussões úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | - | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
References
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A.
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al.
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A.
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C.
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S.
