Summary
Detta manuskript beskriver blot-and-plunge-metoden för att manuellt frysa biologiska exemplar för enpartikel kryogen elektronmikroskopi.
Abstract
Att avbilda biologiska prover med elektroner för högupplöst strukturbestämning av enstaka kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) kräver ett tunt lager glasaktig is som innehåller de biomolekyler av intresse. Trots många tekniska framsteg under de senaste åren som har drivit enpartikel cryoEM till framkanten av strukturell biologi, är de metoder genom vilka exemplar vitrifieras för högupplöst avbildning ofta det hastighetsbegränsande steget. Även om många nya ansträngningar har gett medel för att övervinna hinder som ofta påträffas under provvitrifiering, inklusive utvecklingen av nya provstöd och innovativ vitrifikation instrumentering, är den traditionella manuellt drivna kolven fortfarande en häftklammer i cryoEM-samhället på grund av den låga kostnaden för inköp och användarvänlighet. Här tillhandahåller vi detaljerade metoder för att använda en standard, giljotin-stil manuellt manövrerad blot-and-plunge enhet för vitrifikation av biologiska exemplar för högupplöst avbildning av en partikel cryoEM. Dessutom beskrivs ofta påträffade problem och felsökningsrekommendationer för när en standardpreparat inte ger ett lämpligt prov också.
Introduction
Enpartikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) är en kraftfull strukturell teknik som kan användas för att lösa strukturer av dynamiska biologiska exemplar till nära atomupplösning1,2,3,4. De senaste framstegen inom direkt elektrondetektorteknik4,5,6,7,8,9,10, förbättringar av elektronkällor4,11,12,13,14 och elektromagnetisk linsstabilitet15, i kombination med den fortsatta utvecklingen av datainsamling 16,17 och analysprogrampaket18,19, har gjort det möjligt för forskare att nu rutinmässigt bestämma strukturer av väluppfostrade exemplar till 3 Å-upplösning eller bättre4,11,13,14,20,21,22 23 . Trots dessa förbättrade bild- och databehandlingsfunktioner är kryoEM-nätberedning fortfarande det största hindret för framgångsrik högupplöst strukturbestämning och fungerar ofta som en betydande flaskhals i EM-arbetsflödet24,25,26,27.
CryoEM förlitar sig på avbildning av biologiska prover i vattenlösningar som fryses för att bilda en tunn film av "glasliknande" is - en process som kallas vitrifikation - som bevarar det inhemska biokemiska tillståndet. Vitrifikation av biologiska prover för cryoEM går tillbaka över 40 år28,29,30 och många tekniker och utrustning som har utvecklats för denna process förlitar sig på den ursprungligen detaljerade blot-and-plunge-metoden31,32,33,34,35 , varigenom en liten mängd prov (t.ex. 1-5 μL) appliceras på ett specialiserat EM-nät innan överskottslösningen avlägsnas med hjälp av fysisk interaktion mellan gallret och blottingpapper. Tidpunkten för denna process bestäms vanligtvis empiriskt för varje prov eftersom en kritisk komponent i frysprover är tjockleken på glaskroppens isfilm - om isen är för tjock försämras bildkvaliteten dramatiskt på grund av ökad spridning av elektronstrålen medan is som är för tunn kan begränsa proteinorienteringen och / eller utesluta partiklar från mitten av rutnätsfoliehålen36 . Detta beroende av den perfekta istjockleken för enpartikel cryoEM har lett till ett brett utbud av tekniker och utrustning som kan frysa prover, inklusive robotteknik37,38, mikrofluidik42 och ultraljuds- eller sprutanordningar27,39,40,41,42,43,44 . Under de senaste åren förlitar sig några av de mest populära provberedningsenheterna på användningen av robotteknik för automatiserad frysning av prover med hjälp av blot-and-plunge-tekniken45. Även om dessa enheter är utformade för att reproducerbart skapa korrekt istjocklek för avbildning, förblir de ofta för dyra för enskilda laboratorier att köpa och använda och finns i allmänhet i kryoEM-anläggningar till timpriser för användning. Under de senaste åren har den ursprungliga manuella blot-and-plunge-tekniken kommit tillbaka till ökad användning3,47,48,49,50,51,52. Faktum är att en manuellt manövrerad blot-and-plunge-enhet kan uppnå högkvalitativa kryoEM-nät till en bråkdel av kostnaden för robotmotsvarigheter. Dessutom erbjuder manuell blotting också fler användare kontroll över blotting eftersom forskare kan justera typen av blotting (dvs. back-blotting av gallret, front-blotting av nätet etc.) och blottingtid baserat på varje enskilt prov och forskningsfrågor.
I den här artikeln ger vi information om hur du effektivt fryser biologiska prover med hjälp av en traditionell manuell blot-and-plunge vitrification-enhet i kombination med en specialdesignad dewarplattform53. Bästa praxis, inklusive förberedelse av kryogen, näthantering, provapplikation och blotting, samt vanliga fallgropar och rekommendationer om hur man kan övervinna dessa hinder tillhandahålls. Råd om hur man kan öka istjocklekens reproducerbarhet mellan gallerberedningar och hur man modifierar provutplåning baserat på biologisk provtyp diskuteras. Med tanke på den låga kostnaden i samband med inköp och drift av den manuella kolven som beskrivs i detta manuskript, kan laboratorier över hela världen förbereda biologiska exemplar för cryoEM på ett kostnadseffektivt och reproducerbart sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered den manuella plungningsmiljön
OBS: Beräknad driftstid: 5-30 minuter
- Placera den manuella kolven i ett 4 °C kylrum där en luftfuktare kan samplaceras för att hålla rummet nära 100% relativ luftfuktighet (RH) (figur 1A).
VARNING: Rådgör med institutionens riktlinjer för miljöhälsa och miljösäkerhet för säker placering av den manuella kolven och rekommenderad drift. - Innan gallerberedningen, slå på luftfuktaren i kylrummet för att säkerställa att kylrummets RH är ≥ 95 %.
OBS: Nätberedning i låg luftfuktighet kan leda till uttorkning av tunna filmer, ändring av buffertkomponenter på grund av avdunstning och en minskning av reproducerbarheten mellan rutnät och rutnät46. Det rekommenderas inte att galler fryses med <80 % RH. - Se till att temperaturen i kylrummet är vid 4 °C.
- Placera den manuella kolven bort från starka luftströmmar (dvs. bort från luftkonditioneringsenhetens ventiler) eftersom de kan leda till turbulens nära galler och/eller framträdande isansamling på kalla ytor.
2. Förbered plungningsmaterial och tillbehör
OBS: Beräknad driftstid: 1-5 minuter
- Använd ren sax för att skära blottingpapperscirklar i 1-1,5 cm breda och ~ 9 cm långa remsor. Undvik att vidröra mitten av blottingpapperet och kassera de mindre ändstyckena. Det är viktigt att se till att blottingpappersremsorna är torra, rena och fria från föroreningar. Separera remsorna och placera dem i en 100 mm Petri-maträtt.
- Placera ett 22x22 mm fyrkantigt glasöverdrag i en separat Petri-skål i 60 mm glas. Denna täckglas Petri-skål kommer att användas för att lagra, överföra och glödurladdningsgaller.
OBS: Vi rekommenderar att du använder en luftdysterburkare för att ta bort synligt skräp från rutschkanan innan du lägger till galler. En antistatisk pistol kan också användas för att avlägsna statisk elektricitet som ackumuleras. - Montera och märka nätlagringslådor.
- Skaffa 4 till 6 rena och torra kläm pincett och placera dem till den manuella kolven. Inspektera varje pincett visuellt före fallande för att säkerställa att de inte är skadade och är fria från föroreningar.
3. Förbered kryogendewar och manuell kolv
OBS: Beräknad driftstid: 5-15 minuter
- Installera plattformsbasen längst ner på den fallande dewar. Placera etankärlsdewar ovanpå plattformsbasen, tillsätt etankärlet i mässing och installera sedan förvaringsplattformen för spinngallret.
- När flytande kväve (LN2) har tillsatts i den fallande dewaren kan höjden på plattformsbasen inte längre justeras. Se till att nätbasen är korrekt installerad och är jämn för att begränsa nät- och/eller pincettskador på grund av felaktig kolvhöjd.
- Kontrollera den manuella kolven och all tillhörande utrustning före frysning för att säkerställa att den fungerar korrekt för att begränsa prov- och/eller nätförlusten.
- Byt ut tejpen på den manuella kolvarmen som används för att hålla fast pincetterna före varje fryssession. Rummets höga luftfuktighet kan försämra tejphäftet och minska tejpens förmåga att hålla pincetterna, vilket ökar sannolikheten för pincettskador och / eller nätförlust.
- Justera lyktorna nära den manuella kolven för att säkerställa att det finns tillräckligt med ljus för att övervaka provtransporter och se till att nätöverföringen lätt visualiseras för att förhindra nätskador och/eller förlust (se steg 3.7). Använd en ringlampa direkt bakom kolven för att visualisera flytande rörelse och ett flexibelt armaktivitetsljus nära dewar för att belysa de frusna gallren.
- Justera fotpedalens spänning för att säkerställa att dewar-plungarmen sitter ordentligt på plats när den är i upphöjt läge och är helt frisläppt när pedalen är nedtryckt. Utför flera "torra" körningar före provapplikationen för att säkerställa att kolven fungerar korrekt.
OBS: Felaktig justering av fotpedalsspänningen resulterar i att den fallande armen frigörs i förtid (dvs. spänningen är för låg) och nätförlust eller ofullständig fallande galler i etankärlet (dvs. spänningen är för hög). - Placera den fallande dewaren vid basen av den manuella kolven direkt under den fallande armen och fäst den på plats. Fäst ett par pincett på den fallande armen med hjälp av det bifogade bandet. Medan du håller i den manuella fallande armen trycker du ned fotpedalen för att försiktigt sänka den fallande armen och justera den fallande armens färd för att säkerställa att gallret kommer att lokaliseras i mitten av etankärlet.
- Använd stötstoppet högst upp på den fallande armen för att bestämma den slutliga positionen för den fallande armen när fotpedalen är helt nedtryckt (bild 1B). Justera stötstoppshöjden på den fallande armen för att justera gallrets placering i etankärlet (figur 1C).
OBS: Felaktig inställning av den fallande armhöjden kan leda till att gallret och/eller pincettskadorna (t.ex. att armhöjden är för låg) eller otillräcklig vitrifikation (t.ex. att armhöjden är för hög). - Lokalisera avwar utanför kylrummet och fortsätt med att förbereda flytande etan (steg 4).
4. Förbered kryogenen
OBS: Beräknad driftstid: 10-30 minuter
- Utvärdera etantanken, regulatorn, slangen och etandispenseringsspetsen för eventuella tecken på skador. Rapportera omedelbart och korrigera eventuella tecken på skada innan du fortsätter.
VARNING: Komprimerad etan och etan: propangasblandningar är brandfarliga och kan utgöra ett allvarligt hot mot liv och/eller leda till skador om de hanteras felaktigt. Kontakta en expert om du är osäker på hur komprimerade gastankar ska användas eller hanteras. Se institutionens riktlinjer för miljöhälsa och miljösäkerhet vid hantering av brandfarliga komprimerade gaser. Dessutom är flytande etan en kraftfull kryogen som kan utgöra ett allvarligt hot mot liv och/eller skada om den inte hanteras korrekt. Se institutionens riktlinjer för miljöhälsa och miljösäkerhet vid hantering av kryogener. - Skaffa tillräckligt med LN2 i en lämplig LN2-hanteringsdewar (dvs. 3-4 L är typisk för nätberedning och lagring).
VARNING: LN2 är en kryogen som kan utgöra ett allvarligt hot mot liv och/eller skada om den inte hanteras på rätt sätt.- Se till att all personlig skyddsutrustning används för att minimera risken för skador. Ångan från LN2 är kvävande och bör hanteras i välventilerade områden. Kontakta en expert om du är osäker på hur man använder eller hanterar kryogena kärl och kryogener. Se institutionens riktlinjer för miljöhälsa och miljösäkerhet vid hantering av kryogener. För situationer där flytande kväve inte kan användas i ett kallt rum rekommenderar vi dykfrysning i ett svalt och välventilerat utrymme.
- Utanför kylrummet, kyl ner den fallande dewar genom att hälla LN2 direkt i mässingsettankärlet tills den flytande kvävenivån når toppen av etankärlet (dvs. strax ovanför plattformen). Toppa LN2 utanför etankärlet efter behov. Fortsätt till nästa steg när LN2 slutar bubbla våldsamt (cirka 5 minuter).
- Tillsätt LN2 direkt till forensatkärlet för att kyla kärlet tillräckligt innan etangas kondenseras. Underlåtenhet att kyla ut etankärlet i mässing kommer dramatiskt att öka den tid det tar att kondensera etan.
- När dewar har nått LN2 temperatur, undvik att överfylla dewar så att LN2 spiller in i etankärlet.
- Ethane kommer som en komprimerad gas och måste kondenseras för användning. Etantanken använder en hög renhetsregulator med dubbla steg för att styra gasflödet. Anslut slangen till regulatorns utloppsventil och använd en 14-gauge platt metalldispenseringsspets ansluten i slutet för dispensering av etan.
- Innan du öppnar etans huvudtankventil, se till att tryckjusteringsratten och utloppsventilen är stängda hela vägen. Öppna huvudtankventilen helt och öppna sedan utloppsventilen till ~50%. Öppna långsamt tryckjusteringsratten tills ett långsamt gasflöde observeras. Använd utloppsventilen för att finjustera gasflödet.
VARNING: Rikta alltid bort metalldispenseringsspetsen från mig själv när du öppnar ventiler eller gör gasflödesjusteringar. - Starta långsamt gasflödet och utvärdera flödet genom att föra in spetsen på etangasledningen i en liten bägare av avjoniserat vatten. Justera gasflödet tills flödet stör vattnet måttligt .
- Justera gasflödet för att säkerställa att korrekt etankondensering inträffar - för långsamt av ett flöde kommer att orsaka att etangasen stelnar i dispenseringsspetsen och för snabbt av ett flöde kommer att resultera i intensiv bubblande och förhindra frysning.
- Innan du för in etangasledningens spets i etankärlet i mässing, rengör och torka av dispenseringsspetsen med känsliga uppgiftsservetter för att avlägsna eventuellt vatten.
- I en jämn och snabb rörelse, lokalisera gasdispenseringsspetsen längst ner på mässingsettankärlet och börja flytta dispenseringsspetsen i en långsam cirkel runt botten av etankärlet. Fast etan bildas omedelbart men kondenseras snabbt när mer etangas tillsätts/kondenseras.
- Fortsätt att flytta metallettans dispenseringsspets runt på botten av etankärlet för att kondensera den fasta etan. Fyll etankärlet till 3/4 fullt av flytande etan (2-3 trådar uppifrån). Stoppa etangasflödet genom att försiktigt ta bort dispensspetsen för metallettan från etankärlet i mässing och stänga utloppsventilen.
- Toppa den fallande dewaren med LN2 hälla försiktigt på sidan av dewar för att undvika LN2-tillägg till mässingsetankärlet, tills vätskenivån bara berör mässingens etankärl. Placera skumlocket på den fallande dewar för att underlätta etan stelning.
- LN2 måste direkt kontakta urtankärlet för att underlätta stelningen av etan. Efter cirka 5 minuter blir etan i mässingskärlet helt frusen fast. Tillsätt mer LN2 tills det bara rör vid etankärlet och fortsätt till nästa steg.
- Om etan inte har frusit fast, är etankärlet i mässing inte tillräckligt kallt för de återstående stegen. Tillsätt mer LN2 tills den bara vidrör etankärlet och vänta ytterligare 5 minuter. Se till att etan i mässingskärlet är helt frusen fast.
- Öppna gasutloppsventilen för att producera ett etangasflöde i en liknande takt som fastställs i steg 4.6. Placera metallettans dispenseringsspets vertikalt i den fasta etanen och fortsätt att flytta etandispenseringsspetsen i en cirkulär rörelse för att smälta den fasta etan.
- Fortsätt att tillsätta etan tills den är i nivå med toppen av etankärlet i mässing. Ta långsamt bort spetsen från etankärlet och stäng etantankens utloppsventil. Täck dewar med locket i ~1-4 minuter(s) för att låta etan stelna runt kanterna på mässingsettankärlet.
OBS: Ett idealiskt etankärl kommer att ha en 2-3 mm symmetrisk ring av fast etan vid omkretsen av det stora etankärlet med flytande etan i mitten (figur 1D och figur 2). - Se till att etan är så kall som möjligt utan stelning för att säkerställa korrekt vitrifiering av det biologiska provet. Underlåtenhet att förbereda den flytande etan på rätt sätt kan leda till otillräcklig vitrifikation av provexemplaret, isansamling och/eller förlust av prov, som var och en bidrar till försämringen av provkvaliteten för avbildning.
- Om en solid ring av etan inte bildas efter 2-3 minuter, tillsätt mer LN2 till dewar och täck i 2-5 minuter till.
- Om etan stelnar för snabbt, använd sedan ett stort par rena pincett för att försiktigt värma etankärlet och/eller fast etan för att förhindra fullständig etan stelning. När etan och LN2 är stabila stänger du alla etantankventiler och lokaliserar den fallande dewaren till den manuella kolven. Fäst den fallande dewaren på den manuella kolven.
VARNING: Var extra försiktig när du överför dewar eftersom LN2 kan spilla in i etankärlet och stelna den flytande etanen. Vid behov kan en ren uppsättning pincett användas för att smälta fast etan i mitten av kärlet.
- Fortsätt att tillsätta etan tills den är i nivå med toppen av etankärlet i mässing. Ta långsamt bort spetsen från etankärlet och stäng etantankens utloppsventil. Täck dewar med locket i ~1-4 minuter(s) för att låta etan stelna runt kanterna på mässingsettankärlet.
- Testa platsen för etankrigstiden med ett par tomma pincett för att säkerställa att pincettspetsen finns i mitten av etankärlet och att det finns tillräckligt med utrymme för gallret och pincettspetsen inuti den flytande etan (figur 1D).
- Om den fasta etanringen är för tjock för enkel näthantering, använd sedan ett par rumstemperatur, rengör pincett för att smälta den fasta etan och skapa mer frysområde i mitten av etankärlet.
5. Förbered EM-galler
OBS: Beräknad driftstid: 1-5 minuter
- Lägg till nätförvaringsboxen(es) i dewar, skruva av gallerförvaringsboxlocken och se till att varje lock fritt kan rotera till ett nytt gallerfack.
- Överför försiktigt galler från gallerförvaringslådan till kanten av det fyrkantiga glasöverdraget med ~ 30-40% av gallret från glidkanten. Se till att gallerfolien är vänd uppåt. Se till att galler är täckta när de inte används. Att placera gallren över kanten av det fyrkantiga glasöverdraget ger enkel hantering av galler och minskar risken för böjning eller skada gallret under överföringen.
OBS: 4-6 rutnät förbereds vanligtvis åt gången. - Rendera galler hydrofila med hjälp av en glödurladdning eller plasmarengörare.
OBS: Se de rekommenderade riktlinjerna för nätrengöring från tillverkaren av glödurladdning/plasmarengörare.- Använd gallret inom 10 minuter efter plasmarengöring eftersom gallren förlorar hydrofilicitet och reo reproducerbarheten från rutnät till rutnät minskar efter denna tid.
6. Förbered kryoEM-prov genom dykfrysning
OBS: Beräknad driftstid: >10 minuter (~1-3 min per rutnät)
- Använd en ren och torr klämpläspett för att plocka upp ett rengjort galler, skjut ner plastklämman för att fixera gallret på plats och knacka försiktigt på pincetterna för att säkerställa att gallret är ordentligt fastsatt.
- Hantera galler vid den yttre ringen för att förhindra skador på gallerfolien.
- Applicera 1–5 μL prov på den beredda sidan (t.ex. framsidan eller foliesidan) av gallret.
OBS: Den optimala volymen och blottingtiden beror på provet och måste optimeras för varje prov; större volymer och mer trögflytande prover kräver längre blottingtider. - Fäst pincett-galler-provenheten på den manuella fallande armen genom att linda tejp runt pincetthandtaget.
- Vänd provet mot användaren för traditionell främre blotting. Om provet kräver bakåt blotting, leta upp exemplet bort från användaren.
- Håll en ren, torr, skuren bit blottingpapper mellan tummen och pekfingret på varje hand.
- Hantera endast blottingpapperen från kanterna och rör aldrig mitten eftersom oljor och andra föroreningar från händer / handskar kan ändra gallerkvaliteten.
- Vila händerna på kanten av den fallande dewar för att etablera en stabil position. Placera blottingpapperet parallellt med gallerytan ca 1 cm från gallerytan.
- Använd den mellersta delen av blottingpapperet för att möjliggöra fullständig vätskerörlighet och till och med vetning över gallerytan.
- Skjut försiktigt och rotera tummen och ringfingrarna mot varandra för att böja blottpapper mot gallret för att initiera blotting. Håll kontakten mellan blottingpapperet och gallerytan under hela blottningsprocessen.
- Kontakta blottingpapperet direkt till gallerytan och håll konsekvent kontakt över gallerytan.
- Om du försiktigt böjer blottingpapperet minskar gallrets böjning och/eller skador på gallerytan och resulterar i mer konsekvent is över gallret (figur 3A).
- Observera den mobila vätskefronten och när den slutar gå in i blottingpapperet börja räkna i 4 till 6 sekunder.
OBS: Räkning kan ske när blottingpapperet kommer i kontakt med rutnätsytan, men lägre reproducerbarhet mellan rutnät och rutnät kan uppstå. Den totala fläcktiden beror på rutnätstyp, folietyp, provkoncentration och provtyp (t.ex. lösligt kontra membran kontra filamentösa proteiner). För mer trögflytade prover krävs längre blottider (t.ex. 5 till 7 sekunder).- Viktigt: Utveckla ett tillförlitligt och konsekvent räkneschema för att avsevärt förbättra reproducerbarheten under frysningsprocessen.
- Flytta vänster, höger tumme och pekfingrar i motsatta riktningar för att ta bort blottingpapperet i en "knäpprörelse" bort från rutnätsytan. Tryck omedelbart ned fotpedalen för att släppa den fallande armen och doppa gallret i flytande etan.
- Ta samtidigt bort blottingpapperet och tryck på fotpedalen för att kasta gallret i etan så snart som möjligt för bästa frysresultat. Ju längre tiden mellan borttagning av papper och fallande, desto mer avdunstning av tunna filmer kommer att inträffa och minska reproducerbarheten mellan rutnät och rutnät.
- Använd en hand för att stabilisera klämpläskarna, varva ner tejpen försiktigt från runt pincetterna och den manuella fallande armen.
- Håll alltid kontakt med pincetten för att förhindra att pincettnätet rör sig och begränsa nätskador som uppstår från att slå gallret mot den fasta etan.
- När klämpläpparna är fria från den manuella fallande armen, håll pincetten i ena handen vilande ovanpå den fallande dewar, se till att gallret förblir i den flytande etan. Skjut försiktigt bort plastklämman från gallret så att gallret kan överföras. Håll trycket på pincetterna för att behålla gallret.
- Med en snabb rörelse överför du snabbt gallret från etankärlet till LN2-behållaren . Placera försiktigt gallret i nätförvaringslådan.
OBS: Viss etan kan stelna på gallerytan. Om du öppnar pincetten något bryts etan och gallret kan släppas ner i gallerboxen.
- Med en snabb rörelse överför du snabbt gallret från etankärlet till LN2-behållaren . Placera försiktigt gallret i nätförvaringslådan.
- Linda spetsen på pincetterna i en delikat uppgiftsservett för att förhindra frostackumulering. Ställ åt sidan tills pincetterna har återgått till rumstemperatur.
- Ha 4 till 6 pincett till hands för enkel användning. Varje pincett kommer att användas för provfrysning och uppvärmning före efterföljande användning.
- Upprepa steg 6.1-6.11 för varje rutnät.
- När frysningen har kulminerat stänger du nätboxen säkert och överför till en korrekt lagringsplats.
- Kassera försiktigt den flytande etanen och LN2 och förvara allt material på en torr plats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett framgångsrikt genomförande av det blot-and-plunge-protokoll som beskrivs här kommer att resultera i ett tunt, enhetligt lager av glasaktig is som är fritt från sexkantig is, föroreningar och stora gradienter av oanvändbar is som kan observeras under elektronmikroskopet (figur 3). Inkonsekvent kontakt mellan blottingpapperet med gallerytan, tidig borttagning av blottningspapperet eller förflyttning av blottningspapperet vid nätkontakt kan minska glaskroppens kvalitet och leda till inkonsekvent istjocklek över EM-gallret (figur 4)
Bild 1: Provplungningsrum och nödvändig utrustning. A) Iscensatt kylrum för manuell frysning av biologiska exemplar med hjälp av en traditionell fläck-och-doppanordning som beskrivs i den här artikeln. Nödvändig utrustning visas och märks i enlighet därmed. B) För att justera arbetshöjden på den manuella kolven, justera stötstoppet genom att skjuta det upp och ner i den manuella fallande armen och säkra den genom att dra åt skruven. C) Inzoomad vy över etankärlet och förvaringsplattformen för spinngaller för att indikera korrekt höjd och placering av spänn pincetterna och gallret inuti det tomma etankärlet i mässing. Pincetterna och gallret får inte komma i kontakt med sidorna eller botten av mässingsettan för att undvika skador. D) Korrekt höjd och placering av spänn pincetterna och gallret i flytande etan. Pincetterna och gallret ska komma in i den flytande etan i mitten och undvika kontakt med den fasta etan vid omkretsen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Beredd flytande etan. Inzoomad vy över den fallande dewar som visar tillståndet för flytande etan i mässingsettankärlet före provfrysning. Den 2-3 mm ring av fast etan i mässingsete kärlet är tydligt synlig. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Representativa apoferritinbilder som erhållits med hjälp av den manuella blot-and-plunge-tekniken. (A) Representativ atlas för ett kryoEM-rutnät som visar istjockleken och kvaliteten på rutnätsrutor som kan erhållas med hjälp av den manuella blot-and-plunge-tekniken. (B) Rörelsekorrigerad mikrograf av vitrifierad musapferritin förvärvad med hjälp av ett 200 kV transmissionselektronmikroskop utrustat med en direkt elektrondetektor vid University of California, San Diegos CryoEM-anläggning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Representativ atlas över ett suboptimalt kryoEM-rutnät som visar inkonsekvent istjocklek över gallret, många trasiga rutor och områden där isen är för tjock för att avbilda exemplaret. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitrifikation av biologiska exemplar för avbildning av en partikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) är fortfarande ett kritiskt viktigt steg för framgångsrik strukturbestämning. Den manuella blot-and-plunge-metoden som beskrivs i detta protokoll representerar en kostnadseffektiv, tillförlitlig och robust metod för att snabbt frysa biologiska prover i tunna filmer av glaskroppsis för cryoEM-avbildning. Med hjälp av de metoder som beskrivs i manuskriptet kommer forskare att kunna montera och använda den manuella kolven, förbereda kryogen som är lämplig för blixtfrysande biologiska prover och manuellt blot-and-plunge EM-galler som innehåller biologiska prover. Även om denna metod är ganska robust, bör försiktighet iakttas under kritiska steg i denna procedur för att få optimal istjocklek och kvalitet för högupplöst avbildning. Vi har beskrivit flera av dessa kritiska steg nedan och ger rekommendationer om hur du felsöker dessa steg.
Det är absolut nödvändigt att placera den manuella plungarmen ordentligt för att säkerställa att gallret lokaliserar i mitten av den flytande etanen i mässingskärlet efter fallande. Felaktig höjd eller position på den fallande armen och/eller om du inte säkrar pincetterna ordentligt kommer det att leda till skador på spänn pincetterna, EM-gallret och eventuellt den manuella kolven. Som diskuterats ovan utför vi alltid minst en provkörning innan vi förbereder biologiska prover för att verifiera att EM-nätet kommer att lokalisera till mitten av mässingsettankärlet efter framgångsrik fallande (figur 1C). Dessutom gör vi också mindre justeringar av platsen för den fallande dewar efter varje gallerfrysning för att finjustera nätplaceringen i etankärlet (figur 1D).
Korrekt förberedelse av etan cryogen är avgörande för att få tunna filmer av biologiska exemplar i glaskroppsis. Vi har observerat att närvaron av en 2-3 mm ring av fast etan runt den inre kanten av det stora etankärlet säkerställer att temperaturen på den flytande etan är optimal för provvitrifiering (figur 2). När varje galler har frusits övervakar vi faktiskt etans kvalitet och gör mindre justeringar - vilket värmer kärlet något om för mycket etan har stelnat eller kyler etan om systemet har värmts upp - efter behov. Vi har funnit att kanten på en rumstemperatur pincett är tillräcklig för att kondensera fast etan medan du täcker dewar med skumlocket i 1-5 min är tillräckligt med tid för att låta etan svalna. Viktigt är att vi gör dessa justeringar innan vi förbereder gallerytan (dvs. plasmarengöring) och applicerar provet på gallret eftersom detta kan introducera en annan variabel till gallerberedning som inte är reproducerbar.
Slutligen rekommenderar vi att du utvecklar en standardiserad blot-and-plunge-rutin - provapplikation, prov blottning och blottningstid - för att öka reproducerbarheten mellan rutnät och rutnät. Böjning av blottingpapperet mot EM-gallret möjliggör enhetlig kontakt med papperet med gallret och ger mer konsekvent istjocklek över hela gallret, vilket resulterar i jämn partikelfördelning i gallerhålen (figur 3A respektive figur B). Denna blottingmetod står i kontrast till robotiska blottinganordningar som interagerar med provet i en vinkel som kan resultera i en lutning av istjocklek över gallret. Dessutom minskar denna böjning av blottingpapperet också risken för att skada EM-nätet vid kontakt med blottingpapperet genom att buffra den kraft som användaren applicerar. Efter önskad blottningstid, räta snabbt ut blottingpapperet genom att utföra en snappande rörelse för att snabbt flytta blottingpapperet bort från gallerytan innan du dyker för att förhindra skador på gallret vid frisättning av den manuella plungarmen. Vi har hittat denna blottingmetod och blottingpapperets snappande rörelse, när den tidsbetals med samtidig frisättning av den manuella plungarmen via fotpedalen, begränsar avdunstningen av den tunna filmen före vitrifikation och ökar relikbarheten mellan rutnät och rutnät.
Den manuella blot-and-plunge-metoden som beskrivs här är en robust och pålitlig metod som hjälper till att minska en del av den ekonomiska börda cryoEM kan lägga på framväxande laboratorier. Även om denna metod är reproducerbar, bygger skapandet av högkvalitativ glasaktig is som är lämplig för cryoEM på den enskilda forskarens erfarenhet och skicklighet. Även om robotkolvar och annan ny teknik automatiserar flera aspekter av frysningsprocessen, begränsas de i allmänhet av hur mycket kontroll de erbjuder forskare och ofta ådrar sig ett högt pris för att köpa och driva. Med den metod som beskrivs i detta protokoll kommer forskare att kunna använda en prisvärd och mångsidig EM-nätberedningsplattform som erbjuder flexibilitet för att optimera de fallande förhållandena (dvs. blottingpapperstyper, blottingvinkel, blotting varaktigheter, blotting riktningar, etc.) baserat på provtyper och egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Herzik-labbmedlemmarna för kritiskt tänkande och feedback på detta manuskript och videoinnehållet. M.A.H.Jr. stöds av NIH R35 GM138206 och som Searle Scholar. H.P.M.N stöds av Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vi vill också tacka Bill Anderson, Charles Bowman och Dr. Gabriel Lander vid Scripps Research Institute för hjälp med att designa, montera och testa den manuella kolven som visas i videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al.
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G.
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H.
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).
