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Biochemistry

मैनुअल धब्बा-और-डुबकी एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों की ठंड

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/62765
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि एकल-कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों को मैन्युअल रूप से फ्रीज करने के लिए धब्बा-और-डुबकी विधि की रूपरेखा तैयार करती है।

Abstract

एकल-कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए इलेक्ट्रॉनों के साथ इमेजिंग जैविक नमूनों को ब्याज के बायोमोलेक्यूल्स युक्त विट्रियस बर्फ की एक पतली परत की आवश्यकता होती है। हाल के वर्षों में कई तकनीकी प्रगति के बावजूद, जिन्होंने एकल-कण क्रायोईएम को संरचनात्मक जीव विज्ञान के सबसे आगे धकेल दिया है, जिन तरीकों से नमूनों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए विट्रीफाइड किया जाता है, वे अक्सर दर-सीमित कदम बने रहते हैं। यद्यपि कई हालिया प्रयासों ने नमूना विट्रीफिकेशन के दौरान अक्सर आने वाली बाधाओं को दूर करने के लिए साधन प्रदान किए हैं, जिसमें उपन्यास नमूना समर्थन और अभिनव विट्रीफिकेशन इंस्ट्रूमेंटेशन का विकास शामिल है, पारंपरिक मैन्युअल रूप से संचालित प्लंजर खरीदने और संचालन में आसानी के लिए कम लागत के कारण क्रायोईएम समुदाय में एक प्रधान बना हुआ है। यहां, हम एकल-कण क्रायोईएम द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए जैविक नमूनों के विट्रीफिकेशन के लिए एक मानक, गिलोटिन-शैली मैन्युअल रूप से संचालित धब्बा-और-डुबकी डिवाइस का उपयोग करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, आमतौर पर समस्याओं का सामना करना पड़ा और समस्या निवारण सिफारिशों के लिए जब एक मानक तैयारी एक उपयुक्त नमूना उपज करने में विफल रहता है, तो भी वर्णित हैं।

Introduction

एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) एक शक्तिशाली संरचनात्मक तकनीक है जिसका उपयोग गतिशील जैविक नमूनों की संरचनाओं को निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन 1,2,3,4 तक हल करने के लिए किया जा सकता है। दरअसल, प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर प्रौद्योगिकियों में हाल ही में प्रगति4,5,6,7,8,9,10, इलेक्ट्रॉन स्रोतों में सुधार4,11,12,13,14, और विद्युत चुम्बकीय लेंस स्थिरता15, डेटा अधिग्रहण के निरंतर विकास के साथ युग्मित 16,17 और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज18,19, ने शोधकर्ताओं को अब नियमित रूप से 3 Å रिज़ॉल्यूशन या बेहतर 4,11,13,14,20,21,22,23 के लिए अच्छी तरह से व्यवहार किए गए नमूनों की संरचनाओं को निर्धारित करने में सक्षम बनाया है . इन बेहतर इमेजिंग और डेटा प्रसंस्करण क्षमताओं के बावजूद, क्रायोईएम ग्रिड तैयारी सफल उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए सबसे बड़ी बाधा बनी हुई है और अक्सर ईएम वर्कफ़्लो 24,25,26,27 में काफी बाधा के रूप में कार्य करती है।

क्रायोईएम जलीय समाधानों में जैविक नमूनों की इमेजिंग पर निर्भर करता है जो "कांच की तरह" बर्फ की एक पतली फिल्म बनाने के लिए जमे हुए हैं - एक प्रक्रिया जिसे विट्रीफिकेशन के रूप में जाना जाता है - जो देशी जैव रासायनिक राज्य को संरक्षित करता है। क्रायोईएम के लिए जैविक नमूनों का विट्रिफिकेशन 40 वर्षों से अधिक है28,29,30 और इस प्रक्रिया के लिए विकसित की गई कई तकनीकें और उपकरण मूल रूप से विस्तृत धब्बा-और-डुबकी विधि पर निर्भर करते हैं31,32,33,34,35 , जिससे नमूना की एक छोटी मात्रा (उदाहरण के लिए, 1-5 μL) को एक विशेष ईएम ग्रिड पर लागू किया जाता है, इससे पहले कि अतिरिक्त समाधान ब्लोटिंग पेपर के साथ ग्रिड की भौतिक बातचीत का उपयोग करके हटा दिया जाए। इस प्रक्रिया का समय आमतौर पर प्रत्येक नमूने के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है क्योंकि ठंड के नमूनों का एक महत्वपूर्ण घटक विट्रियस बर्फ फिल्म की मोटाई है - यदि बर्फ बहुत मोटी है तो इमेजिंग गुणवत्ता इलेक्ट्रॉन बीम के बढ़े हुए बिखरने के कारण नाटकीय रूप से खराब हो जाती है जबकि बर्फ जो बहुत पतली है, प्रोटीन अभिविन्यास को प्रतिबंधित कर सकती है और / या ग्रिड पन्नी छेद के केंद्र से कणों को बाहर कर सकती है36 . एकल-कण क्रायोईएम के लिए सही बर्फ की मोटाई पर इस निर्भरता ने तकनीकों और उपकरणों की एक विस्तृत सरणी का नेतृत्व किया है जो रोबोटिक्स 37,38, माइक्रोफ्लुइडिक्स 42, और अल्ट्रासोनिक या छिड़काव उपकरणों सहित नमूनों को फ्रीज कर सकते हैं27,39,40,41,42,43,44 . हाल के वर्षों में, कुछ सबसे लोकप्रिय नमूना तैयारी उपकरण धब्बा-और-डुबकी तकनीक 45 का उपयोग करके नमूनों के स्वचालित ठंड के लिए रोबोटिक्स के उपयोग पर भरोसा करते हैं। जबकि इन उपकरणों को इमेजिंग के लिए उचित बर्फ की मोटाई बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, वे अक्सर व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं को खरीदने और संचालित करने के लिए बहुत महंगे रहते हैं और आमतौर पर उपयोग के लिए प्रति घंटा दरों पर क्रायोईएम सुविधाओं के भीतर पाए जाते हैं। हाल के वर्षों में, मूल मैनुअल धब्बा-और-डुबकी तकनीक बढ़ी हुई उपयोग 3,47,48,49,50,51,52 में वापस आ गई है। दरअसल, एक मैन्युअल रूप से संचालित धब्बा-और-डुबकी डिवाइस रोबोट समकक्षों की लागत के एक अंश पर उच्च गुणवत्ता वाले क्रायोईएम ग्रिड प्राप्त कर सकता है। इसके अलावा, मैन्युअल ब्लोटिंग भी ब्लोटिंग पर अधिक उपयोगकर्ताओं को नियंत्रण प्रदान करता है क्योंकि शोधकर्ता ब्लोटिंग के प्रकार को समायोजित कर सकते हैं (यानी, ग्रिड के बैक-ब्लोटिंग, ग्रिड के फ्रंट-ब्लोटिंग, आदि), और प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने और शोध प्रश्नों के आधार पर ब्लोटिंग समय।

इस लेख में, हम एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए डेवर प्लेटफ़ॉर्म 53 के साथ युग्मित पारंपरिक मैनुअल धब्बा-और-डुबकी विट्रीफिकेशन डिवाइस का उपयोग करके जैविक नमूनों को प्रभावी ढंग से फ्रीज करने के तरीके पर विवरण प्रदान करते हैं। क्रायोजेन की तैयारी, ग्रिड हैंडलिंग, नमूना आवेदन, और ब्लोटिंग सहित सर्वोत्तम प्रथाएं, साथ ही साथ इन बाधाओं को दूर करने के तरीके पर सामान्य नुकसान और सिफारिशें प्रदान की जाती हैं। ग्रिड की तैयारी के बीच बर्फ की मोटाई पुनरुत्पादन को बढ़ाने के तरीके और जैविक नमूना प्रकार के आधार पर नमूना ब्लोटिंग को संशोधित करने के तरीके पर सलाह पर चर्चा की जाती है। इस पांडुलिपि में वर्णित मैनुअल प्लंजर की खरीद और संचालन से जुड़ी कम लागत को देखते हुए, दुनिया भर की प्रयोगशालाएं लागत प्रभावी और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से क्रायोईएम के लिए जैविक नमूने तैयार कर सकती हैं।

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Protocol

1. मैनुअल प्लंजिंग वातावरण तैयार करें

नोट:: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 5-30 मिनट

  1. एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में मैनुअल प्लंजर का पता लगाएं जहां एक ह्यूमिडिफायर को 100% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) (चित्रा 1 ए) के करीब कमरे को बनाए रखने के लिए सह-स्थित किया जा सकता है।
    सावधानी: कृपया मैनुअल प्लंजर और अनुशंसित संचालन के सुरक्षित स्थान के लिए संस्थान के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों के साथ परामर्श करें।
  2. ग्रिड की तैयारी से पहले, ठंडे कमरे में ह्यूमिडिफायर को चालू करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ठंडे कमरे का आरएच 95% ≥ है।
    नोट: कम आर्द्रता में ग्रिड तैयारी पतली फिल्मों के निर्जलीकरण, वाष्पीकरण के कारण बफर घटकों के परिवर्तन, और ग्रिड-टू-ग्रिड पुनरुत्पादन में कमी के परिणामस्वरूप हो सकती है46। <80% आरएच पर ग्रिड को फ्रीज करने की सिफारिश नहीं की जाती है।
  3. सुनिश्चित करें कि ठंडे कमरे का तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर है।
  4. मजबूत हवा की धाराओं (यानी, एयर कंडीशनिंग यूनिट वेंट्स से दूर) से दूर मैनुअल प्लंजर का पता लगाएं क्योंकि वे ठंडी सतहों पर ग्रिड और / या प्रमुख बर्फ संचय के पास अशांति का कारण बन सकते हैं।

2. प्लंजिंग सामग्री और सामान तैयार करें

नोट: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 1-5 मिनट

  1. 1-1.5 सेमी चौड़े और ~ 9 सेमी लंबी स्ट्रिप्स में ब्लोटिंग पेपर सर्कल को काटने के लिए साफ कैंची का उपयोग करें। ब्लोटिंग पेपर के केंद्र को छूने से बचें और छोटे अंत के टुकड़ों को छोड़ दें। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि ब्लॉटिंग पेपर स्ट्रिप्स सूखी, साफ और दूषित पदार्थों से मुक्त हैं। स्ट्रिप्स को अलग करें और उन्हें 100 मिमी पेट्री डिश में रखें।
  2. एक अलग 60 मिमी ग्लास पेट्री डिश में एक 22x22 मिमी वर्ग ग्लास कवरस्लिप रखें। इस coverslip युक्त ग्लास पेट्री पकवान स्टोर, हस्तांतरण, और चमक निर्वहन ग्रिड के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    नोट: ग्रिड जोड़ने से पहले स्लाइड से किसी भी दृश्यमान मलबे को हटाने के लिए एक एयर-डस्टर कैन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। एक एंटी-स्टैटिक गन का उपयोग किसी भी स्थैतिक बिजली को हटाने के लिए भी किया जा सकता है जो जमा होता है।
  3. ग्रिड संग्रहण बक्से को इकट्ठा और लेबल करें.
  4. 4 से 6 साफ और सूखी clamping चिमटी प्राप्त करें और उन्हें मैनुअल प्लंजर के लिए पता लगाने. नेत्रहीन डुबकी से पहले प्रत्येक चिमटी का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे क्षतिग्रस्त नहीं हैं और दूषित पदार्थों से मुक्त हैं।

3. क्रायोजेन देवर और मैनुअल प्लंजर तैयार करें

नोट:: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 5-15 मिनट

  1. प्लंजिंग देवर के नीचे प्लेटफ़ॉर्म बेस स्थापित करें। एथेन पोत देवर को प्लेटफ़ॉर्म बेस के शीर्ष पर रखें, पीतल के एथेन पोत को जोड़ें, और फिर कताई ग्रिड स्टोरेज प्लेटफ़ॉर्म स्थापित करें।
    1. एक बार तरल नाइट्रोजन (एलएन 2) को प्लंजिंग देवर में जोड़ा जाता है, तो प्लेटफ़ॉर्म बेस की ऊंचाई को अब समायोजित नहीं किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि ग्रिड बेस ठीक से स्थापित किया गया है और अनुचित प्लंजर ऊंचाई के कारण ग्रिड और / या चिमटी क्षति को सीमित करने के लिए स्तर है।
  2. ठंड से पहले, मैनुअल प्लंजर और सभी सहायक उपकरणों की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे नमूना और / या ग्रिड हानि को सीमित करने के लिए ठीक से काम कर रहे हैं।
  3. प्रत्येक ठंड सत्र से पहले, चिमटी को पकड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले मैनुअल प्लंजर आर्म पर टेप को बदलें। कमरे की उच्च आर्द्रता टेप चिपकने वाला खराब कर सकती है और चिमटी को पकड़ने के लिए टेप की क्षमता को कम कर सकती है, जिससे चिमटी क्षति और / या ग्रिड हानि की संभावना बढ़ जाती है।
  4. मैन्युअल प्लंजर के पास लैंप (ओं) को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूना बाती की निगरानी करने के लिए पर्याप्त प्रकाश है और यह सुनिश्चित करने के लिए ग्रिड हस्तांतरण आसानी से ग्रिड क्षति और / या हानि को रोकने के लिए कल्पना की जाती है (चरण 3.7 देखें)। तरल आंदोलन और जमे हुए ग्रिड को रोशन करने के लिए देवर के पास एक लचीला हाथ कार्य प्रकाश की कल्पना करने के लिए सीधे प्लंजर के पीछे एक रिंग लैंप का उपयोग करें।
  5. पैर पेडल तनाव को समायोजित करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि देवर प्लंजिंग आर्म को उठाए गए स्थिति में सुरक्षित रूप से जगह में बनाए रखा जाता है और पेडल के उदास होने पर पूरी तरह से जारी किया जाता है। प्लंजर ठीक से काम कर रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए नमूना आवेदन से पहले कई "सूखी" रन निष्पादित करें।
    नोट: पैर पेडल तनाव के अनुचित समायोजन के परिणामस्वरूप प्लंजिंग आर्म की समय से पहले रिहाई होगी (यानी, तनाव बहुत कम सेट किया गया है) और ग्रिड हानि या एथेन पोत में ग्रिड की अधूरी डुबकी (यानी, तनाव बहुत अधिक सेट किया गया है)।
  6. प्लंजिंग देवर को मैन्युअल प्लंजर के आधार पर सीधे प्लंजिंग आर्म के नीचे रखें और इसे जगह में सुरक्षित करें। संलग्न टेप का उपयोग करके प्लंजिंग आर्म में चिमटी की एक जोड़ी संलग्न करें। मैनुअल प्लंजिंग आर्म को पकड़ते समय, प्लंजिंग आर्म को सावधानीपूर्वक कम करने के लिए पैर पैडल को दबाएं और यह सुनिश्चित करने के लिए प्लंजिंग आर्म की यात्रा को समायोजित करें कि ग्रिड एथेन पोत के बीच में पता लगाएगा।
  7. प्लंजिंग आर्म के शीर्ष पर टक्कर स्टॉप का उपयोग करें ताकि प्लंजिंग आर्म की अंतिम स्थिति निर्धारित की जा सके जब पैर पेडल पूरी तरह से उदास हो (चित्रा 1 बी)। इथेन पोत (चित्रा 1 सी) में ग्रिड के स्थान को समायोजित करने के लिए प्लंजिंग आर्म पर टक्कर स्टॉप ऊंचाई को समायोजित करें।
    नोट: गलत तरीके से प्लंजिंग आर्म की ऊंचाई सेट करने से ग्रिड और / या चिमटी क्षति हो सकती है (उदाहरण के लिए, प्लंजिंग आर्म की ऊंचाई बहुत कम सेट की जाती है) या अपर्याप्त विट्रिफिकेशन (उदाहरण के लिए, प्लंजिंग आर्म हाइट बहुत अधिक सेट की जाती है)।
  8. ठंडे कमरे के बाहर देवर का पता लगाएं और तरल इथेन (चरण 4) तैयार करने के लिए आगे बढ़ें।

4. क्रायोजेन तैयार करें

नोट:: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 10-30 मिनट

  1. नुकसान के किसी भी संकेत के लिए एथेन टैंक, नियामक, टयूबिंग, और एथेन वितरण टिप का आकलन करें। आगे बढ़ने से पहले तुरंत रिपोर्ट करें और क्षति के किसी भी संकेत को सुधारें।
    चेतावनी: संपीड़ित इथेन और एथेन: प्रोपेन गैस मिश्रण ज्वलनशील होते हैं और जीवन के लिए एक गंभीर खतरा पैदा कर सकते हैं और / या अनुचित रूप से संभाले जाने पर चोट लग सकती है। कृपया एक विशेषज्ञ से परामर्श करें यदि अनिश्चित है कि संपीड़ित गैस टैंकों को कैसे संचालित या संभालना है। ज्वलनशील संपीड़ित गैसों को संभालते समय कृपया संस्था के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों का संदर्भ लें। इसके अलावा, तरलीकृत इथेन एक शक्तिशाली क्रायोजेन है जो जीवन और / या चोट के लिए एक गंभीर खतरा पैदा कर सकता है यदि ठीक से संभाला नहीं जाता है। क्रायोजेन्स को संभालते समय कृपया संस्थान के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों का संदर्भ लें।
  2. एक उपयुक्त LN2 हैंडलिंग देवर में पर्याप्त LN2 प्राप्त करें (यानी, 3-4 L ग्रिड तैयारी और भंडारण के लिए विशिष्ट है)।
    चेतावनी: एलएन 2 एक क्रायोजेन है जो जीवन और / या चोट के लिए एक गंभीर खतरा पैदा कर सकता है यदि ठीक से संभाला नहीं जाता है।
    1. सुनिश्चित करें कि चोट के जोखिम को कम करने के लिए सभी व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग किया जाता है। एलएन 2 का वाष्प एक श्वासावरोधक है और इसे अच्छी तरह से हवादार क्षेत्रों में संभाला जाना चाहिए। कृपया एक विशेषज्ञ से परामर्श करें यदि अनिश्चित है कि क्रायोजेनिक जहाजों और क्रायोजेन को कैसे संचालित या संभालना है। क्रायोजेन्स को संभालते समय कृपया संस्थान के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों का संदर्भ लें। उन स्थितियों के लिए जिनमें तरल नाइट्रोजन का उपयोग ठंडे कमरे में नहीं किया जा सकता है, हम एक शांत और अच्छी तरह से हवादार स्थान में डुबकी लगाने की सलाह देते हैं।
  3. ठंडे कमरे के बाहर, LN2 को सीधे पीतल के एथेन पोत में डालकर प्लंजिंग देवर को ठंडा करें जब तक कि तरल नाइट्रोजन का स्तर एथेन पोत के शीर्ष तक नहीं पहुंच जाता (यानी, प्लेटफ़ॉर्म के ठीक ऊपर)। आवश्यकतानुसार इथेन पोत के बाहर एलएन 2 से ऊपर। अगले चरण के लिए आगे बढ़ें जब एलएन 2 हिंसक रूप से बुदबुदाना बंद कर देता है (लगभग 5 मिनट)।
    1. इथेन गैस को संघनित करने से पहले पोत को पर्याप्त रूप से ठंडा करने के लिए सीधे पीतल के एथेन बर्तन में एलएन 2 जोड़ें। पीतल के एथेन पोत को ठीक से ठंडा करने में विफलता नाटकीय रूप से एथेन को संघनित करने में लगने वाले समय को बढ़ाएगी।
    2. एक बार जब देवर LN2 तापमान तक पहुंच जाता है, तो देवर को इस तरह से ओवरफिल करने से बचें कि LN2 एथेन पोत में फैल जाए।
  4. एथेन एक संपीड़ित गैस के रूप में आता है और उपयोग के लिए तरलीकृत करने की आवश्यकता होती है। एथेन टैंक गैस प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए एक उच्च-शुद्धता दोहरे चरण नियामक का उपयोग करता है। नियामक आउटलेट वाल्व के लिए टयूबिंग कनेक्ट करें और एथेन वितरण के लिए अंत में जुड़े एक 14-गेज फ्लैट धातु वितरण टिप का उपयोग करें।
  5. इथेन मुख्य टैंक वाल्व खोलने से पहले, सुनिश्चित करें कि दबाव समायोजित घुंडी और आउटलेट वाल्व सभी तरह से बंद हैं। मुख्य टैंक वाल्व को पूरी तरह से खोलें और फिर आउटलेट वाल्व को ~ 50% तक खोलें। धीरे-धीरे दबाव समायोजित घुंडी खोलें जब तक कि धीमी गति से गैस प्रवाह नहीं देखा जाता है। गैस प्रवाह को ठीक करने के लिए आउटलेट वाल्व का उपयोग करें।
    सावधानी: हमेशा वाल्व खोलने या गैस प्रवाह समायोजन करते समय धातु वितरण टिप को स्वयं से दूर इंगित करें।
  6. धीरे-धीरे गैस प्रवाह शुरू करें और विआयनीकृत पानी के एक छोटे से बीकर में एथेन गैस लाइन की नोक को डालकर प्रवाह दर का आकलन करें। गैस के प्रवाह को समायोजित करें जब तक कि प्रवाह दर मामूली रूप से पानी को परेशान न करे।
    1. गैस प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए उचित इथेन संघनन होता है - एक प्रवाह दर की बहुत धीमी गति से ईथेन गैस को वितरण टिप में ठोस करने का कारण बनेगा और प्रवाह दर के बहुत तेज होने के परिणामस्वरूप तीव्र बुदबुदाहट होगी और ठंड को रोकना होगा।
  7. पीतल के एथेन बर्तन में एथेन गैस लाइन की नोक डालने से पहले, किसी भी पानी को हटाने के लिए नाजुक कार्य पोंछे के साथ वितरण टिप को साफ और पोंछें।
  8. एक चिकनी और त्वरित गति में, पीतल के एथेन पोत के तल पर गैस वितरण टिप का पता लगाएं और एथेन पोत के नीचे के चारों ओर धीमी गति से सर्कल में वितरण टिप को स्थानांतरित करना शुरू करें। ठोस इथेन तुरंत बन जाएगा, लेकिन जल्दी से तरल हो जाएगा क्योंकि अधिक एथेन गैस जोड़ा जाता है / संघनित होता है।
    1. ठोस इथेन को तरल बनाने के लिए इथेन पोत के तल पर चारों ओर धातु एथेन वितरण टिप को स्थानांतरित करना जारी रखें। ईथेन पोत को तरल इथेन (शीर्ष से 2-3 धागे) से भरे 3/4 तक भरें। ध्यान से पीतल इथेन पोत से धातु इथेन वितरण टिप को हटाने और आउटलेट वाल्व को बंद करके एथेन गैस प्रवाह बंद करो।
  9. एलएन 2 के साथ प्लंजिंग देवर से ऊपर धीरे से देवर के किनारे पर डालने के लिए पीतल के इथेन पोत के लिए एलएन 2 के अलावा से बचने के लिए, जब तक कि तरल स्तर सिर्फ पीतल के एथेन बर्तन को छूता है। इथेन ठोसीकरण की सुविधा के लिए प्लंजिंग देवर पर फोम ढक्कन रखें।
    1. एलएन 2 को सीधे एथेन के ठोसीकरण में सहायता के लिए पीतल के एथेन पोत से संपर्क करना चाहिए। लगभग 5 मिनट के बाद, पीतल के बर्तन के भीतर इथेन पूरी तरह से जमे हुए ठोस हो जाएगा। अधिक LN2 जोड़ें जब तक कि यह सिर्फ इथेन पोत को छूता है और अगले चरण में आगे बढ़ता है।
  10. यदि एथेन ने ठोस जमे हुए नहीं हैं, तो पीतल के एथेन बर्तन शेष चरणों के लिए पर्याप्त ठंडा नहीं है। अधिक एलएन 2 जोड़ें जब तक कि यह सिर्फ इथेन पोत को नहीं छूता है और अतिरिक्त 5 मिनट प्रतीक्षा करता है। सुनिश्चित करें कि पीतल के बर्तन के भीतर एथेन पूरी तरह से जमे हुए ठोस है।
  11. चरण 4.6 में निर्धारित के रूप में एक समान दर पर एक इथेन गैस प्रवाह का उत्पादन करने के लिए गैस आउटलेट वाल्व खोलें। ऊर्ध्वाधर रूप से धातु एथेन वितरण टिप को ठोस इथेन में रखें और ठोस ईथेन को पिघलाने के लिए एक परिपत्र गति में ईथेन डिस्पेंसिंग टिप को स्थानांतरित करना जारी रखें।
    1. इथेन जोड़ना जारी रखें जब तक कि यह पीतल के एथेन बर्तन के शीर्ष के साथ स्तर न हो। धीरे-धीरे इथेन पोत से टिप को हटा दें और एथेन टैंक आउटलेट वाल्व को बंद कर दें। ~ 1-4 मिनट (एस) के लिए ढक्कन के साथ देवर को कवर करें ताकि एथेन पीतल के एथेन पोत के किनारों के चारों ओर जम सके।
      नोट: एक आदर्श इथेन पोत में केंद्र में तरल इथेन के साथ पीतल के एथेन पोत की परिधि पर ठोस इथेन की 2-3 मिमी सममित अंगूठी होगी (चित्रा 1 डी और चित्रा 2)।
    2. सुनिश्चित करें कि एथेन जैविक नमूने के उचित विट्रीफिकेशन को सुनिश्चित करने के लिए ठोस किए बिना यथासंभव ठंडा हो। तरल इथेन को ठीक से तैयार करने में विफलता के परिणामस्वरूप नमूने, बर्फ संचय, और / या नमूने के नुकसान का अपर्याप्त विट्रीफिकेशन हो सकता है, प्रत्येक इमेजिंग के लिए नमूना गुणवत्ता की गिरावट में योगदान देता है।
    3. यदि ईथेन की एक ठोस अंगूठी 2-3 मिनट के बाद नहीं बनती है, तो देवर में अधिक एलएन 2 जोड़ें और 2-5 मिनट के लिए कवर करें।
    4. यदि एथेन बहुत जल्दी जम रहा है, तो पूर्ण एथेन ठोसीकरण को रोकने के लिए ईथेन पोत और / या ठोस एथेन को धीरे से गर्म करने के लिए साफ चिमटी की एक बड़ी जोड़ी का उपयोग करें। एक बार जब ईथेन और एलएन 2 स्थिर हो जाते हैं, तो सभी ईथेन टैंक वाल्व बंद कर दें और मैनुअल प्लंजर के लिए प्लंजिंग डेवर का पता लगाएं। मैनुअल प्लंजर के लिए प्लंजिंग देवर को सुरक्षित करें।
      सावधानी: देवर को स्थानांतरित करते समय अतिरिक्त सावधान रहें क्योंकि एलएन 2 एथेन पोत में फैल सकता है और तरल इथेन को मजबूत कर सकता है। यदि आवश्यक हो, तो चिमटी के एक साफ सेट का उपयोग पोत के बीच में किसी भी ठोस इथेन को पिघलाने के लिए किया जा सकता है।
  12. खाली चिमटी की एक जोड़ी के साथ एथेन डेवर के स्थान का परीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चिमटी टिप एथेन पोत के केंद्र में स्थित है और तरल इथेन के अंदर ग्रिड और चिमटी टिप के लिए पर्याप्त स्थान है (चित्रा 1 डी)।
    1. यदि ठोस इथेन रिंग आसान ग्रिड हैंडलिंग के लिए बहुत मोटी है, तो कमरे के तापमान की एक जोड़ी का उपयोग करें, ठोस इथेन को पिघलाने के लिए साफ चिमटी का उपयोग करें और एथेन पोत के केंद्र में अधिक ठंड क्षेत्र बनाएं।

5. EM ग्रिड तैयार करें

नोट: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 1-5 मिनट

  1. ग्रिड भंडारण बॉक्स (es) को देवर में जोड़ें, ग्रिड भंडारण बॉक्स ढक्कन (ओं) को खोलें, और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ढक्कन स्वतंत्र रूप से एक नए ग्रिड स्लॉट में घुमा सकता है।
  2. ग्रिड भंडारण बॉक्स से ग्रिड को स्लाइड किनारे से ~ 30-40% ग्रिड के ~ 30-40% के साथ वर्ग ग्लास कवरस्लिप के किनारे पर ग्रिड भंडारण बॉक्स से सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि ग्रिड पन्नी ऊपर का सामना करना पड़ रहा है। सुनिश्चित करें कि उपयोग में नहीं होने पर ग्रिड को कवर किया जाता है। वर्ग ग्लास coverslip के किनारे पर ग्रिड रखने ग्रिड हैंडलिंग की आसानी प्रदान करता है और हस्तांतरण के दौरान झुकने या ग्रिड को नुकसान पहुंचाने की संभावना को कम कर देता है।
    नोट: 4-6 ग्रिड आमतौर पर एक समय में तैयार किए जाते हैं।
  3. एक चमक निर्वहनकर्ता या प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग कर ग्रिड हाइड्रोफिलिक रेंडर.
    नोट:: कृपया चमक निर्वहनकर्ता/प्लाज्मा क्लीनर निर्माता द्वारा प्रदान की गई ग्रिड सफाई के लिए अनुशंसित दिशानिर्देशों को देखें।
    1. प्लाज्मा सफाई के 10 मिनट के भीतर ग्रिड का उपयोग करें क्योंकि ग्रिड हाइड्रोफिलिसिटी खो देते हैं और इस समय के बाद ग्रिड-टू-ग्रिड पुनरुत्पादन कम हो जाता है।

6. डुबकी ठंड द्वारा क्रायोईएम नमूना तैयार

नोट: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: >10 मिनट (~ ग्रिड प्रति 1-3 मिनट)

  1. एक साफ ग्रिड लेने के लिए एक साफ और सूखी क्लैंपिंग चिमटी का उपयोग करें, जगह में ग्रिड को ठीक करने के लिए प्लास्टिक क्लैंप को नीचे स्लाइड करें, और ग्रिड को ठीक से सुरक्षित करने के लिए धीरे से चिमटी को टैप करें।
    1. ग्रिड पन्नी को नुकसान को रोकने के लिए बाहरी अंगूठी द्वारा ग्रिड को संभालें।
  2. ग्रिड के तैयार पक्ष (जैसे, सामने या पन्नी पक्ष) के लिए नमूना के 1 से 5 μL लागू होते हैं।
    नोट: इष्टतम मात्रा और ब्लोटिंग समय नमूने पर निर्भर करता है और प्रत्येक नमूने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है; बड़ी मात्रा और अधिक चिपचिपा नमूनों को लंबे समय तक ब्लोटिंग समय की आवश्यकता होती है।
  3. चिमटी-ग्रिड-नमूना असेंबली को चिमटी हैंडल के चारों ओर टेप लपेटकर मैन्युअल प्लंजिंग आर्म में सुरक्षित करें।
    1. पारंपरिक सामने blotting के लिए उपयोगकर्ता की ओर नमूने का सामना करें। यदि नमूने को बैक ब्लोटिंग की आवश्यकता होती है, तो उपयोगकर्ता से दूर नमूना का पता लगाएं।
  4. प्रत्येक हाथ के अंगूठे और तर्जनी के बीच ब्लोटिंग पेपर का एक साफ, सूखा, कटा हुआ टुकड़ा पकड़ो।
    1. केवल किनारों से ब्लोटिंग पेपर संभालें और कभी भी केंद्र को स्पर्श न करें क्योंकि हाथों / दस्ताने से तेल और अन्य संदूषक ग्रिड की गुणवत्ता को बदल सकते हैं।
  5. एक स्थिर स्थिति स्थापित करने के लिए प्लंजिंग देवर के किनारे पर हाथ रखें। ग्रिड सतह से लगभग 1 सेमी दूर ग्रिड सतह के समानांतर ब्लोटिंग पेपर का पता लगाएं।
    1. पूर्ण तरल गतिशीलता के लिए अनुमति देने के लिए ब्लोटिंग पेपर के मध्य खंड का उपयोग करें और यहां तक कि ग्रिड सतह पर भी बात करें।
  6. धीरे से स्लाइड और अंगूठे और अंगूठी उंगलियों को एक दूसरे की ओर घुमाने के लिए ग्रिड की ओर blotting कागज मोड़ करने के लिए ब्लोटिंग शुरू करने के लिए. पूरे ब्लोटिंग प्रक्रिया के दौरान ब्लोटिंग पेपर और ग्रिड सतह के बीच संपर्क बनाए रखें।
    1. सीधे ग्रिड की सतह के लिए blotting कागज से संपर्क करें और ग्रिड सतह भर में लगातार संपर्क बनाए रखने.
    2. धीरे से ब्लोटिंग पेपर को झुकने से ग्रिड के झुकने और / या ग्रिड की सतह को नुकसान कम हो जाता है, और इसके परिणामस्वरूप ग्रिड में अधिक सुसंगत बर्फ होती है (चित्रा 3 ए)।
  7. मोबाइल तरल सामने का निरीक्षण करें और एक बार जब यह ब्लोटिंग पेपर में प्रगति करना बंद कर देता है तो 4 से 6 सेकंड के लिए गिनती शुरू कर देता है।
    नोट:: गिनती हो सकती है एक बार blotting कागज ग्रिड सतह से संपर्क करता है, लेकिन कम ग्रिड-टू-ग्रिड reproducibility हो सकता है। कुल धब्बा समय ग्रिड प्रकार, पन्नी प्रकार, नमूना एकाग्रता, और नमूना प्रकार (उदाहरण के लिए, घुलनशील बनाम झिल्ली बनाम फिलामेंटस प्रोटीन) पर निर्भर करेगा। अधिक चिपचिपा नमूनों के लिए लंबे समय तक धब्बा समय (उदाहरण के लिए, 5 से 7 सेकंड) की आवश्यकता होगी।
    1. महत्वपूर्ण: ठंड की प्रक्रिया के दौरान पुनरुत्पादन को बढ़ाने के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत गिनती योजना विकसित करें।
  8. ग्रिड सतह से दूर "स्नैपिंग गति" में ब्लोटिंग पेपर को हटाने के लिए बाएं, दाएं अंगूठे और तर्जनी उंगलियों को विपरीत दिशाओं में ले जाएं। तुरंत पैर पेडल depress करने के लिए plunging हाथ जारी करने के लिए और तरल इथेन में ग्रिड डुबकी.
    1. साथ ही ब्लोटिंग पेपर को हटा दें और ग्रिड को ईथेन में जितनी जल्दी हो सके सर्वोत्तम ठंड परिणामों के लिए डुबोने के लिए पैर पैडल दबाएं। ब्लोटिंग पेपर हटाने और डुबकी लगाने के बीच का समय जितना अधिक होगा, पतली फिल्मों का अधिक वाष्पीकरण होगा और ग्रिड-टू-ग्रिड पुनरुत्पादन में कमी आएगी।
  9. Clamping चिमटी स्थिर करने के लिए एक हाथ का उपयोग करें, चिमटी और मैनुअल प्लंजिंग हाथ के आसपास से सावधानीपूर्वक टेप खोलना।
    1. चिमटी-ग्रिड के आंदोलन को रोकने के लिए हमेशा चिमटी के साथ संपर्क बनाए रखें और ग्रिड क्षति को सीमित करें जो ठोस इथेन के खिलाफ ग्रिड को खटखटाने से होती हैं।
  10. एक बार clamping चिमटी मैनुअल प्लंजिंग हाथ से मुक्त कर रहे हैं, एक हाथ में चिमटी बनाए रखने के लिए plunging देवर के शीर्ष पर आराम कर रहे हैं, सुनिश्चित करें कि ग्रिड तरल इथेन में रहता है. ग्रिड से दूर प्लास्टिक क्लैंप को ध्यान से स्लाइड करें ताकि ग्रिड को स्थानांतरित किया जा सके। ग्रिड को बनाए रखने के लिए चिमटी पर दबाव बनाए रखें।
    1. एक तेज गति के साथ, जल्दी से ईथेन पोत से ग्रिड को एलएन 2 जलाशय में स्थानांतरित करें। ग्रिड को ग्रिड संग्रहण बॉक्स में सावधानीपूर्वक रखें.
      नोट: कुछ इथेन ग्रिड सतह पर ठोस हो सकता है। चिमटी को थोड़ा खोलने से एथेन टूट जाएगा और ग्रिड को ग्रिड बॉक्स में गिराने की अनुमति मिलेगी।
  11. ठंढ संचय को रोकने के लिए एक नाजुक कार्य पोंछे में चिमटी की नोक लपेटें। एक तरफ सेट करें जब तक कि चिमटी कमरे के तापमान पर वापस नहीं आ जाती।
    1. उपयोग में आसानी के लिए हाथ पर 4 से 6 चिमटी रखें। प्रत्येक चिमटी का उपयोग नमूना ठंड के लिए किया जाएगा और बाद के उपयोग से पहले गर्म किया जाएगा।
  12. प्रत्येक ग्रिड के लिए चरण 6.1-6.11 दोहराएँ।
  13. एक बार ठंड समाप्त हो जाने के बाद, ग्रिड बॉक्स को सुरक्षित रूप से बंद कर दें और एक उचित भंडारण स्थान पर स्थानांतरित करें।
  14. तरल इथेन और एलएन 2 का सावधानीपूर्वक निपटान करें और सभी सामग्रियों को एक सूखे स्थान पर संग्रहीत करें।

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Representative Results

यहां वर्णित धब्बा-और-डुबकी प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन के परिणामस्वरूप विट्रियस बर्फ की एक पतली, समान परत होगी जो किसी भी हेक्सागोनल बर्फ, संदूषकों और अनुपयोगी बर्फ के बड़े ग्रेडिएंट से मुक्त है जिसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के तहत देखा जा सकता है। ग्रिड की सतह के साथ ब्लोटिंग पेपर का असंगत संपर्क, समय से पहले ब्लोटिंग पेपर को हटाने, या ग्रिड संपर्क के दौरान ब्लोटिंग पेपर को स्थानांतरित करने से विट्रियस बर्फ की गुणवत्ता कम हो सकती है और ईएम ग्रिड में असंगत बर्फ की मोटाई हो सकती है (चित्रा 4)

Figure 1
चित्रा 1: नमूना प्लंजिंग रूम और आवश्यक उपकरण। ए) इस लेख में उल्लिखित एक पारंपरिक धब्बा-और-डुबकी डिवाइस का उपयोग करके जैविक नमूनों के मैनुअल फ्रीजिंग के लिए कोल्ड रूम का मंचन किया। आवश्यक उपकरण दिखाए जाते हैं और तदनुसार लेबल किए जाते हैं। बी) मैनुअल प्लंजर की काम करने की ऊंचाई को समायोजित करने के लिए, इसे ऊपर और नीचे स्लाइडिंग मैनुअल प्लंजिंग आर्म को स्लाइड करके और पेंच को कसकर इसे सुरक्षित करके टक्कर स्टॉप को समायोजित करें। सी) इथेन पोत और कताई ग्रिड भंडारण मंच के ज़ूम-इन दृश्य में उचित ऊंचाई और खाली पीतल इथेन पोत के अंदर clamping चिमटी और ग्रिड के स्थान को इंगित करने के लिए। चिमटी और ग्रिड को नुकसान से बचने के लिए पीतल की इथेन के किनारों या नीचे से संपर्क नहीं करना चाहिए। डी) उचित ऊंचाई और तरल इथेन में clamping चिमटी और ग्रिड का स्थान. चिमटी और ग्रिड को केंद्र में तरल इथेन में प्रवेश करना चाहिए, परिधि में ठोस इथेन के संपर्क से बचना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: तैयार तरल इथेन। नमूना ठंड से पहले पीतल के इथेन पोत में तरल इथेन की स्थिति को दिखाते हुए प्लंजिंग देवर के ज़ूम-इन दृश्य। पीतल के एथेन पोत के भीतर ठोस इथेन की 2-3 मिमी की अंगूठी स्पष्ट रूप से दिखाई देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मैनुअल धब्बा-और-डुबकी तकनीक का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि एपोफेरिटिन छवियां। (ए) क्रायोईएम ग्रिड का प्रतिनिधि एटलस जो बर्फ की मोटाई और ग्रिड वर्गों की गुणवत्ता दिखाता है जिसे मैन्युअल धब्बा-और-डुबकी तकनीक का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। (बी) कैलिफ़ोर्निया विश्वविद्यालय, सैन डिएगो के क्रायोईएम सुविधा में एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से सुसज्जित 200 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित विट्रीफाइड माउस एपोफेरिटिन के मोशन-सही माइक्रोग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक उप-इष्टतम क्रायोईएम ग्रिड का प्रतिनिधि एटलस जो ग्रिड में असंगत बर्फ की मोटाई, कई टूटे हुए वर्गों और उन क्षेत्रों को दिखाता है जिनमें बर्फ नमूने की छवि बनाने के लिए बहुत मोटी है। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) द्वारा इमेजिंग के लिए जैविक नमूनों का विट्रीफिकेशन सफल संरचना निर्धारण के लिए एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण कदम बना हुआ है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित मैनुअल धब्बा-और-डुबकी विधि क्रायोईएम इमेजिंग के लिए विट्रियस बर्फ की पतली फिल्मों में जैविक नमूनों को जल्दी से फ्रीज करने के लिए एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय और मजबूत विधि का प्रतिनिधित्व करती है। पांडुलिपि में उल्लिखित तरीकों का उपयोग करते हुए, शोधकर्ता मैनुअल प्लंजर को इकट्ठा करने और संचालित करने में सक्षम होंगे, फ्लैश-फ्रीजिंग जैविक नमूनों के लिए उपयुक्त क्रायोजेन तैयार करेंगे, और जैविक नमूनों वाले मैन्युअल रूप से धब्बा-और-डुबकी ईएम ग्रिड तैयार करेंगे। हालांकि यह विधि काफी मजबूत है, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए इष्टतम बर्फ की मोटाई और गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों के दौरान देखभाल की जानी चाहिए। हमने नीचे दिए गए इन महत्वपूर्ण चरणों में से कई को रेखांकित किया है और इन चरणों का समस्या निवारण करने के तरीके पर सिफारिशें प्रदान की हैं।

यह सुनिश्चित करने के लिए मैन्युअल प्लंजिंग आर्म को ठीक से तैनात करना आवश्यक है कि ग्रिड प्लंजिंग के बाद पीतल के बर्तन के भीतर तरल इथेन के केंद्र में स्थित हो। अनुचित ऊंचाई या प्लंजिंग हाथ की स्थिति और / या चिमटी को ठीक से सुरक्षित नहीं करने से क्लैंपिंग चिमटी, ईएम ग्रिड और संभवतः मैनुअल प्लंजर को नुकसान होगा। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, हम हमेशा जैविक नमूनों को तैयार करने से पहले कम से कम एक परीक्षण चलाते हैं ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि ईएम ग्रिड सफल डुबकी के बाद पीतल के एथेन पोत के केंद्र में पता लगाएगा (चित्रा 1 सी)। इसके अलावा, हम ईथेन पोत (चित्रा 1 डी) के भीतर ग्रिड प्लेसमेंट को ठीक करने के लिए प्रत्येक ग्रिड फ्रीजिंग के बाद प्लंजिंग डेवर के स्थान पर मामूली समायोजन भी करते हैं।

एथेन क्रायोजेन की उचित तैयारी विट्रियस बर्फ में जैविक नमूनों की पतली फिल्मों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमने देखा है कि पीतल के इथेन पोत के भीतरी किनारे के चारों ओर ठोस इथेन की 2-3 मिमी की अंगूठी की उपस्थिति यह सुनिश्चित करती है कि तरल इथेन का तापमान नमूना विट्रीफिकेशन (चित्रा 2) के लिए इष्टतम है। दरअसल, प्रत्येक ग्रिड को जमे हुए होने के बाद, हम एथेन की गुणवत्ता की निगरानी करते हैं और मामूली समायोजन करते हैं - पोत को थोड़ा गर्म करते हैं यदि बहुत अधिक एथेन ने एथेन को ठोस या ठंडा कर दिया है यदि सिस्टम गर्म हो गया है - जैसा कि आवश्यक हो। हमने पाया है कि कमरे के तापमान चिमटी का किनारा ठोस इथेन को तरल बनाने के लिए पर्याप्त है, जबकि 1-5 मिनट के लिए फोम ढक्कन के साथ देवर को कवर करना एथेन को ठंडा करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त समय है। महत्वपूर्ण रूप से, हम ग्रिड सतह (यानी, प्लाज्मा सफाई) तैयार करने और ग्रिड पर नमूने को लागू करने से पहले इन समायोजनों को करते हैं क्योंकि यह ग्रिड तैयारी के लिए एक और चर पेश कर सकता है जो पुनरुत्पादक नहीं है।

अंत में, हम एक मानकीकृत धब्बा-और-डुबकी दिनचर्या विकसित करने की सलाह देते हैं - नमूना आवेदन, नमूना ब्लोटिंग, और ब्लोटिंग समय - ग्रिड-टू-ग्रिड पुनरुत्पादन को बढ़ाने के लिए। EM ग्रिड की ओर ब्लोटिंग पेपर को मोड़ना ग्रिड के साथ पेपर के समान संपर्क के लिए अनुमति देता है और पूरे ग्रिड में अधिक सुसंगत बर्फ की मोटाई पैदा करता है, जिसके परिणामस्वरूप ग्रिड छेद (चित्रा 3 ए और चित्रा बी, क्रमशः) के भीतर भी कण वितरण होता है। ब्लोटिंग की यह विधि रोबोटिक ब्लोटिंग उपकरणों के विपरीत है जो नमूने के साथ एक कोण पर बातचीत करते हैं जिसके परिणामस्वरूप ग्रिड में बर्फ की मोटाई का ढाल हो सकता है। इसके अलावा, ब्लोटिंग पेपर का यह झुकाव भी उपयोगकर्ता द्वारा लागू किए जा रहे बल को बफर करके ब्लोटिंग पेपर के संपर्क पर ईएम ग्रिड को नुकसान पहुंचाने की संभावना को कम करता है। वांछित ब्लोटिंग समय के बाद, मैन्युअल प्लंजिंग आर्म की रिहाई पर ग्रिड को नुकसान को रोकने के लिए प्लंजिंग से पहले ग्रिड की सतह से दूर ब्लोटिंग पेपर को तेजी से स्थानांतरित करने के लिए एक स्नैपिंग गति का प्रदर्शन करके ब्लॉटिंग पेपर को जल्दी से सीधा करें। हमने इस ब्लोटिंग विधि और ब्लोटिंग पेपर की तड़कने की गति को पाया है, जब पैर पेडल के माध्यम से मैनुअल प्लंजिंग आर्म की एक साथ रिलीज के साथ समय बद्ध किया जाता है, तो विट्रीफिकेशन से पहले पतली फिल्म के वाष्पीकरण को सीमित करता है और ग्रिड-टू-ग्रिड पुनरुत्पादन को बढ़ाता है।

यहां वर्णित मैनुअल धब्बा-और-डुबकी विधि एक मजबूत और विश्वसनीय विधि है जो उभरती हुई प्रयोगशालाओं पर कुछ वित्तीय बोझ क्रायोईएम को कम करने में मदद करती है। जबकि यह विधि पुनरुत्पादन योग्य है, क्रायोईएम के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाली विट्रियस बर्फ बनाना व्यक्तिगत शोधकर्ता के अनुभव और कौशल पर निर्भर करता है। हालांकि रोबोट प्लंजर और अन्य उभरती प्रौद्योगिकियां ठंड की प्रक्रिया के कई पहलुओं को स्वचालित करती हैं, वे आम तौर पर सीमित होते हैं कि वे शोधकर्ताओं को कितना नियंत्रण प्रदान करते हैं और अक्सर खरीदने और संचालित करने के लिए उच्च कीमत लेते हैं। इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधि के साथ, शोधकर्ता एक किफायती और बहुमुखी ईएम ग्रिड तैयारी मंच का उपयोग करने में सक्षम होंगे जो नमूना प्रकारों और विशेषताओं के आधार पर प्लंजिंग स्थितियों (यानी, ब्लोटिंग पेपर प्रकार, ब्लोटिंग कोण, ब्लोटिंग अवधि, ब्लोटिंग दिशाओं, आदि) को अनुकूलित करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि और वीडियो सामग्री पर गंभीर रूप से सोचने और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए हर्ज़िक लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। M.A.H.Jr. NIH R35 GM138206 द्वारा समर्थित है और एक Searle विद्वान के रूप में। H.P.M.N आणविक बायोफिज़िक्स प्रशिक्षण अनुदान (NIH T32 GM008326) द्वारा समर्थित है। हम स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट में बिल एंडरसन, चार्ल्स बोमन और डॉ गैब्रियल लैंडर को वीडियो में दिखाए गए मैनुअल प्लंजर को डिजाइन करने, इकट्ठा करने और परीक्षण करने में मदद करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 slot grid storage box Ted Pella 160-40
14 gauge flat metal dispensing tip Amazon B07M7YWWLT
22x22 mm square glass coverslip Sigma C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids Fisher 08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747F
250 mL beaker Fisher 02-555-25B
Blue styrofoam dewar Spear Lab FD-500
Brass ethane vessel Lasco 17-4075
Clamping tweezers Ted Pella 38825
Delicate task wipes Fisher 06-666
Dual-stage regulator with control valve Airgas Y12N245D580-AG
Dewer grid base UCSD
Ethane platform UCSD
Ethane propane tank Praxair ET PR50ZU-G ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank Praxair UN1035 ethane (100%)
Flexible arm task light Amscope LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q325AR1.3
Humidifier Target 719438
Hygrometer ThermoPro B01H1R0K68
Lab coat UCSD
Liquid Nitrogen dewar Worthington LD4
Liquid Nitrogen gloves Fisher 19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal) UCSD
Mark 5 (plunging platform) UCSD
Nitrile gloves VWR 82026-424
P20 pipette Eppendorf 13-690-029
PCR tubes Eppendorf E0030124286
Pipette tips ibis scientific 63300005
Ring lamp Amazon B07HMR4H8G
Safety glasses UCSD
Scissors Amazon Fiskars 01-004761J
Screw driver Ironside 354711
Tape Fisher 15-901-10R
Tweezer to transfer grid box Amazon LTS-3
Tygon tubing Fisher 14-171-130
Whatman blotting paper Fisher 1001-090

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Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, Jr., M. A. Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e62765, doi:10.3791/62765 (2022).

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