Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ручное замораживание биологических образцов для одночастичной криогенной электронной микроскопии

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/62765
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego
* These authors contributed equally

Summary

В этой рукописи описывается метод блоттинга и погружения для ручной заморозки биологических образцов для криогенной электронной микроскопии с одной частицей.

Abstract

Визуализация биологических образцов с электронами для определения структуры высокого разрешения с помощью криогенной электронной микроскопии с одной частицей (криоЭМ) требует тонкого слоя стекловидного льда, содержащего биомолекулы, представляющие интерес. Несмотря на многочисленные технологические достижения в последние годы, которые вывели криоЭМ на передний план структурной биологии, методы, с помощью которых образцы остекливаются для визуализации с высоким разрешением, часто остаются этапом ограничения скорости. Хотя многочисленные недавние усилия обеспечили средства для преодоления препятствий, часто встречающихся во время витрификации образцов, включая разработку новых опор для образцов и инновационных приборов для витрификации, традиционный плунжер с ручным управлением остается основным продуктом в сообществе криоЭМ из-за низкой стоимости покупки и простоты эксплуатации. Здесь мы приводим подробные методы использования стандартного гильотинного устройства с ручным управлением для витрификации биологических образцов для визуализации с высоким разрешением с помощью криоЭМ. Кроме того, также описываются часто встречающиеся проблемы и рекомендации по устранению неполадок, когда стандартная подготовка не дает подходящего образца.

Introduction

Одночастичная криогенная электронная микроскопия (криоЭМ) является мощным структурным методом, который может быть использован для решения структур динамических биологических образцов с околоатомным разрешением1,2,3,4. Действительно, последние достижения в технологиях прямых детекторов электронов4,5,6,7,8,9,10, улучшения в электронных источниках4,11,12,13,14 и стабильности электромагнитных линз15 в сочетании с продолжающимся развитием сбора данных 16,17 и пакеты программного обеспечения для анализа18,19 позволили исследователям в настоящее время регулярно определять структуры хорошо ведущих себя образцов с разрешением 3 Å или лучше4,11,13,14,20,21,22,23 . Несмотря на эти улучшенные возможности визуализации и обработки данных, подготовка сетки криоЭМ остается самым большим препятствием для успешного определения структуры с высоким разрешением и часто служит значительным узким местом в рабочем процессе EM24,25,26,27.

CryoEM полагается на визуализацию биологических образцов в водных растворах, которые замораживаются с образованием тонкой пленки «стеклоподобного» льда - процесс, известный как витрификация - который сохраняет исходное биохимическое состояние. Витрификация биологических образцов для криоЭМ насчитывает более 40 лет28,29,30, и многие методы и оборудование, которые были разработаны для этого процесса, основаны на первоначально детальном методе пятнистости и погружения31,32,33,34,35 , при этом небольшой объем образца (например, 1-5 мкл) наносится на специализированную ЭМ-сетку перед удалением избыточного раствора с помощью физического взаимодействия сетки с промокательной бумагой. Сроки этого процесса обычно эмпирически определяются для каждого образца, поскольку критическим компонентом замораживания образцов является толщина стекловидной ледяной пленки - если лед слишком толстый, то качество изображения резко ухудшается из-за увеличения рассеяния электронного пучка, в то время как слишком тонкий лед может ограничивать ориентацию белка и / или исключать частицы из центра отверстий фольги сетки36 . Эта зависимость от идеальной толщины льда для криоЭМ с одной частицей привела к широкому спектру методов и оборудования, которые могут замораживать образцы, включая робототехнику37,38, микрофлюидику42 и ультразвуковые или распылительные устройства27,39,40,41,42,43,44 . В последние годы некоторые из самых популярных устройств для подготовки образцов полагаются на использование робототехники для автоматизированной заморозки образцов с использованием метода пятнистости и погружения45. Хотя эти устройства предназначены для воспроизводимого создания надлежащей толщины льда для визуализации, они часто остаются слишком дорогими для отдельных лабораторий для покупки и эксплуатации и, как правило, находятся в криоЭМ-объектах по почасовым ставкам для использования. В последние годы оригинальная ручная техника промокания и погружения вернулась в более широкое использование3,47,48,49,50,51,52. Действительно, устройство с ручным управлением может достигать высококачественных криоЭМ-сетей за небольшую часть стоимости роботизированных аналогов. Кроме того, ручное блоттинг также предлагает пользователям больше контроля над блоттингом, поскольку исследователи могут корректировать тип блоттинга (т. Е. Обратное блоттирование сетки, переднее блоттирование сетки и т. Д.), И время блоттинга на основе каждого отдельного образца и исследовательских вопросов.

В этой статье мы подробно расскажем о том, как эффективно замораживать биологические образцы с помощью традиционного ручного устройства витрификации в сочетании с специально разработанной платформой dewar53. Приведены лучшие практики, включая подготовку криогена, обработку сетки, применение образцов и блоттинг, а также распространенные подводные камни и рекомендации о том, как преодолеть эти препятствия. Обсуждаются рекомендации о том, как увеличить воспроизводимость толщины льда между препаратами сетки и как модифицировать блоттинг образцов на основе типа биологического образца. Учитывая низкую стоимость, связанную с покупкой и эксплуатацией ручного плунжера, описанного в этой рукописи, лаборатории по всему миру могут подготовить биологические образцы для криоЭМ экономически эффективным и воспроизводимым способом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовьте ручную среду погружения

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 5-30 минут

  1. Расположите ручной плунжер в холодильной камере с температурой 4 °C, где может быть расположен увлажнитель воздуха для поддержания в помещении близкой к 100% относительной влажности (RH) (рисунок 1A).
    ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с руководящими принципами учреждения по гигиене и безопасности окружающей среды для безопасного расположения ручного плунжера и рекомендуемых операций.
  2. Перед подготовкой сетки включите увлажнитель воздуха в холодном помещении, чтобы относительная влажность холодильной камеры составляла ≥ 95 %.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка сетки при низкой влажности может привести к обезвоживанию тонких пленок, изменению буферных компонентов из-за испарения и снижению воспроизводимости от сетки к сетке46. Не рекомендуется замораживать сетки при относительной влажности <80 %.
  3. Убедитесь, что температура в холодном помещении составляет 4 °C.
  4. Расположите ручной плунжер вдали от сильных воздушных потоков (т. Е. Вдали от вентиляционных отверстий кондиционера), так как они могут привести к турбулентности вблизи сеток и / или заметному накоплению льда на холодных поверхностях.

2. Подготовьте погружные материалы и аксессуары

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 1-5 минут

  1. Используйте чистые ножницы, чтобы разрезать поясные бумажные круги на полоски шириной 1-1,5 см и длиной ~ 9 см. Избегайте прикосновения к центру промокательной бумаги и отбросьте меньшие концевые кусочки. Важно убедиться, что полоски промокательной бумаги являются сухими, чистыми и свободными от загрязнений. Отделите полоски и поместите их в чашку Петри толщиной 100 мм.
  2. Поместите квадратную стеклянную крышку размером 22x22 мм в отдельную стеклянную чашку Петри диаметром 60 мм. Эта стеклянная чашка Петри, содержащая крышку, будет использоваться для хранения, передачи и тлеющих разрядных сеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать баллончик для удаления любого видимого мусора с слайда перед добавлением сеток. Антистатический пистолет также может быть использован для удаления любого статического электричества, которое накапливается.
  3. Сборка и маркировка коробок для хранения сетки.
  4. Приобретите от 4 до 6 чистых и сухих зажимных пинцетов и разместите их на ручном плунжере. Визуально осмотрите каждый пинцет перед погружением, чтобы убедиться, что они не повреждены и не содержат загрязнений.

3. Подготовьте криоген дьюар и ручной плунжер

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 5-15 минут

  1. Установите основание платформы в нижней части погружающегося дьюара. Поместите этановый сосуд дьюар поверх основания платформы, добавьте латунный этановый сосуд, а затем установите платформу для хранения вращающейся сетки.
    1. Как только жидкий азот (LN2) добавляется к погружающемуся дьюару, высота основания платформы больше не может быть отрегулирована. Убедитесь, что основание сетки установлено правильно и находится на одном уровне, чтобы ограничить повреждение сетки и / или пинцета из-за неправильной высоты плунжера.
  2. Перед замораживанием проверьте ручной плунжер и все вспомогательное оборудование, чтобы убедиться, что они функционируют должным образом, чтобы ограничить потери проб и / или сетки.
  3. Перед каждым сеансом замораживания заменяйте ленту на ручном плунжерном рычаге, используемом для удержания пинцета. Высокая влажность помещения может ухудшить клейку ленты и уменьшить способность ленты удерживать пинцет, увеличивая вероятность повреждения пинцета и / или потери сетки.
  4. Отрегулируйте лампу (лампы) рядом с ручным плунжером, чтобы обеспечить достаточное количество света для контроля за впитыванием проб и обеспечить легкую визуализацию переноса сетки для предотвращения повреждения и/или потери сетки (см. шаг 3.7). Используйте кольцевую лампу непосредственно за поршенем, чтобы визуализировать движение жидкости, и гибкий фонарь для рук рядом с дьюаром, чтобы осветить замороженные решетки.
  5. Отрегулируйте натяжение ножной педали, чтобы гарантировать, что рычаг погружения Дьюара надежно удерживается на месте, находясь в поднятом положении, и полностью отпускается, когда педаль нажата. Выполните несколько «сухих» прогонов перед нанесением образца, чтобы убедиться, что плунжер работает правильно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильная регулировка натяжения ножной педали приведет к преждевременному высвобождению погружающего рычага (т.е. натяжение установлено слишком низко) и потере сетки или неполному погружению сетки в этановый сосуд (т.е. напряжение установлено слишком высоко).
  6. Поместите погружной дьюар у основания ручного плунжера непосредственно под погружным рычагом и закрепите его на месте. Прикрепите пару пинцетов к углубляющемуся рычагу с помощью прикрепленной ленты. Удерживая ручную руку погружения, нажмите ножную педаль, чтобы осторожно опустить погружающую руку и отрегулируйте ход погружающего рычага, чтобы убедиться, что сетка будет располагаться в середине этанового сосуда.
  7. Используйте отбойник в верхней части погружающегося рычага, чтобы определить конечное положение погружающегося рычага, когда ножная педаль полностью нажата (рисунок 1B). Отрегулируйте высоту отбойника на погружном рычаге, чтобы отрегулировать расположение сетки в этановом сосуде (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильная установка высоты погружающегося рычага может привести к повреждению сетки и/или пинцета (например, слишком низкая высота руки погружения) или недостаточной витрификации (например, высота руки погружения установлена слишком высоко).
  8. Расположите дьюар за пределами холодного помещения и приступайте к приготовлению жидкого этана (шаг 4).

4. Подготовьте криоген

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 10-30 минут

  1. Оцените резервуар для этана, регулятор, трубку и наконечник для дозирования этана на наличие каких-либо признаков повреждения. Немедленно сообщите и устраните любые признаки повреждения, прежде чем продолжить.
    ВНИМАНИЕ: Сжатые смеси этана и этана: пропана являются легковоспламеняющимися и могут представлять серьезную угрозу для жизни и / или привести к травмам при неправильном обращении. Пожалуйста, проконсультируйтесь с экспертом, если вы не знаете, как работать или обращаться со сжатыми газовыми баллонами. Пожалуйста, ознакомьтесь с руководящими принципами учреждения по гигиене и безопасности окружающей среды при обращении с легковоспламеняющимися сжатыми газами. Кроме того, сжиженный этан является мощным криогеном, который может представлять серьезную угрозу для жизни и / или травмы, если с ним не обращаться должным образом. Пожалуйста, ознакомьтесь с руководящими принципами учреждения по гигиене и безопасности окружающей среды при обращении с криогенами.
  2. Приобретите достаточное количество LN2 в соответствующем дьюаре обработки LN2 (т.е. 3-4 л характерно для подготовки и хранения сетки).
    ВНИМАНИЕ: LN2 является криогеном, который может представлять серьезную угрозу для жизни и / или травмы, если с ним не обращаться должным образом.
    1. Убедитесь, что все средства индивидуальной защиты используются для минимизации риска получения травм. Пар LN2 является удушающим средством и должен обрабатываться в хорошо проветриваемых помещениях. Пожалуйста, проконсультируйтесь с экспертом, если вы не знаете, как управлять или обращаться с криогенными сосудами и криогенами. Пожалуйста, ознакомьтесь с руководящими принципами учреждения по гигиене и безопасности окружающей среды при обращении с криогенами. Для ситуаций, в которых жидкий азот нельзя использовать в холодном помещении, мы рекомендуем погружать замораживание в прохладное и хорошо проветриваемое помещение.
  3. За пределами холодной комнаты охладите погружающийся дьюар, налив LN2 непосредственно в латунный этановый сосуд до тех пор, пока уровень жидкого азота не достигнет вершины этанового сосуда (то есть чуть выше платформы). По мере необходимости выделывайте LN2 снаружи этанового сосуда. Перейдите к следующему шагу, когда LN2 перестанет бурлить (примерно через 5 минут).
    1. Добавьте LN2 непосредственно в латунный этановый сосуд, чтобы достаточно охладить сосуд перед конденсацией газа этана. Неспособность должным образом охладить латунный этановый сосуд резко увеличит время, необходимое для конденсации этана.
    2. Как только дьюар достигнет температуры LN2 , избегайте переполнения дьюара таким образом, чтобы LN2 разливался в этановый сосуд.
  4. Этан поставляется в виде сжатого газа и нуждается в сжижении для использования. В этановом резервуаре используется двухступенчатый регулятор высокой чистоты для управления потоком газа. Подключите трубку к выпускному клапану регулятора и используйте плоский металлический дозирующий наконечник 14-го калибра, соединенный на конце для дозирования этана.
  5. Перед открытием клапана основного резервуара этана убедитесь, что ручка регулировки давления и выпускной клапан закрыты на всем пути. Полностью откройте клапан основного бака, а затем откройте выпускной клапан до ~50%. Медленно открывайте ручку регулировки давления, пока не будет наблюдаться медленный поток газа. Используйте выпускной клапан для точной настройки потока газа.
    ВНИМАНИЕ: Всегда направляйте металлический дозирующий наконечник в сторону от себя при открытии клапанов или корректировке потока газа.
  6. Медленно запустите поток газа и оцените скорость потока, вставив наконечник этановой газовой магистрали в небольшой стакан с деионизированной водой. Отрегулируйте расход газа до тех пор, пока скорость потока умеренно не нарушит воду.
    1. Отрегулируйте расход газа, чтобы обеспечить правильную конденсацию этана - слишком медленный расход приведет к затвердеванию газа этана в дозирующей головке, а слишком быстрый расход приведет к интенсивному пузырьку и предотвратит замерзание.
  7. Перед тем, как вставить наконечник газопровода этана в латунный сосуд с этаном, очистите и протрите дозирующий наконечник деликатными салфетками для удаления воды.
  8. Плавным и быстрым движением расположите газораспределитель на дне латунного этанового сосуда и начните перемещать дозирующий наконечник по медленному кругу вокруг дна этанового сосуда. Твердый этан образуется немедленно, но быстро сжижается по мере добавления / конденсации большего количества газа этана.
    1. Продолжайте перемещать наконечник для дозирования металлического этана на дне сосуда с этаном, чтобы сжижать твердый этан. Наполните этановый сосуд до 3/4 полного жидкого этана (2-3 нити сверху). Остановите поток газа этана, осторожно сняв металлический этановый дозирующий наконечник из латунного этанового сосуда и закрыв выпускной клапан.
  9. Дополните погружающийся дьюар LN2, аккуратно вылив на бок дьюара, чтобы избежать добавления LN2 к латунному этановому сосуду, пока уровень жидкости не коснется латунного этанового сосуда. Поместите пенную крышку на погружающийся дьюар, чтобы облегчить затвердевание этана.
    1. LN2 должен непосредственно контактировать с латунным этановым сосудом, чтобы помочь в затвердевании этана. Примерно через 5 минут этан в латунном сосуде станет полностью замороженным твердым. Добавьте еще LN2, пока он не коснется этанового сосуда, и перейдите к следующему шагу.
  10. Если этан не замерз в твердом виде, то латунный этановый сосуд недостаточно холоден для остальных этапов. Добавьте еще LN2 , пока он не коснется этанового сосуда, и подождите еще 5 минут. Убедитесь, что этан в латунном сосуде полностью заморожен.
  11. Откройте выпускной клапан газа для получения потока газа этана со скоростью, аналогичной той, которая определена на этапе 4.6. Вертикально поместите дозирующий наконечник металлического этана в твердый этан и продолжайте перемещать дозирующий наконечник этана круговыми движениями, чтобы расплавить твердый этан.
    1. Продолжайте добавлять этан до тех пор, пока он не выровняется с верхней частью латунного этанового сосуда. Медленно извлеките наконечник из этанового сосуда и закройте выпускной клапан этанового бака. Накройте дьюар крышкой на ~1-4 минуты, чтобы этан затвердел по краям латунного этанового сосуда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный этановый сосуд будет иметь 2-3 мм симметричное кольцо твердого этана по периметру латунного этанового сосуда с жидким этаном в центре (рисунок 1D и рисунок 2).
    2. Убедитесь, что этан был как можно более холодным без затвердевания, чтобы обеспечить надлежащую витрификацию биологического образца. Неспособность должным образом подготовить жидкий этан может привести к недостаточной витрификации образца, накоплению льда и/или потере образца, что способствует ухудшению качества образца для визуализации.
    3. Если твердое кольцо этана не образуется через 2-3 минуты, добавьте в дьюар еще LN2 и накройте еще 2-5 минут.
    4. Если этан затвердевает слишком быстро, используйте большую пару чистых пинцетов, чтобы осторожно нагреть этановый сосуд и / или твердый этан, чтобы предотвратить полное затвердевание этана. Как только этан и LN2 стабилизируются, закройте все клапаны резервуара этана и найдите погружной дьюар в ручной плунжер. Закрепите погружающуюся дьюар к ручному плунжеру.
      ВНИМАНИЕ: Будьте особенно осторожны при переносе дьюара, так как LN2 может пролиться в этановый сосуд и затвердеть жидкий этан. При необходимости чистый набор пинцетов можно использовать для расплавления любого твердого этана в середине сосуда.
  12. Проверьте местоположение этанового дьюара с помощью пары пустых пинцетов, чтобы убедиться, что наконечник пинцета находится в центре этанового сосуда и есть достаточно места для сетки и наконечника пинцета внутри жидкого этана (рисунок 1D).
    1. Если твердое этановое кольцо слишком толстое для легкого обращения с сеткой, то используйте пару комнатной температуры, очистите пинцет, чтобы расплавить твердый этан и создать большую площадь замерзания в центре этанового сосуда.

5. Подготовьте ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫЕ сетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 1-5 минут

  1. Добавьте коробку (коробки) для хранения сетки в дьюар, открутите крышку (крышки) коробки для хранения сетки и убедитесь, что каждая крышка может свободно вращаться в новый слот сетки.
  2. Аккуратно переложите сетки от ящика для хранения сетки к краю квадратной стеклянной крышки с ~ 30-40% сетки от края слайда. Убедитесь, что пленка сетки обращена вверх. Убедитесь, что сетки покрыты, когда они не используются. Размещение сеток над краем квадратного стеклянного чехла обеспечивает простоту обработки сетки и снижает вероятность изгиба или повреждения сетки во время передачи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 4-6 сеток обычно готовятся за один раз.
  3. Сделайте решетки гидрофильными с помощью тлеющего разрядника или плазменного очистителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с рекомендуемыми рекомендациями по очистке сетки, предоставленными производителем тлеющего разряда/плазменного очистителя.
    1. Используйте сетки в течение 10 минут после плазменной очистки, так как сетки теряют гидрофильность, а воспроизводимость от сетки к сетке снижается после этого времени.

6. Подготовьте образец криоЭМ путем погружной заморозки

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: >10 минут (~1-3 мин на сетку)

  1. Используйте чистый и сухой зажимной пинцет, чтобы поднять очищенную сетку, сдвиньте пластиковый зажим вниз, чтобы закрепить сетку на месте, и осторожно постучите пинцетом, чтобы убедиться, что сетка правильно закреплена.
    1. Обрабатывайте сетки наружным кольцом, чтобы предотвратить повреждение фольги сетки.
  2. Нанесите от 1 до 5 мкл образца на подготовленную сторону (например, переднюю или фольгированную сторону) сетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный объем и время промокания зависят от образца и должны быть оптимизированы для каждого образца; большие объемы и более вязкие образцы требуют более длительного времени промокания.
  3. Закрепите сборку пинцета-сетки-образца на ручном погружном рычаге, обернув ленту вокруг ручки пинцета.
    1. Поверните образец лицом к пользователю для традиционного пролистывания передней панели. Если образец требует обратного кляттинга, найдите образец подальше от пользователя.
  4. Держите чистый, сухой, разрезанный кусок промокательной бумаги между большим и указательным пальцами каждой руки.
    1. Обрабатывайте только промокательные бумаги с краев и никогда не прикасайтесь к центру, так как масла и другие загрязняющие вещества из рук / перчаток могут изменить качество сетки.
  5. Положите руки на край погружающегося дьюара, чтобы установить устойчивое положение. Расположите промокательную бумагу параллельно поверхности сетки на расстоянии примерно 1 см от поверхности сетки.
    1. Используйте среднюю часть промокательной бумаги, чтобы обеспечить полную подвижность жидкости и даже впитывание по поверхности сетки.
  6. Осторожно сдвиньте и поверните большой палец и безымянный пальцы навстречу друг другу, чтобы согнуть промокательную бумагу к сетке, чтобы начать промокание. Поддерживайте контакт между промокательной бумагой и поверхностью сетки в течение всего процесса промокания.
    1. Напрямую соприкасайтесь с промокательной бумагой с поверхностью сетки и поддерживайте постоянный контакт по всей поверхности сетки.
    2. Мягкий изгиб промокательной бумаги уменьшает изгиб сетки и/или повреждение поверхности сетки и приводит к более однородному льду по всей сетке (рисунок 3A).
  7. Понаблюдайте за подвижным жидким фронтом и как только она перестанет прогрессировать в промокательную бумагу, начните отсчет в течение 4-6 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет может происходить после того, как промокательная бумага контактирует с поверхностью сетки, но может произойти более низкая воспроизводимость сетки. Общее время растяжения будет зависеть от типа сетки, типа фольги, концентрации образца и типа образца (например, растворимые по сравнению с мембранными и нитевидными белками). Для более вязких образцов потребуется более длительное время промокания (например, от 5 до 7 секунд).
    1. Важно: Разработать надежную и последовательную схему подсчета для значительного повышения воспроизводимости в процессе замораживания.
  8. Переместите большой и указательный пальцы левой, правой и указательным пальцами в противоположных направлениях, чтобы удалить промокательную бумагу «щелкающим движением» от поверхности сетки. Немедленно нажмите ножную педаль, чтобы освободить погружающуюся руку и погрузить сетку в жидкий этан.
    1. Одновременно снимите промокательную бумагу и нажмите ножную педаль, чтобы как можно скорее погрузить сетку в этан для достижения наилучших результатов замораживания. Чем дольше время между удалением и погружением бумаги, тем большее испарение тонких пленок будет происходить и снижает воспроизводимость от сетки к сетке.
  9. Используйте одну руку, чтобы стабилизировать зажимной пинцет, осторожно размотайте ленту вокруг пинцета и ручной погружной рычаг.
    1. Всегда поддерживайте контакт с пинцетом, чтобы предотвратить движение пинцета-сетки и ограничить повреждение сетки, которое происходит от удара сетки о твердый этан.
  10. После того, как зажимные пинцеты освободятся от ручного погружающего рычага, держите пинцет в одной руке, опираясь поверх погружающегося дьюара, убедитесь, что сетка остается в жидком этане. Осторожно отодвиньте пластиковый зажим от сетки, чтобы сетку можно было перенести. Поддерживайте давление на пинцет, чтобы сохранить сетку.
    1. Одним быстрым движением быстро перенесите сетку из этанового сосуда в резервуар LN2 . Аккуратно поместите сетку в ящик для хранения сетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторое количество этана может затвердевать на поверхности сетки. Слегка открыв пинцет, вы сломаете этан и позволит опустить сетку в сетку.
  11. Оберните кончик пинцета в деликатную салфетку, чтобы предотвратить накопление мороза. Отложите в сторону до тех пор, пока пинцет не вернется к комнатной температуре.
    1. Имейте под рукой от 4 до 6 пинцетов для удобства использования. Каждый пинцет будет использоваться для замораживания образца и нагреваться перед последующим использованием.
  12. Повторите шаги 6.1–6.11 для каждой сетки.
  13. Как только замораживание достигло кульминации, надежно закройте коробку сетки и перенесите в правильное место хранения.
  14. Осторожно утилизируйте жидкий этан и LN2 и храните все материалы в сухом месте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешное выполнение протокола пятнистости и погружения, описанного здесь, приведет к созданию тонкого, однородного слоя стекловидного льда, свободного от любого шестиугольного льда, загрязняющих веществ и больших градиентов непригодного льда, которые можно наблюдать под электронным микроскопом (рисунок 3). Непоследовательный контакт промокательной бумаги с поверхностью сетки, преждевременное удаление промокательной бумаги или перемещение промокательной бумаги во время контакта с сеткой могут снизить качество стекловидного льда и привести к непоследовательной толщине льда по всей сетке ЭМ (рисунок 4)

Figure 1
Рисунок 1: Помещение для погружения образцов и необходимое оборудование. А) Постановочная холодильная камера для ручной заморозки биологических образцов с использованием традиционного устройства для окрашивания и погружения, описанного в этой статье. Необходимое оборудование отображается и маркируется соответствующим образом. B) Чтобы отрегулировать рабочую высоту ручного плунжера, отрегулируйте отбойник, скользя им вверх и вниз по ручному углу и закрепляя его путем затягивания винта. C) Увеличенный вид этанового сосуда и платформы для хранения вращающейся сетки для указания правильной высоты и расположения зажимного пинцета и сетки внутри пустого латунного этанового сосуда. Пинцет и сетка не должны соприкасаться с боковыми или нижними сторонами латунного этана, чтобы избежать повреждений. Г) Правильная высота и расположение зажима пинцета и сетки в жидком этане. Пинцет и сетка должны вводить жидкий этан в центре, избегая контакта с твердым этаном по периметру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Подготовленный жидкий этан. Увеличенный вид погружающегося дьюара, показывающий состояние жидкого этана в латунном этановом сосуде до замерзания образца. Хорошо видно кольцо 2-3 мм из твердого этана внутри латунного этанового сосуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные изображения апоферритина, полученные с использованием ручной техники блоттинга и погружения. (A) Репрезентативный атлас сетки криоЭМ, показывающий толщину льда и качество квадратов сетки, которые могут быть получены с помощью ручной техники пятнистости и погружения. (B) Скорректированная по движению микрофотография остеклованного мышиного апоферритина, полученного с помощью просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ, оснащенного прямым электронным детектором в Калифорнийском университете, На объекте CryoEM в Сан-Диего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативный атлас неутолимой сетки криоЭМ, показывающий непоследовательную толщину льда по всей сетке, многочисленные разбитые квадраты и области, в которых лед слишком толстый, чтобы изобразить образец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Витрификация биологических образцов для визуализации с помощью криогенной электронной микроскопии с одной частицей (криоЭМ) остается критически важным шагом для успешного определения структуры. Ручной метод пятнистости и погружения, описанный в этом протоколе, представляет собой экономически эффективный, надежный и надежный метод быстрого замораживания биологических образцов в тонких пленках стекловидного льда для криоЭМ-визуализации. Используя методы, описанные в рукописи, исследователи смогут собирать и эксплуатировать ручной плунжер, готовить криоген, подходящий для замораживания биологических образцов, и вручную промоктывать и погружать ЭМ-сетки, содержащие биологические образцы. Хотя этот метод является довольно надежным, во время критических шагов в этой процедуре следует соблюдать осторожность, чтобы получить оптимальную толщину льда и качество для визуализации с высоким разрешением. Ниже мы описали некоторые из этих критических шагов и предоставили рекомендации по устранению неполадок этих шагов.

Крайне важно правильно расположить рычаг ручного погружения, чтобы убедиться, что сетка находится в центре жидкого этана в латунном сосуде после погружения. Неправильная высота или положение погружного рычага и / или неправильное закрепление пинцета приведет к повреждению зажима пинцета, сетки ЭМ и, возможно, ручного плунжера. Как обсуждалось выше, мы всегда выполняем по крайней мере один пробный запуск до подготовки биологических образцов, чтобы убедиться, что эм-сетка будет расположена к центру латунного этанового сосуда после успешного погружения (рисунок 1C). Кроме того, мы также вносим незначительные коррективы в местоположение погружающегося дьюара после каждого замерзания сетки, чтобы точно настроить размещение сетки внутри этанового сосуда (рисунок 1D).

Правильная подготовка криогена этана имеет решающее значение для получения тонких пленок биологических образцов в стекловидном льду. Мы заметили, что наличие 2-3 мм кольца твердого этана вокруг внутреннего края латунного этанового сосуда гарантирует, что температура жидкого этана является оптимальной для витрификации образца (рисунок 2). Действительно, после того, как каждая сетка была заморожена, мы следим за качеством этана и вносим незначительные коррективы - слегка нагреваем сосуд, если слишком много этана затвердело, или охлаждаем этан, если система прогрелась - по мере необходимости. Мы обнаружили, что края пинцета комнатной температуры достаточно для разжижения твердого этана, в то время как покрытие дьюара пенопластовой крышкой в течение 1-5 минут является достаточным временем, чтобы дать этану остыть. Важно отметить, что мы вносим эти коррективы до подготовки поверхности сетки (т.е. плазменной очистки) и нанесения образца на сетку, поскольку это может ввести еще одну переменную в подготовку сетки, которая не воспроизводится.

Наконец, мы рекомендуем разработать стандартизированную процедуру блоттинга и погружения - пример приложения, блоттинг образцов и время блоттинга - для повышения воспроизводимости сетки в сетку. Изгиб промокательной бумаги в сторону эм-сетки обеспечивает равномерный контакт бумаги с сеткой и создает более постоянную толщину льда по всей сетке, что приводит к равномерному распределению частиц внутри отверстий сетки (рисунок 3A и рисунок B, соответственно). Этот метод блоттинга отличается от роботизированных блоттинговых устройств, которые взаимодействуют с образцом под углом, что может привести к градиенту толщины льда по всей сетке. Кроме того, этот изгиб промокательной бумаги также снижает вероятность повреждения электромагнитной сетки при контакте с промокательной бумагой путем буферизации силы, прилагаемой пользователем. По истечении желаемого времени промокания быстро выпрямите промокательную бумагу, выполнив щелкающее движение, чтобы быстро переместить промокательную бумагу от поверхности сетки перед погружением, чтобы предотвратить повреждение сетки при отпускании ручного погружающего рычага. Мы обнаружили, что этот метод блоттинга и щелкающее движение блоттинговой бумаги, когда оно приурочено к одновременному высвобождению ручного погружающего рычага через ножную педаль, ограничивает испарение тонкой пленки перед витрификацией и увеличивает воспроизводимость сетки к сетке.

Описанный здесь метод ручного промокания и погружения является надежным и надежным методом, который помогает уменьшить часть финансового бремени, которое криоЭМ может возложить на новые лаборатории. Хотя этот метод воспроизводим, создание высококачественного стекловидного льда, подходящего для криоЭМ, зависит от опыта и навыков отдельного исследователя. Хотя роботизированные плунжеры и другие новые технологии автоматизируют несколько аспектов процесса замораживания, они, как правило, ограничены тем, сколько контроля они предлагают исследователям, и часто несут высокую цену за покупку и эксплуатацию. С помощью метода, описанного в этом протоколе, исследователи смогут использовать доступную и универсальную платформу подготовки электромагнитной сетки, которая предлагает гибкость для оптимизации условий погружения (т. Е. Типы бумаги для промокания, угол промокания, продолжительность блоттинга, направления промокания и т. Д.) На основе типов и характеристик образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим членов лаборатории Herzik за критическое мышление и предоставление отзывов об этой рукописи и видеоконтенте. M.A.H.Jr. поддерживается NIH R35 GM138206 и как стипендиат Searle. H.P.M.N поддерживается грантом на обучение молекулярной биофизике (NIH T32 GM008326). Мы также хотели бы поблагодарить Билла Андерсона, Чарльза Боумана и доктора Габриэля Ландера из Научно-исследовательского института Скриппса за помощь в проектировании, сборке и тестировании ручного плунжера, показанного в видео.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 slot grid storage box Ted Pella 160-40
14 gauge flat metal dispensing tip Amazon B07M7YWWLT
22x22 mm square glass coverslip Sigma C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids Fisher 08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747F
250 mL beaker Fisher 02-555-25B
Blue styrofoam dewar Spear Lab FD-500
Brass ethane vessel Lasco 17-4075
Clamping tweezers Ted Pella 38825
Delicate task wipes Fisher 06-666
Dual-stage regulator with control valve Airgas Y12N245D580-AG
Dewer grid base UCSD
Ethane platform UCSD
Ethane propane tank Praxair ET PR50ZU-G ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank Praxair UN1035 ethane (100%)
Flexible arm task light Amscope LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q325AR1.3
Humidifier Target 719438
Hygrometer ThermoPro B01H1R0K68
Lab coat UCSD
Liquid Nitrogen dewar Worthington LD4
Liquid Nitrogen gloves Fisher 19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal) UCSD
Mark 5 (plunging platform) UCSD
Nitrile gloves VWR 82026-424
P20 pipette Eppendorf 13-690-029
PCR tubes Eppendorf E0030124286
Pipette tips ibis scientific 63300005
Ring lamp Amazon B07HMR4H8G
Safety glasses UCSD
Scissors Amazon Fiskars 01-004761J
Screw driver Ironside 354711
Tape Fisher 15-901-10R
Tweezer to transfer grid box Amazon LTS-3
Tygon tubing Fisher 14-171-130
Whatman blotting paper Fisher 1001-090

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
  2. Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
  3. Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
  4. Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  5. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  6. Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  7. Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  8. McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
  9. Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
  10. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  11. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  12. Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
  13. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  14. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
  15. Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
  16. Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  17. Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  18. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  19. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  20. Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
  21. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
  22. Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
  23. Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
  24. Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  25. D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
  26. Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  27. Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
  28. McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
  29. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  30. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
  31. Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
  32. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
  33. Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
  34. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
  35. Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  36. Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
  37. Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
  38. Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
  39. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  40. Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  41. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  42. Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
  43. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  44. Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
  45. Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
  46. Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
  47. Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
  48. Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
  49. Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
  50. Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
  51. Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
  52. Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
  53. Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).

Tags

Биохимия выпуск 180
Ручное замораживание биологических образцов для одночастичной криогенной электронной микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L.,… More

Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, Jr., M. A. Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e62765, doi:10.3791/62765 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter