Summary
Questo manoscritto delinea il metodo blot-and-plunge per congelare manualmente i campioni biologici per la microscopia elettronica criogenica a singola particella.
Abstract
L'imaging di campioni biologici con elettroni per la determinazione della struttura ad alta risoluzione mediante microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) richiede un sottile strato di ghiaccio vitreo contenente le biomolecole di interesse. Nonostante i numerosi progressi tecnologici degli ultimi anni che hanno spinto il crioEM a singola particella in prima linea nella biologia strutturale, i metodi con cui i campioni vengono vetrificati per l'imaging ad alta risoluzione spesso rimangono il passo limitante della velocità. Sebbene numerosi sforzi recenti abbiano fornito i mezzi per superare gli ostacoli frequentemente incontrati durante la vetrificazione dei campioni, tra cui lo sviluppo di nuovi supporti per campioni e un'innovativa strumentazione di vitrificazione, il tradizionale stantuffo ad azionamento manuale rimane un punto fermo nella comunità crioEM a causa del basso costo di acquisto e della facilità d'uso. Qui, forniamo metodi dettagliati per l'utilizzo di un dispositivo blot-and-plunge standard a ghigliottina azionato manualmente per la vitrificazione di campioni biologici per l'imaging ad alta risoluzione mediante crioEM a singola particella. Inoltre, vengono descritti anche i problemi comunemente riscontrati e le raccomandazioni per la risoluzione dei problemi per quando una preparazione standard non riesce a produrre un campione adatto.
Introduction
La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) è una potente tecnica strutturale che può essere utilizzata per risolvere strutture di campioni biologici dinamici a risoluzione quasi atomica1,2,3,4. In effetti, i recenti progressi nelle tecnologie dei rivelatori di elettroni diretti4,5,6,7,8,9,10, i miglioramenti nelle sorgenti di elettroni4,11,12,13,14 e la stabilità delle lenti elettromagnetiche15, insieme al continuo sviluppo dell'acquisizione dei dati 16,17 e pacchetti software di analisi18,19, hanno permesso ai ricercatori di determinare ora di routine strutture di campioni ben educati con risoluzione 3 Å o superiore4,11,13,14,20,21,22,23 . Nonostante queste migliorate capacità di imaging ed elaborazione dei dati, la preparazione della griglia crioEM rimane il principale ostacolo per una determinazione efficace della struttura ad alta risoluzione e spesso funge da collo di bottiglia considerevole nel flusso di lavoro EM24,25,26,27.
CryoEM si basa sull'imaging di campioni biologici in soluzioni acquose che vengono congelate per formare un sottile film di ghiaccio "simile al vetro" - un processo noto come vetrificazione - che preserva lo stato biochimico nativo. La vitrificazione di campioni biologici per crioEM risale a oltre 40 anni28,29,30 e molte tecniche e attrezzature che sono state sviluppate per questo processo si basano sul metodo blot-and-plunge originariamente dettagliato31,32,33,34,35 , per cui un piccolo volume di campione (ad esempio, 1-5 μL) viene applicato a una griglia EM specializzata prima che la soluzione in eccesso venga rimossa utilizzando l'interazione fisica della griglia con la carta assorbente. La tempistica di questo processo è solitamente determinata empiricamente per ciascun campione poiché un componente critico dei campioni di congelamento è lo spessore del film di ghiaccio vitreo - se il ghiaccio è troppo spesso, la qualità dell'immagine si deteriora drammaticamente a causa dell'aumento della dispersione del fascio di elettroni mentre il ghiaccio troppo sottile può limitare gli orientamenti proteici e / o escludere particelle dal centro dei fori della lamina della griglia36 . Questa dipendenza dallo spessore di ghiaccio perfetto per il crioEM a singola particella ha portato a una vasta gamma di tecniche e apparecchiature in grado di congelare i campioni, tra cui robotica37,38, microfluidica42 e dispositivi ad ultrasuoni o a spruzzo27,39,40,41,42,43,44 . Negli ultimi anni, alcuni dei più diffusi dispositivi di preparazione dei campioni si affidano all'uso della robotica per il congelamento automatizzato dei campioni utilizzando la tecnica blot-and-plunge45. Mentre questi dispositivi sono progettati per creare in modo riproducibile uno spessore di ghiaccio adeguato per l'imaging, spesso rimangono troppo costosi per i singoli laboratori da acquistare e gestire e si trovano generalmente all'interno di strutture crioEM a tariffe orarie per l'uso. Negli ultimi anni, l'originale tecnica manuale blot-and-plunge è tornata in uso3,47,48,49,50,51,52. In effetti, un dispositivo blot-and-plunge azionato manualmente può ottenere griglie crioEM di alta qualità a una frazione del costo delle controparti robotiche. Inoltre, il blotting manuale offre anche un maggiore controllo degli utenti sul blotting in quanto i ricercatori possono regolare il tipo di blotting (ad esempio, back-blotting della griglia, front-blotting della griglia, ecc.) e il tempo di blotting in base a ogni singolo campione e domande di ricerca.
In questo articolo, forniamo dettagli su come congelare efficacemente i campioni biologici utilizzando un tradizionale dispositivo di vetrificazione manuale blot-and-plunge abbinato a una piattaforma dewar progettata su misura53. Vengono fornite le migliori pratiche, tra cui la preparazione del criogeno, la gestione della griglia, l'applicazione del campione e il blotting, nonché le insidie comuni e le raccomandazioni su come superare questi ostacoli. Vengono discussi consigli su come aumentare la riproducibilità dello spessore del ghiaccio tra i preparati a griglia e su come modificare il blotting del campione in base al tipo di campione biologico. Dato il basso costo associato all'acquisto e al funzionamento dello stantuffo manuale descritto in questo manoscritto, i laboratori di tutto il mondo possono preparare campioni biologici per il crioEM in modo economico e riproducibile.
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Protocol
1. Preparare l'ambiente di immersione manuale
NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 5-30 minuti
- Posizionare lo stantuffo manuale in una cella frigorifera a 4 °C dove un umidificatore può essere co-posizionato per mantenere la stanza vicino al 100% di umidità relativa (RH) (Figura 1A).
ATTENZIONE: Si prega di consultare le linee guida dell'istituzione in materia di salute e sicurezza ambientale per la posizione sicura dello stantuffo manuale e le operazioni raccomandate. - Prima della preparazione della griglia, accendere l'umidificatore nella cella frigorifera per assicurarsi che l'umidità relativa alla cella frigorifera sia ≥ 95%.
NOTA: la preparazione della griglia a bassa umidità può comportare disidratazione di film sottili, alterazione dei componenti tampone a causa dell'evaporazione e una diminuzione della riproducibilità da griglia a griglia46. Non è consigliabile congelare le griglie a <80 % di umidità relativa. - Assicurarsi che la temperatura della cella frigorifera sia a 4 °C.
- Posizionare lo stantuffo manuale lontano da forti correnti d'aria (ad esempio, lontano dalle prese d'aria dell'unità di condizionamento dell'aria) in quanto possono portare a turbolenze vicino alle griglie e / o accumulo di ghiaccio prominente su superfici fredde.
2. Preparare materiali e accessori per immersione
NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 1-5 minuti
- Utilizzare forbici pulite per tagliare i cerchi di carta assorbente in strisce larghe 1-1,5 cm e lunghe ~ 9 cm. Evitare di toccare il centro della carta assorbente e scartare i pezzi finali più piccoli. È importante assicurarsi che le strisce di carta assorbente siano asciutte, pulite e prive di contaminanti. Separare le strisce e metterle in una capsula di Petri da 100 mm.
- Posizionare una copertura di vetro quadrata 22x22 mm in una capsula di Petri di vetro separata da 60 mm. Questa capsula di Petri in vetro contenente coverslip verrà utilizzata per conservare, trasferire e raffreddare le griglie.
NOTA: Si consiglia di utilizzare una bomboletta di spolverino d'aria per rimuovere eventuali detriti visibili dalla slitta prima di aggiungere griglie. Una pistola antistatica può anche essere utilizzata per rimuovere qualsiasi elettricità statica che si accumula. - Assemblare ed etichettare scatole di stoccaggio della griglia.
- Acquisire da 4 a 6 pinzette di serraggio pulite e asciutte e posizionarle nello stantuffo manuale. Ispezionare visivamente ogni pinzetta prima di immergersi per assicurarsi che non siano danneggiati e privi di contaminanti.
3. Preparare il dewar criogeno e lo stantuffo manuale
NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 5-15 minuti
- Installa la base della piattaforma nella parte inferiore del dewar a immersione. Posiziona il dewar della nave dell'etano sopra la base della piattaforma, aggiungi il vaso di etano di ottone e quindi installa la piattaforma di stoccaggio della griglia rotante.
- Una volta aggiunto azoto liquido (LN2) al dewar di immersione, l'altezza della base della piattaforma non può più essere regolata. Assicurarsi che la base della griglia sia installata correttamente e sia in piano per limitare i danni alla griglia e/o alla pinzetta dovuti a un'altezza impropria dello stantuffo.
- Prima del congelamento, controllare lo stantuffo manuale e tutte le apparecchiature ausiliarie per assicurarsi che funzionino correttamente per limitare la perdita di campioni e/o di griglia.
- Prima di ogni sessione di congelamento, sostituire il nastro sul braccio a stantuffo manuale utilizzato per tenere le pinzette. L'elevata umidità della stanza può deteriorare l'adesivo del nastro e diminuire la capacità del nastro di trattenere le pinzette, aumentando la probabilità di danni alla pinzetta e / o perdita della griglia.
- Regolare le lampade vicino allo stantuffo manuale per assicurarsi che vi sia luce sufficiente per monitorare l'assorbimento del campione e garantire che il trasferimento della griglia sia facilmente visualizzabile per evitare danni e/o perdite alla griglia (vedere il punto 3.7). Usa una lampada ad anello direttamente dietro lo stantuffo per visualizzare il movimento del liquido e una luce flessibile vicino al dewar per illuminare le griglie congelate.
- Regolare la tensione del pedale per garantire che il braccio di immersione dewar sia mantenuto saldamente in posizione mentre si trova in posizione rialzata e venga completamente rilasciato quando il pedale è premuto. Eseguire diverse corse "a secco" prima dell'applicazione del campione per garantire che lo stantuffo funzioni correttamente.
NOTA: la regolazione impropria della tensione del pedale comporterà il rilascio prematuro del braccio di immersione (cioè la tensione è impostata troppo bassa) e la perdita della griglia o l'immersione incompleta della griglia nel vaso di etano (cioè, la tensione è impostata troppo alta). - Posizionare il dewar a immersione alla base dello stantuffo manuale direttamente sotto il braccio di immersione e fissarlo in posizione. Attaccare un paio di pinzette al braccio di immersione usando il nastro adesivo. Mentre si tiene premuto il braccio di immersione manuale, premere il pedale per abbassare attentamente il braccio di immersione e regolare la corsa del braccio di immersione per assicurarsi che la griglia si trovi al centro del vaso di etano.
- Utilizzare il bump stop nella parte superiore del braccio di immersione per determinare la posizione finale del braccio di immersione quando il pedale è completamente premuto (Figura 1B). Regolare l'altezza di arresto dell'urto sul braccio di immersione per regolare la posizione della griglia nel vaso di etano (Figura 1C).
NOTA: l'impostazione errata dell'altezza del braccio di immersione può causare danni alla griglia e/o alla pinzetta (ad esempio, l'altezza del braccio di immersione è impostata su un livello troppo basso) o a una vetrificazione inadeguata (ad esempio, l'altezza del braccio di immersione è impostata su un'altezza troppo alta). - Individuare il dewar fuori dalla cella frigorifera e procedere alla preparazione dell'etano liquido (passaggio 4).
4. Preparare il criogeno
NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 10-30 minuti
- Valutare il serbatoio di etano, il regolatore, il tubo e la punta di erogazione dell'etano per eventuali segni di danno. Segnalare e rettificare immediatamente eventuali segni di danno prima di procedere.
ATTENZIONE: Etano compresso ed etano: le miscele di gas propano sono infiammabili e possono rappresentare una seria minaccia per la vita e / o causare lesioni se maneggiate in modo improprio. Si prega di consultare un esperto se non si sa come utilizzare o gestire i serbatoi di gas compresso. Si prega di fare riferimento alle linee guida per la salute e la sicurezza ambientale dell'istituzione quando si maneggiano gas compressi infiammabili. Inoltre, l'etano liquefatto è un potente criogeno che può rappresentare una seria minaccia per la vita e / o lesioni se non gestito correttamente. Si prega di fare riferimento alle linee guida per la salute e la sicurezza ambientale dell'istituzione quando si maneggiano i criogeni. - Acquisire una quantità sufficiente di LN2 in un dewar di movimentazione LN2 appropriato (ad esempio, 3-4 L è tipico per la preparazione e lo stoccaggio della griglia).
ATTENZIONE: LN2 è un criogeno che può rappresentare una seria minaccia per la vita e/o lesioni se non gestito correttamente.- Assicurarsi che tutti i dispositivi di protezione individuale siano utilizzati per ridurre al minimo il rischio di lesioni. Il vapore di LN2 è un asfissiante e deve essere maneggiato in aree ben ventilate. Si prega di consultare un esperto se non si è sicuri di come utilizzare o gestire vasi criogenici e criogeni. Si prega di fare riferimento alle linee guida per la salute e la sicurezza ambientale dell'istituzione quando si maneggiano i criogeni. Per le situazioni in cui l'azoto liquido non può essere utilizzato in una cella frigorifera, si consiglia di immergere il congelamento in uno spazio fresco e ben ventilato.
- All'esterno della cella frigorifera, raffreddare il dewar a immersione versando LN2 direttamente nel recipiente di etano di ottone fino a quando il livello di azoto liquido raggiunge la parte superiore del vaso di etano (cioè appena sopra la piattaforma). Completare l'LN2 all'esterno della nave di etano secondo necessità. Procedere al passaggio successivo quando LN2 smette di gorgogliare violentemente (circa 5 minuti).
- Aggiungere LN2 direttamente al recipiente di etano in ottone per raffreddare sufficientemente il recipiente prima di condensare il gas etano. Il mancato raffreddamento corretto del recipiente di etano in ottone aumenterà notevolmente il tempo necessario per condensare l'etano.
- Una volta che il dewar ha raggiunto la temperatura LN2 , evitare di riempire eccessivamente il dewar in modo tale che LN2 si riversi nel vaso di etano.
- L'etano si presenta come un gas compresso e deve essere liquefatto per l'uso. Il serbatoio di etano utilizza un regolatore a doppio stadio ad alta purezza per controllare il flusso di gas. Collegare il tubo alla valvola di uscita del regolatore e utilizzare una punta di erogazione metallica piatta calibro 14 collegata all'estremità per l'erogazione dell'etano.
- Prima di aprire la valvola principale del serbatoio dell'etano, assicurarsi che la manopola di regolazione della pressione e la valvola di uscita siano chiuse completamente. Aprire completamente la valvola del serbatoio principale e quindi aprire la valvola di uscita a ~ 50%. Aprire lentamente la manopola di regolazione della pressione fino a quando non si osserva un flusso di gas lento. Utilizzare la valvola di uscita per ottimizzare il flusso del gas.
ATTENZIONE: Puntare sempre la punta di erogazione del metallo lontano da se stessi quando si aprono le valvole o si effettuano regolazioni del flusso di gas. - Avviare lentamente il flusso di gas e valutare la portata inserendo la punta della linea del gas di etano in un piccolo becher di acqua deionizzata. Regolare il flusso di gas fino a quando la portata disturba moderatamente l'acqua.
- Regolare la portata del gas per garantire che si verifichi una corretta condensazione dell'etano: una portata troppo lenta causerà la solidificazione del gas etano nella punta di erogazione e una portata troppo veloce comporterà un'intensa gorgogliatura e impedirà il congelamento.
- Prima di inserire la punta della linea del gas di etano nel recipiente di etano in ottone, pulire e pulire la punta di erogazione con delicate salviette per rimuovere l'acqua.
- Con un movimento fluido e rapido, posizionare la punta di erogazione del gas sul fondo del recipiente di etano in ottone e iniziare a spostare la punta di erogazione in un cerchio lento attorno al fondo del recipiente di etano. L'etano solido si formerà immediatamente, ma si liquefarà rapidamente man mano che viene aggiunto / condensato più gas di etano.
- Continua a spostare la punta di erogazione dell'etano metallico sul fondo del vaso di etano per liquefare l'etano solido. Riempire il vaso di etano a 3/4 pieno di etano liquido (2-3 fili dall'alto). Arrestare il flusso di gas etano rimuovendo con cura la punta di erogazione dell'etano metallico dal recipiente di etano in ottone e chiudendo la valvola di uscita.
- Completare il dewar a immersione con LN2 che si versa delicatamente sul lato del dewar per evitare l'aggiunta di LN2 al vaso di etano di ottone, fino a quando il livello del liquido tocca solo il vaso di etano di ottone. Posizionare il coperchio in schiuma sul dewar a immersione per facilitare la solidificazione dell'etano.
- LN2 deve contattare direttamente il recipiente di etano in ottone per aiutare nella solidificazione dell'etano. Dopo circa 5 minuti, l'etano all'interno del recipiente di ottone diventerà completamente solido congelato. Aggiungi più LN2 fino a quando non tocca semplicemente il vaso di etano e procedi al passaggio successivo.
- Se l'etano non ha congelato il solido, il vaso di etano di ottone non è abbastanza freddo per i passaggi rimanenti. Aggiungi più LN2 fino a quando non tocca il vaso di etano e attendi altri 5 minuti. Assicurarsi che l'etano all'interno del recipiente di ottone sia completamente congelato solido.
- Aprire la valvola di uscita del gas per produrre un flusso di gas etano ad una velocità simile a quella determinata nel passaggio 4.6. Posizionare verticalmente la punta di erogazione dell'etano metallico nell'etano solido e continuare a spostare la punta di erogazione dell'etano in un movimento circolare per fondere l'etano solido.
- Continua ad aggiungere etano fino a quando non è a livello con la parte superiore del vaso di etano di ottone. Rimuovere lentamente la punta dal vaso di etano e chiudere la valvola di uscita del serbatoio di etano. Coprire il dewar con il coperchio per ~ 1-4 minuti per lasciare che l'etano si solidifichi attorno ai bordi del vaso di etano di ottone.
NOTA: Un vaso di etano ideale avrà un anello simmetrico di etano solido di 2-3 mm al perimetro del vaso di etano di ottone con etano liquido al centro (Figura 1D e Figura 2). - Assicurarsi che l'etano sia il più freddo possibile senza solidificare per garantire una corretta vetrificazione del campione biologico. La mancata preparazione corretta dell'etano liquido può comportare una vetrificazione inadeguata del campione, l'accumulo di ghiaccio e / o la perdita del campione, ognuno dei quali contribuisce al deterioramento della qualità del campione per l'imaging.
- Se un anello solido di etano non si forma dopo 2-3 minuti, aggiungere più LN2 al dewar e coprire per altri 2-5 minuti.
- Se l'etano si solidifica troppo rapidamente, utilizzare un grande paio di pinzette pulite per riscaldare delicatamente il vaso di etano e / o l'etano solido per evitare la completa solidificazione dell'etano. Una volta che l'etano e l'LN2 sono stabili, chiudere tutte le valvole del serbatoio di etano e posizionare il dewar di immersione nello stantuffo manuale. Fissare il dewar a immersione allo stantuffo manuale.
ATTENZIONE: Prestare particolare attenzione quando si trasferisce il dewar poiché LN2 può fuoriuscire nel vaso di etano e solidificare l'etano liquido. Se necessario, un set pulito di pinzette può essere utilizzato per sciogliere qualsiasi etano solido nel mezzo della nave.
- Continua ad aggiungere etano fino a quando non è a livello con la parte superiore del vaso di etano di ottone. Rimuovere lentamente la punta dal vaso di etano e chiudere la valvola di uscita del serbatoio di etano. Coprire il dewar con il coperchio per ~ 1-4 minuti per lasciare che l'etano si solidifichi attorno ai bordi del vaso di etano di ottone.
- Testare la posizione dell'etano dewar con un paio di pinzette vuote per assicurarsi che la punta della pinzetta si trovi al centro del vaso di etano e che ci sia spazio sufficiente per la griglia e la punta della pinzetta all'interno dell'etano liquido (Figura 1D).
- Se l'anello di etano solido è troppo spesso per una facile manipolazione della griglia, utilizzare un paio di pinzette a temperatura ambiente per fondere l'etano solido e creare più area di congelamento al centro del vaso di etano.
5. Preparare le griglie EM
NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 1-5 minuti
- Aggiungere le scatole di stoccaggio della griglia al dewar, svitare i coperchi della scatola di stoccaggio della griglia e assicurarsi che ogni coperchio possa ruotare liberamente in un nuovo slot della griglia.
- Trasferire con attenzione le griglie dalla scatola di stoccaggio della griglia al bordo del coperchio di vetro quadrato con ~ 30-40% della griglia fuori dal bordo della diapositiva. Assicurarsi che la pellicola della griglia sia rivolta verso l'alto. Assicurarsi che le griglie siano coperte quando non in uso. Posizionare le griglie sul bordo del coperchio di vetro quadrato offre facilità di gestione della griglia e riduce la possibilità di piegare o danneggiare la griglia durante il trasferimento.
NOTA: in genere vengono preparate 4-6 griglie alla volta. - Renderizza le griglie idrofile usando uno scaricatore a bagliore o un detergente al plasma.
NOTA: fare riferimento alle linee guida consigliate per la pulizia della griglia fornite dal produttore del diffusore di incandescenti/detergente al plasma.- Utilizzare le griglie entro 10 minuti dalla pulizia del plasma poiché le griglie perdono idrofilia e la riproducibilità da griglia a griglia diminuisce dopo questo tempo.
6. Preparare il campione di crioEM congelando a immersione
NOTA: Tempo di funzionamento stimato: >10 minuti (~ 1-3 minuti per griglia)
- Utilizzare una pinzetta di serraggio pulita e asciutta per raccogliere una griglia pulita, far scorrere il morsetto di plastica verso il basso per fissare la griglia in posizione e picchiettare delicatamente le pinzette per assicurarsi che la griglia sia adeguatamente fissata.
- Maneggiare le griglie vicino all'anello esterno per evitare danni alla lamina della griglia.
- Applicare da 1 a 5 μL di campione sul lato preparato (ad esempio, lato anteriore o lato lamina) della griglia.
NOTA: il volume e il tempo di blotting ottimali dipendono dal campione e devono essere ottimizzati per ciascun campione; volumi maggiori e campioni più viscosi richiedono tempi di blotting più lunghi. - Fissare l'assemblaggio pinzetta-griglia-campione al braccio di immersione manuale avvolgendo il nastro attorno alla maniglia della pinzetta.
- Affronta il campione verso l'utente per il tradizionale front blotting. Se l'esempio richiede il back blotting, individuare il campione lontano dall'utente.
- Tenere un pezzo di carta assorbente pulito, asciutto e tagliato tra il pollice e l'indice di ogni mano.
- Maneggiare solo le carte assorbenti dai bordi e non toccare mai il centro poiché oli e altri contaminanti da mani / guanti possono alterare la qualità della griglia.
- Appoggia le mani sul bordo del dewar in picchiata per stabilire una posizione stabile. Posizionare la carta assorbente parallelamente alla superficie della griglia a circa 1 cm di distanza dalla superficie della griglia.
- Utilizzare la sezione centrale della carta assorbente per consentire una completa mobilità dei fluidi e persino l'assorbimento attraverso la superficie della griglia.
- Far scorrere delicatamente e ruotare il pollice e l'anulare l'uno verso l'altro per piegare la carta assorbente verso la griglia per avviare il blotting. Mantenere il contatto tra la carta assorbente e la superficie della griglia durante l'intero processo di blotting.
- Contattare direttamente la carta assorbente alla superficie della griglia e mantenere un contatto costante attraverso la superficie della griglia.
- Piegare delicatamente la carta assorbente riduce la flessione della griglia e/o il danneggiamento della superficie della griglia e si traduce in ghiaccio più consistente su tutta la griglia (Figura 3A).
- Osserva il fronte liquido mobile e una volta che smette di progredire nella carta assorbente inizia a contare per 4-6 secondi.
NOTA: il conteggio può verificarsi una volta che la carta assorbente contatta la superficie della griglia, ma può verificarsi una minore riproducibilità da griglia a griglia. Il tempo totale di blot dipenderà dal tipo di griglia, dal tipo di lamina, dalla concentrazione del campione e dal tipo di campione (ad esempio, solubile rispetto alla membrana rispetto alle proteine filamentose). Per i campioni più viscosi saranno necessari tempi di macchia più lunghi (ad esempio, da 5 a 7 secondi).- Importante: sviluppare uno schema di conteggio affidabile e coerente per migliorare notevolmente la riproducibilità durante il processo di congelamento.
- Spostare il pollice sinistro, il pollice destro e l'indice in direzioni opposte per rimuovere la carta assorbente con un "movimento di scatto" lontano dalla superficie della griglia. Premere immediatamente il pedale per rilasciare il braccio di immersione e immergere la griglia nell'etano liquido.
- Rimuovere contemporaneamente la carta assorbente e premere il pedale per immergere la griglia nell'etano il prima possibile per ottenere i migliori risultati di congelamento. Più lungo è il tempo che intercorre tra la rimozione della carta assorbente e l'immersione, maggiore sarà l'evaporazione dei film sottili e diminuirà la riproducibilità da griglia a griglia.
- Utilizzare una mano per stabilizzare le pinzette di serraggio, srotolare il nastro con attenzione da intorno alle pinzette e braccio di immersione manuale.
- Mantenere sempre il contatto con la pinzetta per impedire il movimento della griglia della pinzetta e limitare i danni alla griglia che si verificano battendo la griglia contro l'etano solido.
- Una volta che le pinzette di serraggio sono libere dal braccio di immersione manuale, mantenere la pinzetta in una mano appoggiata sopra il dewar di immersione, assicurarsi che la griglia rimanga nell'etano liquido. Far scorrere con attenzione il morsetto di plastica lontano dalla griglia in modo che la griglia possa essere trasferita. Mantenere la pressione sulle pinzette per mantenere la griglia.
- Con un movimento rapido, trasferisci rapidamente la griglia dalla nave di etano al serbatoio LN2 . Posizionare con attenzione la griglia nella scatola di stoccaggio della rete.
NOTA: alcuni etano possono solidificarsi sulla superficie della griglia. L'apertura della pinzetta romperà leggermente l'etano e consentirà alla griglia di essere lasciata cadere nella casella della griglia.
- Con un movimento rapido, trasferisci rapidamente la griglia dalla nave di etano al serbatoio LN2 . Posizionare con attenzione la griglia nella scatola di stoccaggio della rete.
- Avvolgere la punta delle pinzette in una delicata salvietta per evitare l'accumulo di gelo. Mettere da parte fino a quando le pinzette non sono tornate a temperatura ambiente.
- Avere da 4 a 6 pinzette a portata di mano per facilità d'uso. Ogni pinzetta verrà utilizzata per il congelamento del campione e riscaldata prima dell'uso successivo.
- Ripetere i passaggi da 6.1 a 6.11 per ogni griglia.
- Una volta che il congelamento è culminato, chiudere saldamente la scatola della griglia e trasferirla in un luogo di archiviazione appropriato.
- Smaltire con cura l'etano liquido e LN2 e conservare tutti i materiali in un luogo asciutto.
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Representative Results
L'esecuzione riuscita del protocollo blot-and-plunge qui descritto si tradurrà in uno strato sottile e uniforme di ghiaccio vitreo privo di ghiaccio esagonale, contaminanti e grandi gradienti di ghiaccio inutilizzabile che possono essere osservati al microscopio elettronico (Figura 3). Il contatto incoerente della carta assorbente con la superficie della griglia, la rimozione prematura della carta assorbente o lo spostamento della carta assorbente durante il contatto con la griglia possono ridurre la qualità del ghiaccio vitreo e portare a uno spessore del ghiaccio incoerente attraverso la griglia EM (Figura 4)
Figura 1: Sala di immersione del campione e attrezzatura necessaria. A) Cella frigorifera a tappe per il congelamento manuale di campioni biologici utilizzando un tradizionale dispositivo blot-and-plunge descritto in questo articolo. L'attrezzatura necessaria viene mostrata ed etichettata di conseguenza. B) Per regolare l'altezza di lavoro dello stantuffo manuale, regolare l'arresto del dosso facendolo scorrere su e giù per il braccio di immersione manuale e fissandolo stringendo la vite. C) Vista ingrandita del recipiente di etano e della piattaforma di stoccaggio della griglia rotante per indicare l'altezza e la posizione corrette delle pinzette di serraggio e della griglia all'interno del recipiente di etano di ottone vuoto. Le pinzette e la griglia non devono contattare i lati o il fondo dell'etano di ottone per evitare danni. D) Altezza e posizione corrette delle pinzette di serraggio e griglia in etano liquido. Le pinzette e la griglia dovrebbero entrare nell'etano liquido al centro, evitando il contatto con l'etano solido al perimetro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Etano liquido preparato. Vista ingrandita del dewar che si immerge mostrando lo stato di etano liquido nel vaso di etano di ottone prima del congelamento del campione. L'anello di 2-3 mm di etano solido all'interno del vaso di etano di ottone è chiaramente visibile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative di apoferritine ottenute utilizzando la tecnica manuale blot-and-plunge. (A) Atlante rappresentativo di una griglia crioEM che mostra lo spessore del ghiaccio e la qualità dei quadrati della griglia che possono essere ottenuti utilizzando la tecnica manuale blot-and-plunge. (B) Micrografia con correzione del movimento di apoferritina di topo vetrificata acquisita utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione da 200 kV dotato di un rivelatore di elettroni diretto presso l'Università della California, la CryoEM Facility di San Diego. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Atlante rappresentativo di una griglia crioEM subottimale che mostra uno spessore di ghiaccio incoerente attraverso la griglia, numerosi quadrati rotti e aree in cui il ghiaccio è troppo spesso per visualizzare il campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La vitrificazione di campioni biologici per l'imaging mediante microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) rimane un passo di fondamentale importanza per il successo della determinazione della struttura. Il metodo manuale blot-and-plunge descritto in questo protocollo rappresenta un metodo economico, affidabile e robusto per congelare rapidamente campioni biologici in film sottili di ghiaccio vitreo per l'imaging crioEM. Utilizzando i metodi descritti nel manoscritto, i ricercatori saranno in grado di assemblare e azionare lo stantuffo manuale, preparare criogeno adatto per campioni biologici di congelamento flash e griglia EM manualmente blot-and-plunge contenenti campioni biologici. Sebbene questo metodo sia abbastanza robusto, è necessario prestare attenzione durante le fasi critiche di questa procedura per ottenere uno spessore e una qualità ottimali del ghiaccio per l'imaging ad alta risoluzione. Di seguito sono stati descritti molti di questi passaggi critici e vengono forniti suggerimenti su come risolvere questi passaggi.
È imperativo posizionare correttamente il braccio di immersione manuale per garantire che la griglia si trovi al centro dell'etano liquido all'interno del recipiente di ottone dopo l'immersione. L'altezza o la posizione improprie del braccio di immersione e/o il mancato fissaggio corretto delle pinzette porteranno a danni alle pinzette di serraggio, alla griglia EM e possibilmente allo stantuffo manuale. Come discusso in precedenza, eseguiamo sempre almeno una prova prima di preparare campioni biologici per verificare che la griglia EM si localizzi al centro del vaso di etano di ottone dopo il successo dell'immersione (Figura 1C). Inoltre, apportiamo anche piccole modifiche alla posizione del dewar che precipita dopo ogni congelamento della griglia per mettere a punto il posizionamento della griglia all'interno del vaso di etano (Figura 1D).
La corretta preparazione del criogeno dell'etano è fondamentale per ottenere film sottili di campioni biologici in ghiaccio vitreo. Abbiamo osservato che la presenza di un anello di 2-3 mm di etano solido attorno al bordo interno del recipiente di etano di ottone assicura che la temperatura dell'etano liquido sia ottimale per la vetrificazione del campione (Figura 2). Infatti, dopo che ogni griglia è stata congelata, monitoriamo la qualità dell'etano e apportiamo piccole regolazioni - riscaldando leggermente la nave se troppo etano si è solidificato o raffreddando l'etano se il sistema si è riscaldato - se necessario. Abbiamo scoperto che il bordo di una pinzetta a temperatura ambiente è sufficiente per liquefare l'etano solido mentre coprire il dewar con il coperchio di schiuma per 1-5 minuti è abbastanza tempo per consentire all'etano di raffreddarsi. È importante sottolineare che apportiamo queste regolazioni prima di preparare la superficie della griglia (cioè la pulizia al plasma) e applicare il campione alla griglia in quanto ciò può introdurre un'altra variabile nella preparazione della griglia che non è riproducibile.
Infine, si consiglia di sviluppare una routine standardizzata blot-and-plunge - applicazione di esempio, blotting del campione e tempo di blotting - per aumentare la riproducibilità da griglia a griglia. Piegare la carta assorbente verso la griglia EM consente un contatto uniforme della carta con la griglia e produce uno spessore di ghiaccio più coerente su tutta la griglia, con conseguente distribuzione uniforme delle particelle all'interno dei fori della griglia (Figura 3A e Figura B, rispettivamente). Questo metodo di blotting è in contrasto con i dispositivi di blotting robotici che interagiscono con il campione con un angolo che può comportare un gradiente di spessore del ghiaccio attraverso la griglia. Inoltre, questa flessione della carta assorbente riduce anche la possibilità di danneggiare la griglia EM a contatto con la carta assorbente tamponando la forza applicata dall'utente. Dopo il tempo di blotting desiderato, raddrizzare rapidamente la carta assorbente eseguendo un movimento di scatto per spostare rapidamente la carta assorbente lontano dalla superficie della griglia prima di immergersi per evitare danni alla griglia al momento del rilascio del braccio di immersione manuale. Abbiamo scoperto che questo metodo di blotting e il movimento di scatto della carta assorbente, quando cronometrato con il rilascio simultaneo del braccio di immersione manuale tramite il pedale, limita l'evaporazione del film sottile prima della vetrificazione e aumenta la riproducibilità da griglia a griglia.
Il metodo manuale blot-and-plunge qui descritto è un metodo robusto e affidabile che aiuta a ridurre parte dell'onere finanziario che cryoEM può imporre ai laboratori emergenti. Mentre questo metodo è riproducibile, la creazione di ghiaccio vitreo di alta qualità adatto per il crioEM si basa sull'esperienza e l'abilità del singolo ricercatore. Sebbene gli stantuffi robotici e altre tecnologie emergenti automatizzino diversi aspetti del processo di congelamento, sono generalmente limitati da quanto controllo offrono ai ricercatori e spesso incorrono in un prezzo elevato per l'acquisto e il funzionamento. Con il metodo delineato in questo protocollo, i ricercatori saranno in grado di utilizzare una piattaforma di preparazione della griglia EM conveniente e versatile che offre flessibilità per ottimizzare le condizioni di immersione (ad esempio, tipi di carta assorbente, angolo di blotting, durate di blotting, direzioni di blotting, ecc.) in base ai tipi e alle caratteristiche del campione.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio Herzik per aver pensato criticamente e per aver fornito feedback su questo manoscritto e sul contenuto del video. M.A.H.Jr. è supportato da NIH R35 GM138206 e come Searle Scholar. H.P.M.N è supportato dal Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vorremmo anche ringraziare Bill Anderson, Charles Bowman e il Dr. Gabriel Lander dello Scripps Research Institute per l'aiuto nella progettazione, assemblaggio e test dello stantuffo manuale mostrato nel video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
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